Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập, định danh nấm Chaetomium sp. trong mẫu đất trồng cây ăn quả ở tỉnh Tây Ninh

Ở Việt Nam một vài loài Chaetomiumcũng đã được phân lập và sản xuất thành công chế phẩm sinh học có khả năng kháng lạimột số nam bệnh trên cây trồng.. Định danh được các dong nắm Chaetom

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, ĐỊNH DANH NAM Chaetomium sp TRONG MAU DAT TRONG CAY AN QUA

O TINH TAY NINH

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện =: NGUYEN THI NGOC TÂM

Mã số sinh viên : 19126155

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 2/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP, ĐỊNH DANH NAM CHAETOMIUM sp.

TRONG MAU DAT TRONG CAY AN QUA

O TINH TAY NINH

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TRAN THI THU HÀ NGUYEN THI NGOC TAMThS ĐÀO UYEN TRAN DA

Thu Đức, 2/2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại Học NôngLâm TP.HCM các Thay/ cô Khoa Khoa học sinh học đã giảng day và tạo điều kiệncho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Những kiến thức mà em nhậnđược từ Thay/cé sẽ là hành trang quý giá giúp em vững bước trong tương lai

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Th.S Trần Thị Thu Hà, Th.S Đào UyênTrân Đa cùng với chị Vũ Ngọc Khánh Như, anh Trần Trọng Nghĩa và tất cả các thành

viên trong phòng thí nghiệm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt

thời gian qua dé em có thé hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, em xin cảm ơn Th.S Tran Thị Thu Hà là có van học tập trong suốt 4năm đại học và tập thể lớp DH19SHB cùng với gia đình, bạn bè, người thân đã luônquan tâm, tin tưởng và động viên giúp em có thêm động lực thực hiện tốt khóa luận

nảy.

XÁC NHAN VÀ CAM DOAN

Em tên Nguyễn Thi Ngoc Tam, MSSV: 19126155, Lớp: DH19SHB thuộc ngành Công

nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóaluận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên

cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoản toan chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

Tp Hô Chi Minh, ngay tháng năm

Người việt cam đoan

Nguyễn Thị Ngọc Tâm

il

TÓM TẮT

Mục tiêu dé tài là xác định được một số chi nam Chaetomium trong các mẫu đất trồng

cây ăn quả và định danh được các dòng nam Chaetomium spp dựa vào các đặc diém hình thái và sinh học phân tử.

Từ 30 mau dat thu thập tại Tây Ninh bằng phương pháp bay giấy lọc đã phân lập được

17 dòng nắm T01-T17 Dựa vào sự tương đồng về các đặc điểm hình thái: tản nắm, quảthé, bao tử chia làm 6 nhóm TN1-TN6

Dé phát hiện vùng gen 775, đã sử dung primer F là ITS4 và primer R là ITS5 Kết quảđịnh danh được 6/6 mẫu Trong 6 mẫu nắm khảo sát đều khuếch đại được vùng 77% vamẫu T05 có độ tương đồng cao 95% với loài Ovatospora mollicella; T10 có độ tươngđồng cao 96% với loài Chaetomium globosum; TŨ7 có độ tương đồng cao 96% với loàiArxotrichum gangligerum; T01, T15, T08 có độ tương đồng 98% với loài Arcopilus

cupreus.

1H

The objective of the project is to identify some Chaetomium fungal genera in fruit growing soil samples and identify Chaetomium spp based on morphological and

molecular biological characteristics.

From 30 soil samples collected in Tay Ninh using the filter paper trap method, 17 fungal strains T01-T17 were isolated Based on the similarities in morphological

characteristics: fungal colonies, fruiting bodies, and spores are divided into 6 groups TNI-TN6.

To detect the ITS gene region, primer F was ITS4 and primer R was ITS5 The results identified 6/6 samples In the 6 fungal samples surveyed, the ITS region was amplified and sample T05 had a high similarity of 95% with Ovatospora mollicella species; T10 has a high similarity of 96% to the species Chaetomium globosum; T07 has a high similarity of 96% to the species Arxotrichum gangligerum; T01, T15, T08 have 98% similarity to the species Arcopilus cupreus.

IV

Re lnseueeessnonntribsentttsnggpsbitpgigttS9nSS0V10200.G:/S0-2E001-,003.000gg000g)300g080 11.2 Mục tiêu của đề tab eo cccccccccecsecsessessessessessessessesaesesseesessessessessessessessesseeaeeaeeaes |

1/5.N\GI.QdHE THIS BILSTTaesanineiseonngetrintiiiostointnSGI8NEHENGHGIBDG.S-DNGBGDGESRGSRSIEGNAINMS040103018590.5840730308 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2-2¿222222+2E++2EE2EE2EEzExzzzxrzre 32.1 Téng quan nam Chaetomium Sp n6 6 -.+ 32.1.1 Gidi thigu ndim Chaetominm nan ẽ 2.1.2 Đặc điểm hình thái nắm Chaetomium sp . -2-552©52575255s55s5s5cce-s-~3

2.1.3 Sur phan e4 4

2.1.4 Hoạt tinh cơ ban của Mam eecccceccecececsessessesecsecseseeseeseseesecsesecsesseseeseseeseeeesseeeveees 42.2 Cơ chế hoạt động của nắm - 2-2-2 2S2E£SE+EE£EE2EE22E22E23221212212211212212 22 2e, 52.2.1 Sản sinh kháng sinh đối kháng c2 1 21100240.11620201.1612161 5

2.2.2 Ky sinh 00/2) nh 6

2.2.3 Đặc điểm phân loại của nắm Chaetomium SỤ -. -2-552©52225255222z255z25szc: 62.3 Những nghiên cứu về chế phẩm sinh học -2- 22 2222++2z+2z++z+zzzz+zxzex 7

2.3.1 Những nghiên cin ñgoài HƯỚC s:-c:scsccsscptissi S01 60646616156c650848485455355641159.EVL140.48430/814E Ế/

CHƯƠNG 3 VAT LIEU PHƯƠNG PHÁP 2-22 2 S+E2£E+E+E+E+Ez£xzEzrerxee 103.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2 2¿©22+22+2E+2EE+EE2EE2EEEErzrxrrrrerre 10

3.2 Vat ligu 0/00(ìi.9 0 10

A Errmwertg HE HỆ Huaauasabonootiiigdiiing0ia04G80001-00/84004048.0101300Q0000 30000121008 10

