DANH SACH CAC BANG
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại phòng VI sinh RIBE 212, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học - Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, từ tháng 03/2023 đến tháng 07/2023
3.2. Vat liéu
3.2.1. Mẫu thí nghiệm
Các dòng vi khuẩn được phân lập từ mẫu đất được thu thập từ các vùng trồng cây ăn quả cụ thé là xoài và sầu riêng ở tỉnh An Giang và Tiền Giang. Vị trí lay mẫu cụ thé được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bang 3.1. Địa điểm lay mẫu đất
Kí hiệu mẫu Địa điêm lây mẫu Đất trồng cây XI Vĩnh Xương, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài X2 Vĩnh Xương, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài X3 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài X4 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Dat trồng xoài X5 Phú Lộc, Tân Châu, An Giang Đất trồng xoài SRI Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêng SR2 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêng SR3 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêng SR4 Tân Thanh, Cái Bè, Tiền Giang Đất trồng sầu riêng SR5 Tan Thanh, Cai Bé, Tién Giang Đất trồng sầu riêng
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị: tủ cấy vi sinh vô trùng, nồi hấp khử trùng, máy ly tâm, cân điện tử, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi, máy do quang phổ, microware, máy do pH, máy do độ am, may khuấy từ, máy nuôi cay lắc.
Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, các loại que cấy, micropipette (100 uL, 1000 uL), pipette thủy tinh, cốc thủy tinh, ống falcon (15 mL, 50 mL), cá từ, ống đong,
12
túi mlon, màng bọc thực phẩm, bút ghi mẫu, giấy lọc và một số dụng cụ cơ bản của
phòng thí nghiệm.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp thu mẫu
Mẫu đất được thu thập là mẫu đất trồng xoài và sầu riêng tại tỉnh An Giang và Tiền
Giang.
Gat bỏ lớp bã thực vật trên mặt (nếu có) sau đó dùng xẻng nhỏ lấy khoảng 0,5 kg dat. Vị trí lay mẫu ở độ sâu 0 - 30 cm.
Mẫu được bảo quản trong túi kín, ghi tên mẫu, ngày lấy mẫu trên. Mẫu được đưa về phòng thí nghiệm dùng để phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4°C.
3.3.2. Phương pháp phân lập các dòng vi khuẩn có kha năng phân giải PBZ
3.3.2.1. Phan lập
Các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa paclobutrazol được tăng sinh trong
môi trường khoáng được thực hiện bằng cách: chuẩn bị 25 mL môi trường khoáng có chứa 18 ppm PBZ trong bình đã tiệt trùng và cho 1 g mẫu đất khô có chứa vi khuẩn vao.
Môi trường khoáng có công thức trong | lít như sau: 1 g NaCl; 0,5 g NHuCl; 0,935 g MegCh; 0,015 g CaCl;; 0,49 g K;HPO¿ và 0,375 g KH¿zPO¿ (Chen va ctv, 2010). Môi
trường được hap khử trùng ở 121°C, 20 phút trước khi sử dụng. Các bình nuôi cay được đặt trên máy lắc với tốc độ 90 rpm (nhằm tao kha nang trao đổi oxy tốt cho dung dịch) ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối.
Sau 15 ngày, hút 1 mL dung dịch khuẩn ở bình nuôi cấy đầu tiên vào bình chứa 24 mL môi trường khoáng có chứa 18 ppm PBZ, tiếp tục nuôi trên mấy lắc trong vào 15 ngày. Quy trình sẽ được lặp lại liên tục 3 lần.
Sau 3 lần nuôi cấy thì bắt đầu tách ròng và làm thuần trên môi trường TSA (gồm 30 g Tryptone soya broth và 20 g agar cho 1 lít nước cat).
3.3.2.2. Dinh tinh kha năng phân giải PBZ bang phương pháp cấy điểm
Mục đích: xác định khả năng phân giải PBZ của các dong vi khuẩn phân lập.
Sử dụng phương cấy cham điềm các khuẩn lạc lên môi trường PBZ 100 ppm và ủ.
Sau 5 ngày, cho lugol lên để quan sát vòng phân giải. Nếu thuốc thử lugol không bắt màu quanh khuẩn lạc tức là khuẩn có khả năng phân giải. Sau đó tiến hành đo vòng phân giải. Từ đó có thê kết luận được rằng các đòng vi khuẩn có khả năng phân giải PBZ hay không. Khả năng phân giải được đánh giá bằng cách đo độ lớn của dòng phân giải.
