Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn trong dưa giá lên men

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUAN TRONG DUA GIÁ LÊN MEN Ngành học:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUAN TRONG DUA GIÁ LÊN MEN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: © NGUYEN THUY THANH VY

Mã số sinh viên: 19126237Niên khóa: 2019-2023

Tp Thủ Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHOA LUẬN TOT NGHIỆP

PHAN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN LACTIC CÓ KHẢ

NĂNG KHANG KHUAN TRONG DUA GIÁ LEN MEN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS NGUYEN MANH CƯỜNG NGUYÊN THUY THANH VY

TP Thu Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu nhà trường, Banchủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô Khoa Khoa học Sinh - Trường Đại học Nông LâmThành phố Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho em những kiến thức bồ ích và quý báu trongsuốt thời gian học tập tại trường cùng với những lời góp ý, nhận xét giúp cho khoá luậntốt nghiệp của em hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn Khoa Khoa học Công nghệ và Thực phẩm — Trường Đạihọc Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện và cung cấp cơ sở vật chất

dé em có thé hoàn thành khoá luận

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến ThS Nguyễn Mạnh

Cường đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn em trong toàn bộ quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài

và tập thể các em, các ban làm việc tại phòng thí nghiệm Vi sinh tiên tiến - Giảng đườngCam Tú đã luôn giúp đỡ và động viên em

Cuối cùng em xin bảy tỏ lòng biết ơn và yêu thương đến gia đình vẫn luôn cô vũ vàđộng viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn.

Tp Hô Chí Minh, ngày tháng năm

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Thuy Thanh Vy, MSSV: 19126237, Lớp: DH19SHB (Số điệnthoại: 0818345618, Email: 19126237@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinhhọc Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là tất cả kết quảđạt được trong dé tai nghiên cứu “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năngkháng khuẩn trong dưa giá lên men” đều là do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các sốliệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàntoàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chí Minh,ngày tháng năm

Người viết cam đoan(Ky và ghi rõ họ tên)

it

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện với mục đích phân lập và định danh vi khuẩn lactic cókhả năng kháng khuẩn từ dưa giá lên men Đề tài được thực hiện dựa trên các chủng vi

khuẩn phân lập từ 3 mẫu dưa giá được mua tại chợ Ham Chui, phường Linh Xuân,

Thành phố Thủ Đức Đầu tiên, từ mẫu thực phẩm, các thí nghiệm sơ bộ được tiến hành

dé tìm kiếm vi khuẩn lactic trong mẫu thực phẩm như cấy trang và phân lập Sau đó, cáckhuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn lactic sẽ được tiếp tục thử nghiệm với các thí nghiệmhoá sinh như nhuộm gram, thử tính di động, phản ứng catalase, oxidase Vi khuẩn lactic

sẽ là vi khuẩn gram dương, không di động, catalase va oxidase âm tính Thử nghiệm khảnăng kháng khuẩn từ các dòng phân lập bang hai phương pháp “khuếch tán trên đĩagiấy” và “khuếch tán trên giếng thạch” kết hợp với 2 đòng vi khuẩn chỉ thị gây hại trongthực phẩm là E coli ATCC 8739 (E coli) và Salmonella Typhimurium ATCC 13311 (S.Typhimurium) Tiếp theo, các khuân lạc cho kết qua có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhấttrên 2 loài vi khuẩn chỉ thị sẽ được tiến hành ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCRkhuếch đại trình tự 16S rRNA và định danh thông qua đoạn gene này Cuối cùng mẫuPCR được đem đi giải trình tự và so sánh trên ngân hàng gen NCBI đề xác định loài của

vi khuẩn lactic này Kết quả của nghiên cứu này phân lập được 6 dòng vi khuẩn lactic

đã định danh sơ bộ qua các thử nghiệm sinh hóa Thử nghiệm tính kháng khuẩn của các

dòng phân lập, cả 6 đều dòng biểu hiện tính kháng với 2 dòng vi khuan chỉ thi, trong đóchủng L4 có khả năng kháng khuẩn tốt nhất Z coli và S Typhimurium với đường kínhvòng vô khuẩn khoảng từ 12,09 — 14,73 mm Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA

đã xác định được chủng L4 là Lactiplantibacillus plantarum (còn gọi là Lactobacillus

plantarum).

Từ khoá: vi khuẩn lactic, kháng khuẩn, Lactobacillus plantarum

il

The research was conducted with the aim of identifying and isolating different species of lactic acid bacteria with antibacterial features from Dua gia — a traditional

fermented food in Vietnam Several species of LAB were isolated from three samples

of Dua gia which were collected in Ham Chui Market, Linh Xuan Ward, Thu Duc City.

Firstly, from the food samples which were serially diluted and spread on MRS agar

plate Single colonies with distinguished features that were suspected as LAB was then isolated and tested in several biochemical properties such as gram staining, motility test, catalase and oxidase LAB are gram positive, non-motile catalase negative, and oxidase

negative Testing the antibacterial ability from isolated strains by using two methods:

"Disk diffusion test" and "Well diffusion test" combined with two harmful indicator bacteria strains in food are E coli ATCC 8739 (E coli) and Salmonella Typhimurium ATCC 13311 (S Typhimurium) The colonies that showed the best antibacterial activity

on the two indicators was then extracted DNA, run PCR to amplify the 16S rRNA and then sequenced that gene Finally, the result of 16S rRNA sequence was compared on

the NCBI gene bank to determine the species of LAB colony In this study, 6 lactic acid

bacteria strains are isolated and preliminarily identified through biochemical tests In the test about properties of the antibacterial from 6 the isolated strains, all of them showed the antibacterial ability to 2 indicator bacterial strains, of which strain L4 had the best antibacterial ability against FE coli and S Typhimurium with the diameter of the

sterile ring is about 12.09 — 14.73 mm Sequencing results of the 16S rRNA gene region

identified strain L4 is Lactiplantibacillus plantarum (also known as Lactobacillus plantarum).

Keywords: lactic acid bacteria, antibacterial ability, Lactobacillus plantarum.

