DANH SACH CAC BANG
CHƯƠNG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
1.3 Hinh tron, ria rang cua, mau trang, khô Zeal To, ria trong, tam mau trang, am
25
Hình 4.6. Kết quả nhuộm Gram của 2 dòng vi khuẩn được chọn.
Do là các dòng vi khuẩn gram dương nên tiến hành khảo sát khả năng sinh bào tử bằng phương pháp nhuộm bao tử Schaeffer - Fulton. Các nội bào tử của vi khuẩn sẽ bắt màu xanh lá cây của malachite và các tế bao chat của vi khuẩn sẽ bat màu hồng của safranin. Kết quả 2 chủng vi khuẩn được chọn có sinh nội bào tử.
2.7
. oh °
- Hình 4.7. Két qua shai | bao tu ata 2 đồng vi khuẩn được chọn.
Các chủng vi khuẩn được đem xác định đặc điểm sinh hóa thông qua thử nghiệm catalase, oxidase và tính di động. Kết quả trình bày trong Bảng 4.3 thể hiện các đặc tính sinh lý, sinh hóa nhằm bổ sung đặc điểm cho của các chủng phân lập, làm cơ sở cho các thử nghiệm tiếp theo.
Bảng 4.6. Đặc điểm sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn
Kí hiệu chủng Oxidase Catalase Tinh di động
2.7 (+) (+) (+)
(+) dương tính; (-) âm tính.
26
4.4. Kết quả đánh giá và khảo sát khả năng chuyển hóa PBZ của các dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng
4.4.1. Sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiểu bé sung 100 ppm PBZ trong 15 ngày nuôi cấy
Sự phát triển của 2 dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng tối thiếu được bổ sung 100 ppm PBZ theo thời gian thí nghiệm được trình bày ở Hình 4.8. Nhìn chung, mật số vi khuẩn trong môi trường khoáng tăng nhanh trong giai đoạn từ ngày 0 - 3, và có dấu hiệu giảm nhẹ va dần 6n định từ ngày 3 - 9. Từ ngày 9 - 15 thì mật số vi khuẩn giảm đáng kể. Điều này cũng đồng nghĩa với việc vi khuẩn có thé sử dung nguồn carbon của PBZ dé làm nguồn dinh dưỡng dé phát triển và cũng có thê hiểu rằng nồng độ PBZ trong môi trường nuôi cấy lỏng có thé giảm đi dé phục vụ cho sự phát triển của các dòng vi khuẩn.
wee5 72
=a 6,8 =
5 6,6 Š
ac ='S Tụ 6,4
e0 —Ì 6,2Bo 5 owBq 6 gf
“8 5ã
>~ 5,6Ss
= k
2 5,4
2 0 3 6 9 12 15
Thời gian nuôi cấy (Ngày)
—e—13 —=©®—=2./
Hình 4.8. Sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường khoáng
tôi thiêu bô sung 100 ppm PBZ trong 15 ngày nuôi cây.
4.4.2. Nong độ PBZ trong môi trường nuôi cấy lỏng vào ngày 0 và ngày 15
Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải PBZ trong môi trường khoáng tối thiểu bổ sung 100 ppm PBZ của chủng vi khuẩn 1.3 trong 15 ngay nuôi cấy được trình bày ở Hình 4.9. Kết quả cho thấy khả năng phân giải PBZ của chủng 1.3 khoảng 15%,
điều đó cho thấy vi khuẩn trong đất trồng xoài, sầu riêng có sử dụng PBZ thường xuyên có khả năng phân giải PBZ và có thé sử dụng PBZ làm nguồn dinh dưỡng.
27
Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng phân giải PBZ trong môi trường khoáng tối thiểu bổ sung 100 ppm PBZ của chúng vi khuẩn 1.3 trong 15 ngày nuôi cấy được trình bảy ở Hình 4.10. Kết quả cho thấy chủng 2.7 chưa làm giảm được nồng độ PBZ trong môi trường nuôi cấy lỏng so với ban đầu. Kết quả trên có thé do số ngày dé chủng 2.7
có khả năng phân giải PBZ là trên 15 ngày.
| a) : b)
\
ph... SS. `
8 L3 8 rn"
thôn ki
Hình 4.9. Sắc kí đồ thé hiện nồng độ PBZ của chủng 1.3. a) Ngày 0; b) Ngày 15
| | ủ | |
| 3 tị
1s j }| |
|
|
Hình 4.10. Sắc ki đồ thé hiện nồng độ PBZ của chủng 2.7. a) Ngày 0; b) Ngày 15
4.5. Kết quả định danh
Hai chủng vi khuẩn 1.3 và 2.7 được gửi định danh ở Viện sinh học phân tử Loci với 2 cặp moi: 27-F: 5” AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ và 1492-R: 5’
GGTTACCTTGTTACGACTT 3' (Piterina va ctv, 2010) và so sánh kết quả trên ngân hang gen NCBI bang phần mềm blastn được xác định là Bacillus velezensis va Bacillus stercoris với độ tương đồng lần lượt là 99,51% và 99,93%.