3,222 Ney etn Vật LIỆU sáng DE5000063840563580153509015159535SBXHESRS.SSESBĐ14EĐLAPEIGSLSSSELEESIRGBASG8435E8 10

3:2:2-1 Dựng aụ to thiết ee 103.2.2.2 MOi truOng MUG CAY ni 10

3.3 Phương phần ñnghiẾnGỨ cscesceseesesnesiescisksisi6itiA5E SEN geS30.08Sl2ES38/846881-36I0:GĐE8306.0.301500056530,58 10

3.3.1 Phương pháp phân lập nấm Chaetomiuim Sp 5 22-22-552©5225225522552£: 10

3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu -2- 2 2 ©22S12E22E22E2E2EE212E121 2121121212212 22c 10

3.3.1.2 Phân lập và làm thuần nắm từ mẫu đất - 2 2++22+z22++2z+z22zzex 113.3.2 Dinh danh cac dong nam Chaetomium sp phan lập được dựa vào các đặc điểm

3.3.34 Điện,d1 TEN Gel S8 41D SŠ is sessssssessnnux014E10132161015883S501248E38048.088h01AG13038:0008001 58028385: 13

CHƯƠNG 4 KET QUA THẢO LUẬN 2-2 52+S2+E2EE£E2E2EE2E22E2E2E22E 2E crxe 154.1 Kết quả phân lập và định danh nam Chaetomium Sp -. -2 2252-552 154.2 Định danh bằng hình thái 22 22S2222SE2E22EE2EE222127122212712711221 712222 2e l65.321 Phtoentm phfpssử Tổ gổ |) es 134.2.1 Đặc điểm hình thái nhóm TN1 gồm mẫu nam T01 -:225z552¿ 304.2.2 Đặc điểm hình thái nhóm TN2 gồm mẫu nấm T05 2 22222522 314.2.3 Đặc điểm hình thái nhóm TN3 gồm các mẫu nam T06, T07, T15 3⁄24.2.4 Đặc điểm hình thái nhóm TN4 gồm các mẫu nam T10, T11, T12, T16 334.2.5 Đặc điểm hình thái nhóm TN5 gồm các mẫu nắm T02, T03, T04, T08, T13, T17

¬

4.2.6 Đặc điểm hình thái nhóm TN6 gồm các mẫu nam T09, T14 -2- 354.3 Định danh nam Chaetomium sp bằng kỹ thuật sinh học phân tử 364.3.1 Khéch đại vùng gene ITS -rDNA bằng cặp môi ITS4/ ITS5 374.3.2 Phân tích kết quả trình tự 2: 2 22222E+EE2EE2EEzEEerxerxerxerxerererxereexc dT

9:53: CA plats ME GII s:ssnssnsnonanguinbitioddiiolrsa4 SURDIRIGREGSENGHLEENSIEDNGIGIERHGSIRGERGEHIGSSH0010/0208332gg9 40

“na 42

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ, -2-©252©25c2cxcczccrreerreee 43

TT hi Ï-7ý_—_——== h h hằằẶẶ 43

IP oa 1 5 D 43TAI LIEU THAM KHẢO 5-52 S22S2SE£E2E£EE£EE2EEEEEE12521271211712121121 111.21 xe 44

PHU LLỤC 2 ©7222<22212221222122112211221122112111211121112111211121122112211211 11 tre 46

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT

Ctv Cộng tác viên

DKTB Duong kinh trung binh

PDA Potato Dextrose Agar

CMA Cornmeal Agar

WA Water Agar

Vil

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 3.1 Trinh tur öố 1n 12

Bang 3.2 Thành phan phản ứng PCR o ccccccecsssessessessessessesstessesseseessessessseeseesseees 13

Bang 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR - cece cee eeceeceeceseeeceeeeeneeneenees 13

Bang 4.1 Ty lệ số mẫu có nam Chaetomium ở các mẫu phân lap - 15Bang 4.2 Đường kính nắm trên môi trường PDA -cccc‡‡2<>>>+>2 15Bang 4.3 Kết qua do OD c 21111222 111122 1112111111 2n sen rớ 37Bảng 4.4 Kết quả so sánh trình tự đã xử lí -2-©22©22222222222222222222E22EzExrrrervee 4]

Vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoạt chat kháng sinh đã được xác định từ nắm Chaetomium sp 5Hình 4.1 Bay nam ở thời điểm 20 ngày sau khi đặt giấy vô trùng - l6Hình 4.2 Đặc điểm hình thái dong nắm T01 -2-©22©2222S222ZcEScczerrrrree 18Hình 4.3 Đặc điểm hình thái dong nắm T02 2-2: 22 522S+2E22E22E22E22E22Ez2ze2 19Hình 4.4 Đặc điểm hình thai dong nắm T03 2-52 2+SE+2E+2E+2E22EZEZEZEzzze2 20Hình 4.5 Đặc điểm hình thai dong nắm T4 2-2 22 2+SE+2E+2E+2E2E+ZEZEzzzezze2 20Hình 4.6 Đặc điểm hình thai dòng nắm T05 -2- 2-22 52+2E22E22E22E22E22E2Z2z2ze2 21Hình 4.7 Đặc điển hình thái đồng nằm T06 ecccssesenscesswnvarsservarseuserintovneanwserenwronieseres 22Hình 4.8 Đặc điểm hình thái dòng nấm TŨ7 22 2 2222222++22222+z2zzzzzzz+2 22

Hình 4.9 Đặc điểm hình thái dong nam T08 -2- 2-22 5222S22E22E2E2E2Ezzzzze2 23

Hình 4.10 Đặc điểm hình thái dòng nấm 'T09 2-22 S+SE+EE+2E2£E£E+£EZEzzzzzez 24Hình 4.11 Đặc điểm hình thái dong nấm 'T10 2-22 2222+2E+2E+2EZE2ZEzEzzzzzze2 25Hình 4.12 Đặc điểm hình thái dong nấm TÌ 1 2- 2+22+S+EE+££+E££E+£zzEzzzzrxzea 26Hình 4.13 Đặc điểm hình thái dòng nấm 'T12 2-2 s+SS£2E+£E££Ez£Ez£EzEzzezzez 26Hình 4.14 Đặc điểm hình thái dòng nấm T13 - 2-2 2+S£+2E+£E+£E£E+£EzEzzzzzzez a7Hình 4.15 Đặc điểm hình thai dòng mam T14 . 2: 2¿©2222222z22+z2szzzzzz+2 28