IV

MỤC LỤC

LOI CAM 090 iXÁC NITNM là, GAM BN ceeeenesnnokentibkianenudiindngpbiiddionhidnndlittiiDggnnirobEutgregintgrrkdtset iiTINH TT DusnonoingtttontotponstigthelSb3892408000098430012288301000234000900801001005%4000000000080108000G00000g:0 iiiL2 lam ,ƠƠ 1V

SECU DoT greases ceca ere 01039:GI0301010030G1G380P |1.1 Đặt vấn đề - + s2 2 3221221211121121111211111111111111121111211211112112212 21211 ca |1.2 Mục tiêu đề tài - + Ss 2 SE E121112112111211211111211111211112111 121121211 re |l5 O1-01i1pftHWG HC THiosassssessunbazborueouusknieoingidiektli4tiznRiusj6gplưsilpoErotlibodagitiibipVEn4iđfDa14-iMEDgi4100008 1

CHƯƠNH? TÍHGUUAN TI THỂ TT sáceunnisdgnhet hong ggEh gioh8ig2hggHh26:G3060600g8g6E2 2

2.1 Sản phẩm dưa giá lên men eccecceccecsesssesseesseesecsseeseeseseseesesssecseesssseesnseseeseesseenees 52.1.1 GiGi thiệu đứa giá LEM ri6H - ccc-cs c2 162202265000 060 1á Hong 0A 1g 001180840.46 22.1.2 Tiêu chuẩn của đưa giá lên men -2 2 222222EE22EE2EE£EEE2EE2EE2EE2EErrErrrre 22.2 Témg quan vi khuẩn lacti€ - 25-55-S2<22<2Cx2223221111111113.2111121121111.12 2.0 32.2.1 Lich sử về vi khuẩn lactic - + s2s+Sz+E£SE2E2E£EE2EEEerxrrrrerxerrrrrrrerrrrreec 2.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactiC 2: 2-52 5S+222E22E£2E2EE22E22E2E2E2Ezxze 32.2.3 Phan loai vi khan lactic 8n -.ŒẬẬÃ|Ã| ƠỎ 42.2.4 Các yếu tố anh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 62.3 Các giai đoạn lên men của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men dưa giá 82.4 Chat kháng khuan sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic 2- ¿522222222222 92.4.1 So lược về chat kháng khuẩn sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic . - 92.4.2 Phân loại chat kháng khuẩn 2-2 2 52SS+SE+EE£EE£EE£EEEEEEEEEEZEEErErrrrree 102.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoai NUGC - ¿52552 +52 £+£+2£+vE+eeeeeeree 14 2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngồi hƯỚC - cee 2222 +22 *+E* E2 vn re 14 2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong TưỚC -csc<6c 10210112101 212 n4 H4 gà 6n X6 X6 163.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 2-22©22+22E++z£E+++£Ez£E+Ezzxrrxrzxrzzrrree 18Bele MAUI LÍ szzspsizdsepoưiriossiszgotili3Egorngprigozrsldirtesrilirtzzmpuynirsi23ui1m uitrEmcipzicizvizgruzstreoZdưggsgtz3eztcgrsưt 18

OTN cece a eee PI AEA 18

3.2.2 Chủng vi khuẩn chi thi o 0 0.ccccccccceseecsessessessessessessssessessssessessesseseessessesaesseesesees 18SCL (| a 18

Em 117 18S352: DUNE CU s20 s652S6< 1038 DhltVSESEERSGUGE39ESEĐISHESSESHNERHGCSMBBELIGBTSHBHSVSHGSASgSGSLISRSGHSHESEEREISESISEEHAESE 193.4 Môi trường nuôi cấy và hóa chất 2-22 252222222122E2221223222122322212212222 xe 19

3.4.1 Môi trường nuôi cấy 2: 2+22122222122112112211211211211211211211211211211 21 e6 19

3.4.2 Hóa chất - 55+ 2+2 2222222112211 11 20

5.5 Phironie phap igHiÊHH.GUsseseeoeesveestbedtdebiabbsdipdotbssbtsaslgisgseGEEsetooiaiBisess2x3gubsstiägsissodbibs 20

3.5.1 Phan lập các chủng vi khuan lactic từ mau dưa giá lên men - 203.5.2 Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn từ các chủng vi khuân đã phân lập 233.5.3 Định danh bằng sinh học phân tử -2- 22 2 222E+22++£E2E++EE+2Exerxrrxrrrrees 24

JG ee 264.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ mau đưa giá lên men - 274.1.1 Sự thay đối của pH, brix và mật độ VSV theo thời gian lên men - 27

1112 Wot phân Wes vì khuôn bee se»eeseoedoilikonasildsjkidbitpdogfits4240310003066/0010.046 284.3 Kết quả định danh vi khuẩn lactic bằng sinh học phân tử -2- 2252 33

AY bị (HẢO, MVEA ssc sian einen en nA ihe iin oie oid ete 35CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ S222 375.1 Kết luận - 2 222 E223E2121121221211211121121111111111111111111111111111 212211211 re 37

12117186 .:‹.-+-15a ,TÀI LIEU THAM KHẢẢO 2 2+S+2E£E2E££EeEzEerxerrrrrrerrrrrrrrrrrrrrrrrco.28

VI

DANH SÁCH CHU VIET TAT

LAB : Lactic acid bacteria

NCBI : National Center for Biotechnology Information

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

VI

Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong rau quả muối, rau quả khô 3

Bacteriocin sinh ra từ vi khuẩn lactic va ứng dụng trong thực phẩm 12Acid hữu cơ và ứng dụng trong thực phẩm 2- 22 55¿222z2sz>s2 13Các hợp chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic và ứng dụng trong thực

Sÿ9S2105024709JBSE2ES.HEGGISETSEEERGINEDESEHEEEEBIGRSESRHETEEEEEHIXSSHDSSVIEEGTEGEEEREEIDEEHEHHGIISIAISE-SSSESĐEEEE 14

Danh sách các thiết bị sử dung trong thí nghiệm -. 2-52 5525522 19Danh sách các dụng cu sử dụng trong thí nghiệm - - -==+ 19

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc các chủng vi khuẩn trên môi trường MRS agar 29Kết quả nhuộm gram và thử nghiệm sinh hoá 2-52 22 22S22Sz2z25z 31Vòng kháng vi khuan chỉ thị của các chủng vi khuẩn lactic Ÿ2

vill

DANH SÁCH HÌNH

TrangHình 2.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn lactic a) Cầu khuẩn lactic; b) Trực khuẩn lactic 5Hình 3.1 Quy trình pha loãng mẫu dưa giá ở từng nồng độ 107, 102, , 10°, 10° 20

Hình 4.1 Biểu đồ về sự thay đổi của pH, Brix đến dưa giá lên men 27

Hình 4.2 Biéu đồ đánh giá mật độ vi sinh vật theo thời gian lên men 28Hình 4.3 Hình anh phân lập vi khuẩn trên MRS a) Dia cấy trang; b) Đĩa cấy ria .29Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc thuần của các chủng vi khuẩn (a) Chung L1; (b) ChungL2; (c) Chung L3; (d) Chung L4; (e) Chung L5; (f) Chúng Ló - 3ÖHinh 4.5 Két quả thử nghiệm catalase của một số chung vi khuẩn (a) C hung L3, (b)

Hình 4.6 Kết quả thử nghiệm oxidase của một số chủng vi khuan (a) Ching L3; (b)

Hình 4.7 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đối với E coli của các chủng lactic

A, PIA LẤDIsxssensesooiiiiitirdiiotdesbsliBgibgi04GG2300000i00018040501303831098gg/G03RRUEtIS4000015034G00/4ĐS4G0HIGIGH.30.0E4310360.8080 31Hình 4.8 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn đối với S Typhimurium của cácchủng laotio:đã phân ÍẬD»easeeeseseseesnnniieoieiisS0iA053558008856555485135EXE.ERSSEAEASE5E'0082890308:35))Hình 4.9 Phổ điện di của chủng vi khuẩn L4 -2- 22 s22szzszzsezsszsessezsc-se .-33Hình 4.10 Kết qua BLASTN của chủng L4 2¿ 522552 5222E2222E2E2E2Ezxzrres 34Hình 4.11 Cây đi truyền của chủng L4 mang gen 16S rRNA -2-2-552 34

IX

và gây ra ảnh hưởng đối với khả năng kháng thuốc ở vi sinh vật, đồng thời phương phápnay cũng chưa đáp ứng được yêu cau về an toàn thực pham Vì thế việc nghiên cứu cácchat bảo quản thực phẩm cần phải đi theo hướng mới, an toàn hon và hiệu qua hon.