13
Công thức tính độ lớn vòng phân giải:
A=D-d trong đó:
A: độ lớn vòng phân giải (cm) D: đường kính vòng phân giải (cm)
d: đường kính khuẩn lạc (em)
Chọn các chủng có vòng phân giải lớn nhất dé làm tiếp các khảo sát tiếp theo.
3.3.3. Khảo sát các điều kiện phân giải PBZ trên thạch đĩa
3.3.3.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ PBZ đến vòng phân giải của các chủng vi khuẩn
Ảnh hưởng của nồng độ PBZ đến vòng phân giải của các chủng vi khuân được khảo sát trên môi trường khoáng bổ sung 100 ppm, 200 ppm và 300 ppm PBZ.
Tiến hành cấy ria 2 chủng vi khuẩn được chọn trên môi trường TSA, sau đó dùng que cấy điểm cấy lần lượt từng loại vi khuẩn vào từng môi trường có bổ sung PBZ với nồng độ khác nhau, mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Ủ trong 5 ngày, tiếp theo tiễn hành nhuộm với lugol dé quan sát vòng phân giải. Sau đó chon nồng độ PBZ có vòng phân giải tốt nhất dé làm các khảo sát tiếp theo.
14
Thí nghiệm được bồ trí theo sơ đồ tóm tắt quy trình ở Hình 3.1.
Cay ria 2 dong vi khuẩn được
chon trên môi trường TSA
Cay điểm
| | |
[ Môi trường khoáng [ Môi trường khoáng I Môi trường khoáng bố )
bồ sung 100 ppm bồ sung 200 ppm sung 300 ppm PBZ⁄
Ỷ
| Ủ 5 ngày
Ỷ
[ Nhuộm lugol |
v
Chọn nồng độ PBZ có vòng phân giải tốt Hình 3.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 1.
3.3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến vòng phân giải của các chủng vi khuẩn ở nồng độ PBZ thích hop
Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến vòng phân giải của các chủng vi khuẩn được khảo
sát ở 3 mức nhiệt độ là 30°C, 35°C, 40°C.
Tiến hành cấy ria 2 chủng vi khuẩn được chọn trên môi trường TSA, sau đó dùng que cấy điểm cấy lần lượt từng loại vi khuẩn vào từng môi trường có bổ sung PBZ với nồng độ đã được chon từ khảo sát ở Mục 3.4.1., mỗi dia lặp lại 3 lần. U trong 5 ngày, với các nhiệt độ khác nhau, tiếp theo tiễn hành nhuộm với lugol dé quan sát vòng phân giải. Sau đó chọn nhiệt độ cho vòng phan giải tốt nhất.
15
Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ tóm tắt quy trình ở Hình 3.2.
Cay ria 2 dong vi khuẩn được
chọn trên môi trường TSA
Cấy điểm
Môi trường khoáng bổ sung PBZ với nồng độ thích hợp
| | |
U ở nhiệt độ 30°C U ở nhiệt độ 35°C U ở nhiệt độ 40°C trong
trong 5 ngày trong 5 ngày 5 ngày
Vv
Nhuộm lugol
[ Chọn nhiệt đủ ủ cho vòng phân giải tốt nhất
Hình 3.2. Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm 2.
3.3.3.3. Làm thuần và giữ giống
Cay chuyên và giữ giống trong ống thạch nghiêng hay glycerol dé bảo quản giống
được lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống.
Dùng que cấy vòng cấy chuyền các khuẩn lạc nghi ngờ qua đĩa petri chứa môi trường thạch TSA dé làm thuần. Thực hiện cấy chuyền nhiều lần đến khi biểu hiện dang khuẩn lạc đồng nhất. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn phân lập được sẽ được cat theo kiểu zic zac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống nghiệm. Sau 3 - 5 ngày mọc lên sẽ được đưa đi giữ ở 4°C, cấy truyền hàng tháng.
16
Giữ giống trong glycerol: giữ giống trong dung dich glycerol 20% có bổ sung pepton 1% để giữ đông ở nhiệt độ -20°C. Giữ giống theo cách này có thể gữ được lâu hơn và cần được hoạt hóa lại trước khi nhân giống.
3.3.4. Khảo sát đặc điểm hình thái chủng được chọn
3.3.4.1. Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn được chọn
Cay ria các chủng vi khuẩn được chọn trên môi trường TSA dé quan sát các đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn: hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc.
3.3.4.2. Nhuộm gram
Mục đích: phân biệt dong vi khuẩn gram âm hay gram dương, cho phép ta quan sát hình thái tế bảo.
