Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân giải Pacloputrazol ở các vùng trồng cây ăn quả ở tỉnh An Giang và Tiền Giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO -TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP PHAN LẬP, TUYẾN CHỌN CAC DONG VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PACLOPUTRAZO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO

-TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, TUYẾN CHỌN CAC DONG VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PACLOPUTRAZOL Ở CÁC VÙNG TRONG CÂY AN QUÁ O TINH AN GIANG VÀ TIEN GIANG

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HQC

Sinh viên thực hiện : NGUYEN THỊ TƯỜNG VY

MSSV : 19126236

Khóa : 2019 — 2023

TP Thủ Đức, 8/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, TUYẾN CHON CÁC DONG VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG PHAN GIẢI PACLOPUTRAZOL Ở CÁC VUNG TRONG CÂY AN QUÁ O TINH AN GIANG VÀ TIEN GIANG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG NGUYEN THỊ TƯỜNG VY

TP Thú Đức, 8/2023

LỜI CẢM ƠN

Trong quãng thời gian bốn năm học tập và rèn luyện tại Trường Đại học NôngLâm Tp.HCM Em đã được học hỏi rất nhiều kiến thức bổ ích, tích lũy được nhiều kĩnăng và kinh nghiệm cho bản thân, làm quen được nhiều bạn mới Bên cạnh đó, cũng

gap nhiều khó khăn, đặc biệt trong giai đoạn thực hiện khóa luận tại trường, nhưng nhờ

có sự động viên giúp đỡ của thầy cô bạn bè mà em đã vượt qua và hoàn thành khóa luận

Sau day, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám Hiệu và tất cả quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, tất cảquý thầy cô trong Khoa Khoa học sinh học đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiếnthức bô ích trong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trương Phước Thiên Hoàng vàThS Lê Phước Thọ đã giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến KS Võ Trần Quốc Thắng và các bạn sinhviên tại phòng thí nghiệm Ribe 212 đã nhiệt tình hỗ trợ và tạo môi truờng điều kiệnthuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn gia đình đã tạo luôn quan tâm, động viên và tạo moi điều kiện tốtnhất dé em có thé đến trường, luôn ủng hộ em về cả vật chất lẫn tinh than

Xin chân thành cảm on!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên: Nguyễn Thị Tường Vy, MSSV: 19126236, Lớp: DH19SHA (Số di động:

0394371084, Email: 19126236@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh hocTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốtnghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu làhoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2023

Người việt cam đoan (Ký và ghi rõ họ tên)

H

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành với mục dich phân lap, tuyển chọn các dòng vi khuẩn

có khả năng phân giải paclobutrazol (PBZ) ở các vùng trong cây ăn qua ở tỉnh An Giang

và Tiền Giang bằng phương pháp nuôi cấy trong môi trường khoáng có bổ sung PBZ và

phương pháp sắc kí HPLC-PDA Đề phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân giải

PBZ, từ 10 mẫu đất đã thu thập từ vùng trồng cây ăn quả ở tỉnh An Giang và Tiên Giang.Kha năng phân giải PBZ được xác định bằng sự xuất hiện của vòng phân giải trên môitrường khoáng có bổ sung PBZ Sau đó, khảo sát khả năng phát triển của các chủng vikhuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng bằng phương pháp cấy trang và xác định nồng độPBZ ở ngày 0 và ngày 15 bằng phương pháp HPLC-PDA Kết quả phân lập được 20chủng vi khuẩn từ 10 mẫu dat, 7 chủng có vòng phân giải PBZ trong đó chủng có kíhiệu 1.3 và 2.7 có vòng phân giải tương đối tốt so với các chủng còn lại Nồng độ PBZsau 15 ngày của chủng 1.3 giảm 15% so với ban đầu Kết quả định danh sinh học phân

tử đã xác định chủng 1.3 và 2.7 lần lượt là Bacillus velezensis và Bacillus stercoris với

độ tương đồng là 99,51% và 99,93% Ở điều kiện môi trường khoáng bé sung 100 ppm

PBZ và nhiệt độ là 30°C thì có vòng phân giải tương đối tốt

Từ khóa: Paclobutrazol, HPLC-PDA, Bacillus velezensis, Bacillus stercoris.

ll

The study was conducted with the aim of isolating bacterial strains capable of degrading paclobutrazol (PBZ) in fruit tree regions in An Giang and Tien Giang provinces by culturing in mineral medium supplemented with PBZ and HPLC-PDA chromatography To isolate bacterial strains capable of degrading PBZ, 10 soil samples were collected from fruit growing areas in An Giang and Tien Giang provinces The ability to degrade PBZ was determined by the presence of a resolution ring on mineral medium supplemented with PBZ After that, the ability of strains to grow in liquid culture was investigated by the method of inoculation and determined the concentration

of PBZ at day 0 and day 15 by HPLC-PDA method As a result, 20 bacterial strains were isolated from 10 soil samples, 7 strains had PBZ degrading rings, in which strains with symbols 1.3 and 2.7 had relatively good resolution rings compared to the remaining strains The PBZ concentration after 15 days of strain 1.3 decreased by 15% compared

to baseline The results of molecular biological identification identified strains 1.3 and 2.7 as Bacillus velezensis and Bacillus stercoris, respectively, with the similarity of 99.51% and 99.93% At the condition of mineral environment supplemented with 100 ppm PBZ and the temperature is 30°C, there is a relatively good resolution ring.

Keywords: Paclobutrazol, HPLC-PDA, Bacillus velezensis, Bacillus stercoris.

IV

MỤC LỤC

Trang

CS, iXÁC NHẬN VA CAM DOAN escsssssssssssssssesssssssscssssssssesusssessesucsussssassssessessessessesseseees ii

là HẠ TRANG zrssssrsstoitststttgbodgtiotggLdE4832.30300995/800078880/8003190030-31SHSGG07SR27/013101804GH0/3:2100.0000.03:GH30302401EE 1V

MUC LUC 0 Ô VDIANE BACH GA CHỮ VIỆT TẮTT c2SLe212/12002676L602,/.0n0L,mgp0gdicu0 viiiDANH SÁCH CAC BANG 00 ssesscsssssesscssssseessessnsnesceesnnenscesssnnecsesunuescessnsnnessensenees ix

SU est ll; |, ae x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU . ©2222¿22222+2222222221112222.112222 re 1

1.1 Đặt vấn đề + + 22s t2 21211121 211112121121 0121211121211 |1.2 Mục tiêu đỀ tài -5- 522225 212121221211212112112111211211121121211121121220122 ca 2

