Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas spp. chịu mặn có khả năng chuyển hóa lân từ đất canh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre

Nhưng vì thực vật không có quá trình đó trong hệ thống rễ nêngiảm khả năng hấp thụ phytase - P từ đất Singh và Satyanarayana, 2011; Mohsin vàctv, 2017 nên cây trồng cần có sự phân giải c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ;

TRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP, TUYẾN CHON VI KHUAN Pseudomonas spp.

CHIU MAN CO KHA NANG CHUYEN HOA LAN

TU DAT CANH TAC NONG NGHIEP

TINH BEN TRE

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : MAI THỊ HUYỆN TRANG

Mã số sinh viên : 19126193

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thú Đức, 09/2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, TUYẾN CHON VI KHUAN Pseudomonas spp.

CHIU MAN CO KHA NANG CHUYEN HOA LAN

TU DAT CANH TAC NONG NGHIEP

TINH BEN TRE

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG MAI THỊ HUYEN TRANG

ThS LÊ PHUGC THO

TP Thi Đức, 09/2023

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm Thành

phố Hồ Chí Minh, ngoài sự né lực của bản thân tôi còn nhận được sự giảng dạy và chỉ

bảo nhiệt tình của quý Thầy Cô, đặc biệt là quý Thầy Cô Khoa Khoa Học Sinh Học đãtạo cơ hội cho tôi được học tập, rèn luyện Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu, quý thầy cô Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

và Khoa Khoa học Sinh học đã tận tình chỉ dẫn, giảng dạy những kiến thức và kinhnghiệm trong thời gian ở trường, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học hỏi và hoànthành tốt đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trương Phước Thiên Hoàng và

ThS Lê Phước Thọ đã tạo điều kiện, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt

quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến KS Võ TrầnQuốc Thắng cùng tập thê các bạn sinh viên phòng Vi sinh Ứng dụng đã động viên, chia

sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận.

Sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã luôn là chỗ dựa tinh

thần vững chắc, động viên tôi hoàn thành đề tài của mình.

Xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Tôi tên Mai Thị Huyền Trang, MSSV: 19126193, Lớp: DH19SHB (Số di động:

0962753306, Email: 19126193(@st.hemuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt

nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày 07 tháng 09 năm 2023

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

Mai Thị Huyền Trang

TÓM TẮT

Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩnPseudomonas spp chịu được ở nồng độ muối cao, có khả năng phân giải lân vô cơ vớihiệu suất cao và sinh tổng hợp phytase từ đất canh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre Từ 10mau dat tiến hành phân lập trên môi trường King B agar có bổ sung 1% NaCI nhằm loại

bỏ những chủng vi khuẩn chịu mặn yếu, chọn lọc các chủng có khả năng phát huỳnh

quang dưới đèn UV bước sóng 366 nm được 10 chủng nghi ngờ Đánh giá khả năng

chịu mặn của các chủng vi khuẩn phân lập được ở các nồng độ muối 3%, 4%, 5%, 6%,7% Khả năng phân giải lân sẽ được xác định bằng sự xuất hiện của vòng phân giải trên

môi trường PVK xung quanh khuẩn lạc, có 8 chủng có khả năng phân giải và 2 chủng

có vòng phân giải mạnh nhất T3 và T6 Tiếp tục xác định hàm lượng phospho bang

phương pháp trắc phố dùng amoni molipdat theo TCVN 6202:1996 sau 96 giờ nuôi cấy,chủng T3 phân giải cao nhất với 76,42 mg/L tương ứng hiệu suất 10,19% Tất cả các

chủng vi khuẩn đều không có khả năng sinh tổng hợp phytase do không xuất hiện vòngphân giải trên môi trường PSM Kết quả định danh sinh học phân tử đã xác định chủngT3 thuộc loài Pseudomonas aeruginosa với mức độ tương đồng 100% trình tự thamchiếu NR 114471.1

Từ khóa: Pseudomonas spp chịu mặn, chuyên hóa lân, phytase

il

The research aimed to isolate and select Pseudomonas spp tolerant to high salt concentrations, capable of decomposing inorganic phosphorus with high efficiency and biosynthesis phytase from agricultural land in Ben Tre province From 10 soil samples, isolates were carried out on King B agar medium supplemented with 1% NaCl to eliminate weakly salt-tolerant bacterial strains, selected strains capable of fluorescing under UV light at 366 nm wavelength were suspected by 10 strains Evaluation of salt tolerance of bacterial strains isolated at salt concentrations of 3%, 4%, 5%, 6%, 7% Phosphorus degradation ability will be determined by the appearance of a degrading ring

on the PVK medium around the colony, there are 8 strains with the ability to degrade and 2 strains with the strongest degrading rings T3 and T6 Continuing to determine phosphorus content by a spectrometric method using ammonium molybdate according

to TCVN 6202:1996 after 96 hours of culture, strain T3 had the highest resolution with 76.42 mg/L, equivalent to 10.19% yield All bacterial strains were not able to biosynthesize phytase due to the absence of a lysis cycle on the PSM medium The

results of molecular biological identification identified strain T3 belonging to

Pseudomonas aeruginosa species with 100% similarity of reference sequence NR 114471.1.

Keywords: Pseudomonas spp., salt tolerance, phosphorus metabolism, phytase.

MỤC LỤC

Trang

XÁC NHAN VA CAM ĐOAN 5-2221 1221221121211212112122112121212121 re ii

TY XỈCTinnninnuuaainditiointingtgtintd924G10 0106140000600005001803030156109119N0I01710G8202100ã.0110/0059I2100 iii

ABS TRA GI esscsscsussseuressanesmnsensauversuansanenaienexeuacavencanenestameenssenenennuansnauancenweseenareneteaees 1V MUC LUC 2 V

123 NOI dung thực li Ctivemmsts ieee eee een ee eee eee 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIBU 0 c.ccsccssessessessessessesseescsessessessesstssesaesetssesaeeneens 32.1 Điều kiện tự nhiên va tình hình xâm nhập mặn ở tỉnh Bến Tre 3

2.1.1 Điều kiện tự nhiên 2-2-5 +S2S2E£2EEE2EE2EE2E 2121

clr TÍNH HINH SH HẬU M00 at sen nggõgghg HE GA GA 1H hUG3SGDRÄRBS40EĐNGGEGSSNIEARSUR.GHSTR-ISRNSaE2 2EA 3

2.2 Tổng quan về vi khuẩn ?s1/ÄO/101149 2-52-5252 S£2E22EE2EE2EE2EE22E22E22E2E2222zce, 42.2.1 Đặc điểm HT Of essere atest treet ee ated 42.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 22522 22E22E2E22E£EE2E22E22222225222222 4

2.3 Vi khuẩn kích thích tăng trưởng vùng rễ (PGPR) 2¿©22©222222Ez2zzzzzzzzz 52A; PHOSPDG sen s156016101606353615882358.5998553588163954305E881013904B0ASEESSESEGBS-SSSESEUQGJSGSHBISSRRHUCGSI402808/804/ 6 2:4.1 Các dang lần trong tự nhiÊH sec c0 5112211612101 106 2 11c 1430614011606 10614 661301466 6

OE Del Te ee ee a QAV.2 LAM cố vi

2.4.2 Vòng tuần hoàn phospho trong tự mhién 20.2.0 cece eececeeeceesseececseeseecseeseeeeesees 7

2.4.3 Vai trò kích thích sinh trưởng phát triển cây trồng 2- 2+sz+sz+s2zz+sz 8

9.5 Wi sinh vjt-chuyÔn hóa Teen einen serie svenepusnsensensintneineansecesocounertenis 92.5.1 Vi sinh vật chuyền hóa lân hữu cơ -2-©22522222S22E22E22E2E22E22E22E222z22z2ze2 10

2.5.2 Vi sinh vật chuyên hĩa lân vơ CO -2-©222222222222E22EE22E222E22E2EE2Excrrree 10

2.6 »yA20((80ïả 0 I1

2.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và thé giới -2- 2: 2222222z222+z2zz2zzzzxz+z 11

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong ƯỚC - . - eee + 5+ 2< *+** +2 vs re 11

3.10, Vis hình nghiên cửu thế giới «.ceeee-eechod khu gi ngggH3hghcadkĩa kg 21G0LM.G11620-220180 13CHƯỚỜNG, VAT LIM VÀNG HAT eaenesnnnnnnenennnnsdonannnoostpssssos 153.1 Thời gian và địa điểm nghiên Ctr ccc ccc esse esesesssesesessseesseeseessscsesssteeseesseeesees 15

