Đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường: Nghiên cứu phân lập và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Ahpnd) trên tôm biển

QT6.2/KHCN1-BM21 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TƠM BIỂN Chủ nhiệm đề tài: ThS NGUYỄN THỊ TRÚC LINH Chức danh: Giảng viên Đơn vị: Khoa Nông nghiệp - Thủy sản Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 TRƯỜNG ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus, GÂY BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH (AHPND) TRÊN TÔM BIỂN Xác nhận quan chủ quản Chủ nhiệm đề tài (Ký, đóng dấu, ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Trúc Linh Trà Vinh, ngày tháng năm 2016 TÓM TẮT Đề tài thực từ tháng 12/2014 đến tháng 8/2015 với mục đích tìm chủng vi khuẩn lactic kháng với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mạnh ứng dụng chúng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp hạn chế việc sử dụng kháng sinh ni trồng thủy sản đề tài "nghiên cứu phân lập định danh dòng vi khuẩn lactic có khả ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) tơm biển" tiến hành Vi khuẩn lactic (LAB) phân lập từ nguồn khác như: (1) ruột tôm biển; (2) ruột cá rô phi (Oreochromis niloticus); (3) bùn nước ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh, Sóc Trăng Các dịng vi khuẩn LAB sàng lọc tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa sau xác định tính đối kháng với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch Thí nghiệm xác định khả kháng khuẩn bacteriocin khả chịu đựng nồng độ muối chủng vi khuẩn kháng với Vibrio parahaemolyticus tiến hành Kết phân lập từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi, bùn nước ao tơm biển tỉnh Trà Vinh Sóc Trăng sau: 30 chủng vi khuẩn lactic Trà Vinh, 25 chủng vi khuẩn lactic Sóc Trăng phân lập Kết xác định khả kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sau: tất chủng LAB phân lập có 02 chủng có khả kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus yếu với đường kính vơ trùng nhỏ 11 mm Các chủng vi khuẩn khơng thể ứng dụng phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp 40 chủng vi khuẩn lactic có khả ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus vịng vơ trùng mức trung bình (++) từ 11-16mm 13 chủng vi khuẩn cịn lại có vịng vơ khuẩn lớn (+++) từ lớn 16 mm Trong 13 chủng vừa nêu có chủng rp5.4.1 rp5.5.1 có vịng vơ khuẩn lớn tương ứng 18,2 18 mm Nghiên cứu cho thấy dòng rp5.4.1 rp5.5.1 sử dụng việc phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm biển Kết thử nghiệm khả đối kháng bacteriocin với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng vi khuẩn lactic vi khuẩn tiết acid lactic tiết bacteriocin Các chủng vi khuẩn thí nghiệm phát triển độ mặn từ 0-25‰ phát triển tốt độ mặn 5-15‰, phát triển chậm độ mặn 25‰ Tuy nhiên chủng vi khuẩn lactic TV20 phát triển mạnh độ mặn 25‰ MỤC LỤC TÓM TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LỜI CẢM ƠN PHẦN MỞ ĐẦU 10 Tính cấp thiết đề tài 10 Tổng quan nghiên cứu 11 2.1 Tổng quan tình hình ni tơm nước lợ 11 2.1.1 Trên giới 11 2.1.2 Ở Việt Nam 11 2.2 Tình hình dịch bệnh tôm nuôi 12 2.2.1 Bệnh virus động vật thủy sản 12 2.2.2 Bệnh vi khuẩn tôm 13 2.3 Sơ lược vi khuẩn lactic 23 2.4 Ứng dụng vi sinh vật hửu ích nuôi trồng thuỷ sản 28 Mục tiêu nghiên cứu 30 Đối tượng, phạm vi phương pháp nghiên cứu 30 4.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 30 4.2 Quy mô nghiên cứu 30 4.3 Phương pháp nghiên cứu 30 4.3.1 Dụng cụ hóa chất 30 4.3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 4.3.2.1 Thu mẫu bảo quản mẫu 31 4.