Từ các yêu cầu trên, việc tìm ra các chất bảo quản mới ngày càng trở nên quan trọng

hơn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm Đó là sử dụng các chất kháng khuẩn được

tổng hợp từ vi khuan lactic để làm chất bảo quản bằng sinh học, đây là các hợp chất có

có nguồn gốc từ vi sinh vật, có khả năng kháng khuân mà không gây ảnh hưởng việckháng thuốc ở vi sinh vật và đặc biệt an toàn vời sức khoẻ con người Đây là một phươngpháp còn khá mới mẻ ở nước ta, song với những ưu điểm trên thì đây là một lựa chọnhoàn toản hợp lí Và đề tài: “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng kháng

khuẩn trong dưa giá lên men” đã được thực hiện.

1.2 Mục tiêu đề tài

Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích phân lập được các chủng vi khuẩn lactic

từ nước dua giá lên men Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn được sinh tông hop từ cácdòng vi khuẩn đã phân lập Định danh thành công vi khuẩn lactic có hoạt tính khángkhuẩn mạnh nhất bằng sinh học phân tử

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập vi khuẩn lactic các mẫu dưa giá lên men

Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn từ các vi khuẩn lactic đã chọn

Định danh bằng sinh học phân tử

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Sản phẩm dưa giá lên men

2.1.1 Giới thiệu dưa giá lên men

Dưa giá lên men là một trong các món ăn kèm quen thuộc trong mỗi gia đình hằng

ngày Các nguyên liệu quen thuộc trong món dua giá lên men bao gồm giá đỗ, he, cảrốt, kết hợp với các gia vị như đường, nước tắc, muối

Dưa giá khi lên men sẽ sinh ra các vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hoá con người, gop

phần bồ sung thêm các vi sinh vật cho đường ruột tăng cường hệ miễn dich cho cơ thể

Đồng thời kích thích tiêu hoá nhờ có men lactic, ăn ngon miệng hơn, giảm mỡ trong

máu va cải thiện lưu thông máu Ngoài ra các vi sinh vật có lợi trong dưa giá tạ ra cácenzyme thuỷ phân protein trong thức ăn, giúp cơ thể nhanh chóng hấp thụ dinh dưỡng(Theo Giáo trình mô dun Sản xuất rau quả muối chua, dầm giấm của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn)

2.1.2 Tiêu chuẩn của dưa giá lên men

Tiêu chuẩn cảm quan: Tiêu chuẩn cảm quan của dưa giá lên men được đánh giáthông qua các yêu cau sau:

Yêu cầu chung: đúng trọng lượng tịnh, đúng loại; không lẫn cát sạn hay các tạp chấtkhác.

Màu sắc: các nguyên liệu như giá đỗ, hẹ và cà rốt phải có màu sắc đặc trưng, không

bị biến đen

Trạng thái: giá đỗ và cà rốt giòn chắc, không bị héo mềm nhũn

Mùi: mùi thơm tự nhiên của dưa giá lên men, không có mùi của hiện tượng phân

huỷ hay mùi lạ của các nguyên liệu.

Vi: vị chua ngọt hài hòa, không có vi lạ.

Tiêu chuẩn vi sinh: Chỉ tiêu vi sinh của dưa giá lên men được quy định trong bảng2.1 (Theo Quyết định số 46/2007/QD-BYT về Quy định giới hạn tối da 6 nhiễm sinh

học và hóa học trong thực phẩm).

Bảng 2.1 Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong rau quả muối, rau quả khô

Tên tiêu chuẩn Giới hạn tốiSTT

đa

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số vi khuân/g sản pham 104

2 E.coli, số vi khuan/g sản phẩm 0

3 Coliforms, số vi khuan/g sản pham 10

4 Bacillus cereus, số vi khuan/g sản phẩm 10

5 Clostridium perfringens, số vi khuan/g sản phâm 10

6 Téng số bào tử nam men, nam mốc 10

2.2.Téng quan vi khuẩn lactic

2.2.1 Lịch sử về vi khuẩn lactic

Acid lactic hay acid sữa lần đầu tiên được tìm thấy và mô tả trong sữa chua bởi nhàhóa học người Thụy Điển Karl Wilhelm Scheele vào năm 1780, ông đã tách acid nàykhỏi sữa lên men và tinh chế nó Năm 1847, Bloudean đã xác nhận acid lactic là sảnphẩm cuối cùng của quá trình lên men Năm 1856, Louis Pasteur đã chứng minh rằng

quá trình lên men acid lactic trong sữa tươi được xúc tác bởi vi sinh vật đặc biệt gọi là

vi khuẩn lactic (LAB) Cho đến năm 1878, Joseph Lister đã phân lập được một loại vikhuẩn lactic thuần chủng đầu tiên đặt tên là Bacterium lactis Vi khuẩn lactic này hiện

là Streptococcus lactis và được sử dụng dé lên men sữa dé sản xuất hang trăm sản phamsữa khác nhau Công nghệ sản xuất lactic bắt đầu ra đời, theo thời gian, nhiều công trìnhnghiên cứu lên men đã được thực hiện và cho đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic khác

nhau đã được phân lập liên tục.

2.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuan lactic là những vi khuẩn tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic trong quátrình lên men carbohydrate Hầu hết vi khuẩn lactic đều được xếp chung vào họLactobateriaceae Về hình thái ching không đồng nhất (gồm các vi khuẩn có dang quelẫn vi khuẩn có dạng cầu) nhưng về đặc điểm sinh lí lại giống nhau Vi khuẩn lacticthuộc vi khuẩn Gram dương, không sinh bao tử, hầu hết các loài đều không di động, hôhấp kị khí tuỳ tiện (Abbe và ctv, 1999) Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giải cáchợp chất carbonhydrate và sinh ra acid LAB là nhóm lên men bắt buộc không chứa các

cytochrome và enzyme catalase Chúng có thé sinh trưởng và phát triển khi có hoặckhông có mặt của oxy trong môi trường Vì thế vi khuẩn lactic là vi khuẩn ki khí, vi hiéukhí.