Hình 4.16 Đặc điểm hình thái dòng nấm T15 2- 22522 5222E22z£2z£zz2zzzz>se2 28

Hình 4.17 Đặc điểm hình thái dòng nấm T16 2-2 5225S+2E+2E+2E+£E+£EzEzzzzze2 29Hình 4.18 Đặc điểm hình thái dòng nấm TÌ7 2- 2+ 2222+2E+2E+2E+ZE+zEzzzzse2 30Hình 4.19 Đặc điểm hình thái nhóm nắm TN1 (T01) 5 2+522s+£2+zz£szzzzzz 31Hình 4.20 Đặc điểm hình thái nhóm nấm TN2 (T05) 5-52 55222££z2S2z22522 32Hình 4.21 Đặc điểm hình thái nhóm nắm TN3 (T07) 25-+csszs-zcscs -.- 33Hình 4.22 Đặc điểm hình thái nhóm nắm TN4 (T10) - 52 52 2+S£2s+£z+Ezzzzzxzez 34Hình 4.23 Đặc điểm hình thái nhóm nam TN5 (T08) - 2-5255 5s+2£22s2z22522 35Hình 4.24 Đặc điểm hình thái nhóm nấm TN6 (T15) 2: -222s+2zz22++£zz+zz+z+2 36Hình 4.25 Kết quả PCR của 6 dong nam với cặp môi ITS4/ITSS trên gel agarose 1,5 % 37

Hình 4.26 Kết quả so sánh trình tự đã xử lí, khếch đại vùng ITS trên NCBI của 6 mau 40

Hinh 4.27 Cây phat sinh loài dựa trên vùng ITS — rDNA -c -+-c<-c+s 41

1X

lại có tác dụng tiêu điệt nắm bệnh gây hại.

Nam Chaetomium sp là một loại nam đối kháng có khả năng tiết ra enzyme tancông và ức chế nhanh các loại nắm gây bệnh ở cây trồng và trong đất Một số nghiêncứu đã chỉ ra rằng các chế phẩm sinh học được sản xuất từ chủng nam Chaetomium,giúp cây sinh trưởng phát triển mạnh và cho năng xuất chất lượng cao Chế phẩmKaetomium có phố tác dụng rộng được các nhà khoa học Thái Lan nghiên cứu sáng chế

có khả năng phòng trừ được nhiều loại nam bệnh Ở Việt Nam một vài loài Chaetomiumcũng đã được phân lập và sản xuất thành công chế phẩm sinh học có khả năng kháng lạimột số nam bệnh trên cây trồng Có rat ít nghiên cứu dé cập đến việc phân lập, địnhdanh nắm Chaetomium sp.7 từ đất trồng các loại ăn quả Vì vậy, em tiến hành đề tài: “Phân lập, định danh nam Chaetomium sp trong mẫu đất trồng cây ăn qua ở Tây Ninh”.1.2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được một số chi nấm Chaetomium trong các mẫu đất trồng cây ăn quả

Định danh được các dong nắm Chaetomium phân lập được dựa vào các đặc điểm

hình thái và sinh học phân tử.

1.3 Nội dụng thực hiện

Nội dung 1: thu mẫu và phân lập các dòng nam Chaetomium

Nội dung 2: định danh các dòng nam Chaetomium phân lập được dựa vào cácđặc điểm hình thái

Nội dung 3: định danh các dòng nam Chaetomium bằng kỹ thuật sinh học phân

tử (PCR).

Thời gian và địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2023 đến tháng

12 năm 2023 Tại phòng vi sinh ứng dụng (RIBE 208), Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường,trường Đại học Nông Lâm TP HCM

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan nam Chaetomium sp

2.1.1 Giới thiệu nắm Chaetomium sp

Chi Chaetomium thuộc

Bộ Sordariales có 120 chi va 700 loài khác nhau Riêng chi Chaetomium có khoảng 300 loài khác nhau Các loài Chaetomium có đặc trưng riêng là có các lông bao,

còn gọi là “sợi tóc”; cellulose là vật chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát sinh bào

tử Nam Chaetomium sp duoc tim thay trên nhiều loại bề mặt vật chất khác nhau ở điều

kiện ấm áp và khô như: phân, rơm, giấy, hạt, mảnh vụn thực vật, lông chim, Nhung

môi trường sống chủ yếu van là ở trong đất Theo Soytong và Quimio (1989), các loàiChaetomium có thé được phân lập bằng phương pháp bay nam bằng mảnh giấy lọc đặttrên bề mặt đất âm trong dia petri (vì nam Chaetomium có enzyme phân huỷ cellulose

nên dé dang chọn lọc được Chaetomium).

2.1.2 Đặc điểm hình thái nắm Chaetomium sp

Khuẩn lạc: phát triển nhanh trên môi trường thạch khoai tây, kích thước 6- 9emsau 9-10 ngày nuôi cấy Khuan lạc ban đầu có màu trắng như bông, sau chuyển sangmàu xám nhạt, rồi dần chuyên sang màu nâu đen do sự hình thành các thé quả ascoma.Các quả thể này có dạng hình gần cầu hoặc hình quả lê, kích thước lớn, hình thành rảirác khắp bề mặt khuẩn lạc, tạo thành đám màu nâu đen khi về gia ( Soytong, 1991).

Soi nam: Soi nắm có vách ngăn, có màu xám hoặc nâu nhạt, moc từ môi trường

và từ sợi khí sinh (Soytong, 1991).