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên CỨU - - + +25 ++S+*++*+*£+zE+zEerErrrrerrrrrrrerrke 15 Beles Vi |1€UTEHISH GỮUuaesecnserbosioelByftreostogtseolluyspsitinglLasd0s03ssiitsiPvoioiAl4 sssr2ss3EEp8g Is

3.2.2) Phone Pháp TSMEN CUU secre ascnsncncainianscieran seaveuniamen an cattioan ceiteeaaatssimnasseernenetes 15

3.2.2.1 Phân lập các chủng vi khuan Pseudomonas spp từ mau đất - 13.2.2.1 Khao sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn 2- 22225222222222z22z2z2s+2 17

3.2.2.3 Khao sat kha nang phan pial Bt wens neem mura 18

3.2.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng vi khuan 20

3.2.2.5 Định danh bằng sinh học phân tử 2: 22222222E+EE22E222E+2E222x22xzzzzrxcez 223.3 Xử lý số liệu ¿ ¿©2¿2222222212112112112112112112112112112112112112112112112112112112121 2 xe 23CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2-52 2+S++E2E2E2E22E2E2E2Exzxe2 24

4.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn sewÄO12Oï14§ -.-©22©52©5255252222222z25+2 244.2 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn - 264.3 Kết quả khảo sát khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn 28

4.3.1 Xác định khả năng phân giải lân - eee + 52252 *S<**£*E+2E+vEerrrrrrrrrerrrrree 28

4.3.2 Xác định hiệu suất phân giải phospho -2- 2+ csz+cxecrxerrxrrrxrrrsrcrxree 29

4.4 Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase 2-©2225222222222z225c2 31

4.4.1 Xác định khả năng sinh tong hop phytase -2-22-55c5ccscsezscssersc-s 3Ï

4.5 Kết quả định danh chủng 'T3 2-22©22S22E+2E2E22E22E22E22E22E225223222222222222xe2 32

4.6 Thao Wat nh

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI uo cccsecsscscessesessessesecsesseseseesvesesseeesesseseeeseees 35

57 1 EuasaasssäsraaeeeerrrtểrrttrrGGGrGrNtrrrrNrxyyiaagryaarneua 35

ee 35TÀI LIEU THAM KHAO 0 .co css csesesesssosesssesssessuessseesuesssesssesssesssessesssesssetsseesneesseensees 33

PHU LUC

DANH SÁCH CHU VIET TAT

ADD : Adenosine diphosphat

ATP : Adenosin triphosphat

PCR : Polymerase Chain Reaction

PGPR : Plant Growth Promoting Rhizobacterium

Pj : Hợp chat phospho vô cơ

Po : Hop chat phospho hitu co

PSB : Phosphate solubilizing bacteria

PSM : Phosphat Solubilizing Microorgannisms medium

Độ mặn của các mẫu đẤt, c2 2212111112111 1112111211121 re 22

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường KB 23

Kết quả nhuộm gram 22 2 22222E2EE22EE2EE2EE22EE221222122122112212212222 2e, 24Mật độ các chủng vi khuẩn trên môi trường KB có bồ sung muối 25Mật độ vi khuẩn trên môi trường KB có bổ sung muối 8% NaCI 26Hiệu suất phân giải phospho của hai chủng T3, T6 2 2552552 28

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 P aeruginosa dưới kính hiển vi điện tử UCT (SEM) scsssscssensanavnssrennssnsensscenee 4Hình 2.2 Chu trình chuyền hóa phospho trong Gat 0ccccccceceeesseessessseesseesseesseesseeeees 7Hình 4.1 Kết qua thử nghiệm Oxidase của một số chủng vi khuẩn 23Hình 4.2 Kết quả thử nghiệm Catalase của một số chủng vi khuân 23

Hình 4.3 Biéu đồ ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở các

nồng độ muối khác nhau - 22 2¿©SS22S+2EE+ÊEE2EEEEEEEEEEEEEEE2EE122E12231223122212222222 2e 24Hình 4.4 Hình ảnh vòng phân giải của các chủng vi khuẩn mọc trên môi trường PVK

Ñ HO ẦY 5 srớnáctisv80055011406081813689406916438-38g6558538B3SE8EỢNBGS48S883ãgE08g8/04GĐSGGGS033913E9E893409385ĐSBESSESGG09883303538588 26Hình 4.5 Đồ thị đường chuẩn P (mg/LL) - 2 2+S222E2EE2EE2EE2EE2EE22E221221221222222 2 xe2 37

Hình 4.6 Ching T3 và T6 nuôi cấy trong môi trường PVK lỏng - 2

Hình 4.8 Phé điện di của gen 16S rRNA của chủng T3 tuyến chọn 30Hình 4.9 Cây di truyền của chủng T3 mang gen 16S rRNA -. -=52¿ 30

IX

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Bến Tre là tỉnh trọng điểm về cây trồng thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long,

nổi tiếng bởi vùng đất phù sa trù phú, sản sinh ra vựa lúa lớn và nhiều loại nông sảnmang hiệu quả kinh tế cao Hiện nay, do bat lợi thời tiết và biến đôi khí hậu dẫn đến hệ

qua xâm nhập mặn diễn ra phức tap phá hủy cấu trúc đất, giảm kha năng phát triển cây,khiến cây bị stress mặn ảnh hưởng nhiều diện tích lúa, cây ăn quả,.v.v Dé tăng năng

suất, người nông dân đã sử dụng biện pháp hóa học nhưng việc lạm dụng phân bón vô

cơ gây ảnh hưởng xấu đến môi trường đất, nước, vi sinh vật trong đất cũng như chấtlượng nông sản làm mat cân bằng sinh thái

Lượng phospho trong đất có tới 95 - 99% ở dạng không hòa tan và kết tủa mà thực

vật không thể sử dụng theo Hayman (1975) được tồn lại phosphate hữu cơ và phosphate

vô cơ Hàm lượng phosphat trung bình ở nhiều loại đất thường từ 0,02 - 0,08% Tuynhiên, hiệu suất sử dụng phospho bởi cây trồng không quá 25%, trong khi đó một lượnglớn lại bị cô định trong dat và chuyền thành dạng khó tan, cây trồng khó có thé hap thụ

Sử dụng phân vô cơ lâu ngày với liều lượng cao sẽ làm giảm sự đa dang của quan thésinh vật đất, làm cho đất trồng dần bị thoái hóa, độ phì nhiêu của đất giảm nghiêm trọng.Bên cạnh đó phytate có nhiều trong đất ở dạng phosphate hữu cơ Giải phóng enzymephytase giúp tăng khả năng cung cấp phospho cho sự hấp thụ của cây trồng và giảmlượng sử dụng phân bón Nhưng vì thực vật không có quá trình đó trong hệ thống rễ nêngiảm khả năng hấp thụ phytase - P từ đất (Singh và Satyanarayana, 2011; Mohsin vàctv, 2017) nên cây trồng cần có sự phân giải các vi sinh vat để tạo dang dé tan hơn Việclựa chọn các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân giải lân vừa thích nghi với điều kiện

môi trường khắc nghiệt cũng là yếu tố quan trọng

Vi khuẩn vùng rễ thúc day tăng trưởng thực vật (PGPR - plant growth promoting

rhizobacterium) là các chủng từ các chi như Bacillus, Pseudomonas, Actinobacteria, Acetobacter, Azospirillum, Paenibacillus, Serratia, Burkholderia, Herbaspirillum và

Rhodococcus (Rodriguez va Fraga, 1999) Trong số đó Pseudomonas spp có kha năngchịu mặn, kích thích sinh trưởng thực vật, giảm tác động xấu tới môi trường và lượng

phân bón hóa học nhưng vẫn đảm bảo năng suất cây trồng

Vì vậy, dé tài nghiên cứu “Phân lập, tuyên chọn chủng Pseudomonas spp chịu

mặn có khả năng chuyên hóa lân từ đất canh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre” nhằm phânlập được chủng vi khuẩn bản địa chịu mặn, có khả năng phân giải lân, cải tạo đất, kíchthích cây trồng sinh trưởng phát triển tốt trên nền đất nhiễm mặn, góp phan cải thiệnhiệu quả sử dụng lân, tăng năng suất, chất lượng và ứng dụng sản xuất phân bón vi sinhhoặc bổ sung vào đất góp phan phát triển nền nông nghiệp bền vững

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyên chọn chủng vi khuan Pseudomonas chịu được ở nồng độ muốicao, có khả năng phân giải lân vô cơ với hiệu suất cao và sinh tổng hợp phytase từ đấtcanh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Pseudomonas từ đất canh tác nông nghiệp ở tỉnhBến Tre

Khao sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn phân lập được qua các nồng