123 Nối đúng THC: HIỂT g2 eso arnseers cere S9SEEEEXANGLSABSSUECSH043920SS038S4484i103530023024080380096:01238 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 222¿¿-2222222z22222Sz+rrtrErvrerrrrrrreerre 32.1 Tổng quan về xoài, sầu riêng và phương pháp kích thích ra hoa trái vụ 32.1.1 Tổng quan VỀ XOài -2- 2-©22©2222222EE2EE22E1221221122122112112211211211221121111 21222 32.1.2 Tổng quan về sầu ri6ng eo cccecceccseessesssessesseeesessecssecsecseessecseesussseesesseeseeseeesees 42.1.3 Phương pháp kích thích ra hoa trái vụ bằng Paclobutrazol ở xoài và sầu riêng 52.2 Tổng quan về paclobutrazol, vai trò va tác hại của paclobutraZol . - 6

De Doles PACIOD UAL lon ueuintegiisnnöigBiiIBiV3808033888100R\3G838A506149301883040100G03823303583E42180801g1830030063889880008/008004Ù 6

2.2.2 MHIL.WOTGUÚN ĐBHEIGBUUEHZlispissgseissiisgessessil5ix04820Pá:300390160s05:812383651863368503003g8559:8tSSE 7

2.2.3 Tac hại của pacloDufTAZOÌ - - + + + +* + **xE 1S vn HH HH kg 7 3:3.khái niệm HPLG-PDA cái dt ó1 0á btdkElšEkssi1uEBNEQ40518 E5216313tvS48I43i551488.4035 8 2.4 NHững nghiện Cứu TONS THƯỚC wcscescecevvevressssrnssnensesssnesessesvavereovesvsvsvasuneresuaeeesueasesuesees 9

2.5 Những nghiên cứu HƯỚC |HOÀI-:ceccssesxss6- 668244611006 111 010148141661440356556556456/665115806801018 10CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -:©225ccccsecceecee 123.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2: 2¿©22+2++2E++EE+£E++EEeEE+2Exerxrrrrerxres 123.2 Vật LGU ecceecceeccseecsseessseessvesssecssuessssesssesssuvessuessussssusssisessissssuessitesssessssssussssessseesseees 12

3.2.1 Mẫu thí nghiệm -¿- ¿2 5222212212E121221221212121121212112121211212121121 1121 xe 12

3.2.2 Dụng cụ và thiẾt bị 2252222 22222222221121123121121121121121121121121121121121121121 xe 123.3 Phương phap nghiÊn:GỮU-‹ ‹-.e ecssccseseckkkkiE.-S0,1200212n02 140 060Ản80 000004 -200E8.02-0880/6.4008 13

SB Ehương phẩy hi Bi seseenakaeinbidEk nh ghEHHà gagL42g.200 00 aggh GI1G/308/0003035810//086E 13

3.3.2 Phương pháp phân lập các dòng vi khuẩn có khả nang phân giải PBZ 133.3.3 Khảo sát các điều kiện phân giải PBZ trên thạch đĩa - 2: 52552255z+: 143.3.4 Khảo sát đặc điểm hình thái chủng được chọn - 2: 22©22222222z22xz2zz2 173.3.5 Phương pháp đánh giá và khảo sát khả năng chuyển hóa PBZ - 193.3.6 Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử 2-2222 55z52zz25z+2 20BANU NY 8 4 20CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -22252222+E2E22E22E22E22E22Ez22.zxee 21

4.1 Thu mau, phân lập, định tính khả năng phân giải PB/ -5-55+ 21

f1 eC TsosengnoartatttdftiiGibcPNsttofitRGE/09/SESNnSĐ-ONHGLSL4GIGUESGDdNEVEnargsoi 21

ee, | re 21

4.1.3 Kết qua định tính khả năng phân giải PBZ 0 0.ccc ccc ccseecseeceseecseesseestesseeeeeees 22

4.2 Kết quả khảo sát vòng phân giải PBZ trên thạch đĩa 2 255222zz2z5522 244.2.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ PBZ đến vòng phân giải 244.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến vòng phân giải - - 244.3 Kết quả làm thuần giữ giống và các đặc điểm hình thái của chủng được chon 254.4 Kết quả đánh giá và khảo sát khả năng chuyên hóa PBZ 2- 52-552 27

4.4.1 Sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường khoáng - 27

4.4.2 Nồng độ PBZ trong môi trường nuôi cấy lỏng vào ngày 0 va ngày 15 27

vi

S8{ no t8 5 284.6 Thảo luận 2 2-52222222122212212211221221121121121121111121121121121121121121121121 212 xe 30CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ DE NGHỊ 2 2222222221224 21 2122121221211 ce, 33

h‹a 1 a5 33

5.2 Đề nghị -2- 52-52 2222221121121121121121121121121121111211111111111101010120121111211 2e re 33TÀI LIEU THAM KHẢO 2 2+S£SE+E2E£EEeErEerxerreererrrerrrrerrre 34

Vil

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

PBZ: Paclobutrazol

Ctv: cộng tác viên

Vsv: vi sinh vat

vill

Đường kính vòng phân giải PBZ (cm) của các chủng vi khuẩn sau 5 ngày 23

Đường kính vòng phân giải PBZ (cm) ở các nồng độ khác nhau 24Đường kính vòng phân giải PBZ (cm) ở các nhiệt độ khác nhau 25

Đặc điểm khuẩn lạc của các dong vi khuẩn được chọn 25s 25

Đặc điểm sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn -2- 2 5222222zz2zz+zxz>sz 26

IX

DANH SÁCH CÁC HÌNH

TrangHình 2.1 Cau trúc của Paclobutrazol 2-2 ©22©2++2E+E++EE2EE+EEvEE+erxerxrrrrerrree 6Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 2-22 222222222z22z22zzz2zz+ 15Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 2 2 2222222222222EE22+22zzzzz+ 16Hình 4.1 Một số dia cấy trang trên môi trường khoáng tối thiểu bổ sung PBZ 22Hình 4.2 Một số đĩa cấy ria trên môi trường khoáng tối thiểu bồ sung PBZ 22Hình 4.3 Một số đĩa cấy ria trên môi trường TSA 2-©222222222z+22z+22zzzzzze 22Hình 4.4 Các dòng vi khuẩn có vòng phân giải tốt nhất ở nồng độ PBZ 100 ppm 23