Cơ quan sinh sản: Quả thé hình quả lê phinh ra ở giữa, có mau tối (đen hoặcnâu đen), có mở lỗ; có nhiều lông bao mọc xung quanh bên ngoài, kích thước 100-500

x 100-400 um, với các kiểu dang và độ dày mỏng khác nhau tuỳ loài; có loại thang hay

uốn nếp kiểu gon sóng, loại ngoằn ngoèo kiểu ruột già, loại chỉ ngoan ngoéo trên đỉnhsợi, loại xoăn lon, loại đơn giản, loại phân nhánh (Soytong, 1991) Quả thé lúc còn non

có hình cavat đến hình gậy chứa đựng từ 4-8 bao tử màu nâu Khi quả thé chín các nangnam giống như cột trụ hoặc hình chùy nhú lên từ đầu của qua thé, chứa các nang bào tử

thang hoặc không thang hàng Kích thước của nang nam là 68-84 x 5-7 im Các nang

bao tử có màu, thành tế bảo nhẫn, có nhiều hình dạng khác nhau (chủ yếu là hình quachanh) với 1 lỗ mầm, kích thước 10-12 x 2.8-4 um Bao tử bọc sinh ra từ túi bào tử hìnhtrụ hoặc sợi nấm, kích thước bào tử 7-8 x 5-6 um (Rai và Mukerrji, 1964)

2.1.3 Sự phân bố

Nam Chaetomium sp là một rong những nhóm nam lớn nhất trong hệ vi sinhvật đất Chúng phân bồ rộng rãi trong tự nhiên, và sự phân bố của chúng cũng tuân

theo quy luật như các loài vi sinh vật khác Số lượng của nam Chaetomium sp chủ yếu

nằm trong các tầng đất dưới Đặc biệt ở tầng đất sâu 25-30 em thì số lượng

Chaetomium sp có nhiều nhất (Soytong và Quimio, 1989)

2.1.4 Hoạt tính cơ bản của nắm

Một trong những hoạt tính cơ ban và quan trọng của loài C?haefomium là khả năng

sinh enzyme ngoại bào mạnh như cellulase Cellulase là enzyme phố biến ở nhiều loàiChaefomium Đây là enzyme khá quan trọng trong quá trình sống của loài nắm này.Chúng không chỉ giúp phân giải các xác thực vật tạo nguồn dinh dưỡng cho sinh trưởng

và phát triển của nắm ma chúng còn tạo cơ chế đề xâm nhập và phá hủy một số loại namgây bệnh khác bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào nắm như ức chế hình thànhthành tế bào B (1,3) - D - glucan của nam Đây là một trong những cơ chế cơ bản dé ký

sinh trên nắm bệnh của Chaetomium

Chaetomium kích thích sinh trưởng của cây bằng cách tiết ergosterol làm tăng độmùn trong đất, từ đó kích thích cây sinh trưởng làm tăng sức đề kháng cho cây

Nam Chaetomium sản sinh ra bào tử trong vùng đất của rễ cây trồng, có kha

năng cạnh tranh dinh dưỡng mạnh hon so với nam bệnh, nhất là trong điều kiện đất có

nhiêu mùn hơn.

Chaetomium còn tông hợp được các chất hoạt hóa sinh học nhóm Mycotoxin

(Chaetoglobosin Q, R, T,U) và nhóm Epipolythiodioxopiperazine (Chaetoglobosin A,

B, C) Đây là nhóm chất có hoạt tính kháng nắm, có khả năng tiêu diệt các tế bao nambệnh bang cach bệnh, kết qua là làm giảm hiệu qua của tác nhân gây bệnh cũng như

mức độ nhiễm bệnh (Zhang và ctv, 2012)

2.2 Cơ chế hoạt động của nam

2.2.1 Sản sinh kháng sinh đối kháng

Chaefomium sp được biết đến là một loại nắm đối kháng có khả năng tổng hợp

một số hợp chất kháng sinh có tác dụng ức chế hoạt động của nam bệnh Cho tới nay, 4hoạt chất kháng sinh đã được xác định từ nam Chaetomium sp., bao gồm:

¢ Chaetoglobusin C: Có khả năng ức chế sinh trưởng của một số nam gây bệnh câynhư Colletotrichum gloeosporioides, Col dematium, Fusarium oxysporum, Phytophthora, palmivora, P parasitica, P cactorum, Pyricularia

oryzae, Rhizoctonia solani va Sclerotium rolfsii Cac loai nam nay 1a tac nhan

gay bệnh than thư, thối trái, thối rễ, héo xanh, (Soytong và ctv., 2001)

Bên cạnh đó hợp chất Chaetoglobusin C còn có khả năng kích thích tính kháng bệnhcủa cây trồng

« Chaetoviridins A và B: Có khả năng ức chế sinh trưởng và phát triển của một số

loại nam gây bệnh thối rễ, đạo ôn như Pyricularia oryzae, Pythium ultimum (Park

và ctv., 2005)

« Rotiorinols do nam Chaetomium cupreum tạo ra có khả năng ức chế sinh trưởng

của nhiều tác nhân gây bệnh gồm cả nắm và vi khuẩn (Kanokmedhakul va ctv.,

2.2.2 Ký sinh (mycoparasism)

Nam Chaetomium sp ky sinh trực tiếp lên nam hại sau đó sử dụng các enzymes

dé tan công tác nhân gây bệnh Chaetomium là nhóm nam có hệ enzyme ngoại baophong phú Nam có khả năng tạo các enzyme cellulases, chitinases và B-1,3-glucanases.Các enzyme này giúp Chaetomium có thé phân hủy vách tế bao nam that (fungi) đượccau tạo bởi chitin (là các chuỗi N-acetyl-D-glucosamine không phân nhánh) và B-1,3-glucan hay vách tế bào của nam trứng (Phytophthora, Pythium), được câu tạo bởi

cellulose va glucan (Hung và ctv, 2015).

2.2.3 Đặc điểm phân loại của nắm Chaetomium sp

Phân loại theo phương pháp truyền thống

Nam Chaetomium được chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên các đặc điểmhình dang qua thé, lông bề mặt và lông bên của qua thé, chi tiết quả bao tử Trong thực

tế Chaetomium rat đa dạng về hình dang quả thé, đa dang của lông bao Hầu hết các tácgiả đều dựa trên sự phân nhánh và cách cuộn xoắn của lông bao bên ngoài quả thé làm

tiêu chí chính cho phân loại, trong khi Von Arx và ctv (1984), dựa trên đặc điểm của

nang bao tử, quả bao tử và dựa vào bề mặt thành của nang bào tử

Trong khuôn khô chỉ Chaefomium, có trên 300 loài đã được nghiên cứu và mô

tả Trong đó phân loại của Soytong và Quimio (1989) có những mô tả và hình ảnh rõ

ràng nhất từ quả thể, lông bao quả thể (đặc điểm của lông, sự phân nhánh của lông),

hình dạng quả bào tử, hình dạng nang bảo tử.

