Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập vi sinh vật phân giải cellulose từ phụ phẩm cây chuối tại huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai

Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi sinh vật phân lập ...284.3.. tồn, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa sau một thời gian sửdụng, đạt nhiều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

——

PHAN LAP VI SINH VAT PHAN GIẢI CELLULOSE

TU PHU PHAM CAY CHUOI TAI HUYEN MANG YANG

TINH GIA LAI

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : BÙI THỊ HUỆ

Mã số sinh viên : 19126057

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thú Đúc, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LAP VI SINH VAT PHAN GIẢI CELLULOSE

TU PHU PHAM CAY CHUOI TAI HUYEN MANG YANG

TINH GIA LAI

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS VÕ THI THUY HUE BUI THI HUE

KS NGUYEN MINH QUANG

TP Thu Đúc, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được bài khóa luận va 4 năm học dai học, tôi xin bày tỏ lòng

kính trọng và biết ơn sâu sắc đến:

Ban Giám hiệu Trường Dai học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủnhiệm Khoa Khoa học Sinh học, cùng các Quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức, giúp

đỡ trong suốt 4 năm học và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cô Võ Thị Thúy Huệ và Thầy Nguyễn Minh Quang đã tận tình góp ý và hướngdẫn cho tôi về phương pháp và nội dung nghiên cứu cũng như truyền đạt nhiều kinhnghiệm quý báu, có những lời khuyên, động viên thiết thực để giúp tôi hoàn thànhkhóa luận tốt nghiệp

Chị Nguyễn Thi Thùy Trang và những người bạn, người em tại Phòng Nam ăn

& nắm dược liệu đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm đề tài

Và con đặc biệt cảm ơn sâu sắc đến gia đình mình đã cổ vũ, động viên controng quá trình thực hiện dé tài này dé con có thành quả như ngày hôm nay

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2024

Sinh viên thực hiện

Bui Thị Huệ

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Bùi Thị Huệ, MSSV: 19126057, Lớp: DHI9SM (Số di động:

0388762513, Email: 19126057@st.hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận tốt

nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là

hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoan toàn chịu trách nhiệm trước hội

TÓM TẮT

Việt Nam là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn phế phụ phẩm nôngnghiệp rất phong phú và đa dạng Việc sử dụng phụ pham nông nghiệp làm phân hữu

cơ vi sinh là giải pháp tối ưu, vừa giảm thiểu ô nhiễm môi trường vừa tận dụng làm

phân hữu cơ Vì vậy, việc nghiên cứu được tiến hành đề phân lập các dòng vi sinh vật

có khả năng phân giải cellulose từ phụ pham nông nghiệp là lựa chọn thích hợp Visinh vật được phân lập từ 9 mẫu đất và phụ phẩm cây chuối ở Dak Ya, huyện MangYang, tỉnh Gia Lai Kết quả thu được 20 chủng vi sinh vật có khả năng phân giảicellulose, trong đó có 9 chủng vi khuẩn, 10 chủng xạ khuẩn và 1 chủng nam Khao sát

khả năng phân giải cellulose của các chủng vi sinh vật bằng phương pháp cấy chấm

điểm trên môi trường CMC, tuyển chọn được 4 mẫu có khả năng phân giải cellulosemạnh nhất với đường kính vòng phân giải là G2.5 (31,50 mm), N1 (29,50 mm), G2.1

(21,00 mm), X4.2 (20,50 mm) Thực hiện định danh sinh hóa và định danh sinh học

phân tử dựa trên trình tự 16S rDNA, và cho kết qua chủng G2.1 là Bacillus

xiamenensis, chủng G2.5 là Bacillus mojavensis, ching X4.2 là Streptomyces diastaticus subsp ardesiacus va ching N1 1a Penicillium citrinum.

Từ khóa: cellulose, cellulase, vi khuân, nam, xạ khuan

1H

Vietnam is an agricultural production country, so the sources of agricultural waste are very rich and diverse Using agricultural by-products as microbial organic fertilizer is the optimal solution, both minimizing environmental pollution and making use of organic fertilizer Therefore, research conducted to isolate microbial strains capable of degrading cellulose from agricultural by-products is an appropriate choice Microorganisms were isolated from 9 soil samples and banana tree by-products in Dak

Ya, Mang Yang district, Gia Lai province The results were 20 strains of

microorganisms capable of degrading cellulose, including 9 strains of bacteria, 10 strains of actinomycetes and ] strain of fungus Investigating the cellulose degrading ability of microbial strains using the dot culture method on CMC medium, 4 samples were selected with the strongest cellulose degrading ability with a resolution circle diameter of G2.5 (31.50 mm), N1 (29.50 mm), G2.1 (21.00 mm), X4.2 (20.50 mm).