độ muối khác nhau

Khảo sát khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn

Khao sát khả năng sinh tong hop phytase của các chủng vi khuẩn

Định danh bằng sinh học phân tử

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Điều kiện tự nhiên và tinh hình xâm nhập mặn ở tỉnh Bến Tre

2.1.1 Điều kiện tự nhiên

Bến Tre là tỉnh thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long, có diện tích tự nhiên là

2.360 km’, được hợp thành bởi cù lao An Hóa, cù lao Bảo, cù lao Minh va do phù sa

của 4 nhánh sông Cửu Long bồi tụ thành (sông Tiên, sông Ba Lai, sông Hàm Luông,

sông Cổ Chiên) Tỉnh Bến Tre được chia thành 9 đơn vị hành chính gồm: Thành phốBến Tre va 8 huyện: Mỏ Cay Bac, Mỏ Cay Nam, Châu Thành, Giồng Trôm, Ba Tri,Bình Đại, Chợ Lách, Thạnh Phú, với 164 xã, phường và thị tran

Nguồn tai nguyên chủ yếu và quan trọng của tinh là tài nguyên đất nông nghiệp

Năm 2010, diện tích đất nông nghiệp của tỉnh là 179.672 ha, chiếm 76,11% diện tíchđất tự nhiên, trong đó diên tích trồng cây ăn trái là 32.023 ha, với sản lượng là 318.469tan, diện tích trồng mía là 5.865 ha, sản lượng đạt 460.056 tấn, diện tích trồng cây dừa

là 51.560 ha, sản lượng đạt 420 triệu trái/năm và lớn nhất nước

2.1.2 Tình hình xâm nhập mặn

Độ mặn là một trong những trở ngại và căng thắng hàng đầu trong việc hấp thu

chất dinh đưỡng của cây, yếu tố phô biến nhất ảnh hưởng xấu đến sự phát triển và sảnlượng cây trồng

Theo báo Điện tử của Bộ Tài nguyên và Môi trường đến tháng 3/2020 xâm nhập

trên địa bàn tỉnh Bến Tre diễn biến phức tạp Độ mặn 4%o đã xâm nhập cách cửa sông

60 km; trên các tuyến sông nhánh, nội đồng, ké cả các đập tạm trữ nước đều bị nhiễmmặn trung bình trên 2%o ở hầu hết các huyện, thành phố Qua thống kê, Bến Tre hiện có

trên 5.200 ha diện tích lúa bị thiệt hại; khoảng 20.000 ha cây ăn trái, 72.000 ha dừa và

hơn 1.000 ha cây giống, hoa kiểng có nguy cơ bị ảnh hưởng; tình hình nuôi thủy sản

đang gặp khó khăn, có 722 ha diện tích nuôi tôm càng xanh bị ảnh hưởng, xảy ra hiện

tượng nghêu chết với số lượng khoảng 1.100 tan, ước thiệt hại khoảng 23 tỷ đồng

Theo Chủ tịch UBND tỉnh Bến Tre, hạn mặn của năm nay diễn biến rất phức tạp,không theo quy luật Năm 2023, ngoài xâm nhập mặn còn gắn theo triều cường, triềucường lên rất cao thì đây là tác động kép Mùa khô 2022 - 2023, nhận định xâm nhậpmặn ở mức sớm hơn trung bình nhiều năm Từ nửa cuối tháng 12 năm 2022, mặn bắt

đầu xâm nhập vào khu vực gần cửa sông Xâm nhập mặn sâu nhất ở mức xấp xi và thấp

hơn mùa khô 2021 - 2022 Độ mặn cao nhất và xâm nhập sâu nhất xuất hiện vào tháng

2 và tháng 3 năm 2023 Dự báo độ mặn 4%o có thể xâm nhập cách các cửa sông khoảng

từ 45 - 57 km; độ mặn I%o có thể xâm nhập cách cửa sông khoảng từ 54 - 68 km

Bên cạnh đó, việc lạm dụng quá nhiều phân bón vô cơ diễn ra liên tục trong nhiềunăm đã góp phan làm cho đất bị nhiễm mặn Dat bị nhiễm mặn có hàm lượng muối tancao, dẫn đến áp suất thâm thấu của dung dịch đất tăng cao, natri trao đổi ở mức độ cao,dẫn đến tính chat vật lý của đất ngày càng xấu và cũng vì vậy hàm lượng dễ tiêu củamột số chất dinh dưỡng cần thiết rất thấp

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas

2.2.1 Đặc điểm phân loại

Vi trí phân loại của chi Pseudomonas

2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh ly, sinh hóa

Theo Lương Đức Phẩm (2002), Pseudomonas là trực khuẩn gram âm, chuyên động

do có các tiên mao mọc ở một đầu Trực khuẩn có thể là hình que thăng hoặc hơi cong,không tạo bào tử và phát triển ở điều kiện hiếu khí Nhiều loại của chi này ưu lạnh, nhiệt

độ tối thiểu là - 2 °C đến 5 °C và cũng có khả năng chịu được nhiệt độ cao 35 - 38 °Cđược tìm thấy nhiều nơi trong nước, đất và các khu vực ẩm ưới

Trong môi trường phân lập đặc hiệu cho Pseudomonas là King B có chứa glycerol,

khoáng Mg?' và K2HPOu, kích thích Pseudomonas sinh ra sắc tố màu xanh, nhận điệnkhuẩn lạc màu xanh lá do sinh sắc t6 làm xanh môi trường, bắt màu huỳnh quang dướitia UV (Mansoor và ctv, 2007) Pseudomonas spp sản sinh một loạt các sắc tố có thể

tan trong nước và khuếch tán vào môi trường nuôi cấy hoặc liên kết với tế bào vi khuẩn

như pyoverdine mau vàng xanh (fluorescein) là các siderophore có vai trò sinh lý quan

trọng trong việc hấp thu Fe ở vi khuẩn Các sắc tố khác được tạo ra bởi các loài

Pseudomonas spp bao gồm pyocyanin (P aeruginosa, màu xanh da trời), pyorubin (P.

aeruginosa, màu đỏ), chlororaphin (P chlororaphis, màu xanh lục), pyomelanin (P.

aeruginosa, mau den hoặc nâu) Ngoài ra, P mendocina còn có thé tạo ra các sắc tốcarotenoid (Ramos và ctv, 2010) Các tính chat sinh hóa chính: oxidase (+); catalase (+);

di động (+); cimmons citrate (+).

P aeruginosa là trực khuẩn gram âm, hình que, chiều dai 1 - 1,55 ym, đứng mộtmình hoặc thành đôi, không sinh bảo tử, có khả năng di động nhờ một tiên mao đơn cực.

hình thành màng sinh học thường được gọi là trực khuân mủ xanh P aeruginosa có khả

năng tạo thành các khuẩn lạc có sắc tố màu lục và sinh sắc tố huỳnh quang ở 42 °C, vi

khuẩn còn sinh mùi thơm đặc trưng (giống nho chín), điều này giúp cho việc nhận biết

vi khuẩn này trên môi trường rắn trong phòng thí nghiệm theo Engleberg (2019)

Vô số Pseudomonas spp bao gồm P aeruginosa, P chlororaphis, P putida, và P

fluorescens nôi tiếng về khả năng cải thiện sự phát triển và giảm bớt nhiều loại bệnh câytrồng Chi Pseudomonas chủ yêu được sử dụng làm chế phẩm trồng trọt vì sự xuất hiệnnhiều và khả năng trao đôi chất linh hoạt của nó, giúp thúc đây tăng trưởng thực vật theo

nhiều cách như trong vùng rễ, vi khuẩn tao ra các kích thích t6 thực vật như auxin,gibberellin, axit abscisic, ethylene, và cytokinin kích thích tăng trưởng thực vật.

2.3 Vi khuẩn kích thích tăng trưởng vùng rễ (PGPR)

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant Growth PromotingRhizobacteria - PGPR) là nhóm vi khuẩn phân bố tự do trong đất trên bề mặt rễ hoặccộng sinh bên trong rễ, sống và phát triển tốt với mật số khá phong phú xung quanhvùng rễ, có khả năng thúc đây tăng trưởng thực vật thông qua việc nâng cao khả năngnảy mầm của hạt, sự phát triển của rễ, sự hấp thu nước và dinh dưỡng khoáng và đóngvai trò quan trọng trong phòng trừ các tác nhân gây bệnh, ức chế bệnh thực vật

Những vi khuẩn này tham gia vào các hoạt động của hệ sinh thái đất góp phần giúp

hệ sinh thái trở nên năng động dé chuyên hóa chất dinh dưỡng trong sản xuất nôngnghiệp PGPR kích thích sự phát triển của thực vật liên quan đến sự hình thành cấu trúccủa dat, phân hủy chất hữu cơ, tái chế các nguyên tố thiết yếu, hoà tan các chất dinhdưỡng khoáng, sản sinh các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, phân huỷ các chất ônhiễm hữu cơ, kích thích sự phát triển của rễ, kiểm soát sinh học đất và các mầm bệnhhại cây trồng, kích hoạt các cơ chế kháng stress phi sinh học (kháng hạn, kháng mặn,chống chịu nhiệt độ thấp, chống chịu với các kim loại nặng và các chất ô nhiễm khác ở

nồng độ cao) PGPR ảnh hưởng đến việc thúc đây tăng trưởng trực tiếp của thực vậtbằng cách cố định đạm trong khí quyền, hòa tan phosphate không hòa tan Kháng sinh,cạnh tranh dinh dưỡng, ký sinh, sản xuất các chất chuyển hóa (hydro cyanide,siderophores) là những cơ chế gián tiếp từ PGPR có lợi cho sự phát triển của thực vật.