Ở Philippines, Quimio và Soytong (1989) đã phân lập được 19 loài hoàn chỉnhtrong tổng số 88 mau phân lập Ở Thai Lan, Soytong (1991) đã phân lập được 15 loàihoàn chỉnh trong tổng số 190 mẫu phân lập

Định danh dựa vào trình tự vùng ITS

DNA tổng số của nam được chiết bằng phương pháp CTAB theo phương pháp

Doyle (1987) Phan ứng PCR được thực hiện với primer ITS4 và [TSS Phan ứng được thực hiện theo chu trình nhiệt như sau: 94°C: 5 phút, 25 chu ky (94°C: 30s, 51°C: 30s,

72°C: 1 phút), 72°C: 10 phút Sản phẩm của phan ứng PCR được kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 1,5% Kích thước của đoạn DNA thu được sau phan ứng PCR được so

sánh với thang DNA chuẩn (1 Kb Plus DNA ladder Marker) sau đó sản pham PCR đượcgiải trình tự Mức độ tương đồng về trình tự ITS của hai chủng nghiên cứu được so sánhvới các chủng đã công bố trên Genbank bằng công cụ BLAST Sử dụng phần mềm

6

MEGAII để xây dựng cây di truyền Dựa vào cây phân loại và độ tương đồng dé xácđịnh mối quan hệ di truyền của chủng nghiên cứu.

2.3 Những nghiên cứu về chế phẩm sinh học

2.3.1 Những nghiên cứu ngoài nước

Các loài nam Chaetomium được tim thay trong đất và phân hữu cơ Các loàiChaetomium globosum và C Cochlioides đối kháng với loài Fusarium vaHelminthosporium (Tveit va Moore, 1954) Người ta nhận thấy rang bang cách sử dung

các chủng C globosum cụ thể có thé kiểm soát tốt nhiều loại mầm bệnh Bang cách phủ

bao tử lên hạt ngô người ta có thể ngăn ngừa bệnh bạc lá cây con do Fusarium roseum

ƒˆsp.cerealis cv graminearum (Chang và Kommedahl,1968; Kommedahl va ctv, 1981).

Cac loài Chaetomium được phân lập từ đất sử dụng như tác nhân kiểm soát sinhhọc được khai thác ở Thái Lan từ năm 1989 Ketomium là tên thương mại của thuốc trừnam sinh học phổ rộng là chế phẩm sinh học sản xuất từ 22 chủng Chaetomium

globosum và Chaetomium Ketomium đã được đăng ký bởi Bộ Nông nghiệp Thái Lan

(số 458/2539, 02/9/1996) sử dụng như thuốc trừ nam sinh học kiểm soát bệnh hai câytrồng, như phân bón sinh học phân hủy chất hữu cơ, cảm ứng hệ miễn dịch thực vật vànhư chất kích thích tăng trưởng 22 chủng đã được phát hiện có khả năng ức chế các tácgây gây bệnh khác nhau (Soytong và Soytong, 1997) Các báo cáo chỉ ra rằng các chủng

C cupreum vad C globosum có khả năng ức chế nam bệnh như Pyricularia oryzae,

Curvularia lunata, Rhizoctonia oryzae, Phytophthora palmivora, Phytophthra

parasitica (Soytong va Quimio, 1989) Các bào tử sông của loài Chaetomium sp làmgiảm bệnh héo rũ cây cà chua do nam Fusarium oxysporum, F lycopersici trong nhữngthí nghiệm trong nhà kính hay trên đồng ruộng và cũng ngăn ngừa bệnh thối gốc ngô do

Sclerotium rolfsii (Soytong, 1991).

Các chủng nam nay được tạo thành các chế phẩm sinh học dạng bột hay dạngviên, được cấp bằng sáng chế và đăng kí đưới tên Ketomium có hiệu quả phòng chốngbệnh héo rũ trên cây cà chua (F oxysporum f sp lycopersici) và bệnh thối gốc ngô

(S rolfsii) đã được đánh giá thành công trong các thử nghiệm tròng thí nghiệm va nhà kính (Soytong,1992).

Năm 2017 Viện Công nghệ King Mongkut Ladkrabang Bangkok, Thái Lan đã

nghiên cứu thành công Công thức sinh học và sản phẩm nano từ Chaetomium cupreumCC3003 để kiểm soát bệnh đốm lá lúa var Sen Pidoa ở Campuchia Curvularia

lunata được phân lập từ bệnh đốm lá lúa var Sen Pidoa và được kiểm tra khả năng gâybệnh Chaetomium cuprewnCC3003 thể hiện hoạt tính kháng nấm chống

lại C /unafa trong thử nghiệm nuôi cay kép Chiết xuất thô hexane, chiết xuất thô

EtOAc và chiết xuất metanol-thô từ C cupreum đã ức chế sự hình thành bào tử của C.lunata với ED50 lần lượt là 6,41, 0,83 và 7,81 pg/mL

2.3.2 Những nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam việc nghiên cứu nam Chaetomium được tiễn hành từ năm 1999 bởi

Viện Di truyền nông nghiệp, sau khi chuyên gia nắm đối kháng Kasem Soytong sang

thăm và làm việc với phòng bệnh học phân tử thực vật Viện Di truyền nông nghiệp Cácnghiên cứu, tìm kiếm định danh các loài Chaetomium Các nghiên cứu thử nghiệm hiệu

lực chế phẩm sinh học trừ nấm Chaetomium được sản xuất từ các chủng nam

Chaetomium globosum va Chaetomium cupreum đã được thực hiện trong phòng thí nghiệm

Chế phẩm Ketomium cũng đã được thử nghiệm và đăng ký thành công tại ViệtNam trên một số bệnh cây trồng: bệnh đạo ôn trên lúa do Pyricularia oryzae gây ra,bệnh thối rễ cây cà chua nam Fusarium oxysprum gây ra, bệnh thối rễ và vàng lá câyhoa cúc do nam Rhizoctonia solani gây ra Các nghiên cứu đã phân lập và định danhđược 4 loài Chaetomium, nghiên cứu được khả năng đối kháng của hai loài Chaetomium

globosum và Chaetomium cupreum O Việt Nam trong phòng thí nghiệm, đã chứng tỏ

rằng nam có khả năng đối kháng cao với với các loài nấm bệnh như: Curvularia lunata,

Fusarium olucopersici, Sclerotium rolfsii, Pyricularia oryzae, P palmyvora, P Parasitica, Colletotrichum gloeosporioides.