Hình 4.5 Các dòng khuan được chọn trên môi trường TSA - -: 24

Hình 4.6 Kết quả nhuộm Gram của 2 dong vi khuẩn được chọn 2 +: 26Hình 4.7 Kết quả nhuộm bao tử của 2 dòng vi khuẩn được chọn -5- 26Hình 4.8 Sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường khoáng 27Hình 4.9 Sắc kí đồ thé hiện nồng độ PBZ của chủng 1.3 - 2 22©2222222222 2 28Hình 4.10 Sắc ki đồ thé hiện nồng độ PBZ của chủng 2.7 2- 225225222: 28Hình 4.11 Kết qua Blast của chủng vi khuẩn 1.3 -2-552552222252zzscse2 29Hình 4.12 Kết qua Blast của chủng vi khuẩn 2.7 -2©22222222222222E2222zz2ze2 29Hình 4.13 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn 1.3 - .30Hình 4.14 Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn 2.7 . -.- 30

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Dat van đề

Cây ăn quả là những cây nông nghiệp được trồng khá phổ biến ở nước ta, đem lại

nguồn thu nhập không nhỏ cho người dân Van đề thị trường nông sản thường không ổn

định và rat bap bênh vì nhà vườn không thé định giá cho nông sản Do vậy, thường

xuyên xảy ra hiện tượng “được mùa mất giá” Theo Nguyễn Sự, 2020 nếu sản xuấtnghịch vụ thì lợi nhuận cao gấp 1,7 lần so với sản xuất vụ chính Do đó, nông dân dùngnhiều biện pháp xử lý ra hoa trái vụ cho vườn của mình, trong đó có sử dụng chế phampaclobutrazol (PBZ).

Paclobutrazol (2RS, 3RS) - 1 - (4-chlorophenyl) - 4, 4 - dimethyl - 2 - (1H - 1, 2,4-triazol - 1 - yl) pentan - 3 - ol (UPAC), là hop chất hóa học được sử dung như hormone

điều hòa sinh trưởng tổng hợp ở thực vật, thuộc nhóm kháng nam chứa vòng triazole

(Vaz và ctv, 2015) PBZ có chức năng ức chế kéo dai tế bao và kéo đài long, làm chậm

tăng trưởng cây trồng bằng cách ức chế sinh tổng hợp giberelin PBZ là hợp chất hóa

học xử lý được đánh giá cao trong việc xử lý ra hoa cây ăn trái (Trần Văn Hâu và ctv,2001) Nông dân sử dụng PBZ với nồng độ rất cao 1000 - 1500 ppm Hiện tại, nông dâncòn tưới trực tiếp vào các gốc cây đề kích thích ra hoa với nồng độ lên đến 5,0 g hoạtchất cho 1 m đường kính (Tran Văn Hau va ctv, 2005)

Tuy nhiên, do thiếu các nhóm chức phân cực nên PBZ rất khó tan trong nướcnhưng rat dé liên kết với các vị trí ky nước trong dung môi hữu co Vòng chlorobenzenecủa paclobutrazol có thé bị di hóa, nhưng vòng 1,2,4 - trizole có khả năng chống lai sựphân giải của vi sinh vật Việc phá hủy paclobutrazol bằng phương pháp phi sinh họcdiễn ra trong đất rất khó bởi vì độ bay hơi của paclobutrazol rất thấp (1 Pa) và thường

lưu tồn trong đất ở thời gian rất lâu Paclobutrazol có thời gian bán hủy từ 43 đến 618ngày (trung bình 182 ngày) trong đất ở điều kiện hiếu khí Thời gian bán hủy thực tế

phụ thuộc vào các điều kiện vật lý và sinh học, bao gồm nhiệt độ xung quanh, độ chặtcủa đất và thành phần vi sinh vật đất Vì nhu cầu tiêu thụ quanh năm các nhóm cây ănquả như xoài, nhãn, sầu riêng Hiện nay, PBZ được sử dụng rộng rãi đến quá mức tạicác nhà vườn, làm cho đất trồng bị tồn dư một lượng paclobutrazol khá lớn Bên cạnh

đó, việc liên tục sử dung paclobutrazol trong thời gian dài dẫn đến tình trạng cây chậm

phát triển, trở nên còi cọc và sức chống chịu kém Bên cạnh đó PBZ rất độc cho sức

khỏe con người và ảnh hưởng đến môi trường sinh thái (Wastson và Jacobs, 2012) Do

đó đề tài được thực hiện nhằm mục đích tuyển chọn các chủng vi khuan có khả năng

Mục tiêu 4: định danh được dòng vi khuẩn phân giải PBZ

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng chuyên hóa PBZ

Nội dung 2: khảo sát các điều kiện phân giải PBZ trên thạch đĩa

Nội dung 3: đánh giá khả năng phân giiar PBZ của các dòng vi khuẩn trong môitrường khoáng.

Nội dung 4: định danh các dòng vi khuan chuyền hóa PBZ

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Téng quan về xoài, sầu riêng và phương pháp kích thích ra hoa trái vụ bangPaclobutrazol ở xoài và sầu riêng

2.1.1 Tổng quan về xoài

Theo Dương Minh va ctv, (1996), xoài (Mangifera indica) là cây ăn quả nhiệt đới,phần lớn các tác giả đều cho rằng nguồn gốc cây xoài ở miền Đông Ấn Độ và các vùnggiáp ranh như Miến Điện, Việt Nam, Malaysia

Trên thé giới hiện nay có 87 nước trồng xoài với diện tích khoảng 1,8 - 2,2 triệu

ha Vùng Châu Á chiếm 2/3 diện tích trồng xoài trên thế giới, trong đó đứng đầu là Ấn

Độ (chiếm gần 70% sản lượng xoài thế giới với 9,3 triệu tấn), Thái Lan, Pakistan,Philippin, và Miền Nam Trung Quốc, Zimbabué, Ghiné, Cônggô, Nam Phi, Keynia,Modambich, Mali, Ai Cập, Brazin, Mêhicô, Hoa kỳ Ngoài ra, xoài còn được trồng ởvùng ven biển nước Úc

Khoảng 3 - 4 tháng sau khi tré hoa thì trái đã đủ già và chín Năng suất tăng dần

từ năm cho trái đầu tiên đến sau 5 năm thì 6n định Trái được hái khi đã già, da láng, lúc

đó trái hơi nặng hơn nước Có thé quan sát bằng kinh nghiệm trên mỗi giống dé ấn địnhthời gian thu hoạch.