Các bước thực hiện: nhỏ 1 giọt nước cat vô trùng lên giữa lam kính. Dùng que cấy đã khử trùng lấy ít sinh khối vi khuan, trải đều lên lam kính, cố định mau bằng cách ho trên ngọn lửa đèn cồn. Đầu tiên nhỏ 1 đến 2 giọt dung dich crystal violet, dé khoảng 30 giây đến 1 phút sau đó rửa lại bang nước cất vô trùng. Bước này sẽ giúp nhuộm tat cả vi khuẩn thành màu tim đen. Tiếp theo nhỏ 1 đến 2 giọt dung dịch lugol để có định mau, cũng dé khoảng 30 giây đến 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng. Rửa cồn khoảng 30 giây và rửa lại nước. Cuối cùng nhỏ 1 đến 2 giọt dung địch đỏ safranin để khoảng 30 giây đến 1 phút rồi rửa nước cất vô trùng, bước này giúp các vi khuẩn đã bị tây hết màu tím bắt lại màu hồng, những vi khuẩn đã bắt màu tím sẽ không bị ảnh hưởng. Đề ráo nước, quan sát dưới kính hién vi ở độ phóng đại 100X dưới vật kính soi dầu và ghi nhận kết quả
Kết quả: mẫu có màu tím là gram đương, mẫu có màu hồng là gram âm.
3.3.4.3. Nhuộm nội bào tử
Mục đích: phân biệt vi khuẩn hình thành nội bào tử và không hình thành nội bảo tử.
Làm sạch và tạo tiêu bản mẫu trên lam kính sử dụng kỹ thuật vô khuẩn. Làm khô trong không khí và sử dụng có định vi khuẩn trên lam bằng nhiệt, phủ một miếng giấy thâm hoặc giấy ăn cắt vừa với lam kính. Làm âm hoàn toàn giấy thấm với thuốc nhuộm malachite green va hap trong năm phút, giữ 4m giấy và thêm thuốc nhuộm khi cần.
Ngoài ra có thé hap lam kính trong bình nước sôi. Rửa lam kính trên vòi nước máy.
Nhuộm tương phản với 0,5% safranin trong 30 giây. Rửa với nước vòi, thấm khô.
Kiểm tra lam kính dưới kính hiển vi dé xem sự có mặt của nội bao tử. Nội bào tử có màu xanh sáng và các tế bào hoạt động có màu đỏ nâu tới hồng.
17
3.3.4.4. Catalase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
Giống vi khuẩn và thuốc thử: vi khuân kiểm tra sẽ được nuôi trên môi trường thạch đến khi phát triển thành khuẩn lạc. Dùng que cấy lay khuẩn lạc từ môi trường nuôi cấy đặt lên lam kính sạch. Sau đó sử dụng thuốc thử là: HạOa 30% nhỏ vào dé kiểm tra hoạt
tính catalase. Quan sát qua 1 - 2 giây. Phan ứng (+) sẽ tạo bọt khí, ngược lại phản ứng (-) sẽ không tạo bọt khí.
3.3.4.5. Oxidase
Mục đích: xác định vi khuẩn sinh cytochrome c oxidase.
Lấy giấy loc đã ngâm với chất nền dihydrochloride tetramethyl-p-phenylenediamine, làm 4m giấy bằng nước cất vô trùng. Chọn khuẩn lạc dé được thử nghiệm bang que cấy gỗ hoặc bach kim và bôi trong giấy lọc. Quan sát vùng giây được cấy xem sự thay đôi
màu thành xanh đậm hoặc tím trong vòng 10 - 30 giây. Khi hiện diện, cytochrome c
oxidase oxy hóa thuốc thử (tetramethyl-p-phenylenediamine) thành (indophenol) sản phẩm có màu tím. Khi không có enzyme, thuốc thử bị khử và không màu.
3.3.4.6. Tính di động
Mục đích: thử nghiệm tính di động dé xác định xem một vi sinh vật có khả năng
đi động hay không.
Phương pháp thử:
Môi trường: môi trường thạch mềm (với nồng độ thạch thường dùng là 4-5 g/1).
Rot môi trường vào ống nghiệm (5 mL/éng), hap 121°C 15 phút. Bảo quản ở 4- 10°C. Dùng que cấy đâm lấy khuẩn lạc từ môi trường KIA đã ủ 18-24 giờ cấy. Sau đó, đâm xuyên vào tâm môi trường trong ống nghiệm tới độ sâu khoảng 2 em. Ủ môi trường ở 37°C trong 24 - 48 giờ, nếu âm tính ủ tiếp ở 21 - 25°C trong 5 ngày.