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 32 4.4 Phương pháp xử lý số liệu 37 PHẦN NỘI DUNG 38 Chương Kết phân lập dòng vi khuẩn lactic từ nguồn khác tiêu sinh lý sinh hóa 38 1.1 Kết phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn khác 38 1.2 Sàng lọc tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 39 Chương 2: Tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus điều kiện in vitro 40 2.1 Kết xác định tính đối kháng chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn Vibrio parahemolyticus điều kiện in vitro 40 2.2 Kết xác định khả ức chế vi khuẩn Vibrio parahemolyticus vi khuẩn lactic bacteriocin 42 2.3 Thử nghiệm nồng độ muối khác ảnh hưởng lên mật số vi khuẩn lactic 43 Chương Kết định danh dòng vi khuẩn phân lập có khả kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 45 3.1 Kết định danh vi khuẩn lactic RP5.5.1 phương pháp giải trình tự gen 16s 46 3.2 Kết định danh vi khuẩn lactic RP5.4.1 phương pháp giải trình tự gen 16s 46 3.3 Kết định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 phương pháp giải trình tự gen 16s 47 3.4 Kết định danh vi khuẩn lactic RP5.2.1 T5.1 phương pháp giải trình tự gen 16s 48 PHẦN KẾT LUẬN 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 64 DANH MỤC BẢNG BIỂU Tên bảng Số trang Bảng 2.2.1 Các loại virus gây bệnh tơm biển 14 Bảng Các tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn lactic 40 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Tên biểu đồ Số trang Hình 2.2.2a Dấu hiệu tơm bị bệnh hoại tử gan tuỵ 18 Hình 2.2.2b Hình dạng vi khuẩn V Parahaemolyticus thể thực khuẩn 18 Hình 2.2.2c Hình mơ bệnh học tơm khoẻ 19 Hình 2.2.2 d Hình mơ bệnh học tơm bệnh hoại tử gan tụy 19 Hình 2.2 e Hình vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 20 Hình 1: Quy trình phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, cá rô phi, bùn đáy nước ao ni tơm biển 32 Hình 2: Quy trình xác định khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus phương pháp khuếch tán giếng thạch 34 Hình khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus 40 Hình khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus Trà Vinh 41 Hình khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus Sóc Trăng 41 Hình khả kháng khuẩn vi khuẩn lactic với V parahaemolyticus Sóc Trăng 41 Hình Kết xác định khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus bacteriocin 42 Hình Kết thử nghiệm nồng độ muối khác ảnh hưởng lên mật số vi khuẩn lactic 43 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU, ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG, TỪ NGẮN HOẶC THUẬT NGỮ AHPNS Acute Hepatapancreatic Necrosis Syndrome CFU Colony Forming Unit ĐBSCL : Đồng sông Cửu Long DNA Deoxyribo Nucleic Acid EMS Early Mortality Syndrome FAO Food and Agriculture Organization GAV Gill Associated Virus HPV Hepatopancreatic Parvovirus IHHNV Hypothermal And Hematopoietic Necrosis Virus MBV Monodon Baculovirus MRS Man Rogosa Sharpe NA Nutrient Agar OIE Office International des Epizooties PCR Polymerase Chain Reaction PL Post Larval TCBS Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar TSA Tryptone Casein Soy Agar TSB Tripticase Soya Broth TSV Taura Syndrome Virus V P : Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus WSSV White Spot Syndrome Virus YHV Yellow Head Virus LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị em đồng nghiệp, Ban Lãnh đạo Khoa Nơng nghiêp Thủy sản, Phịng Khoa học Công nghệ Ban Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh tạo điều kiện thuận lợi cấp kinh phí cho tơi thực đề tài Tơi xin trân trọng gởi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Trương Quốc Phú dành nhiều thời gian hướng dẫn, quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Chân thành cảm ơn đến PGS TS Đặng Thị Hoàng