LAB có nhu cầu về đinh dưỡng phức tạp, không một đại điện nào của nhóm này cóthé phát triển trong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucose và ion NH¡” Da

số chúng rất cần các vitamin và acid amin cho sự phát triển nên người ta thường nuôicấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một lượng cao nam men, điển hình là

MRS, dịch cà chua hoặc thậm chí cả máu Theo Quyết định số 08/2006/QD-BYT về

Quy chuẩn kỹ thuật xác định tổng số vi khuẩn lactic trong thực phẩm, khuẩn lạc nghingờ là vi khuẩn lactic sẽ có dạng tròn nhỏ, trong bong, có màu môi trường, màu trắngđục hoặc màu vàng kem hay khuẩn lạc có kích thước to hơn tròn lồi trắng đục và đặcbiệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid

2.2.3 Phân loại vi khuẩn lactic

Hiện nay, các nhà khoa hoc đã tìm được khoảng 20 chi vi khuẩn lactic Aerococus,Carnobacterium, Enterococus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella được coi là vi

khuan lactic chinh (Limsowtin va ctv, 2002) Vé hinh dang thi nhom vi khuẩn này được

xếp vào bốn chi: Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus Ngày nayngười ta b6 sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuan Bifidobacterium

Dựa vào đặc điểm kiểu hình: vi khuẩn lactic được chia làm 2 loại: cầu khuẩn vàtrực khuẩn

Trực khuẩn (Lactobacillus): là trực khuẩn phô biến nhất bao gồm 52 loài Tế bàocủa chúng có thé thay đổi từ hình bau dục đến hình que dài, có thể đứng riêng lẻ hoặckết thành chuỗi Lactobacillus plantarum là hình que có đầu tròn, thang, thường rộng0,9-1,2 um và dài 3-8 pum, xuất hiện đơn lẻ, thành cặp hoặc thành chuỗi ngắn trong khiLactobacillus bulgaricus có dang que dài, mảnh, kích thước khoảng 0,7 — 0,9 um (Landete và ctv, 2010).

Cầu khuẩn (Streptococcus va Leuconostoc): Streptococcus cô tế bào hình tròn hoặcoval, thường xếp thành đôi hoặc thành chuỗi Chúng thường xếp thành chuỗi dài hoặcxếp đôi, ít khi đứng riêng lẻ, đường kính từ 0,5 — 1 um, nhiệt độ phát triển tối ưu từ 30

— 35°C Leuconostoc mesenteroides cô đường kính khoảng 0,5-0,7 um có dạng hình quengắn hoặc hình ovan tuỳ vào môi trường nuôi cấy, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30°C,

nhưng có thê tồn tại ở nhiệt độ từ 10°C đến 30°C (Özcan va ctv, 2019; Dols và ctv,1997) Ngoài ra giống Lactococcus có hình dáng tế bao giống với Leuconostoc nhưnglại thường xếp thành tu, tạo thành đám lớn.

Hình 2.1 Hình ảnh tế bào vi khuẩn lactic a) Cầu khuẩn lactic; b) Trực khuẩn lactic

Dựa vào cơ chế lên men: có thể chia thành 2 kiểu lên men là vi khuẩn lactic lên

men đồng hình và vi khuẩn lactic lên men dị hình

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình: là những vi khuẩn trong tế bào của chúng chứaenzyme aldolase và enzyme triosophotphatizomerase Chúng biến đổi một phân tử

glucose theo chu trình đường phân EMP (Embden-Meyerhof-Parnas) thành hai phan tử

pyruvic và thu được sản phẩm cuối cùng chi là acid lactic:

Co6Hi206 —› 2 CH:COOH —› 2CH:CHOCOOH

acid pyruvic acid lacticTheo Nguyễn Thị Thanh Tâm (2011), các vi khuẩn lactic lên men đồng hình có thé

kể đến là Streptococus cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium casei,Lactobacterium delbruclkii, Lactobacterium cucumerisfermentati.

Streptococus cremoris thường tạo thành chuỗi dai, nhiệt độ phat triển tối ưu từ 25 —30°C, lên men đường glucose, galactose.

Lactobacterium bulgaricus có dạng trực khuân rat dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là20°C, lên men glucose, lactose và có khả năng tạo độ acid cao (3,7% acid lactic).

Lactobacterium casei là những trực khuân rất ngắn, gây chua sữa tự nhiên, thườngphát triển ở nhiệt độ cao hơn Streptococus cremoris, tối ưu là 35°C và tối đa là 45°C,lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 — 1% acid lactic Ở điều

bình thường, chúng gây chua sữa trong vòng 10 — 12 giờ.

Lactobacterium delbruckii là trực khuân lớn, thường gặp trên hạt đại mach, có khảnăng tạo sợi trong quá trình phát triển, nhiệt độ tối ưu từ 45 — 50°C, không có khả năng

5

lên men đường lactose như các loài khác nên chúng không được dùng trong chế biến

sữa.

Lactobacterium cucumeris fermentati là trực khuân, không chuyên động, thườngtìm thấy trong sữa ủ chua, vi khuẩn có đạng tế bào đơn, thường tạo thành chuỗi trongquá trình lên men, khả năng tạo acid tối đa trong môi trường từ 0,9 — 1,2%

Vi khuẩn lactic lên men dị hình: Vi khuẩn lactic lên men dị hình không có enzymeamylase nên chúng chuyên hoá đường theo chu trình pentose photphat Ngoài acid lacticthì quá trình còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ khác bao gồm: acid acetic, malic, fumaric,focmic, etanol, COa, H› và một số chat thơm (diaxetyl, các este), Lactobacillus brevisthường tìm thấy chủ yếu trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột là trực khuân Gram

dương ngắn, tế bào tồn tại riêng biệt hoặc tạo thành chuỗi ngắn, khi lên men rau cải chua

chúng tạo thành acid lactic, rượu etylic, acid acetic và COz Nhiệt độ phát triển tối ưu là30°C Leuconostoc mesenteroides là vi khuân Gram đương, không di động, không sinhbao tử và có dạng hình cầu Thường tôn tai theo cặp hay tạo thành chuỗi, đôi khi nó códang que ngắn và tạo thành chuỗi dài, hình dạng nó sẽ thay đối tuỳ theo môi trường pháttriển Leuconostoc mesenteroides phat triển tốt nhất ở 30°C, nhưng có thé tồn tại ở nhiệt

độ từ 10°C đến 30°C Chúng sử dụng đường glucose làm nguồn trao đổi chất chính cũng

như các loại đường khác như sucrose va fructose, tạo ra ethanol, lactate và CO2 dưới

dạng sản phẩm lên men (Nguyễn Thị Thanh Tâm, 201 1)