Hơn nữa, ứng dụng PGPR làm giảm việc sử dụng phân hoá học và tiết kiệm vềmặt kinh tế, đem lại lợi ích môi trường và giảm chi phí sản xuất Nhiều nghiên cứu chothay PGPR là một giải pháp tiềm năng thay thé hóa chất nông nghiệp (phân bón và thuốcbảo vệ thực vật) trong việc kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

2.4 Phospho

Phospho (P) là nguyên tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố dinh dưỡng đalượng chính (N, P, K) là nguyên tố cơ bản thiết yếu chính cho sự tăng trưởng và pháttriển sinh học cây trồng

P là thành phần xây dựng nên các hợp chất quan trọng bậc nhất của tế bào như:

phosphoprotein, phospholipid, phosphoester và các vitamin (Bì, Bo) Đặc biệt P là tham

gia vào quá trình truyền năng lượng, hô hấp và quang hợp của tế bào, là thành phần quan

trọng trong quá trình trao đôi chất của thực vật cau tạo nên ATP, ADP, GTP, FAD,NADP, CoA là những phân tử trao đôi năng lượng

Lượng phospho trong đất có tới 95 - 99% ở dạng không hòa tan và kết tủa theo

Hayman (1975) Đề giải quyết vấn đề thiếu P, phân lân hóa học là nguồn cung cấp chínhđược bón thường xuyên dé đạt năng suất cây trồng tối đa Tuy nhiên, hầu hết P hòa tan

được sử dụng nhanh chóng chuyên đổi thành các phức hợp không hòa tan, dan đến việc

sử dụng lặp đi lặp lại bắt buộc, vượt qua nhu cầu của cây trồng Trong tự nhiên, câytrồng muốn hấp thu được các dạng lân khó tiêu này trong đất thường cần có sự phân giảicủa các vi sinh vật đất dé tạo ra các dạng lân dễ tan hơn

2.4.1 Các dạng lần trong tự nhiên

Phospho ton tại trong tự nhiên ở nhiều dạng hữu cơ và vô cơ, chủ yếu ở dạng vô

cơ không hòa tan hoặc hòa tan rất kém Tất cả các dạng lân hữu cơ và vô cơ này đều ở

dạng khó tiêu đối với cây trồng Phospho đi vào cây dưới dạng lân dễ tiêu là các ionPO¿ở, HPO¿?, H2PO* và dang là dang cây trồng dễ hap thu nhất Trong quá trình sảnxuất nông nghiệp, lân thường được bổ sung vào đất đưới dang phân lân hóa học nhưngtới hơn 80% lượng phân này bị có định trong đất bởi các phức hợp kim loại - cation trở

thành dạng khó tiêu hoặc bị rửa trôi.

2.4.1.1 Lân hữu cơ

Trong đất các dạng lân hữu cơ thường gặp là phytin, axit nucleic, nucleoprotein,phosoholiphosphat thường có trong các hợp chất hữu cơ, xác động vật và thực vật

Tuy nhiên cây trồng không thé hap thụ được đưới dạng hữu cơ mà chỉ có thé hapthụ lân vô cơ đưới dang hòa tan nhờ sự hiện diện vi sinh vật đất

Phytin: là muối Ca và Mg của acid phytic Trong đất những chất có cùng nhómvới phytin là inositol, inositol monophosphate, inositol triphosphate Tất cả đều cónguồn gốc thực vật Phytin và những chất có cùng họ hàng chiếm trung bình từ 40 - 80%phospho hữu cơ trong đất

Acid nucleic và nucleoprotein: trong đất đều có nguồn gốc thực vật và nhất là vi

sinh vật Hàm lượng của chúng trong đất nhỏ hơn 10%

Phospholipid: sự kết hợp giữa lipid và phosphate không nhiều có trong đất

2.4.1.2 Lân vô cơ

Lân vô cơ thường ở trong các dạng khoáng như apatit, phosphoric, phosphat sắt,phosphat nhôm Hợp chất vô cơ chứa lân chủ yếu là những muối của axit ortho-

phosphoric acid với Ca, Mg, Fe và AI.

Các hợp chat lân vô cơ được hình thành do quá trình phân giải lân hữu co (còn gọi

là quá trình khoáng hóa lân hữu cơ), phần lớn là các muối phosphate khó tan Cây trồng

không thé hấp thu được những dạng khó tan này Các hợp chất lân khó tan còn nằmtrong các chất khoáng thiên nhiên như các mỏ apatit, phosphoric Nếu không có qua

trình phân giải các hợp chất phospho khó tan biến thành dạng dễ tan thì hàm lượng

phospho tông số trong đất dẫu có nhiều cũng trở thành vô dụng

2.4.2 Vòng tuần hoàn phospho trong tự nhiên

ch ong na nh hoạt

[—casackhsoang > ntfs rei Circic (r2) eee Rion cus dat (cong)

nguyen sinh ⁄ |] chất huwu cơ tong aat Apattes P hữu cơ hoa tan > 2

Hình 2.2 Chu trình chuyên hóa phospho trong đất

Quá trình khoáng hóa là sự chuyên đổi các chất hữu cơ thành các ion lân mà câytrồng có thể hấp thu Quá trình này được thực hiện chủ yếu bằng các enzymephosphatase và phytases, tạo ra bởi vi sinh vật và rễ cây.

Quá trình có định lân là sự chuyển hóa ion lân trở lại thành các dạng hữu cơ Cácphản ứng này được xúc tác bởi vi sinh vật hoạt động trong đất và là hệ quả của các quátrình di hóa và đồng hóa của vi sinh vật dị dưỡng

Quá trình phong hóa là quá trình phá hủy đất đá và các khoáng chất, đưới tác dụngcủa thời tiết Các quá trình phong hóa được phân thành hai loại: cơ học và hóa học.Trong đất chua, quá trình phong hóa diễn ra mạnh mẽ

Quá trình hòa tan là sự chuyên hóa các hợp chất kết tủa của lân và nhôm, sắt, canxi

thành các hợp chat ion lân: H2POs, HPO¿? Nói chung, khả năng hòa tan của lân từ

nguồn nhôm và sắt tăng lên khi độ pH trong khoảng pH = 6,5 Tuy nhiên, khi pH tiếptục tăng, các kết tủa canxi - lân được hình, làm giảm lượng lân dé tiêu

Quá trình kết tủa: các ion lân phản ứng với các ion kim loại trong môi trường đểtạo thành kết tủa không tan Các yếu tố môi trường thuận lợi cho sự kết tủa: đặc tính hòatan của lân, pH, trạng thái oxy hóa khử và nồng độ của các ion

2.4.3 Vai trò kích thích sinh trưởng phát triển cây trồng

Lân có trong thành phan chủ đạo của chat nucleoprotein không thể thiếu cho sựsong của cây và có sự liên kết chặt chẽ với dam, là trung tâm trong quá trình trao đôi

năng lượng va protein của cây.