Quả xoài chín có màu vàng hấp dẫn, có vị chua ngọt, mùi thơm ngon được nhiềungười ưa thích và được xem là một loại quả quí Trái xoài chứa nhiều vitamin A, C,đường (15,4%), các acid hữu cơ nên xoài được sử dụng rộng rãi cả trái chín và trái giàcòn xanh Xoài chín được ăn tươi, đóng hộp, làm nước trái cây, mứt kẹo, kem, sấy khô

dé tiêu thụ nội địa hay xuất khẩu

Ở Việt Nam xoài được trồng từ Nam chí Bắc, vùng trồng xoài tập trung là từ Bình

Định trở vào nhiều nhất là các tỉnh Đồng Bằng sông Cửu Long như: Tiền Giang (trên6.000 ha, trong đó đang cho trái 4.000 ha), Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Nai

Các giống xoài hiện được trồng tại Việt Nam

Xoài Cát Hòa Lộc: xuất phát từ Cái Bè (Tiền Giang), xoài có trái to, trọng lượng

trái 400 - 600 g, thịt trái vàng, dé, thơm, ngọt, hat dep, được coi la giống xoai có phẩm

chất ngon Thời gian từ tré bông đến chín trung bình 3,5 - 4 tháng

Xoài Cát Chu: phẩm chất trái ngon, thịt thơm ngọt có vị hơi chua, dạng trái hơitròn, trong lượng trái trung bình 250 - 350 g, vỏ trái mỏng Day là giống xoài ra hoa rattập trung và đễ đậu trái, năng suất rất cao.

Xoài Xiêm: phẩm chất tương đối ngon, cơm vàng, thịt dẽo, mịn, hạt nhỏ, vỏ trái

dày Đây là giống dễ đậu trái, năng suất cao

Xoài Bưởi: còn gọi là xoài ghép hay xoài 3 mùa mưa, trọng lượng trái trung bình

250 - 350 g, có nguồn gốc từ Cái Bè (Tiền Giang), giống xoài nay có thé trồng đượctrên nhiều loại đất ké cả đất nhiễm phèn, mặn Cây phát triển nhanh, nếu trồng từ hộtcây cho trái sau 2,5 - 3 năm.

Nam-dok-mai (Thái Lan): tán thưa, lá to bản, mép gợn sóng Trái nặng trung bình

320 g, hình bầu dục, đầu trái nhọn, vỏ mỏng láng, màu vàng đẹp, ngọt, thơm, hạt nhỏ

Từ khi nở hoa đến thu hoạch 115 ngày

Khiew-sa-woei (Thái Lan): là giống xoài ăn xanh, cây phát triển mạnh, lá thon đài,đầu hơi nhọn, trái đài hơi cong, nặng trung bình 300 g

Yellow Gold (Đài Loan): là giống ăn sống, trái từ 800 g - 1 kg, phiến lá lớn, phát

triển, phẳng, đuôi lá tròn, cây sinh trưởng tốt và dé ra hoa, cho trái từ 2 - 3 năm sau khi

trồng.

R2E2 (xoài Úc): là giống có chất lượng trái ngon đang được phát triển trong thờigian gần đây, đặc biệt ở vùng Nha Trang - Khánh Hoà, An Giang R2E2 có trái tròn,màu sắc vỏ trái đẹp, có mùi thơm đặc trưng, thịt trái ngọt, chắc và ít xơ; lá vặn hình xoắn

ốc Trong những năm gần đây xoài Úc có giá khá cao và ôn định

Ngoài ra còn một số giống xoài như: xoài Hòn, xoài Chau, xoài Thanh, xoài Thanh

Ca dé trồng cho trái 6n định, năng suất cao

2.1.2 Tống quan về sầu riêng

Theo Thông tin nông nghiệp, cây sầu riêng có tên khoa học là Durio ZibethinusMurray, thuộc họ Bombacaceae, chi Durio Cây sầu riêng giống có nguồn gốc từ vùngnhiệt đới âm của Đông Nam A Cây được phat hiện lần đầu tiên là loài cây mọc dại ởrừng Sumatra, Kalimantan thuộc Malaysia Cây sầu riêng được nhân giống và trồng ởnhiều vùng thuộc Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Philippin, Lào, Campuchia và ViệtNam.

Cây được trồng đầu tiên tại Biên Hòa (Đồng Nai) Sau này, cây được nhận giống

và trồng rộng rãi ở các tỉnh Đông Nam Bộ, Tây Nam bộ va Tây Nguyên Ngày nay, cây

sầu riêng là một trong những loại cây ăn quả cho giá trị kinh tế cao, được bà con nôngdân trồng kinh doanh ở nhiều vùng trên đất nước ta.

Sầu riêng là loài cây ăn quả cây gỗ, mọc thăng, vỏ thô Trong điều kiện tự nhiên,cây sầu riêng có thé cao từ 27 - 40 m Trong điều kiện trồng canh tác, cây có chiều caotrung bình từ 10 - 12 m, đường kính cây khoảng 1,2 m.

Cây sầu riêng giống có tán to và rộng phía dưới Cây thường có hình nón, càng lêntrên phần ngọn càng nhỏ dần Nhánh sầu riêng thường mọc ngang Khi cây mang quảnặng, cành thường thăng ra Lá sầu riêng dạng đơn, mọc so le Phiến lá khá dày, có hìnhdạng trứng thuôn dai Lá cây có kích thước dài khoảng 5 - 7 em với các vảy nhỏ bao

xung quanh Lá non có màu đồng, lá lớn lên mặt trên màu xanh dam, trong khi mặt dưới

của phiến lá có màu vàng Lá rụng thay phiên Phần cuống của lá có hình dạng hơi nhọn

Hoa sau riêng mọc thành từng chùm từ 1 - 15 hoa ở những cành chính ra trái lớn.Hoa sầu riêng khi nở có mùi hương rất mạnh Cánh hoa có màu trắng, một số giống cómàu hồng hoặc đỏ nhạt Bầu hoa có vòi đài hình quả xoan, đó là vòi nhụy, đầu nhụytròn bao gồm 5 mảnh, có nhựa dính

Quả sau riêng có hình dang hơi cầu Vỏ quả có day gai nhọn bên ngoài Khi còn

non, quả có màu xanh lợt, khi chín, vỏ quả hơi chuyền thành vàng xanh, vỏ nứt ra va cómùi thơm nồng đặc trưng Com sau riêng có nhiều màu khác nhau tùy vào từng giống

như: mau vàng, màu vàng nhạt, màu vàng cam, màu đỏ, mau vàng sam Cơm sầu khi ăn

vào có vị béo, ngọt, xơ dính vào hạt.