2.2.4 Các yêu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Oxy: Theo Huỳnh Ngọc Thạch (2002), các vi khuẩn lactic có thé sống từ kị khí đến

vi hiểu khí Đặc điểm này bị qui định bởi sự không có mặt của hệ enzyme oxi hóa khửcytochrome và catalase trong tế bào Đây là các hệ enzyme đặc trưng của nhóm vi khuẩnhiếu khí dùng dé vận chuyền điện tử và ion H* khi chuyển hóa các chất với sự có mặtcủa oxy phân tử Tuy nhiên, khả năng oxy hóa các chất sở dĩ vẫn thực hiện (được bằngcách sử dụng oxy phân tử) là nhờ các FAD (Flavin Adenin Dinucleotit) Mặt khác, cácenzyme peroxydase trong tế bào có thê thực hiện các chức năng thay cho hệ enzymedehydrogenase nên quá trình vận chuyên ion H vẫn xảy ra Khi đó, NADH¿ làm chấtnhận diện tử và quá trình phân giải H2O2 sẽ tạo ra NAD” có tác dụng bảo vệ tế bảo

NADH+H'+ H202 — NAD* +2H20

Là loại hô hap tùy tiện, vi khuẩn lactic có thé sinh trưởng được cả trong điều kiện hiếukhí Một sô loài thuộc giông Leuconostoc rat can có sự có mặt của oxy trong giai đoạn

6

đầu đồng hóa hexose Một số khác như Streptococcus faecium, Pedicoccus spp.,Lactobacillus plantarrum chỉ đồng hóa glycerin trên môi trường thạch khi có mặt của

OXy.

Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn lactic Tất cả các phản ứng sinh lý, sinh hoá diễn ra trong cơthé đều chịu sự ảnh hưởng của nhân tổ nay, đặc biệt là các phản ứng có enzyme xúc tác.Dựa vào nhiệt độ tối ưu cho lên men và cho sinh trưởng, v1 khuẩn lactic được chia làmhai loại: loại ưa nhiệt và loại ưa 4m Loại ưa nhiệt bao gồm: Lactobacillus bulgaricus,Lactobacillus thermophilus, phát triển tốt ở 45 — 60°C Loại ưa ấm gồm: Lactobacilluscausasicus, Lactobacillus acidophilus, phát triển tốt ở 37 — 45°C và Lactobacillusbrevis, Lactobacillus buchner va Lactobacillus pastorianus phát triển tốt ở 28 — 32°C(Nguyén Thi Thanh Tam, 2011)

pH: Acid lactic là tác nhân chủ yếu dẫn đến sự biến đôi pH đối với quá trình sinhtrưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Giá trị giới hạn thấp nhất của pH mà mà các

giống khác nhau thì khả năng chịu đựng cũng khác nhau, có thể ké đến như Lactobacillus

là 3,2 — 3,5; Pedicoccus là 3,5 — 4,4 trong khi Leuconostoc là 5,0 — 5,5 Khả năng chịu

pH thấp của các loài lên men đồng hình tốt hơn lên men dị hình (Huynh Ngọc Thạch,2002).

Nguồn cacbon: Đối với vi khuẩn lactic thì đường mono và disaccharide là nguồncacbon tốt nhất, còn các polysaccharide hầu như không thê lên men được Tốc độ lênmen của các loại đường khác nhau là khác nhau nhưng khi nhân giống ta dùng một loạiđường có định thì vi khuẩn có thể thích nghi với loại đường đó và về sau chúng pháttriển hiệu quả trên môi trường chứa loại đường này (Võ Thị Minh Lại và ctv, 2017).Nguồn nitơ: Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chấtchứa nitơ Vì vậy dé đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng nguồnnito có sẵn trong môi trường Các nguồn nitơ được sử dung trong nuôi cấy vi sinh vậtthường ở hai dạng: nguồn nitơ hữu cơ và nguồn nito vô cơ Trong đó nguồn nitơ được

sử dụng chủ yếu trong nuôi cấy vi sinh vật là protein như: cao thịt, cao nắm men, trypton,dịch thủy phân casein từ sữa Hiện nay cao nắm men là nguồn nitơ được sử dung

nhiều và có hiệu quả nhất trong phòng thí nghiệm (Võ Thị Minh Lại và ctv, 2017).

Vitamm: Hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sinh

trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Thường phải bổ sung vào môi trường các chất

7

vitamin như khoai tây, cà rốt, dịch tự phân nam men và nhiều chất khác Vitamin đóngvai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào và rat ít vi khuan lactic cókhả năng sinh tong hợp được vitamin (Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2011).

Muối khoáng: Các chất khoáng có vai trò quan trọng trong qua trình trao đôi chất ở

vi sinh vật Các chất khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là nhữngchất khoáng ở dang hợp chất, đơn chất, có thé ở dạng vô cơ hay hợp chất hữu cơ Một

số muối khoáng được sử dung trong nuôi cấy vi sinh vật là: KzHPO¿, KH¿PO4,MgSO¿.7HaO, CaSO¿, Trong các loại muối khoáng đó photpho là loại muối quantrọng nhất mà các vi khuẩn lactic cần Số lượng photpho trong môi trường nuôi cấy cóảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật Nếu hàm lượng qua cao vi sinh vậtkhó phát triển, nếu quá ít sẽ không đủ cho quá trình trao đổi chất và như vậy sẽ ảnh

hưởng rất lớn đến sự đồng hóa carbohydrate (Võ Thị Minh Lại và ctv, 2017)

2.3 Các giai đoạn lên men của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men dưa giáQuá trình lên men dưa giá gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Muối có tác dụng nâng cao áp suất thâm thấu làm co nguyên sinh chất

ở tế bao thực vật, đường và các chất dinh dưỡng trong dịch bào sẽ tiết ra tạo điều kiện

cho các vi sinh vat lactic phát triển Tuy nhiên, vi khuẩn lactic phát triển cùng tạp khuẩn.Hàm lượng muối ăn dùng làm dịch muối chua khoảng 3 — 4%, nồng độ này chưa thêtiêu diệt được các vi khuẩn hoại sinh Nhưng nếu nồng độ muối cao hơn thì có thể ứcchế tạp khuẩn phát triển và cũng kìm hãm vi khuẩn lactic sinh trưởng Ở giai đoạn này,trên bề mặt sẽ xuất hiện những bọt khí, đó là do sự hoạt động của các v1 khuẩn Coli vàmột số vi sinh vật có khả năng sinh khí Một số công trình nghiên cứu cho thay rangchủng vi khuan lactic phát triển chủ yếu trong giai đoạn nay là Leuconostocmesenteroides, một loại cầu khuẩn có khả năng sinh acid lactic và khí, khả năng tích tụacid lactic của loài này thấp (dưới 1%) Khí COa sinh ra trong vi khuẩn giúp ức chế các

vi sinh vật “lạ”, làm tăng điều kiện yếm khí, ngoài ra còn ngăn cản sự oxy hoá vitamin

C và giữ được màu sắc tự nhiên của rau cải Hơn thế nữa, sự phát triển của chủng này

sẽ làm môi trường biến đôi dé tạo điều kiện thuận lợi cho các chủng vi sinh vật lên men

ở giai đoạn sau phát triển Khi nồng độ acid (chủ yếu là acid lactic) đạt 0,25 — 0,3 %, nó

sẽ phát triển chậm dần và chết đi trong khi đó các enzyme mà nó tiết ra vẫn tiếp tụcchuyền hóa đường thành acid lactic