Lân rất cần cho sự hình thành nên các bộ phận mới ra mam non bằng việc thamgia tích cực trong quá trình kiến tạo nên hoạt chất hình thành mầm hoa, đẻ nhánh,

phân cành, ra hoa, đậu qua và phát triển bộ rễ dưới dang ion phosphat (PO) Lan ảnh

hưởng đến sự vận chuyền đường tích lũy về hạt và các bộ phận của chất nguyên sinh

làm cho cây chống được lạnh, chống được nóng đồng thời tăng khả năng chống chịuvới các điều kiện bat lợi khác như han, ung, sâu bệnh, tác dụng đệm, làm cho cây chịuđược chua, kiềm, hạn chế được tác hại của việc bón thừa đạm

Thiếu lân ảnh hưởng đến chất lượng hoa, quả, củ, giảm khả năng tổng hợp chấtbột, hoa khó nở; quả ít, chín chậm, quả thường có vỏ dày, xốp và dé bị thối, nam bệnh

dé tan công, bộ rễ cây phát triển kém ảnh hưởng đến việc hap thụ các chất đinh dưỡng,

hạn chế quá trình quang hợp và hô hấp, ảnh hưởng đến quá trình đậu quả, giảm tính

chống chịu ảnh hưởng lớn đến năng suất cây trồng

2.5 Vi sinh vật chuyển hóa lân

VSV phân giải lân không chỉ là các vsv chuyên hoá phosphat vô cơ, mà bao gồm

cả các VSV có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung

cấp cho đất và cây trồng Các vi sinh vật này có khả năng chuyền hoá lân khó tan thành

dang dé tiêu cho cây trồng sử dụng dựa trên các cơ chế khác nhau Các axit hữu cơ được

vi sinh vật tiết ra là tác nhân chủ yếu phân giải lân khó tan, khoáng hóa các hợp chất lân

hữu cơ tạo nguồn lân dé tiêu cung cấp cây trồng, giúp cho quá trình phosphoryl hóa,

tong hợp protein, lipit, phyto hormone diễn ra liên tục trong cây, giúp cây có thể trao

đổi nước, chất khoáng trong điều kiện đất bị nhiễm mặn Ngoài ra, vi sinh vật phân giải

lân cũng đóng vai trò kích thích sinh trưởng thực vật như tổng hợp indole - 3 - aceticaxit (IAA), gibberellic axit (GA), cytokinin, ethylene, hydro cyanide, có định nitơ và

đối kháng nam gây bệnh cây có nguồn gốc từ dat (Tahir va Sarwar, 2013)

Hệ vi sinh vật phân giải lân không giống nhau trên các loại đất khác nhau, phụ

thuộc chặt chẽ vào độ phì của đất, chế độ canh tác Sự tồn tại và phát triển của chúng có

ảnh hưởng rất lớn đến khả năng huy động lân dé tiêu trong đất từ các dạng lân khó tiêu

Từ các hệ sinh thái khác đặc biệt như đất và nước bao gồm ven biển, ngoài khơi và rừng

ngập mặn, vi khuẩn trong môi trường bién như Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Vibrio,

Alcaligenes, Micrococcus, Corynebacterium và Flavobacterium có khả năng thủy phan

các hợp chất P vô co (Pi), đồng hóa các chất P hữu co (Po) và chuyên hóa chúng thànhcác hợp chất vô cơ hòa tan dé sử dụng đối với cây trồng (Chen va ctv, 2006; Dastager

và Damare, 2013; Mudryk, 2004).

Trong số các giải pháp dé khắc phục van dé thiếu P, việc ứng dụng vi khuẩn hòa

tan phosphat có khả năng hòa tan phosphat khoáng không hòa tan Sử dụng PSB làm

phân bón sinh học thân thiện với môi trường và tiết kiệm chi phí cũng đã thu hút được

nhiều sự quan tâm gần đây vi tac dụng đối với sự tăng trưởng và năng suất của cây trồng,cũng như độ phì nhiêu của đất PSM từ môi trường khắc nghiệt như đất mặn - kiềm, đất

có mức độ thiếu dinh đưỡng cao hoặc đất từ môi trường nhiệt độ khắc nghiệt có xuhướng hòa tan nhiều phosphat hơn PSM từ đất ở điều kiện ôn hòa hơn (Zhu và ctv,

2011) Các chủng vi khuân Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter được phân lập từ trầm

tích rừng ngập mặn hòa tan phosphat rat tốt và có tiềm năng ứng dụng dé sản xuất phânbón hữu cơ áp dung cho đất ngập mặn (Teymouri và ctv, 2016).

Các vi sinh vật trong đất có tác dụng hòa tan P thông qua:

(1) Giải phóng các hợp chất tạo phức hoặc các chất có thé hòa tan Po, ví dụ, các

anion axit hữu cơ, H*, OH va COs,

(2) Giải phóng các enzyme ngoại bào (nhằm hòa tan Po) như phosphatase

(3) Giải phóng P trong quá trình phan hủy chat Po

Vi sinh vật phân giải lân được chia thành hai nhóm vi sinh vật phân giải lân hữu

cơ và vi sinh vật phân giải lân vô cơ.

2.5.1 Vi sinh vật chuyển hóa lân hữu co

Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi Bacillus và Pseudomonas

Các loài có khả năng phân giải mạnh là Bacillus megaterium, Bacillus mycoides,

Pseudomonas sp Nhiều vi sinh vật có men dephosphorylaza phân giải phytin theo phản

Ứng sau:

Nucleoprotit —> Axit nucleic — Nucleotit —> H3PO4

2.5.2 Vi sinh vật chuyến hóa lân vô cơ

Về cơ chế của quá trình phân giải phospho vô cơ do vsv cho đến nay vẫn còn nhiềutranh cãi Nhưng đại đa số các nhà nghiên cứu đều cho rằng: sự sản sinh acid trong quá

trình sống của một số nhóm vsv đã làm cho nó có khả năng chuyền các hợp chất phospho

từ dạng khó tan sang dạng có thé hoà tan Quá trình lên men tạo ra axit carbonic, là axitchủ yếu thúc day quá trình hòa tan P vô cơ, phương trình:

Ca3(POx4)2 + H2CO3 + HO —› Ca(POs)2H20 + Ca(HCO3);

Các vi khuẩn nitrate sống trong đất cũng có khả năng hòa tan phosphat vô co do

nó có khả năng oxy hóa NHa thành NOz và NOz” Axit HNO3 được hình thành sẽ phan

ứng với phosphat khó tan tạo thành dang dé tan:

Ca3(PO4)2 + 4HNO3 — Ca(HaPO¿)› + 2Ca(NO3)2Các vi khuẩn sulfate cũng có khả năng hòa tan phosphat khó tan do sự hình thành

HzSO¿ trong qua trình trao đổi chat:

Cas(POa)a + 2H2SO4 — Ca(HaPO¿); + 2CaSO¿

Các loài có khả năng phân giải lân vô cơ mạnh là Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas radiobacter Trong nhóm vi nam

10

thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất và một số chủng khác như

Penicillin, Rhizopus (Lê Xuân Phuong, 2008).

Ngoài ra nhóm xạ khuân cũng có khả năng hòa tan phosphat, chủ yêu thuộc nhóm

ưa 4m Tuy nhiên hoạt tính hòa tan phosphat của chúng thường là rất yếu

2.6 Enzyme phytase

Acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis dihydrogen phosphate) va mudicủa acid phytic được gọi là phytate Phytate là một nhóm các hợp chat phospho hữu cođược tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên, là một trong những dạng dự trữ chính của phosphotrong thực vật nhưng thực vật phan lớn không thé sử dụng nó từ thân rễ do hoạt độngthủy phân phytate thấp trong rễ cây

Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thựcphẩm và thức ăn chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối của axit

phytic (phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-phosphate và

các cấp độ 2 thấp hơn của phan ứng phosphoyl hóa Việc sử dụng phytase không chỉ

làm tăng khả năng hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng hấp thu các nguyên tốkhoáng và khả năng tiêu hóa các hợp chất khác

Phytase được tim thay trong động vat, thực vật, nam, vi khuẩn, tuy nhiên nam và

vi khuẩn là đối tượng sản sinh enzyme đáng kể nhất Có tới 80% tổng số P trong đấtchiếm P hữu cơ ở dang axit phytic (phytate) vẫn liên kết chặt chẽ với đất làm giảm khadụng sinh học của nó đối với cây trồng Thực vật thường không thê thu nhận phosphotrực tiếp từ phytate Tuy nhiên, sự hiện diện của PSM trong tầng sinh quyên có thể bù

đắp cho việc cây không có khả năng thu nhận phospho trực tiếp, làm tăng khả năng sử

dụng phospho đối với thực vật (Richardson va Simpson, 201 1)

2.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới

2.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việc bón vi khuẩn nốt rễ và vi khuẩn Pseudomonas giúp tăng năng suất, tiết kiệm

N đồng thời giữ hàm lượng protein trong hạt gạo từ đó cho thấy các đòng vi khuẩn hữu

hiệu kích thích phát triển va gia tăng năng suất lúa cao sản trồng trên đất phù sa Cần

Thơ theo nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2005).

Thí nghiệm ngoài đồng được thực hiện tại thị xã Sa Déc, tinh Đồng Tháp trong vụXuân Hè 2004 của Cao Ngọc Điệp (2005), cho kết quả thành phần năng suất, năng suấthột và hàm lượng protein trong hột đậu nành gia tăng đáng kế khi tưới dich lên men vi

khuẩn Pseudomonas spp hòa tan lân khó tan so với chỉ bón phân hóa học hay phânchủng vi khuẩn nốt rễ.

Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh (2006), thực hiện thí nghiệm ngoài đồngruộng đánh giá hiệu quả khi sử dụng vi khuẩn Pseudomonas spp ở cây mía đường trênđất phèn tại huyện Bến Lức, tỉnh Long An trong 2 vụ (2004 - 2005) Kết quả tăng trữđường trong mía cây ở vụ 1 và tăng năng suất mía cây, lượng đường Lượng phân bón

sinh học cũng giảm được 184 kg N (400 kg urê), 192 kg PzOs (1200 kg phân supe lân)

nhưng đảm bảo năng suất và lượng đường thu được cao hơn bón phân hóa học

Chu Nguyên Thanh va ctv (2018), đã nghiên cứu đánh giá khả năng kích thích tang

trưởng thực vật của hai chủng Pseudomonas phân lập từ vùng rễ cây bắp Kết quả nghiêncứu bước đầu cho thay 2 chủng vi khuẩn khảo sát thuộc chi Pseudomonas có khả năngkích thích tăng trưởng thực vật trong điều kiện in vitro như cô định N, hòa tan P, sảnsinh phytohormone (IAA và GAs), cải thiện tỉ lệ nảy mầm và các thông số tăng trưởngcủa Arabidopsis thaliana; nhà lưới thông qua các thông số tăng trưởng của cấy bắp cho

thấy tiềm năng phát triển chế pham sinh học cho nền nông nghiệp bền vững

Với nghiên cứu hỗ trợ sinh trưởng phát triển cây bưởi da xanh vùng đất nhiễm mặn

ở tỉnh Bến Tre, Nguyễn Đức Thanh và ctv (2019) đã phân lập và tuyển chọn được hai

loài vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân vô cơ trên môi trường PVK có bổ sung muối

NaCl > 3% từ các mẫu đất trồng cây bưởi Kết quả xác định mẫu T2917 gần nhất thuộc

chi Pseudomonas là Pseudomonas oryzihabitans va T3602 gần nhất với loàiBurkholderia sp., chi Burkholderia Khuẩn lạc mẫu T2917 có hình tròn, lỗi, sinh tiết sắc

tố màu vàng nhạt, tế bào dạng hình que ngắn, có khả năng di động, nhuộm gram âm,chịu NaCl 5% Mẫu phân lập T3602 không sinh tiết sắc tố, màu trắng đục, tế bao danghình cầu, hình ovan, có khả năng di động, nhuộm gram âm và chịu man 3% NaCl

Theo nghiên cứu cua Chu Nguyên Thanh va ctv (2020), đã sàng lọc 3 chủng vi

khuẩn thuộc chi Pseudomonas phân lập từ vùng đất nhiễm mặn thuộc huyện Ba Tri, tinhBến Tre đều có đặc điểm kích thích tăng trưởng cây đậu phộng trong điều kiện nhiễmmặn cả ba chủng đều có khả năng sản xuất indole - 3 - acetic axit (IAA), hòa tanphosphat, có định đạm va có gen mã hóa enzyme cải thiện căng thang phi sinh học

Với mục tiêu phân lập và tuyên chọn chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân và

chịu mặn nhằm tạo phân bón vô cơ tan chậm từ các mẫu đất thu thập ở Đồng Nai, Thànhphố Hồ Chí Minh và Long An của Bùi Đoàn Phượng Linh và ctv (2022), đã phân lập

TẾ

được chủng PSMS54 có xuất hiện vòng phân giải trên môi trường PVK bé sung 3%,4%

NaCl và kết quả định danh tương đồng 99,9% với Bacillus velezensis Sau 60 ngày được

cô định trong màng bao, chủng vi khuẩn này vẫn sống và có mật độ 88,3% so với mật

độ ban đầu

Năm 2021, Thái Thành Được và Nguyễn Hữu Điệp đã tiến hành phân lập và nhậndiện vi khuẩn có điịnh đạm từ dat vùng rễ cây bắp ở Đồng bằng sông Cửu Long trên bamôi trường Nfb không N, môi trường LGI và môi trường Burks không N Tuyển chọnđược sáu chủng vi khuẩn có khả năng có định đạm tốt nhất được giải trình tự gene 16StRNA với cặp môi 27F/1492R ba chủng này thuộc ba chi khác nhau Bacillus,

Pseudomonas, Klebsiella.

Phùng Thi Thùy Oanh va ctv, đã phan lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tinhkháng sinh và ức chế enzyme xanthine oxidase từ đất rừng ngập mặn Gio Linh, QuảngTrị vào năm 2018 Kết quả đã phân lập được 129 chủng vi khuẩn, trong đó 45 chủng vikhuẩn có hình thái khác nhau được lên men, tạo cao chiết ethyl acetate (EtOAc) và đánhgiá hoạt tính kháng vi sinh vật và ức chế enzym XO Kết quả thử hoạt tính cho thấy cặn

chiết EtOAc của 15 chủng thé hiện hoạt tinh kháng đối với ít nhất một trong các chủng

vi sinh vật kiểm định Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa

ATCC27853, Bacillus subtilis ATCC6633, Staphylococcus aureus ATCC25923,

Candida albicans ATCC10231 với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu MIC = 32 - 256ug/mL và cặn chiết EtOAc của 26 chủng có hoạt tính ức chế enzym XO với tỷ lệ ức chếđạt 10,5 + 2,4% - 96,2 + 5,6% tại nồng độ thử nghiệm 500 ug/mL Phân tích trình tựgen 16S rRNA với cặp môi 27F/1492R cho thấy 5 chủng có hoạt tính cao thuộc các chi

Ruegeria, Pseudovibrio, Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus.

2.7.2 Tình hình nghiên cứu thế giới

Năm 2002, Kim và ctv đã phân lập từ đất quanh chuồng gia súc được một dòng vi

khuẩn sản xuất phytase Ching này được xác định là một chi của Pseudomonas sp và

được đặt tên là Pseudomonas sp YH40 Nghiên cứu cho thay rằng điều kiện nuôi cay

tối ưu Pseudomonas sp YH40 trong môi trường nuôi cấy bao gồm 1,0% (w/v) glixerol,2,0% (w/v) peptone, và 0,2% (v/v) FeSOx.7HaO đồng thời cũng chỉ ra rằng việc sản xuấtphytase hiệu suất cao nhất sau 10 giờ ủ tại 37 °C và độ pH 6.0

Nghiên cứu ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải lân và vi sinh vật vùng rễ kíchthích tăng trưởng đến năng suất ngô của Yazdani và ctv (2009), kết quá cho thấy nghiệm

thức kết hợp PSM và PGPR cùng với phân NPK làm tăng trọng lượng bông, số hàng,

số hạt Bên cạnh đó có thể giảm 50% lượng phân bón phospho mà không làm giảm năngsuất nhưng không bù đắp lượng N đã giảm

Tahir và ctv (2013), cho thay rang vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng câytrồng đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp vì kích thích sinh trưởng thực vậtnhư: auxin, gibberellic axit, cytokinin, ethylene, cố định nitơ và hòa tan phosphate vô

cơ tăng khả năng hap thy phospho; cải tiến tăng trưởng thực vật thông qua ngăn vi sinh

vật có hại, cải thiện năng suất, giảm nhu cầu sử dụng phân bón

Vimal và ctv (2018), thực hiện thử nghiệm so sánh tác động thúc đây tăng trưởngthực vật tại đất nhiễm mặn ở cây lúa mì Thông qua các nghiên cứu về cô định đạm, hòatan phosphate, amoniac, acid acetic, hydro xyanua và hình thái, sinh hóa xác định cụ thểhai chủng vi khuẩn thuộc Bacillus sp (JG3) và Pseudomonas sp (JG7) Từ đó nhận thấyviệc sử dụng PGPR chịu mặn tạo điều kiện thuận lợi cho cây phát triển ở môi trường

nhiễm mặn

Tổng quan về việc enzyme phytase của vi sinh vật được sử dụng trên toàn cầu giảmhiện tượng ô nhiễm phospho, tăng cường hấp thu dinh dưỡng động vật đạ dày đơn, tăngkhả năng cung cấp phospho tăng trưởng cây trồng và giảm lượng phân bón tăng năngsuất mà không tốn thêm chi phí theo Singh và ctv (2020)

14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 03/2022 đến tháng 07/2023, tại phòng Vi sinh Ứng dụng

RIBE 212, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường, Trường Đại học Nông

Lâm Thanh phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Thu thập mẫu đất ở tỉnh Bến Tre Mẫu đất được lấy ở độ sâu tầng đất 0 - 30 cm,0,5 kg dat/mau, cho vào lọ nhựa sạch, ghi thông tin mẫu thu thập, vị trí lấy mẫu Mẫu