Performed biochemical identification and molecular biological identification based on

16S rDNA sequence, and showed that strain G2.1 is Bacillus xiamenensis, strain G2.5

is Bacillus mojavensis, strain X4.2 1s Streptomyces diastaticus subsp ardesiacus and

strain N1 is Penicillium citrinum.

Keywords: cellulose, cellulase, bacteria, fungi, actinomycetes

IV

2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối ở nước ta 2 2 s+22+E++z+EzEzzxzrxzez 4

2.2 Tổng quan về cellulOse s2 2¿+22++2E+2E++2EE+2EE+2EE22EE12E31221221221221221 222122 e2 5

73,1 Giỏi thiệu chung: vũ giÌ|H [BE seossesseesaeiebdioiiogiDioboSgidu26gg028.xiogi2i0G88/021-00040/:00 5

20: ốn/m TAZ VMI CO UIA SỂPơgsng ceca teats sine seascape tenes 5

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme cellulase 2 2 2222SE+2E2E++EE2EE22E22+22Ezzxzzzxee 6

2.2.3 46/0 a0: an 7 2.2.4 Các ứng dụng của nhóm celÏuÌase - + + 5+ + + ***x S2 HH HH ri 8

2.3 Một sơ nghiên cứu trong nước Và nước nIBOải c5 5c S Street §

2.3.1 Những righiện cứu tone TƯỚỨC ái: cacccc0 0166 610114112 2631451154488551151SL 010488314 1044031386 0338 8

2.3.2 Những nghiên cứu nước RBOảI - - + 5 + xxx re, 10

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2+ 2+S2E£2E2E2E+EEzEzzrrxced 12

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2+ s2S+2E+2E£2E2E2E22E22322322322222222Xe2 12

3.2 Vật liệu, dụng cụ và hĩa chất 2: 2-+s2s+2E£2E92E22E22322112112121121121121121 22 2x2 12

3.2.1, Đối tượng nghiễn Giƒ - -secSSS 2H H210 2216 001000230 012030 gE12202060 12

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hĩa chẤt -2-522222E22E22E223221121121221221121221221222 x2 12

3:3; FHƯƠNE DHậP 18 DICH CW sec asecreecsesesssinorniasistsgitdsltv0Dsi9883000535059HS008S838ICLE00000283838gE5E 12

3.3.1 Phương pháp thu mẫu phân lập vi sinh vật 2 ©222222S22S22S2z2zzzz25+2 12

3:52: Phuong pháp phần lap iss cscncsmanscesnamene nian meena 133.3.3 Làm thuần và giữ giống - 2: ©2¿©22222222222122112212211221221211221211211 21.2 xe 13

3.3.4 Khao sát đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật 2- 22 22+2z222+2E222z22z2ze2 14

3.3.4.1 Quan sát hình thái - - - + 2222223221111 1 12211119 111191112811 981 1n na 14

<1 44-2: NUTT TAI sạn sợ tho eens secre NGG2SHSISG.ONSESEDARSEEEEDSSSRHGESGSHĐLMESISEMSS0S8SgE2SGEBDSISRSESISNEE230E 14

3.3.5 Định danh dựa vào đặc điểm sinh hĩa -2- 2 S+2E2£E£2E££E££EZEEErrEzxrrrrrei 15

350/951; KH ane đÌ:đỐHDticscsesseiiioitseietoegpixliss0825004633A/580858E2g00M208APHSSĐG.2SSĐS.Si-g1618020.4g0 15

3.3.5.2 Khao sát hoạt tinh cafaÏaSe 2 222 22211121112 1 22111211111 121111 erree 16

3.3.5.3; THỨ nghiệm Khả nane lên men đưƠHE cazsecissecsisixiBisteviogtiCQlv10gg80086xgãe 16 3.3.5.4 Thir nghiém citrate eee 16