Năm 2002-2003 Viện Di truyền nông nghiệp đã san xuất thử thành công chếphẩm trừ nam sinh học từ các chủng Chaetomium được tìm thấy ở Việt Nam, với têngọi Chae VDT và đã tiến hành thử hiệu lực chế phẩm trừ nam sinh học này lên một sốloài cây trồng như: Cam Canh, Thông, hoa Hồng, hoa Cúc và Cà Chua Ngoài ra ở việnkhoa học kỹ thuật nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc, Nguyễn Văn Thiệp và cộng sự(2016) đã có những nghiên cứu bước đầu về khả năng ức chế của nắm Chaetomium vớimột số loại nắm gây bệnh chính trên chè, cà phê, cao su Tuy nhiên, những nghiên cứunày van hạn chế về số loài nam đối kháng Chaetomium, và các nghiên cứu chỉ mới là

những nghiên cứu bước đâu.

Năm 2018 Viện Di truyền nông nghiệp đã sản xuất thành công chế phẩm sinhhọc Fugi Can phòng trừ bệnh đốm nâu trên cây thanh long Giúp phòng và trừ bệnh dém

nâu, tạo miễn dịch cho cây, kích thích cây sản sinh các chất phytoalenxin chống lại các

tác nhân gây bệnh, kích thích tăng trưởng, ra rễ mới cải tao đất và tại đinh dưỡng hữu

cơ và tăng năng suất

Năm 2019 Trung tâm Uom tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao đã nghiên

cứu thành công Quy trình sản xuất chế pham sinh học từ nấm Chaetomium cupreum và nam

Arthrobotrys oligospora dé phòng trừ bệnh lở cô rễ trên cây dua leo dựa trên cơ chế đối

kháng của các chủng vi nam đối với vi sinh vat gây bệnh hại cây trồng Trong đó, nam đốikháng Chaetomium cupreum là loài có khả năng ức chế nhiều tác nhân gây bệnh cây gồm

cả nam va vi khuan; nam Arthrobotrys oligospora được công bố có kha năng bay tuyếntrùng, đóng vai trò như một tác nhân sinh học trong kiểm soát nắm bệnh hại cây

Năm 2021 Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam đã hoàn thiện được công nghệ

sản xuất chế phâm trừ bệnh từ vi sinh vật có ích, công nghệ nay tao ra sản phẩm sử dụng

an toàn cho con người, môi trường và sản phẩm sẽ dan thay thé thuốc hóa học trừ bệnhtrong sản xuất nông nghiệp Chế phẩm CP2-VMNPB giúp bồ sung vi sinh vật có íchvào trong đất, chúng sẽ hạn chế sự phát sinh thành dịch của dịch hại (hiệu lực trừ bệnhtrên mô hình chè và cà phê dao động từ 81,52% đến 82,31%), kích thích cây trồng pháttriển, tăng năng suất (năng suất tăng so với đối chứng dao động từ 15,38% đến 27,37%),giảm đầu tư, từ đó tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 7 năm 2023 đến tháng 12 năm

2023 Tại phòng vi sinh ứng dụng (RIBE 208), Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường,trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các dòng nam Chaetomium phân lập được từ đất trồng cây ăn quả: cam, bưởi,

chuối ở tỉnh Tây Ninh

3.2.2.2 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong các thí nghiệm:

Môi trường WA: glucose 20 g/1, agar 20 g/1.

Môi trường PDA: khoai tây 200 g/l, glucose 20 g/1, agar 20 g/l.

Môi trường CMA: Nước chiết ngô 60 g/l, glucose 20 g/l, agar 20 g/l

3.3 Phuong pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phan lập nam Chaetomium sp

3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu

Các mẫu đất được lấy tại Tây Ninh ở các huyện Châu Thành, Tân Châu, TrảngBàng Tổng số mẫu là 30 mẫu, mỗi huyện lấy 10 mẫu đất 5 mẫu ở độ sâu 0-15 cm và 5

mẫu ở độ sâu 15- 30 cm Đối tượng nghiên cứu: cam, bưởi, chuối.

Phương pháp thu mẫu: Lấy mẫu đất ở độ sâu 0-15 cm và 15-30 cm ở các vườn

cây ăn quả ở Tây Ninh, mỗi điểm lay 2 mẫu (1 mẫu ở độ sâu 0-15 cm; 1 mẫu ở độ sâu

10

15-30 cm) với lượng 500 g đất/mẫu, mỗi mẫu ở cùng một độ sâu sẽ được lay ở nhiều

nơi khác nhau trong vườn và trộn đêu.

Các mẫu thu thập được đều cho ngay vào túi PE đưa về phòng thí nghiệm Cácmẫu đất được bảo quản đề xử lý dần

Mẫu được ghi rõ các thông tin: Ngày, địa điểm lấy mẫu, đánh số mẫu Thời điểm lấy

mẫu trong ngày.

3.3.1.2 Phân lập và làm thuần nam từ mẫu dat

Phân lập bằng phương pháp bẫy nắm: Các mẫu đất được phơi khô và nghiền nhỏ,sau đó đất nghiền được cho vào đĩa petri loại đường kính 90 mm với lượng khoảng 2/3đĩa Đất được làm âm bằng nước cất vô trùng Các mảnh giấy lọc vô trùng, kích thướckhoảng 1 cm? được đặt trên bề mặt đất trong dia petri Các đĩa đất được ủ trong tủ định

ôn ở điều kiện 28°C và hàng ngày kiểm tra sự hình thành quả thé trên bẫy giấy dưới kínhhiển vi soi nổi Khi qua thể xuất hiện thì chuyên lên môi trường WA, sau đó tiếp tục caylên môi trường PDA dé làm thuần và theo dõi sự phát sinh phát triển của bao tử

Nam thuộc chi Chaetomium sp được phân loại đựa vào đặc điểm hình thái theo

khóa phân loại của Soytong và Quinio (1989) Theo hình dạng, màu sắc tản nắm: tất cảcác mẫu phân lập được nuôi cấy trên môi trường PDA, sau 7 ngày nuôi cấy ghi nhậncác đặc điểm về tan nam Theo hình dạng, màu sắc quả thé, bào tử: tat cả các mẫu phânlập (MPL) được nuôi cấy trên môi trường PDA, sau 14 ngày nuôi cấy ghi nhận các đặcđiểm về quả thé Quan sát hình thái quả thé, cách phân nhánh, hình dang lông bề mặtquả thé, hình dang quả bao tử, nang bào tử dưới kính hiển vi để nhận diện nam dựa vào

khóa phân loại.