được lưu trữ mát chuyền về phòng thí nghiệm Mẫu đất được phân tích chỉ tiêu trongđất: EC, pH trong vòng 24 giờ

Bảng 3.1 Địa điểm thu thập mẫu

Số thứ tự Địa điểm thu mẫu Ký hiệu mẫu

1 Tan Pha, Chau Thanh, Tinh Bén Tre |

Tan Pha, Chau Thanh, Tinh Bén TreTân Phú, Châu Thanh, Tinh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến TreTân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre

WN

OMAN DNAHWN

© œ¬ìiatœ:>

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp từ mẫu đất

Mau đất sau khi thu thập sẽ được tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu như EC, pH Déđánh giá độ mặn của đất, ta sẽ dùng đại lượng EC EC là độ dẫn điện của đất là phép đotong lượng muối hòa tan trong đất trồng, có đơn vị là dS/m (1dS/m = 0,64%), là cáchtốt nhất dé đo các ion đất, điều này giúp theo dõi được các chất dinh dưỡng có san

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ dẫn điện của đất như: nhiệt độ không khí,

nước, đất; loại đất, độ âm; lượng nước tưới; phân bón; độ sâu của đất

Độ dẫn điện và pH tương tác mật thiết với nhau Đất có tính axit thì độ dẫn điện

càng cao, pH gan trung tính càng ít ảnh hưởng đến độ dẫn điện

Bảng 3.2 Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng

Độ mặn Nông độ muôi

Khôngmặn 0-2 0- 1,28 Mặn ảnh hưởng không đáng kê _

Mặn thấp 2-4 1,28 - 2,56 Năng suât của nhiều loại cây có thê

bị giới han

Mặn trung 4-8 2,56 - 5,12 Nang suât của nhiều loại cây trông bị

bình giới hạn

Mặn cao 8-16 5,12 - 10,24 Chỉ một sô cây trông chịu đựng được

Mặn rất cao > 16 > 10,24 Chi rat ít cây trồng chịu đựng được

(Nguon: Utah State University).

Phân lập, làm thuần và giữ giống các chủng vi khuẩn:

Phân lập: tiến hành cân 10 g mẫu dat cho vào bình chứa 90 mL nước cất đã đượchap vô trùng và lắc 150 vòng trong 30 phút Dé lắng khi dich phân thành 2 lớp hút 1 mLdung dịch vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã hấp khử trùng thực hiện trong tủ cấy

vi sinh vô trùng, thu được dung địch có độ pha loãng 107 Tiếp tục thực hiện các bướctrên dé được độ pha loãng tương ứng 103, 10, 10Š Hút 100 ul dich pha loãng ở nồng

độ 103, 10, 10° trải đều trên các đĩa petri chứa môi trường King B (20 g peptone;

MgSO¿.7HaO 1,5 g; KzHPO/¿ 1,5 g; glycerol 10 mL; agar; nước cất vừa đủ 1 lít) có bổsung 1% NaCl Dùng que cấy trang đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, trang đều dịchtrên bề mặt thạch đến khi bề mặt khô hoàn toàn Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 48 giờ

dé vi khuan phát triển

Làm thuần: sau 48 giờ lựa chọn các khuẩn lạc đơn nam riêng lẻ, phát huỳnh quangdưới đèn UV với bước sóng 366 nm cấy chuyên trên đĩa thạch KB, ủ ở nhiệt độ phòngtrong 48 giờ, quan sát và ghi nhận kết quả Tiến hành cấy chuyền hai đến ba lần để đảmbảo độ thuần của các chủng vi khuẩn

Giữ giống: trong ống thạch nghiêng, nuôi cấy thuần vi khuẩn trên đĩa petri Sau 48giờ, chọn khuẩn lạc đơn cấy ria trên ống thạch nghiêng chứa môi trường KB đã đượchấp khử trùng, làm nút bông gói lại bằng giấy báo Bảo quản ở nhiệt độ 4°C Bên cạnh

đó, giữ giống trong ông eppendorf (20% glycerol; 1% peptone; nước cat) ở nhiệt độ

-20 °C đến 0 °C

Xác định các đặc điểm hình thái, sinh hóa:

Hình thái khuẩn lạc: đo kích thước, mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ

tiêu: màu sac, hình thái, độ nôi, dạng bìa khuân lạc.

16

Mô tả một số đặc điểm tế bào:

Nhuộm gram: mục dich phân biệt dòng vi khuẩn gram âm hay gram đương, quansát hình thái tế bảo

Các bước thực hiện: nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên giữa lam kính Dùng que cấy

đã khử trùng lấy ít sinh khối vi khuẩn, trải đều lên lam kính, cố định mẫu bằng cách hơtrên ngọn lửa đèn cồn Đầu tiên nhỏ 1 đến 2 giọt dung dịch crystal violet (Đức), đểkhoảng 1 phút sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vikhuẩn thành mau tim đen Tiếp theo nhỏ 1 đến 2 giọt dung địch lugol dé có định màu,

cũng dé khoảng 1 phút rồi rửa nhanh lại bằng ethanol khoảng 10 giây và nước cất vô

trùng Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loài vikhuẩn Cuối cùng nhỏ 1 đến 2 giọt dung dịch safranin để khoảng 1 phút rồi rửa nước cất

vô trùng giúp các vi khuẩn đã bi tay hết màu tim bắt lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bắtmàu tim den sẽ không bị ảnh hưởng Dé ráo nước, quan sát dưới kính hiền vi ở độ phóng

đại 100X dưới vật kính soi đầu và ghi nhận kết quả

Kết quả: mẫu có màu tím là gram dương, mẫu có màu hồng đỏ là gram âm

Phản ứng Catalase: mục đích phát hiện sự có mặt của các vi sinh vat có hệ enzyme catalase Catalase giúp vi sinh vật ky khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy không

khí bởi sự hình thành chất HạO¿

Các bước thực hiện: vi khuẩn kiểm tra sẽ được nuôi trên môi trường thạch Dùng

que cấy đã được khử trùng bằng ngọn lửa đèn côn lấy sinh khối vi khuân từ môi trườngnuôi cấy đặt lên lam kính sạch Sau đó nhỏ thuốc thử HzOa 3% dé kiểm tra hoạt tính

catalase Quan sát qua 1 - 2 giây Phản ứng dương tinh sẽ tạo bọt khí, ngược lại phản

ứng âm tính sẽ không tạo bọt khí.

Phản ứng Oxidase: mục đích phát hiện sự có mặt của hệ enzyme cytocrom oxydasecủa vi khuẩn

Các bước thực hiện: dùng que cấy đã khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn đặt lên đĩa

giấy oxydase có tâm thuốc thử Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu tím đen, ngược

lại phản ứng âm tính.

3.2.2.1 Khảo sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch KB 48 giờ, dùng quecấy lay sinh khối dé tiến hành tăng sinh cấp 1 trong môi trường KB đã hấp khử trùngtrong vòng 24 giờ, tốc độ lắc là 150 vòng/phút Do ODøøøam và điều chỉnh sao cho mật

độ quang các bình bằng nhau bằng 0,5 Tiếp giống với tỷ lệ 1% từ bình tăng sinh cấp 1cho vào bình chứa môi trường KB có bé sung các nồng độ muối khác nhau: 3%, 4%,5%, 6%, 7% Tiếp tục tăng sinh cấp 2 trong vòng 24 giờ tốc độ lắc là 150 vòng/phút.Hút 100 uL dịch khuẩn đã tăng sinh cấp 2 lên đĩa chứa môi trường KB agar, mỗi nồng

độ với 3 lần lặp lại Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Từ đóchọn ra các chủng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nồng độ muối cao déthực hiện các nội dung tiếp theo

Chon đĩa có số đếm trong khoảng 25 - 250 sau đó đếm tat cả khuẩn lạc và tính kết

quả Mật độ tông vi khuẩn được tính như sau:

N

"n1xVxfl+ +nixVxfñtrong đó:

A: số tế bào vi khuẩn trong 1 g hay 1 mL mau (CFU/g hoặc CFU/mL)N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ ¡V: thể tích địch mẫu (mL) cay vào trong mỗi đĩa

fi: độ pha loãng tương ứng.