Cây sầu riêng giống có các giống phô biến như sau riêng ri 6, sầu riêng chuồng bò,sầu riêng monthong Thái Lan, sầu riêng khổ qua xanh, sầu riêng cái mơn, sầu riêng hạt lép.2.1.3 Phương pháp kích thích ra hoa trái vụ bằng Paclobutrazol ở xoài và sầu riêng2.1.3.1 Ở xoài

Xử lý paclobutrazol khi lá non phát triển hoàn toàn, lúc lá có màu đỏ đồng và được

10 - 15 ngày tuôi Pha 1 - 2 g hoạt chat với 3 - 5 lít nước tưới quanh gốc cây, sau đó tưới

nước liên tục 1 - 2 ngày/lần trong 7 ngày 25 - 30 ngày sau khi xử lý Paclobutrazol thì

bón phân: DAP + KCI theo tỉ lệ 1:1 với lượng 300 - 500 g/cây và phun MKP 0-52-34(KH¿PO/) với liều lượng 50 - 80 g/10 lít nước, cách 10 ngày phun 1 lần, phun 2 - 3 lần

45 - 60 ngày sau khi xử lý paclobutrazol thì phun KNO: kích thích ra hoa Phun khi thờitiết khô ráo, chồi ngọn phát triển mạnh, nhô cao, gân lá phát triển hoặc cong lại 5 - 7ngày sau tiễn hành phun lại lần 2 với liều lượng giảm 50%

5

2.1.3.2 Ở sầu riêng

Bước 1: bón phân trước khi đậy mủ (nilong)

Đối với cơi đọt cuối xịt thuốc để mau già lá đồng loạt Sau đó, bón phân DAP hoặcNPK 20-10-10, mỗi gốc 700 g - 1 kg, cách 7 ngày rải 1 lần (bón 2 lần) Đồng thời tiếnhành phun thuốc phòng ngừa sâu, ray

Bước 2: phun chất tạo mầm

Phun chất tạo mầm 2 lần, cách 7 ngày phun 1 lần Điều kiện dé phun chất tạo mầm,

ba con dé ý cây đi coi dot nhanh hay chậm, thông thường thì sau rải lân tầm 1 tháng, lábắt đầu lụa đần Làm 2 - 3 cơi đọt vì còn phụ thuộc vào sức khỏe của cây

Phun chất tạo mầm theo tỷ lệ: 0,5 kg Lân 86 + 0,5 kg Kali đen + 200 Lit nước.Bước 3: đậy mủ cho cây sầu riêng Thời điểm đậy mủ: Lá đã lụa đồng loạt, đồngthời có dấu hiệu xuất hiện mắt cua ra lưa thưa Đậy mủ kín gốc, không dé nước dongvao géc

Bước 4: phun paclobutrazol (Paclo) Sau khi đậy mu thì phun paclo Phun bên trong cây, kỹ vào cành, thân và mặt dưới lá.

Chú ý: chỉ phun paclo 1 lần, áp dụng trên những cây khỏe mạnh Cần bơm cạnnước trong mương, tạo điều kiện khô hạn cho cây

Bước 5: phun tạo mam lần cuối Sau khi phun Paclo thì cách 7 ngày phun chat tạomam lần cuối

Bước 6: đỡ mủ và tưới nhẹ nước 1 tháng sau bắt đầu dé mũ, khi đó cây cũng đãnhú mắt cua nhiều (70 - 80%) Sau khi đở mủ cần tưới nhẹ nước (lượng nước tướikhoảng 20 - 30% khi tưới bình thường, sau đó tăng dần)

2.2 Tổng quan về paclobutrazol, vai trò và tác hai của paclobutrazol

Paclobutrazol là hợp chất hóa học bao gồm một vòng triazole và một vòngchlorobenzene liên kết với một mach carbon mở, dùng dé điều hòa sinh trưởng ở thựcvật bang cách ức chế sự tông hợp gibberellin (Nông nghiệp xanh, 2022)

2.2.2 Vai trò của paclobutrazol

Paclobutrazol được hiểu và sử dụng như một hormone điều khiến các tế bào sinh

trưởng của cây trồng như ngắn lóng, tăng khả năng đẻ nhánh, thúc đây sự ra hoa, đậu

trái mùa nghịch, làm chậm tăng trưởng của cây trồng

Trong quá trình sinh tổng hợp gibberellin của thực vật, ent-kaurene oxidase là mộtenzyme quan trọng giúp chuyên đổi chất chuyên hóa trung gian, ent-kaurene, thành axitent-kaurenoic, sau đó được xử lý thêm bởi các enzyme khác dé tạo ra các gibberellinkhác nhau Vi paclobutrazol ức chế hiệu quả hoạt động của ent-kaurene oxidase để ngănchặn quá trình sinh tông hợp gibberellin trong thực vật

Từ đó, paclobutrazol được áp dụng rộng rãi và được sử dụng trên hoa, trái cây, rau

và các loại cây trồng khác dé thúc day sự ra hoa và đậu trái, đồng thời điều chỉnh sự sinh

trưởng của cây trồng và ngăn ngừa các bệnh liên quan đến nắm bệnh

Đặc biệt, xử lý cây trồng ở thời điểm cây đâm chồi bằng paclobutrazol, dam baotrái sẽ không bị chậm phát triển mà sẽ lớn tròn đều (Tanixa, 2022)

2.2.3 Tác hại của paclobutrazol

Vì nhu cau tiêu thụ quanh năm các nhóm cây ăn quả như xoài, nhãn, sau riêng.Hiện nay, paclobutrazol được sử dụng rộng rãi một cách quá mức tại các nhà vườn, làm

cho đất trồng bị tồn du một lượng paclobutrazol khá lớn Ngoài ra, việc lạm dụng

paclobutrazol trong thời gian dài dẫn đến tình trạng cây chậm phát triển, trở nên còi cọc

và sức chống chịu kém Do thiếu các nhóm chức phân cực nên paclobutrazol rất khó tantrong nước nhưng rất dễ liên kết với các vị trí ky nước trong dung môi hữu cơ Vòng

chlorobenzene của paclobutrazol có thé bị di hóa, nhưng vòng 1,2,4 - trizole có kha năng

chống lại sự phân giải của vi sinh vật Việc phá hủy paclobutrazol bằng phương phápphi sinh học diễn ra trong đất rất khó bởi vì độ bay hơi của paclobutrazol rất thấp (1uPa) và chúng thường lưu tồn trong đất ở thời gian rất lâu Nếu sử dụng hàm lượng caopaclobutrazol cho cây của mùa vụ trước thì dư lượng paclobutrazol trong đất ở nhữngnăm tiếp theo sẽ cực kỳ cao Bởi vì paclobutrazol vẫn hoạt động trong đất một thời giandai và thời gian ban phân hủy (thời gian dé phân huỷ một nửa lượng đã sử dụng) cũng

thay đối theo loại đất và điều kiện khí hậu địa phương

7

Paclobutrazol có thời gian bán hủy từ 43 đến 618 ngày (trung bình 182 ngày) trongđất ở điều kiện hiếu khí Thời gian bán phân hủy thực tế phụ thuộc vào các điều kiện vật

lý và sinh học, bao gồm nhiệt độ xung quanh, độ chặt của đất và thành phần vsv đất.Trong nước bề mặt, thời gian bán phân hủy của paclobutrazol là 164 ngày Do đó,paclobutrazol thể hiện tính ổn định hóa học cao và sự phân hủy của nó phan lớn không

bị ảnh hưởng bởi các điều kiện axit, bazơ hoặc trung tính

Việc sử dụng paclobutrazol trong nông nghiệp theo thời gian dài sẽ đẫn đến ônhiễm hệ thống nước ngầm do mưa và nước tưới Dư lượng paclobutrazol trong đất còngay ảnh hưởng đặc biệt đến cấu trúc và chức năng của quan thé vi sinh vat trong đất và

cả trong nước Đặc biệt là hệ vi sinh vật đất bị ảnh hưởng nghiêm trọng Paclobutrazoltích tụ nhiều nhất ở lá, trong khi các hoạt động của catalase và phosphatase đã giảm