28
Hình 4.11. Kết quả Blast của chủng vi
SƠ Name SE. viec eee cans pe ae Accession
vy, vy v v v
Bacillus velezensis 2588 2588 100% 0.0 99.51% 1445 NR_ 116240. |
Bacillus velezensis 2582 2582 100% 0.0 99.44% 1550 NR_075005.2 | Bacillus subtilis subsp. subtilis 2577 2577 100% 0.0 99.37% 1550 NR_102783.2 | Bacillus amyloliquefaciens 2577 2577 100% 00 99.37% 1472 NR 041455.1 Bacillus amyloliquefaciens 2573 2573 100% 0.0 99.30% 1475 NR_112685.1 |
Bacillus amyloliquefaciens 2571 2571 100% 0.0 99.30% 1468 NR_116022.1 |
Bacillus vallismortis 2571 2571 100% 0.0 99.30% 1530 NR_024696.1 |
Bacillus amyloliquefaciens 2569 2569 99% 0.0 99.37% 1448 NR_117946.1 |
Bacillus tequilensis 2569 2569 100% 0.0 99.30% 1456 NR_104919.1 | Bacillus vallismortis 2567 2567 100% 0.0 99.23% 1475 NR_113994.1 |
Bacillus stercoris 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1455 NR_181952.1 |
Bacillus nakamurai 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1508 NR_151897.1 | Bacillus subtilis 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1472 NR_113265.1 | Bacillus subtilis 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1475
Bacillus siamensis KCTC 13613 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1525 4 Bacillus subtilis 2566 2566 100% 0.0 99.23% 1517
Bacillus stercoris 2560 2560 100% 00 99.16% 1508 NR_180796.1 2560 2560 100%. 0.0 99.16% 1550 NR 1804191.
khuân 1.3.
Si Name ee = oe = bo in Accession
vv v ằv vv vv `.
Bacillus stercoris 2614 2614 100% 0.0 99.93% 1455 NR 181952.1 Bacillus subtilis 2614 2614 100% 0.0 99.93% 1472 NR_113265.1 Bacillus subtilis 2614 2614 100% 0.0 99.93% 1475 NR_112629.1 Bacillus subtilis 2614 2614 100% 0.0 99.93% 1517 NR_027552.1 Bacillus tequilensis 2612 2612 99% 0.0 99.93% 1456 NR_104919.1 Bacillus cabrialesii 2608 2608 100% 0.0 99.86% 1550 NR_180419.1 Bacillus subtilis 2608 2608 100% 0.0 99.86% 1550 NR_112116.2 Bacillus inaquosorum 2608 2608 100% 0.0 99.86% 1538 NR 104873.1 Bacillus subtilis 2608 2608 100% 0.0 99.86% 1468 NR 116017 Bacillus rugosus 2603 2603 100% 0.0 99.79% 1548 NR 181236.1 Bacillus subtilis subsp. subtilis 2603 2603 100% 0.0 99.79% 1550 NR_102783.2 Bacillus spizizenii 2603 2603 100% 0.0 99.79% 1475 NR_112686.1 Bacillus stercoris 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1508 NR_180796.
Bacillus halotolerans 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1468 NR 11593 Bacillus halotolerans 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1468 NR_115930.1 Bacillus halotolerans 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1468 NR_115929.1 Bacillus halotolerans 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1545 NR 115063.1 Bacillus mojavensis 2597 2597 100% 0.0 99.72% 1475 NR_112725.1
29
Hình 4.12. Kết qua Blast của chủng vi khuẩn 2.7.
46
64
78 51
59
52
42
61
39
NR 102783.2'56-1477 Bacillus subtilis subsp. subtilis strain 168
NR 104919. 1:36-1455 Bacillus tequilensis strain 10b
NR 024696. 1:44-1465 Bacillus vallismortis strain DSM 11031
NR 113994.1:29-1450 Bacillus vallismortis strain NBRC 101236
NR 075005.2:56-1477 Bacillus velezensis strain FZB42
13
NR 116240.1:17-1439 Bacillus velezensis strain CBMB205
NR 041455. 1:29-1450 Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535
NR 117946.1:31-1448 Bacillus amyloliquefaciens strain MPA 1034
NR 112685 1:29-1450 Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC 15535
NR 116022.1:27-1448 Bacillus amyloliquefaciens strain BCRC 11601
NR 024570.1 Escherichia coli
Hình 4.13. Cây phat sinh chủng loại của chủng vi khuẩn 1.3.
53
5 97
84 NR 181952.1 Bacillus stercoris strain D7XPN1
71
77
NR 104919.1 Bacillus tequilensis strain 10b
NR 113265.1 Bacillus subtilis strain JCM 1465
NR 112629.1 Bacillus subtilis strain NBRC 13719
73
55
NR 027552.1 Bacillus subtilis strain DSM 10
NR 180419.1 Bacillus cabrialesii strain TE3
NR 180796.1 Bacillus stercoris strain JCM 30051
NR 104873.1 Bacillus inaquosorum strain BGSC 3A28
NR 026078.1 Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071
Hình 4.14. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn 2.7.