3.2.2.3 Khảo sát khả năng phân giải lần

Xác định khả năng phân giải lân dựa theo TCVN 6167:1996 nhằm đánh giá sơ bộ

khả năng phân giải lân vô cơ của các chủng vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp

cấy điểm trên đĩa thạch chứa môi trường Pikovskaya medium gồm: glucose 10,0 g;

Ca3(PO4)2 5,0 g; (NH¿)¿SO¿ 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSOu.7H20 0,1 g; MnSO¿ 0,002 g;

FeSO, 0,002 g; cao nam men 0,5 g; agar 20,0 g và nước cất vừa đủ 1 lít)

Nuôi cay chủng vi khuẩn trên môi trường KB 48 giờ Dùng que cay lấy sinh khối

khuẩn cấy 3 điểm tương ứng với lặp lại 3 lần Ủ ở nhiệt độ phòng 2 - 5 ngày Đường

kính vòng phân giải lân khó tan được quan sát dựa trên kích thước vòng phân giải qua

từng ngày nuôi cấy nhằm chọn lọc các chủng có vòng phân giải lớn

Xác định hàm lượng phân giải phospho: các chủng có vòng phân giải lớn sẽ tiếp

thục xác định hàm lượng phân giải phospho bằng phương pháp trắc phố dùng amoni

molipdat theo TCVN 6202:1996 tại Phòng thử nghiệm môi trường, Viện A2, Trường

18

Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, nhằm khảo sát khả năng phân giải lân vô

cơ và chọn lọc được các chủng có hiệu suất phân giải cao

Nguyên tắc: phan ứng giữa ion octophosphat, dung dịch axit chứa molipdat và ionantimon sẽ tạo ra phức chất antimon phosphomolipdat Khử phức chất bằng axit ascobictạo thành phức chất molipden màu xanh đậm Do độ hấp thu có thé xác định được nồng

Pha thuốc thử P: định mức 300 mL nước cất vào cốc đong 1000 mL, thêm từ từ

150 mL HaSOa Hoa tan 12,5 g amoni heptamolipdat tetrahydrat (NH1)6Mo7024.4H20

trong 100 mL nước cất Hòa tan 0,35 g antimon kali hemyhydrat K(SbO)C4H4Oo.1/2

HaO trong 100 mL nước cat Sau khi dung dịch axit nguội bồ sung hai dung dịch trên.Thuốc thử được bảo quan trong lọ thủy tinh mau nâu

Pha dung dich lên màu: thuốc thử P pha với dung địch axit ascobic với tỉ lệ 1 g

axit/100 mL thuốc thử P Dung dich lên màu đựng trong lọ thủy tinh và sử dụng trong

ngày.

Cách tiến hành phản ứng:

Đối với mẫu cần xác định phospho tổng:

Phá mau: lắc đều mẫu gốc, dùng pipet hút 5 mL mẫu cho vào bình kendan Thậntrọng thêm 2,5 mL dung dịch H2SO, và lắc đều Dun nóng nhẹ đến khi xuất hiện khóitrắng thêm từ từ 0,5 mL axit nitric từng giọt, vừa thêm vừa lắc nhẹ đến khi dung dịchtrong không màu Nếu dung dịch vẫn còn màu thì tiếp tục đun

Làm nguội và thêm từ từ 10 mL nước cất, lắc đều

Lọc mẫu: sau khi đã làm mát, chuyên dung dịch đã phá sang bình định mức, trángbình kendan bang một nước cat cho vào bình định mức đủ 50 mL bằng nước cat Tiếnhành lọc dung dịch bằng giấy lọc thu dịch trong

Lên màu: hút 1 mL dung dịch đã lọc cho vào bình định mức (độ pha loãng dung

dịch phụ thuộc vào độ lên màu của mẫu) Cho thêm một ít nước cất Chính pH bằng 1giọt phenolphtalein Tiếp tục lắc và cho từng giọt NaOH 25% cho đến khi dung dịch

chuyên sang màu hồng nhạt Thêm 4 mL dung dịch lên màu và nước cất định mức đủ,

đập nắp, lắc đều và đợi 30 phút Do bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm

Đối với mẫu cần xác định octophosphat:

Lọc mẫu gốc bằng giấy lọc thu dịch trong

Lên màu: hút 1 mL dung dịch đã lọc cho vào bình định mức (Độ pha loãng dung

dịch phụ thuộc vào độ lên màu của mẫu) Cho thêm một ít nước cất Chỉnh pH bang 1giọt phenolphtalein Tiếp tục lắc và cho từng giọt NaOH 25% cho đến khi dung dịchchuyển sang màu hồng nhạt Cho 4 mL dung dịch lên màu va nước cất định mức đủ,

đập nắp, lắc đều và đợi 30 phút Do bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm.

Cách tiến hành dựng đường chuẩn:

Bảng 3.3 Pha dung dịch chuẩn P

Dé yên 30 phút, đo bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm

Chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân tốt nhất tăng sinh trong Luria

Bertani Broth lỏng (tryptone 10 g; cao nắm men 5 g; NaCl 10 g và nước cất vừa đủ 1lit) trong 24 giờ, tốc độ lắc là 150 vòng/phút Do ODeo0nm và điều chỉnh sao cho mật độquang các bình bằng nhau bằng 0,5 Tiếp giống 1% ở bình tăng sinh cấp 1 vào bình chứamôi trường PVK lỏng đã hấp khử trùng Tiếp tục nuôi lắc trong vòng 96 giờ, tốc độ lắc

150 vòng/phút Hiệu suất phân giải lân bằng cách đo hàm lượng phospho trong môi

trường PVK lỏng trước và sau khi nuôi cấy

Hàm lượng phospho tan đầu ra — Hàm lượng phospho tan đầu vào

Hiệu suất = x 100

Tổng hàm lượng phospho3.2.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng vi khuẩn

Xác định khả năng sinh tổng hợp phytase theo Stephen Joseph và Jisha (2008): từkết quả khảo sát chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn và phân giải lân tốt déxác định khả năng sinh tông hợp enzyme phytase

20

Đánh giá khả năng sinh enzyme phytase ngoại bảo qua môi trường Phytase

screening medium (glucose 1,5%, natri phytate 0,1%, NH4NO3 0,2%, KCI 0,05%,

MgS0O4.7H20 0,05%, MnSO¿ 0,05%, FeSO¿ 0,03%, agar 2%, pH = 7 va nước cất vừa

đủ 1 lit) bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3

-5 ngày Hoạt tính sinh enzyme thể hiện ở hình thành vòng sáng xung quanh khuẩn lạc

Hoạt tính phân giải phytase được xác định dựa vào công thức:

(D - d)

D x 100

x(%) =

trong do:

x: hoạt tinh phân giải phytate (%)

D: đường kính vòng phân giải (mm)

d: đường kính khuẩn lạc (mm)

Xác định hoạt độ phytase theo Shimizu và ctv (1992):

Pha dung dịch thử màu: gồm dung dich A (((NH4)sMo702)4.4H20 1,5% pha trongH;SO¿a 5,5%) và dung dich B (FeSOx.7HaO 2,7% pha trong nước cat) với tỉ lệ (4:1)

Dung dịch thử màu được pha và dùng trong ngảy.

Dung dịch cơ chất: có chứa 3 mM Na - phytate trong đệm Na - acetate 0,1 M pH

= 5,5 Cách pha: Cân 0,198 g muối Na - phytase pha trong 10 mL nước cất ta thu đượcdung dịch gốc có nồng độ 30 mM (bảo quản 20 °C) Từ dung dịch gốc này pha loãng 10lần với đệm Na - acetate 0,1 M (pH = 5,5) thu được dung dịch cơ chat có nồng độ 3 mM

Chủng vi khuẩn sau khi được có hoạt tính sinh enzyme phytase được nuôi trong

ống nghiệm chứa 5 mL môi trường PSM lỏng, lắc 200 vòng/phút, ở 37 °C, sau 24 giờ

tiếp giống sang bình tam giác (V = 250 mL) chứa 100mL môi trường PSM lỏng sao choODøoo trong bình nuôi đạt 0,05, lắc 200 vòng/phút, ở 37 °C Sau 3 ngày nuôi, dịch nuôi

vi khuẩn được ly tâm 10000 vòng/phút, 5 phút, ở 40°C thu dich trong

Mẫu thí nghiệm: hút 0,2 mL dịch ly tâm cho vào 0,2 mL địch cơ chất, ủ ở 55 °Ctrong 20 phút, sau đó bồ sung 0,4 mL dung dich TCA 15% dé dùng phan ứng, bổ sungtiếp 0,8 mL thuốc thử, dé phản ứng ôn định 5 phút rồi xác định OD700 nm

Mẫu đối chứng: hút 0,2 mL dịch đã ly tâm cho vào 0,4 mL TCA 15% nhằm bất

hoạt enzyme, sau đó bổ sung 0,2 mL dịch cơ chất trong 20 phút, bổ sung tiếp 0,8 mLthuốc thử, dé phản ứng 6n định sau 5 phút rồi xác định OD700 am