đáng kể, nhưng các hoạt động của invertase lại tăng lên dang kê.

Việc sử dụng paclobutrazol ở nồng độ cao làm tăng sự đa dang của vi khuẩn trongđất và của nắm tại rễ, bề mặt rễ; trong khi sự đa dang và phong phú của cả vi khuẩn rễ

và nam cành, lá giảm đi đáng kể Việc sử dụng quá nhiều paclobutrazol đã gây ra thayđổi đáng ké trong hoạt động của catalase, phosphatase và sucrase trong đất, cũng như

sự phong phú và đa dạng của vi khuẩn và nam trên đất bề mặt, rễ, cành và lá của cây

quả mọng.

Năm 2003 theo Silva và ctv, với đề tài sự ảnh hưởng của paclobutrazol đến vi sinhvật dat Da cho thấy việc bổ sung paclobutrazol vào dat của vườn xoài ở Petrolina, đãảnh hưởng tiêu cực đến cộng đồng vi sinh vật trong đất Các giá trị trung bình cho tổng

số vi khuân, nam và xạ khuẩn đã giảm lần lượt là 58,28% va 28% so với dat không đượccải tạo bang paclobutrazol

2.3 Khái niệm HPLC-PDA

HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnhchứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏngphủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học vớicác nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phô biến

vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó

bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Đầu dò PDA (Photodiode Array Detector) là công cụ quan trọng trong phân tích

sắc ký HPLC, được sử dụng dé phat hién cac thanh phan trong mau.

Phạm vi bước sóng, đầu đò PDA có thé thu thập đữ liệu trên nhiều bước sóng khácnhau trong khoảng từ 190 đến 1100 nm Do vậy, PDA có khả năng phát hiện rộng hơn,cho phép xác định chính xác hơn các hợp chất có phổ hấp thụ hoặc phân tán ở các bướcsóng khác nhau PDA có kha năng phát hiện các chất có nồng độ cực thấp và phô hapthụ yếu hơn Điều này làm cho phân tích chất lượng mẫu trở nên chính xác hơn Cấutrúc đầu dò PDA bao gồm một mảng photodiode, mỗi photodiode ở mỗi bước sóng khácnhau Khi ánh sáng đi qua mẫu, mỗi photodiode sẽ phát ra một tín hiệu dòng tỷ lệ thuậnvới hấp thụ của mẫu ở bước sóng tương ứng Đầu dò PDA được sử dụng rộng rãi trongcác ứng dụng phân tích da phỏ, phân tích chất lượng mẫu và thông tin phố mà khôngcần xác định sẵn bước sóng cụ thé

2.4 Những nghiên cứu trong nước

Năm 2014, Đặng Phạm Thu Thảo vả ctv thực hiện nghiên cứu phân lập và địnhdanh các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy thuốc kích thích ra hoa

paclobutrazol từ đất vườn trồng cây ăn trái ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long

Từ 4 mẫu đất ban đầu qua quá trình làm giàu mật số vi khuẩn và phân lập trong môitrường khoáng tối thiểu loãng chứa PBZ như nguồn carbon duy nhất cho sự phát triểncủa vi khuẩn, tổng cộng 30 dong vi khuẩn được phân lập Tám trong số 30 dong vi khuẩn

trên được kiểm tra khả năng phân hủy PBZ trong môi trường khoáng tối thiểu (MM) có

bồ sung 15 ppm PBZ trên máy lắc, trong điều kiện phòng thí nghiệm va trong tối trong

15 ngày Kết quả đã chọn được 2 chủng vi khuẩn được định danh lần lượt là

Burkholderia sp CT2-29 va Burkholderia sp CT3-18 Hai dong vi khuẩn này có khả

năng phân hủy PBZ cao hơn các nghiệm thức con lại và phân hủy lần lượt là 15,53% va

16,41% của nồng độ PBZ ban đầu (15 ppm)

Trong bài báo khoa học về tình hình sử dụng và tồn dư của paclobutrazol trong đấttrồng sau riêng (Durio zibethinus Murr.) tại tinh Tiền Giang và Bến Tre (Phạm Thị ThùyDương và ctv, 2022) đã cho thấy tại tỉnh Tiền Giang và Bến Tre có lần lượt là 65% và18% hộ sử dụng PBZ với mức nồng độ cao hơn nồng độ khuyến cáo Hàm lượng trungbình PBZ tồn dư cao nhất trong dat được lay ở vị trí mép tán ở độ sâu 0 - 20 cm, đạt 1,036mg/kg (Tiền Giang) và 0,480 mg/kg (Bến Tre) Không phát hiện sự tồn dư PBZ trongmẫu đất được thu nhận vị tri 4 đường kính tán lá độ sâu từ 40 - 60 cm

9

2.5 Những nghiên cứu nước ngoài

Mục tiêu của dé tài của Vaz và ctv, (2011), là điều tra sự phân hủy củapaclobutrazol (PBZ) bằng cách nuôi cay hỗn hợp Pseudomonas spp., được phân lập từ

đất ở thung lũng Sao Francisco, nằm ở Đông Bắc Brazil Các thí nghiệm phân hủy sinh

học được thực hiện theo lô, trong điều kiện vô trùng và không vô trùng Paclobutrazol

ở dang tinh khiết (Sigma) và ở dang thương mại Cultar 250 SC (Syngenta) được sử dụng

làm nguồn carbon duy nhất và cũng được bổ sung thêm glycerol Hai loại đất (Argisol

và Vertisol) từ vùng Thung lũng São Francisco đã được sử dụng Một nền hỗn hợp nuôicấy của vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, trước đây được phân lập bằng cách làm giàu,