4.6. Thảo luận
Từ 10 mẫu đất trồng cây ăn quả tại tỉnh An Giang và Tiền Giang đã phân lập được 20 chủng vi khuẩn. Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lac, màu sắc, cùng với kết quả nhuộm gram đều là hình que, gram dương và sinh bao tử. Thí nghiệm kiểm tra kha năng phân giải PBZ của 20 chủng vi khuẩn này trên môi trường khoáng có bổ sung PBZ cho
30
thấy có bảy chủng vi khuẩn có khả năng phân giải PBZ, với kết quả đo vòng phân giải lần lượt là 1.3 (3,03 em), 2.7 (2,37 em), 3.1 (2,03 cm), 1.1 (0,90 cm), 2.5 (1,37 cm), 5.8 (0,67 cm). Dựa vào kết quả đó cho thấy hai chủng vi khuẩn có vòng phân giải lớn hơn
các chung còn lại là 1.3 (3,03 cm), 2.7 (2,37 cm).
Khao sát khả năng phân giải PBZ trên thạch đĩa ở môi trường khoáng bồ sung 100 ppm PBZ thì các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tốt hon ở các nồng độ 200 ppm
và 300 ppm. Khảo sát khả nang phân giải PBZ trên thạch đĩa ở môi trường khoáng có
bồ sung 100 ppm và ủ nhiệt độ 30°C thì cho vòng phân giải tốt hơn các nhiệt độ còn lại, do vậy nên chọn môi trường khoáng bồ sung 100 ppm PBZ và ủ ở 30°C để làm các khảo sát tiếp theo.
Kết quả khảo sát sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy lỏng môi trường khoáng bồ sung 100 ppm PBZ trong 15 ngày thì thu nhận được kết quả là mật số của các chủng vi khuẩn tăng từ ngày 0 - 3 và giảm từ ngày 9 - 15 cũng tương đồng với nghiên cứu của Đặng Phạm Thu Thảo và ctv (2014). Trên môi trường khoáng bồ sung 15 pmm PBZ trong 15 ngày, sự phát triển của các chủng vi khuẩn tăng từ ngày 0 - 6, và giảm từ ngày 9 - 15. Điều đó cho thấy hai chủng vi khuẩn được chọn có khả năng phát triển trong môi trường khoáng bổ sung PBZ với các nồng độ cao hơn.
Kết quả nồng độ PBZ trong môi trường nuôi cấy lỏng môi trường khoáng bổ sung 100 ppm PBZ ngày 0 và ngày 15 của chủng 1.3 cho thấy nồng độ PBZ giảm 15% so với nồng độ ban đầu. Trong nghiên cứu của Đặng Phạm Thu Thảo và ctv (2014) thì phần trăm phân giải PBZ không quá chênh lệch, phần trăm phân giải cao nhất của nghiên cứu là 16,41% với nồng độ PBZ là 15 ppm trong 15 ngày. Theo Pham và ctv (2023), sau 30 ngày, hàm lượng paclobutrazol bị vi khuẩn này phân hủy lần lượt là 36,51%, 36,23%, 34,19% và 33,56% ở nồng độ ban dau là 60 ppm. Từ đó cũng có thé thấy rằng ching 1.3 có khả năng phân giải ở nồng độ cao hơn trong cùng thời gian mà vẫn cho kết quả khá tương đồng so với nghiên cứu của Đặng Phạm Thu Thảo và ctv (2014). Có thể dựa vào nghiên cứu của Pham va ctv (2023) dé có thé tăng thời gian nuôi cấy dé khảo sát thêm về nồng độ PBZ ở ngày 30, 40. Kết quả nồng độ PBZ trong môi trường nuôi cay lỏng môi trường khoáng bổ sung 100 ppm PBZ ngày 0 và ngày 15 của chủng 2.7 cho thấy nồng độ PBZ không giảm, có thé do thời gian 15 chưa đủ dé chủng 2.7 có thé phân giải được PBZ, cần thêm thời gian khảo sát.
31
Hai chủng vi khuẩn 1.3 và 2.7 được gửi định danh và so sánh kết quả trên ngân hàng gen NCBI bang phần mềm blastn được xác định là Bacillus velezensis và Bacillus stercoris với độ tương đồng lần lượt là 99,51% và 99,93%.
Nhìn chung kết quả nghiên nghiên cứu đã chọn được chủng vi khuẩn Bacillus velezensis có khả năng phân giải PBZ tốt. Tuy nhiên chủng Bacillus stercoris thì cần phải khảo sát thêm về thời gian phân giải PBZ để có được kết quả chính xác nhất. Nghiên cứu này cũng cần khảo sát thêm các điều kiện môi trường khác có khả năng ảnh hưởng đến sự phân giải PBZ. Đề tài này thực hiện nhằm tìm ra chủng vi khuan mới với kha năng phân giải PBZ mạnh đề ứng dụng trong xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp, tăng sự đa dạng của các chế phẩm phân giải PBZ trên thị trường hiện nay.
32