Giai đoạn 2: Ở giai đoạn này lượng vi khuẩn lactic đạt cao nhất và acid lactic cũng

được tích tụ nhiều nhất làm cho độ pH của dich men giảm nhanh tới mức 3,0 — 3,5 Do

môi trường acid như vậy nên các vi khuân gây thối mốc khác không phát triển được và

bị giảm nhanh Các chủng vi khuẩn lactic phát triển trong thời ky này là Lactobacillus

cucumeris, Bacillus brassicae fermentati và một số chủng khác Ö giai đoạn nay

hương vị đặc trưng của sản phẩm lên men cao và chất lượng sản phẩm cuối cùng phụthuộc rất nhiều vào giai đoạn này Cho tới khi nồng độ acid đạt cực đại từ 1,5 — 2 %,cùng với nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp, các chủng này sẽ bị giảm hoạt tính

Giai đoạn 3: Một vài chủng vi sinh vat lactic khác chang hạn như L pentoacetic sẽtiếp tục quá trình lên men và tăng nồng độ lên 2 — 2,5% Khi acid lactic được tích tụ vớihàm lượng tương đối cao thì chính các vi khuẩn lactic sẽ bi ức chế Khi đó, nam mốc vànam men có khả năng phát triển mạnh làm giảm chất lượng sản phẩm vi chúng có khảnăng phân huỷ acid lactic Vì vậy, trong thời kỳ này, cần ngăn ngừa các hiện tượng trên

bằng cách bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (2 — 4°C) hoặc trong điều kiện yếm khí

hay bảo quản bằng các chất sát trùng như muối benzoate, muối sorbate

2.4 Chất kháng khuẩn sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic

2.4.1 Sơ lược về chất kháng khuẩn sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic

Bắt đầu từ những năm 1940, các nghiên cứu về khả năng ức chế vi sinh vật đượcsinh từ vi khuẩn lactic đã được các nhà khoa học và các nhà công nghiệp thực phẩm đặcbiệt chú ý Từ đó đến nay có rất nhiều chất kháng khuẩn đã được tìm thấy, trong đó nisin

là chất kháng khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất Chat kháng khuẩn có théđược định nghĩa là các polypeptide có tính kháng khuẩn, được sản sinh trên các proteinhay các ribosome có khả năng ức chế hay chống lại một phổ hẹp các loài vi khuẩn cóquan hệ gần gũi

Trong thực phẩm lên men, nhờ các chất kháng khuẩn ma sản phẩm có thể kéo daithời hạn sử dụng hơn bằng cách bằng cách kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật gây

hư hỏng và vi khuẩn gây bệnh Dang chú ý là hoạt động của các chất kháng khuẩn này

không tác động tiêu cực đến chất lượng dinh đưỡng và cảm quan của thực phẩm, do đó

bảo tồn được cấu trúc hóa lý của chúng

2.4.2 Phân loại chất kháng khuẩn

Hoạt tính đối kháng chống lại mầm bệnh đường ruột và thực phẩm là một phần thiết

yếu trong các đặc tính sinh học của vi khuẩn lactic, do đó rất quan trọng đối với quátrình lên men và bao quản thực phẩm Đặc tinh kháng khuẩn của các chủng lactic đượcđiều hòa bởi các phân tử kháng khuẩn do các chủng này tạo ra Những chất kháng khuẩnnày có thé được chia thành ba nhóm chính:

a) Bacteriocin peptide hoặc bacteriocin protein

Bacteriocin là protein hoặc peptide được tông hợp từ ribosome của vi khuẩn, có khảnăng chống lại các vi khuẩn có liên quan chặt chẽ hoặc không liên quan với chủng vikhuẩn sản xuất Nghĩa là loại vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin nào thì sẽ kháng lạichính bacteriocin đó Với bản chất là peptide thì bacteriocin sẽ bị phân huỷ bởi enzymeprotease, lipase nên không gây di ứng cho con người va bao đảm an toản cho sức khoẻcộng đồng

Phân loại bacteriocin: Có rất nhiều loại bacteriocin được sản xuất bởi các vi khuẩnlactic khác nhau và chúng có thể được phân loại theo đặc tính sinh hóa và đặc điểm di

truyền Bacteriocin được chia làm 4 nhóm, trong đó các nghiên cứu về ứng dụng của

nhóm I, II là chủ yếu

Nhóm I — Lantibiotics: là những peptid nhỏ (<5 kDa) bên nhiệt, hoạt động theocau trúc màng tế bào và được biến đổi sau phiên mã Các bacteriocin lantibiotic ban đầuđược chia thành hai lớp phụ dựa trên sự tương đồng về cấu trúc

Lớp phụ Ia: bao gồm các peptit tương đối dài, linh hoạt và tích điện đương, hoạtđộng bằng cách hình thành các lỗ trên màng tế bào chất của các loài nhạy cảm Đại diệnđiển hình cho nhóm phụ Ia là nisin, epidermin, gallidermin

Lớp phụ Ib: các peptid có hình cầu đặc trưng, không linh hoạt và có cấu trúc cứng

hơn, thường mang điện tích âm hoặc không có điện tích, thường có hoạt động liên quan

tới việc ức chế các enzymes đặc hiệu cần thiết của vi khuẩn mục tiêu (Deegan và ctv,2006) Lacticin 481, cytolysin, salivarisin là các bacteriocin nhóm Ib (Bierbaum va Sahl, 2009).

Nhóm II — Non-Lantibiotics: có trọng lượng phan tử biến thiên nhưng thường nhỏ(<10 kDa), bền nhiệt, chứa các axit amin thông thường Nhóm này được chia thành banhóm nhỏ:

10

Loại Ha: các bacteriocin có câu trúc dang thang, có cầu nối disulfide và thường tácđộng lên nhóm vi khuẩn Listeria, do vậy còn được gọi là bacteriocin kháng Listeria, đạidiện cho nhóm phụ Ia là leucocin A, acidocin A, pediocin PA-1 (Devi và Halami, 2011).Loại IIb: được hình thành bởi phức hop gồm hai peptide riêng biệt, các peptide này

có ít hoặc không có hoạt động và dường như không có sự tương đồng về trình tự giữacác peptide bổ sung, trong nhóm này điển hình là lactococcin G, plantaricin EF vàplantaricin JK.