đã được sử dụng Paclobutrazol được sử dụng ở nồng độ 10 và 25 mg/L và nồng độ

paclobutrazol được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Ba mô hình toánhọc đã được sử dụng đề đánh giá động học phân hủy sinh học thu được bằng thực nghiệmcủa paclobutrazol Theo phân tích thống kê (ANOVA), kết quả phân hủy sinh học thuđược là tương tự nhau, đối với cả Argisol vàng và Vertisol, cũng như đối với các thí

nghiệm trong điều kiện vô trùng và không vô trùng, cũng như đối với PBZ tinh khiết và

PBZ thương mại Phân hủy sinh học đạt giá trị tối đa là 43%, khi chỉ có PBZ được sửdung làm ngu6n carbon duy nhất Tuy nhiên, khi glycerol được sử dung làm nguồncarbon bồ sung, quá trình phân hủy sinh học đạt khoảng 70%

Năm 2021, Kumar va ctv với dé tài nghiên cứu khảo sát K/ebsiella pneumoniae

M6 dé phân hủy paclobutrazol, các thuộc tinh tăng trưởng thực vật và hành động kiểmsoát sinh học trong hệ sinh thái cận nhiệt đới Trong nghiên cứu nảy, một chủng

Klebsiella pneumoniae mới M6 (MW228061) được phân lập từ vùng rễ xoài và được

đặc trưng là chất kích thích tăng trưởng thực vật, kiểm soát sinh học và chất phân hủy

PBZ mạnh Chung M6 sử dụng hiệu qua PBZ làm nguồn carbon, năng lượng và nito vàphân hủy tới 98,28% (50 mgL! nồng độ ban đầu) PBZ vào ngày ủ thứ 15 trong môi

trường MS Trong hệ thống đất, động học phân hủy bậc nhất và mô hình tuyến tính đề

xuất 4,5 ngày là thời gian bán hủy lý thuyết (ty, value) của PBZ với chủng M6 Mô hìnhthiết kế Box Behnken (BBD) của phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) cho thấy pH 7,0,nhiệt độ 31°C và kích thước chat cấy 2,0 mL (8 x 10 CFU mL”) là điều kiện tối ưu hóa

dé phân hủy PBZ tối đa với chủng M6 Các đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật như

khả năng hòa tan Zn, K, POs IAA, HCN và sinh NH3 của chủng M6 cho kết quả kha

quan và được đánh giá định lượng Mối quan hệ giữa kích thích tăng trưởng thực vật và

10

sự suy giảm PBZ được phân tích bằng bản đồ nhiệt, phân tích thành phần chính (PCA)

và phân tích tương quan cụm (CCA) Chủng M6 cũng cho thấy hoạt động kiểm soát sinh

học đáng ké chống lại các loại nam gây bệnh như Fusarium oxysporum (MTCC-284),Colletotrichum gloeosporioides (MTCC-2190), Pythium aphanidermatum (MTCC-1024), chủng nhiệt đới 1 (TR-1) va chung nhiệt đới 4 (TR-4) Do đó, két qua cua nghiéncứu cho thấy rang chủng M6 có thé được sử dung như một tác nhân sinh học hiệu qua

dé phục hồi đất bị suy thoái bị ảnh hưởng bởi việc sử dụng liên tục paclobutrazol

Kumar và ctv (2021), với đề tài cơ chế và động lực đối với sự phân hủypaclobutrazol và tác đụng kiểm soát sinh học của chủng vi khuẩn Pseudomonas putidaT7 Nghiên cứu cơ chế phân hủy sinh học và tối ưu hóa quy trình của chất làm chậmtăng trưởng thực vật từ nhóm triazole paclobutrazol (PBZ; CisH20CIN30 mol wt 293,79

g mol!) trong một thí nghiệm theo lô Một loại vi khuẩn gram âm hình que T7 đượcphan lập từ cánh đồng nông nghiệp sử dụng PBZ bằng phương pháp tăng sinh và phânlập được chủng Pseudomonas putida T7 Ching đã được thử nghiệm về khả năng phan

hủy sinh học PBZ và các đặc tính thúc day tăng trưởng thực vật Kết quả cho thay rang

chủng T7 sử dụng PBZ làm nguồn carbon và năng lượng va cho thay sự suy thoái lên

tới 98,30% vào ngày thứ 15.

Từ nghiên cứu phân giải Paclobutrazol của chủng vi khuẩn bản địa ở vườn xoàitại đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam từ mẫu đất được thu thập tại 30 vườn xoài ởĐồng bằng sông Cửu Long của Việt Nam Sau khi nuôi cấy, các khuẩn lạc vi khuẩn

được phân lập và chuyển vào môi trường TSA để xác định đặc điểm hình thái, xét

nghiệm sinh hóa và đánh giá khả năng phân hủy sinh học PBZ Bốn chủng vi khuẩn, cókhả năng phân hủy sinh học PBZ cao, đã được xác định và đánh giá khả năng phân hủy

sinh học PBZ Ngoài ra, vùng 16S rDNA đã được giải trình tự Kết quả định danh cho

thay 4 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy sinh học PBZ cao là Pseudomonasfluorescens, Pseudomonas nitroreducens, Burkholderia cepacia, Acinetobacter

seifertii Sau 30 ngày, hàm lượng paclobutrazol bị vi khuan nay phân hủy lần lượt là

36,51%, 36,23%, 34,19% và 33,56% ở nồng độ ban đầu là 60 ppm (Pham và ctv, 2023)

11

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng VI sinh RIBE 212, Viện Nghiên cứu Công nghệ

Sinh học - Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng03/2023 đến tháng 07/2023

3.2 Vat liéu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất được thu thập từ các vùng trồng cây

ăn quả cụ thé là xoài và sầu riêng ở tỉnh An Giang và Tiền Giang Vị trí lay mẫu cụ thé

được thể hiện ở Bảng 3.1

Bang 3.1 Địa điểm lay mẫu đất

Kí hiệu mẫu Địa điêm lây mẫu Đất trồng cây

XI Vĩnh Xương, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài

X2 Vĩnh Xương, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài

X3 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài

X4 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Dat trồng xoài

X5 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài

SRI Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêngSR2 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêngSR3 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêngSR4 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêngSR5 Tan Thanh, Cai Bé, Tién Giang Đất trồng sầu riêng

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hấp khử trùng, máy ly tâm, cân điện tử, tủlạnh, tủ sấy, kính hiển vi, máy do quang phổ, microware, máy do pH, máy do độ am,may khuấy từ, máy nuôi cay lắc

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, các loại que cấy, micropipette (100 uL,

1000 uL), pipette thủy tinh, cốc thủy tinh, ống falcon (15 mL, 50 mL), cá từ, ống đong,

12

túi mlon, màng bọc thực phẩm, bút ghi mẫu, giấy lọc và một số dụng cụ cơ bản của

phòng thí nghiệm.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Mẫu đất được thu thập là mẫu đất trồng xoài và sầu riêng tại tỉnh An Giang và TiềnGiang.