Bao quản và lưu giữ: nam Chaetomium sp được bảo quản trên môi trường PDAtrong ống thạch nghiêng

3.3.2 Định danh các dòng nam Chaetomium sp phân lập được dựa vào các đặcđiểm hình thái học

Sau khi phân lập và làm thuần các mẫu nam Chaetomium sp ở các huyện ChâuThành, Tân Châu, Trảng Bàng của tỉnh Tây Ninh, tiến hành quan sát các đặc điểm tảnnam, hình thái sợi nam, quả thé, bào tử, túi bào tử, râu và đo kích thước tan nam, quathé, bao tử, râu theo khóa phân loại của Soytong va ctv (1989) để định danh nam

Chaetomium.

lãi

3.3.3 Định danh các dòng nam Chaetomium sp bang kỹ thuật sinh học phân tử

(PCR)

3.3.3.1 Tach chiết DNA nắm Chaetomium sp

Các mẫu nam được nuôi cấy trên môi trường PDA sau 7 ngày cấy

Nghién sợi nam thu được trong dung dich Lysis Bufer ủ ở 65°C trong 1 giờ

Thêm 300 pl hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1),

vortex, ly tâm 10000 vòng/phút ở 28°C trong 5 phút Thu phan dịch nổi vào một

eppendorf 1,5 ml mới.

Thêm 200 pl CI, vortex, ly tâm 10000 vòng/phút 6 28°C trong 5 phút.

Hút 100 yl dich nổi và một eppendorf 1,5 ml mới, thêm 100 l isopropanol va 3

ul sodium acetate, u lạnh 30 phút Ly tam 10000 vòng/phút ở 28°C trong 10 phút, bỏ

phan dich nổi, thu phan kết tủa trắng

Rửa sạch DNA bang 500 pl ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/phút ở 28°C trong

3 phút, loại bỏ dich nồi Thực hiện 2 lần

Dé DNA khô cho đến khi phan tủa chuyên sang màu trắng trong, hòa tan trong

50 ul dung dịch TE 1X, pH 8,0, ủ ở 55°C cho đến khi phan tủa trang hòa tan hoản toàn

dung dung dịch TE 1X, giữ ở 4°C hay 20°C cho tới khi sử dụng (Doyle & Doyle, 1987).

3.3.3.3 Phương pháp khuyếch đại gen bằng kỹ thuật PCR

Sau khi thu được DNA tổng sé, tiến hành phan ứng PCR dé khếch đại đoạn trình

tự ITS của nam bang cặp mdi ITS 4 và ITS 5 Cặp môi nay dùng dé khếch đại đoạn

DNA kích thước 550 — 650 bp (White va ctv, 1990).

Cho vào mỗi ống PCR loại 0,5 ml với tổng thé tích phản ứng là 25 wl, trong đó

có chứa 12,5 ul đệm PCR; 2 ul DNA tổng số; 0.5 ul mỗi loại mỗi và 9,5 pl nước khử

ion.

12

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR

Thành phan phan tng Nôồng độbanđầu Néngd6phanimg Thể tích (ul)

Master Mix 2X 1X 12,5

ITS4 100 uM 10 uM 0,5 ITS5 100 uM 10 uM 0,5

Kéo dai 72°C 30 gidy

Kéo đài cuối TC 30 giây 1

Giữ sản pham 4%C 1

3.3.3.4 Dién di trén gel agarose

San phim PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, cho 5 ul san phâm PCR trộnđều với 10 tr] Gel red cho vào từng giếng Kích thước của đoạn DNA thu được sau phanứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp Quá trình điện di được thực hiệnbằng đệm TAE 0,5X và hiệu điện thế 100V trong 25 phút Quan sát gel đưới tia tử ngoại(UV) của máy đọc kết quả Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi giải trình tự hai chiều

Dựa vào trình tự thu được so sánh với trình tự gen trên GenBank dùng phần mềm trực

tuyến BLAST tại NCBI Sử dụng phần mềm MEGA X để tạo cây phát sinh loài của cácchủng nắm phân lập được

3.3.4 Phương pháp xử lí số liệu

Sử dụng phần mềm Microsoft Excel dé tổng hợp số liệu, xử lý thống kê theoANOVA, trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm Minitab 19

13

Dùng công cụ BLAST trên NCBI dé so sánh trình tự với các loài nam đã có trên

ngân hàng gen (Genbank).

Phần mềm MEGA X dé vẽ cây di truyền

14

CHUONG 4 KET QUÁ THẢO LUẬN

4.1 Kết qua phân lập và định danh nắm Chaetomium sp

Sau 15 đến 20 ngày bay nam trên đĩa petri, những quả thé xuất hiện với các sợi lông đặctrưng dé nhận biết của nam Chaetomium sp Từ 30 mẫu đất thu được ở tỉnh Tây Ninh

phân lập được 17 mẫu nắm nghi Chaetomium Quy tắc ký hiệu mẫu là đánh số từ T01 —

T17 Trong đó, số mẫu đất có xuất hiện nam Chaetomium ở các địa điểm không giống nhau Mẫu dat ở Châu Thành có sự hiện diện của nam Chaetomium chiêm tỉ lệ cao nhất

là 70%, tiếp đến là mẫu đất ở Tân Châu chiếm tỉ lệ là 50% và thấp nhất ở Trảng Bàngchiếm tỉ lệ là 20%

Bảng 4.1 Tỷ lệ sô mẫu có nam Chaetomium ở các mẫu phân lập

Tổng SỐ Số mẫu xuất hiện nam Tỉ lệ (%) số Địa điểm Cây kímẫu Chaetomium mẫu có nam lây mẫu chủ

Hình 4.1 Bay nam ở thời điểm 20 ngày sau khi đặt giấy vô

trùng (A) Bây nắm sau 20 ngày; (B) Quả thé xuất hiện sau 20 ngày

bay nam.