Loại IIc: là các peptide nhỏ, bền nhiệt, được vận chuyén bang peptide dẫn dau,trrong lớp phụ này chỉ tìm thấy các bacteriocin đivergicin A và acidocin B

Loại III — Peptide lớn, có trọng lượng phân tử trên 30 kDa và kém bền nhiệt Đạidiện cho lớp nay là helveticin J (Joerger và Klaenhammer, 1986) và V (Vaugham va ctv,1992), acidofilicin A va lactacin A và B Bacteriocin nhóm II thường tac động đến hoạtđộng của các enzyme (vi dụ endopeptidase), dẫn đến việc làm suy yếu thành tế bao của

vi khuẩn mục tiêu (Héchard và Sahl, 2002)

Loại IV: được đặc trưng bởi cấu trúc có chứa các lipid hoặc carbohydrate (Savadogo

và ctv, 2006), hoạt động bằng cách phá vỡ màng tế bào vi khuẩn mục tiêu Đặc điểm

cấu trúc này làm cho các phân tử này nhạy cảm với một số enzyme (tức là enzymeglycolytic hoặc lipolytic) Đại diện cho bacteriocin nhóm IV là plantarlen S va leuconocin S (Silva va cvt, 2014).

Bacteriocin là chất kháng khuẩn mạnh mẽ và day hứa hen Vì vay, vi khuẩn lacticsản sinh bacteriocin là những chủng có triển vọng sử dụng trong các ứng dụng an toànthực pham va nisin là loại bacteriocin duy nhất được FDA chấp thuận sử dụng trongthực phẩm (Ng và ctv, 2020) Tuy nhiên, nhiều loại bacteriocin khác đang được pháttriển để sử đụng trong thực phẩm (ví dụ bảng 2.2)

1]

Bảng 2.2 Bacteriocin sinh ra từ vi khuẩn lactic và ứng dụng trong thực phẩm

Ung dụng trong thực

Bacteriocin Dong vi khuan „

pham Sữa Tôm hùmNisin Lactococcus lactis Cá hồi

Reuterin Limosilactobacillus reuteri Stra tach béo

Gassericin Lactobacillus gasseri Kem sữa trứng

Lactococcin Lactococcus lactis Stra

Enterocin Enteroccocus spp Nước ép táo

(Theo Ibrahim va ctv, 2021)

b) Acid hữu co (acid acetic butyric va acid lactic)

Các vi khuẩn lactic sản xuất các acid hữu co khác nhau có tác dụng kháng khuẩnkhông đặc hiệu (Bảng 2.3) Các acid hữu cơ được vi khuẩn lactic sản xuất là formate vasuccinate Các acid hữu cơ điền hình khác như acid acetic, acid propionic va acid lacticthì được tổng hợp lần lượt bởi một số loài Acetobacter aceti, Propionibacteria vaLactobacillus Acid hữu cơ rất hap dẫn vì chúng cản trở sự phát triển của vi khuẩn Gram

âm va Gram dương, cũng như nắm men và nắm mốc trong một số sản phẩm thực phẩm.Hơn nữa, nó thường được coi là an toàn cho con người sử dụng và đặc tinh kháng khuẩncủa acid hữu cơ còn được cho là do các phân tử phan li bị khử proton khi xâm nhập vaomàng tế bào Một nguyên nhân khác dẫn đến tác dụng kháng khuẩn của vi khuẩn lacticnói chung là các acid hữu cơ và điều này có thé là do tác động phối hợp của các ion phân

li và các phân tử không phân li dẫn đến việc gây tôn thương tế bao

12

Bang 2.3 Acid hữu cơ và ứng dụng trong thực phẩm

Acid hữu : :

Vi khuan sản xuât

cơ

Ví dụ về ứng dụngmầm bệnh thực phẩm

Ứng dụngtrong thựcphẩm

Acetic acid Lactobacillusacidophilus

Butyric acid Lactobacillusacidophilus

Pseudomonas spp.

Esherichia coli Listeria spp.

Phương thức hoạt động kháng khuẩn được tạo ra bằng cách vô hiệu hóa các enzyme chủ

chốt, dẫn đến thay đổi hoạt động xúc tác Sự mat hoạt tính này là kết quả của nhómđicarbonyl cua diacetyl phản ứng với arginine trong enzyme.

Hydrogen peroxide được vi khuẩn lactic tông hợp trong điều kiện không có catalasenội bao, pseudocatalase hoặc peroxidase ở môi trường hiếu khí Trong sữa thô, HaO› có

13

hoạt tính kìm khuẩn và phương thức hoạt động kháng khuẩn càng được tăng cường nhờ

sự kích thích hệ thống lactoperoxidase-thiocyanate Sự hiện diện của enzyme HaO¿ vàlactoperoxidase trong sữa thô đã tạo ra anion hypothiocyanite được tạo ra và hợp chấtnày có khả năng phá hủy các thành phần tế bào ở vi khuẩn gram âm như protein màng

do quá trình oxy hóa nhóm SH Reuterin được tổng hợp bởi một số loài

Limosilactobacillus reuferi, thường là các phân tử kháng khuẩn nhỏ và có đặc tính khángkhuẩn ức chế một số vi khuẩn Gram dương và Gram âm Reuterin có khả năng khánglại một loạt các enzyme phân giải mỡ và phân giải protein trong thực phẩm và có phạm

vi pH hoạt động rộng Ngoài ra, reuterin làm bất hoạt các enzyme chủ chốt, chang hạnnhư ribonucleotide reductase.

Bang 2.4 Cac hợp chất kháng khuẩn sinh ra từ vi khuẩn lactic va ứng dụng trong thựcphẩm

5 3 Ung dung

Cac phan tir „ Vi du về ứng dung mam

Vi khuan san xuat 7 trong thực nhỏ bệnh thực phâm „

phâm Escherichia coli O157:H7

H202 Lactobacillus johnsonii Salmonella enterica Rau xa lach

Listeria monocytogenes

; Limosilactobacillus Campylobacter spp.

Reuterin Thit

reuteri Escherichia coli O157:H7

; Streptococcus diacetyl _— Escherichia coli O157:H7

Diacetyl Thit

lactis Salmonella typhimurium

(Theo Ibrahim va ctv, 2021)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất kháng khuẩn được vi khuẩn lactic sinhtổng hợp hiện nay là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Cácchat kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này màviệc ứng dụng của vi khuẩn lactic được đa dang và phong phú hơn Nhờ vậy, các nghiêncứu của các nhà khoa học trên thế giới đã đạt nhiều thành tựu, ứng dụng thành công vàgóp phân vào việc nâng cao chât lượng cuộc sông của nhân loại.

14

Vào năm 1983, Geis và ctv đã tiến hành khảo sát thử nghiệm về khả năng sản sinhbacteriocin của liên cầu khuẩn lactic Nhờ tinh chế một phần bằng kết tủa ammoniumsulfate cho thay phố ức chế của tất cả bacteriocin rat hạn chế Hầu hết các liên cầu khuẩnlactic và một số ít thuộc chi Clostridium, Leuconostoc và Pediococcus đều bị ức chế.Không có loại bacteriocin nào tác động lên vi khuẩn gram âm Các chủng vi khuẩn gây

bệnh cũng được đặc trưng dựa trên hàm lượng plasmid.