Chú ý: nhiệt độ ủ là yếu tổ cực kỳ quan trọng vì nhiều vi sinh vật di động ở 15 - 25°C. Nhưng không di động ở nhiệt độ 37°C là nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của
chúng.
Kết quả: dương tính (đi động) vi sinh vật di động rời khỏi đường cấy phân tán vào môi trường và làm đục môi trường. Có thể có những nhánh mờ như rễ phụ tỏa ra do vi sinh vật phát triển. Âm tính (không di động) vi sinh vật chỉ phát triển đọc theo đường cấy, môi trường xung quanh vẫn trong.
18
3.3.5. Phương pháp đánh giá và khảo sát kha năng chuyển hóa PBZ của các dòng vi khuẩn trong môi trường khoáng
Chọn ra 2 dòng vi khuẩn trong số các dòng vi khuẩn phân lập được từ qui trình phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng chuyên hóa PBZ. Các dòng vi khuan được chọn được bố trí thí nghiệm trong môi trường khoáng nhằm đánh giá và kiểm tra khả năng chuyên hóa PBZ. Cac dòng được chọn là những dòng có độ lớn vòng phân giải to và có hình thái khuẩn lạc khác nhau.
Theo Đặng Pham Thu Thảo va ctv, 2014, nhân mật s6 các dong vi khuẩn được chọn trong 50 mL dung dịch giàu dinh dưỡng GYM tiệt trùng trong 3 ngày trên máy lắc (công thức trong 1 lít gồm 10 g glucose và 10 g yeast extract). Chuyển toàn bộ sinh khối thu được vào ống Falcon và ly tâm trong 10 phút với tốc độ 10000 rpm. Sau ly tâm, loại bỏ phần nước phía trên tiếp tục cho 40 mL nước khử khoáng vào và votex 2 phút nhằm hòa tan sinh khối vi khuẩn, sau đó ly tâm. Các bước được lặp lại 3 lần nhằm loại bỏ nguồn carbon còn
sót lại trong môi trường dung dịch giàu dinh dưỡng GYM. Sau đó, hiệu chỉnh độ đục của
dung dịch chứa vi khuẩn và nước khử khoáng bằng máy đo quang phố về độ đục 0,7 với
bước sóng 600 nm.
Tiến hành đánh giá và so sánh khả năng chuyên hóa PBZ của các dòng vi khuẩn, chuẩn bị 9 mL môi trường khoáng và 1 mL dung dich vi khuẩn có bao gồm nước khử khoáng cho vào ống nghiệm dé nồng độ cuối cùng của PBZ là 100 ppm. Lap lại 3 lần cho mỗi dòng vi khuẩn. Các ống nghiệm được đề trên máy lắc ngang với tốc độ 130 rpm ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối. Mỗi 2 ngày, các ống nghiệm được mở nắp dé tránh việc thiếu hụt khí oxy cho vi khuẩn hô hấp (Đặng Phạm Thu Thảo và ctv, 2014).
Các chỉ tiêu cần theo dõi:
Đếm mật số vi khuẩn vào các ngày 0, 3, 6, 9, 12 và 15. Mật số vi khuẩn được đếm bằng cách: pha loãng các dung dich vi khuẩn và sau đó cấy trang trên môi trường TSA, các đĩa môi trường chứa khuẩn được ủ 3 ngày trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sau đó đếm số khuẩn lạc hiện diện.
Kiểm tra nồng độ paclobutrazol trong môi trường nuôi cấy lỏng ngày 0 và ngày 15 bằng phương pháp HPLC - PDA. Gửi mẫu ở Công ty Vietlabs (Địa chỉ: 26 Đường D1A,
KDC Trí Kiệt, P. Phước Long B, TP. Thủ Đức, TP.HCM).
19
3.3.6. Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử
Định danh chủng vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp giải trình tự gen vùng 16S, với primer 27 - F và 1492 - R. Gửi phân tích định danh chủng bằng phương pháp giải trình tự bởi Viện sinh học phân tử Loci (Dia chỉ: 1140 Pham Văn Đồng, P. Linh Đông, TP. Thủ Đức, Thành phó Hồ Chi Minh).
3.4. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được nhập va xử lý sơ bộ, tinh giá trị trung bình và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel 2016, phân tích ANOVA một nhân té các chỉ tiêu khảo sát bằng phần mềm Minitab 16, vẽ cây di truyền bằng phần mềm Mega 11.
20