Kết quả bay nam cũng cho thấy ở tat cả các điểm lấy mau, số mẫu xuất hiện nam

Chaetomium độ sâu 15-30 cm nhiều hơn lớp đất ở độ sâu 0-15 cm, đất thu thập ở Tân

Châu có 4/5 mẫu xuất hiện và ở Châu Thành có 4/7 mẫu xuất hiện Sau khi bẫy nắmkhoảng 2 — 3 tuần, qua thé nắm Chaetomium xuất hiện trên bề mặt các bẫy giấy, các quathé mọc tách biệt nhau, lông bám nhiều, có màu đỏ va màu xám ở Kết quả này hoàntoàn phù hợp với những nghiên cứu của Soytong và Quimio (1989) về đặc điểm phân

bố của chi nam này

4.2 Định danh bằng hình thái

Các mẫu nấm T01, T04, T05, T06, T07, T10, T15, T16 phát triển nhanh hơn so

với mẫu nắm T02, T03, T08, T09, T11, T12, T13, T14, T17 trong cùng một thời điểmnuôi cấy (bảng 4.2)

Các mẫu nam Chaetomium phân lập được, được lưu trữ trên môi trường CMA trong ốngthạch nghiên, được kí hiệu và đặc tên đề thuận lợi trong quá trình theo dõi

16

Bảng 4.2 Đường kính nắm trên môi trường PDA

Ký hiệu mau nam Đường kính nắm Chaetomium trên môi trường

PDA (cm) 7NSC 14NSC

T01 6,00°4+ 0,10 8,20%¢ + 0,44 T02 5,00%®+ 0,20 8,00" + 0,10 T03 4,90% + 0,26 7,90° 40,26 T04 6,30°° + 0,46 8,30 + 0,30 T05 6,60°° + 0,36 §,20°°* + 0,30 T06 6,30°° + 0,44 9,00? + 0,10 T07 6,40°° + 0,26 9,008 0,17 T08 6,00° + 0,17 8,20°° + 0,26 T10 6,00°4 + 0,20 9,002 + 0,20

L7

Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T01 (Châu Thanh)

sau 7 ngày cấy; (C) Tản nam sau 14 ngày cấy; (D) Quả Thể, (E) Lông quả thể; (F) Bao tử; (G-]) Túi bào tử:

Qua hình 4.2 cho thấy rằng mẫu T01 có tản nam mọc đều, sát bề mặt thạch, sợi

nắm mảnh ở giữa có màu hồng cam rìa trắng và có vòng tròn đồng tâm, sinh tiết sắc tốmàu hồng Quả thé có dang hình cau, lông bề mặt dài, dạng gon sóng ở ngọn Bào tử

có dang hình thoi, có 1 lỗ mầm Bào tử ban đầu có màu trắng, chuyên màu sang xanh

lá mạ, dan chuyền sang xanh đậm

Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T02 (Châu Thành)

Đặc điểm hình thái cho thay tản nắm mọc đều, sát bề mặt thạch, sợi nắm mảnh,

ở giữa có mau trắng ria có vòng tròn màu hồng cam, sinh tiết sắc tố màu hồng Quả thé

có dạng hình cầu, lông phan trên qua thé có màu vàng và lông bám phan đầu quả thé cómàu vàng hồng, dạng gợn sóng ở ngọn Bảo tử ban đầu có màu trắng, chuyển màu sang

xanh lá mạ, dân chuyên sang xanh đậm.

18

Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu nam T02 (4,B) Tản nắm

sau 7 ngày cấy; (C) Tản nắm sau 14 ngày cay; (D) Quả Thể, (E) Lông qua thé; (F) Bào tử; (G-]) Túi bào tử

Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T03 (Trảng Bàng)

Qua hình 4.4 cho thấy rằng mẫu T03 có tản nắm mọc đều, sát bề mặt thạch, sợi

nam mảnh, ở giữa có màu trang ria có vòng tròn màu hồng cam, sinh tiết sắc tổ màuhồng Qua thé dạng hình qua lê, lông bề mặt dài có màu vàng, dang gon sóng ở ngọn.Bào tử có đạng hình thoi, có 1 lỗ mầm Bào tử ban đầu có màu trắng, chuyển màu sang

xanh lá mạ, dân chuyên sang xanh đậm.

19

Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu nấm T03 /4,8) Tan

nam sau 7 ngày cay; (C) Tản nam sau 14 ngày cay; (D) Quả Thể, (E) Lông quả thé; (F) Bao tử; (G-]) Túi bào tử

Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T04 (Châu Thành)

Hình 4.5 Đặc điểm hình thái mẫu nắm T04 (4,B) Tản nắm sau 7 ngày cấy; (C) Tản

nam sau 14 ngày cay; (D) Quả Thể; (E) Lông quả thé; (F) Bào tử; (G-]) Túi bào tử:

Đặc điểm hình thái có tan nấm mọc đều, sát bề mặt thạch, sợi nam mảnh, ở giữa

có mau hông cam ria trang và có vòng tròn đông tâm, sinh tiệt sắc tô mau hông Quả thé

20

dạng hình quả lê, lông bề mặt dài có màu vàng, dang gon sóng ở ngọn Bao tử có dạnghình thoi, có 1 lỗ mầm Qua thể ban đầu có mau trắng và dan chuyền sang mau nâu.Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T05 (Châu Thành)

Hình 4.6 Đặc điểm hình thái mẫu nam T05 (4,B) Tản nắm sau 7

ngày cay; (C) Tản nam sau 14 ngày cay; (D) Quả Thể, (E) Lông quả thé;

(F) Bào tử; (G-]) Titi bào tử

Đặc điểm hình thái có tản nấm mọc nồi và vươn cao trên bề mặt thạch, tản nắm

có màu xanh đậm và không sinh tiết sắc tô trên môi trường PDA Quả thé có dạng hìnhcầu, có màu xám, lông bề mặt dài, đạng xoắn cuộn chặt, có vách ngăn Bào tử dạng hìnhhạnh nhân Bao tử ban đầu có màu trắng, chuyên mau sang xanh lá mạ, dần chuyền sang

xanh đậm.

Đặc điểm hình thái màu sắc mẫu nắm T06 (Châu Thành)

Đặc điểm hình thái có tản nắm dày, mọc bông xù trên bề mặt môi trường, có màuvàng nhạt, dạng vòng tròng đồng tâm Quan sát thay mặt dưới của tan nấm xuất hiệnvòng tròn màu xám đen ở tâm của mặt đĩa Quả thể có hình cầu, có màu xám, dạng xoắn

cuộn chặt, có vách ngăn Bào tử có dạng hình thoi Bào tử ban đầu có màu trắng, chuyên

màu sang xanh lá mạ, dân chuyên sang xanh đậm.

21