Gat bỏ lớp bã thực vật trên mặt (nếu có) sau đó dùng xẻng nhỏ lấy khoảng 0,5 kgdat Vị trí lay mẫu ở độ sâu 0 - 30 cm

Mẫu được bảo quản trong túi kín, ghi tên mẫu, ngày lấy mẫu trên Mẫu được đưa

về phòng thí nghiệm dùng để phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4°C

3.3.2 Phương pháp phân lập các dòng vi khuẩn có kha năng phân giải PBZ

3.3.2.1 Phan lập

Các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa paclobutrazol được tăng sinh trong

môi trường khoáng được thực hiện bằng cách: chuẩn bị 25 mL môi trường khoáng có

chứa 18 ppm PBZ trong bình đã tiệt trùng và cho 1 g mẫu đất khô có chứa vi khuẩn vao.Môi trường khoáng có công thức trong | lít như sau: 1 g NaCl; 0,5 g NHuCl; 0,935 g MegCh; 0,015 g CaCl;; 0,49 g K;HPO¿ và 0,375 g KH¿zPO¿ (Chen va ctv, 2010) Môitrường được hap khử trùng ở 121°C, 20 phút trước khi sử dụng Các bình nuôi cay đượcđặt trên máy lắc với tốc độ 90 rpm (nhằm tao kha nang trao đổi oxy tốt cho dung dịch)

ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối

Sau 15 ngày, hút 1 mL dung dịch khuẩn ở bình nuôi cấy đầu tiên vào bình chứa 24

mL môi trường khoáng có chứa 18 ppm PBZ, tiếp tục nuôi trên mấy lắc trong vào 15

ngày Quy trình sẽ được lặp lại liên tục 3 lần

Sau 3 lần nuôi cấy thì bắt đầu tách ròng và làm thuần trên môi trường TSA (gồm

30 g Tryptone soya broth và 20 g agar cho 1 lít nước cat)

3.3.2.2 Dinh tinh kha năng phân giải PBZ bang phương pháp cấy điểm

Mục đích: xác định khả năng phân giải PBZ của các dong vi khuẩn phân lập

Sử dụng phương cấy cham điềm các khuẩn lạc lên môi trường PBZ 100 ppm và ủ.Sau 5 ngày, cho lugol lên để quan sát vòng phân giải Nếu thuốc thử lugol không bắtmàu quanh khuẩn lạc tức là khuẩn có khả năng phân giải Sau đó tiến hành đo vòng phângiải Từ đó có thê kết luận được rằng các đòng vi khuẩn có khả năng phân giải PBZ haykhông Khả năng phân giải được đánh giá bằng cách đo độ lớn của dòng phân giải

13

Công thức tính độ lớn vòng phân giải:

A=D-d

trong đó:

A: độ lớn vòng phân giải (cm)

D: đường kính vòng phân giải (cm)

d: đường kính khuẩn lạc (em)

Chọn các chủng có vòng phân giải lớn nhất dé làm tiếp các khảo sát tiếp theo.3.3.3 Khảo sát các điều kiện phân giải PBZ trên thạch đĩa

3.3.3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ PBZ đến vòng phân giải của các

chủng vi khuẩn

Ảnh hưởng của nồng độ PBZ đến vòng phân giải của các chủng vi khuân được khảo

sát trên môi trường khoáng bổ sung 100 ppm, 200 ppm và 300 ppm PBZ

Tiến hành cấy ria 2 chủng vi khuẩn được chọn trên môi trường TSA, sau đó dùng

que cấy điểm cấy lần lượt từng loại vi khuẩn vào từng môi trường có bổ sung PBZ vớinồng độ khác nhau, mỗi đĩa lặp lại 3 lần Ủ trong 5 ngày, tiếp theo tiễn hành nhuộm vớilugol dé quan sát vòng phân giải Sau đó chon nồng độ PBZ có vòng phân giải tốt nhất

dé làm các khảo sát tiếp theo

14

Thí nghiệm được bồ trí theo sơ đồ tóm tắt quy trình ở Hình 3.1.

Cay ria 2 dong vi khuẩn đượcchon trên môi trường TSA

Cay điểm

| | |

[ Môi trường khoáng [ Môi trường khoáng I Môi trường khoáng bố )

bồ sung 100 ppm bồ sung 200 ppm sung 300 ppm PBZ⁄

3.3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến vòng phân giải của các chủng vikhuẩn ở nồng độ PBZ thích hop

Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến vòng phân giải của các chủng vi khuẩn được khảo

sát ở 3 mức nhiệt độ là 30°C, 35°C, 40°C.

Tiến hành cấy ria 2 chủng vi khuẩn được chọn trên môi trường TSA, sau đó dùngque cấy điểm cấy lần lượt từng loại vi khuẩn vào từng môi trường có bổ sung PBZ vớinồng độ đã được chon từ khảo sát ở Mục 3.4.1., mỗi dia lặp lại 3 lần U trong 5 ngày,với các nhiệt độ khác nhau, tiếp theo tiễn hành nhuộm với lugol dé quan sát vòng phângiải Sau đó chọn nhiệt độ cho vòng phan giải tốt nhất

15

Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ tóm tắt quy trình ở Hình 3.2.

Cay ria 2 dong vi khuẩn đượcchọn trên môi trường TSA

Cấy điểm

Môi trường khoáng bổ sung

PBZ với nồng độ thích hợp

| | |

U ở nhiệt độ 30°C U ở nhiệt độ 35°C U ở nhiệt độ 40°C trong

trong 5 ngày trong 5 ngày 5 ngày

Vv Nhuộm lugol

[ Chọn nhiệt đủ ủ cho vòng phân giải tốt nhất

Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 2

3.3.3.3 Làm thuần và giữ giống

Cay chuyên và giữ giống trong ống thạch nghiêng hay glycerol dé bảo quản giống

được lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống.

Dùng que cấy vòng cấy chuyền các khuẩn lạc nghi ngờ qua đĩa petri chứa môitrường thạch TSA dé làm thuần Thực hiện cấy chuyền nhiều lần đến khi biểu hiện dangkhuẩn lạc đồng nhất Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn phânlập được sẽ được cat theo kiểu zic zac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm Sau

3 - 5 ngày mọc lên sẽ được đưa đi giữ ở 4°C, cấy truyền hàng tháng

16