Oanh, Khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ, tạo điều kiện thuận sở vật chất dành nhiều thời gian để giúp tơi hồn thành đề tài Xin chân thành cảm ơn anh chị em Bộ môn Bệnh học Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã chia sẽ, giúp đỡ động viên suốt thời gian nghiên cứu trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè em sinh viên lớp DA11TS chia sẽ, giúp đỡ động viên suốt thời gian nghiên cứu trường Đại học Trà Vinh Xin chân thành cảm ơn! PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Việc ni tơm sú, tôm thẻ Đồng Bằng sông Cửu Long năm trước đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể góp phần vào việc phát triển kinh tế cho nước Nhưng khoảng thời gian gần (2010 -2012), nghề nuôi tôm đối mặt với nhiều thách thức, dịch bệnh, môi trường ô nhiễm tượng tôm chết hàng loạt gây thiệt hại kinh tế 800 tỷ đồng Trong đáng quan tâm hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome - AHPNS) (Flegel, 2012) hay gọi hội chứng chết sớm (early mortality syndrome – EMS) (Lightner et al., 2012) Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính xuất Trung Quốc vào năm 2009, Việt Nam vào năm 2010 đến Thái Lan Mã Lai vào năm 2011 (Lightner et al., 2012; Flegel, 2012) Bệnh xuất gây chết hàng loạt tôm nuôi Tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre Kiên Giang Bệnh xuất tôm sú tôm thẻ khoảng 10 - 45 ngày sau thả giống, tỉ lệ chết lên đến 100% ao nhiễm nặng Tác nhân gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Lightner et al., 2012) mang thể thực khuẩn (Bateriophage) (Loc Tran, et al, 2012) Hiện có nhiều biện pháp đề xuất để ngăn chặn phát triển vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng hoại tử gan tụy cấp như: dùng hóa chất diệt khuẩn, sử dụng kháng sinh, áp dụng biện pháp sinh học, Tuy nhiên, biện pháp sử dụng hóa chất, kháng sinh hiệu không cao, dễ gây nguy phát sinh nhiều loài vi khuẩn gây bệnh kháng với kháng sinh Thêm vào đó, tồn dư thuốc thực phẩm tiêu quan trọng kiểm định nhập sản phẩm nông nghiệp nhiều quốc gia giới Vì thế, cách tốt sử dụng biện pháp pháp sinh học, dùng vi khuẩn có lợi có khả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Biện pháp khơng kiểm sốt mật độ vi khuẩn gây bệnh mà đảm bảo an tồn vệ sinh thực phẩm có lợi cho mơi trường sử dụng lồi vi khuẩn hữu ích Vi khuẩn lactic ứng dụng rộng rãi ngày phổ biến việc sản xuất chế phẩm sinh học, bổ sung thức ăn động vật thủy sản, thức ăn chăn nuôi việc bón vào ao ni để ức chế lồi vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản Trong nghiên cứu lồi vi khuẩn hữu ích có số dịng vi khuẩn tiết chất ức chế đề kháng lại với vi khuẩn khác Lactobacillus sp kháng lại vi khuẩn Vibrio sp (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả kháng mạnh Escherichia coli Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu ctv, 2010) Trong trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid hữu cơ, chúng ức chế vi khuẩn gây bệnh tác động lên tế bào chất vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức bảo vệ màng tế bào (Fooks et al., 1999; Jay, 2000; 10 ... ĐẠI HỌC TRÀ VINH HỘI ĐỒNG KHOA HỌC ISO 9001 : 2008 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC DÒNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ VI KHUẨN... tử gan tụy cấp hạn chế vi? ??c sử dụng kháng sinh ni trồng thủy sản đề tài "nghiên cứu phân lập định danh dịng vi khuẩn lactic có khả ức chế vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan. .. chủng vi khuẩn lactic Trà Vinh, 25 chủng vi khuẩn lactic Sóc Trăng phân lập Kết xác định khả kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus sau: tất chủng LAB phân lập có 02 chủng có khả kháng vi khuẩn Vibrio