Sáu chủng Enterococcus faecalis đã được Arihara và ctv thử nghiệm về hoạt tínhkháng khuẩn chống lại Listeria monocytogenes (1991) Bang cách sử dụng thử nghiệmtrên thạch, Enterococcus faecalis NRIC 1143 và 1144 cho thấy hoạt động mạnh mẽchống lại tất cả năm chung Listeria monocytogenes được thử nghiệm Hoạt tinh khángkhuẩn của các chủng này bị ức chế bởi một số enzyme phân giải protein

Năm 1996, Jack và ctv đã nghiên cứu đặc tính hóa học và đặc tính kháng khuẩn của

piscicolin 126, một loại vi khuẩn được sản xuất bởi vi khuẩn lactic Carnobacteriapiscicola JG126 Piscicolin 126 là một loại bacteriocin peptide ức chế sự phát triển củamột số vi khuẩn gram dương, nhưng không có tác dụng đối với sự phát triển của một sốloại nam men và vi khuẩn gram âm Kết quả ghi nhận được việc bồ sung piscicolin 126vào hệ thống thực phẩm thử nghiệm bột giăm bông đã ức chế sự phát triển của Listeriamonocytogenes trong ít nhất 14 ngày Piscicolin 126 có hiệu quả hơn hai chế phẩm

bacteriocin thương mại được thử nghiệm trong cùng một hệ thống

Nghiên cứu quá trình sản xuất hydrogen peroxide của vi khuẩn lactic và xác địnhcác yêu tô chính liên quan thi Endo và ctv (2009) đã thực hiện đề tài về việc bổ sungnatri acetat dé gia tăng sản xuất hydrogen peroxide ở vi khuẩn Weissella cibaria Kếtquả nghiên cứu ghi nhận rằng Weissella cibaria sản xuất một lượng lớn hydro peroxidetrong môi trường nuôi cấy có sục khí, trong một quá trình phụ thuộc vao sự hiện diệncủa axetat trong môi trường nuôi cấy NADH oxydase có thé là enzyme chủ chốt trongquá trình nảy.

Năm 2014, các nghiên cứu về tiềm năng Probiotic của các chủng Lactobacillus cóhoạt tính kháng khuẩn chống lại một số chủng gây bệnh ở người do Shokryazdan và ctvthực hiện Mục tiêu của nghiên cứu này là phân lập, xác định và mô tả đặc điểm của một

số chủng vi khuan lactic từ sữa mẹ, phân trẻ sơ sinh, nho lên men và chà là, như nhữngchế phẩm sinh học tiềm năng có hoạt tính kháng khuẩn chống lại một số chủng gây bệnh

ở người.

15

Nghiên cứu của Adetoye và ctv (2018) được thực hiện nhằm xác định hoạt tínhkháng khuẩn Salmonella enterica spp và tính phù hợp của LAB phân lập từ phân giasúc ở Nigeria làm chế pham sinh học trong thức ăn gia súc Lactobacillus amylovorusC94 va Lactobacillus salivarius C86 là 2 chủng lactic chứng minh cho tiềm năngprobiotic đầy hứa hen trong nuôi cấy in-vitro và xa hơn nữa sẽ được thử nghiệm thêmin-vivo trong thử nghiệm thực dia trên động vật.

Vào năm 2022, Wang và ctv đã nghiên cứu được hoạt chất kháng khuẩn chính củaLactobacillus pentosus L-36 của chất nỗi trên bề mặt nuôi cay không có tế bào (CFCS)

là peptide L-36 CFCS én định nhiệt, hoạt động trong điều kiện axit, không nhạy cảmvới các ion kim loại và thé hiện tác dụng kháng khuẩn bằng cách làm hỏng màng tế bào

va DNA Sử dụng vi khuan acid lactic dé ức chế S aeureus cung cấp cơ sở lý thuyết choviệc phát hiện ra các chất kháng khuẩn mới và có ý nghĩa to lớn trong việc phát triểncác chất thay thế kháng sinh, giảm tình trạng kháng vi khuẩn và đảm bảo an toàn thựcphẩm cho vật nuôi

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, các nghiên cứu và ứng dụng của các chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic

dù vẫn còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan Tuy nhiên hiện nay, việc nghiêncứu về chất kháng khuẩn được vi khuan lactic sinh tổng hợp đang được nhiều nhà khoahọc chú ý và quan tâm hơn.

Nguyễn Thị Hoài Ha và ctv đã nghiên cứu khả năng sinh tong hop bacteriocin củachủng Lactobacillus plantarum L24 được phân lập từ nước dưa (2002) Kết quả chothấy chủng vi khuẩn lactic vừa có khả năng sinh acid lactic, vừa có khả năng sinhbacteriocin II , protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10-30 kDa

Bên cạnh đó, năm 2006, Đỗ Thị Hạnh đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làmnem chua Nhằm kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và góp phần tạo

hương vị cho nem chua.

Đến năm 2014, Lê Ngọc Thuỳ Trang và Phạm Minh Nhật đã tiến hành phân lập vàkhảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuan củaLactobacillus plantarum Kết quả này là tiền đề cho các nghiên cứu về tách chiết hợpchat kháng khuẩn từ Lactobacillus plantarum nhằm ứng dụng trong lĩnh vực bảo quảnthực phẩm cùng các ứng dụng trong phòng bệnh trên vật nuôi

16

Gần đây, Bùi Hoàng Đăng Long và ctv (2021) đã thành công trong việc mở ra triểnvọng ứng dụng trong lĩnh vực làm đẹp và chăm sóc sức khỏe con người Nghiên cứu đã

phân lập và định danh được hai chủng là Propionibacterium acnes DNF00413 mẫu nhân

mụn và Lactobacillus plantarum 7.11E có khả nang sinh bacteriocin với hoạt tinh khángkhuân tốt nhất Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum L39 từnước chua tau hủ sinh chất kháng khuẩn được xác định ở môi trường bé sung sucrose2% (w/v), peptone 1% (w/v) và KaHPO¿ 2 % (w/v), hàm lượng đường từ 5,73 — 5,87%(w/v), pH từ 6,09 — 6,14 và mật số giống chủng log7 (tế bao/mL)

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào các san

phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ồn định và về mặt cảm quan, có nhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phâm lên men lactic tự nhiên Có được ưu điểm này là do

ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp chất khángkhuẩn, một chất bảo quản thực phẩm

17

CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 8/2023 đến tháng 12/2023, tại phòng Vi sinh tiên tiến

(Phòng 108), Giảng đường Cẩm Tú, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ ChíMinh.

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu

3 mẫu dưa giá khác nhau được được mua tại khu vực Chợ Ham Chui, phuong

Linh Xuân, Thanh phố Thủ Đức cho vào túi PE sạch, ghi thông tin mẫu thu thập, vị trílay mẫu Mẫu được lưu trữ mát chuyên về phòng thí nghiệm trong 24h Sau đó, theodõi và do chỉ tiêu về độ pH và độ brix trong 7 ngày lên men

3.3 Thiết bị và dụng cụ

3.3.1 Thiết bị

Danh sách các thiết bị sử dụng trong đề tài sẽ được trình bày theo bảng 3.2

18