3.3.5.5 Thử:nghi@m kha nang sinh:innll:sssszsssssosisseesseotiosgssig4G06366160040330.000g0888L088 17

3.3.6 Định tính khả năng phân giải cellulose của các chủng vi sinh vật - 17

33, 1z 101111: dan VỊ Sinh Val cecvoresere mien eaerraum en 183.3.8 Phương pháp xử lý va phân tích số liệu 2-2222 ©222++2z2z++2xzzx+zzxeex 18

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUAN 0.ceececcccssessessesesseseeseseesecseseesseseeesesseeeeeeees 19

VI

AL Két qua 0n s-s344,.ĂH Ả ẢẢ 19

TT TPR te rt TT THusassesesadeesononthiaginbbsgiotititiikitertrcibbitbidlgigEgstereiotEsttbtlsfnks 19

4.1.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của các chủng vi khuân 2-22- 22552 22

4.1.3 Phân lập xạ WWAM nssncsnessescosensornensoadncsnssneonssedesnnennsenssansensonnsnsisennesneannsansaneste 23

4.1.3 Phân lập nấm - 2: 2¿+222SE22E222192112212211211211121121121121111211211211211 21 re 27

4.2 Định tính khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi sinh vật phân lập 284.3 Kết quả định danh sinh học phân tử 2-22 22222E£22E£2E2EEz£E+zEEzzxzzzxsree 31

CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHI o.oo coccccccccssecseesesesseeseeeeseesesteseesssessesssseeseeeeee33

5.2 Đề nghị -2- 2-22 21 2122121122121121121121121121121222erereree 3

TÀI LIEU THAM KHẢO - 2 2+S29SE92E9EE22192122122121212121212121212121 21 xe 34

PHU LỤC 22 5222222122122122212211211211221121121112112111112111112111121121111211 1 1e 36

Vil

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

CMC : Carboxy methyl cellulose

DANH SÁCH CÁC BANG

Bang 4.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập - 21

Bang 4.2 Tông hợp các thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn -5-=2 33

Bảng 4.3.Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn - 2-52 ©5222 sz2zzccse2 24

Bảng 4.4.Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng VSV 29

Bang 4.5 Kết quả định danh tên loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nắm - 32

IX

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc không gian enzyme cellulase của Thermomonospora fusca 7

Hình 3.1 Các bước nhuộm Gram ¿2 222 3222 E*+EE£2EE££2EezEereeerreeersee 17

Hình 4.1 Kết quả nhuộm Gram xạ khuẩn ở độ phóng đại 40X và 100X 26

Hinh 4.3 Cây phát sinh loài của chủng G2.1 và G2.5 - -c+cc+ccseceerree 32

Hinh 4.4 Cây phát sinh loài của chủng 4.2 - 55 2< *+ set 32

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chuối thuộc chi Musa có thân thảo lớn, các giống chuối trồng thuộc thé tam

bội, loài Eumusa, họ Musaceae Việt Nam thuộc khu vực khởi nguyên trồng chuối,bên cạnh đó chuối là cây trồng thích hợp với điều kiện khí hậu của nước ta Theo BộNông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2022) cả nước hiện có hơn 130.000 ha trồngchuối, với sản lượng 2,1 triệu tắn/năm Theo dự án quy hoạch rau quả, hoa và cây cảnhđến năm 2010, tầm nhìn 2020 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, chuốiđược chọn làm cây chủ lực Ngoài việc tiêu thụ nội địa, chuối còn được xuất khâu một

lượng khá lớn.

Hiện nay, huyện Mang Yang tỉnh Gia Lai là một trong địa điểm có nhiều nôngtrường rộng lớn đang cải thiện trong việc trồng và phát triển cây chuối tiến tới xuấtkhẩu sản phẩm chuối Dẫn tới một lượng lớn một lượng lớn phụ phẩm cây chuối (thân,

lá, quả) được thải ra môi trường mà chưa qua quy trình xử lý thích hợp Do đó, việctận dụng phụ pham cây chuối như nguồn nguyên liệu chính dé chế thành phân hữu cosinh học (dung bón lại cho cây chuối), thức ăn cho vật nuôi (gia súc, gia cầm), gópphan nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, qua đó giúp cho việc

trồng và chế biến chuối được phát triển một cách bền vững hơn

Trong tự nhiên có rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng sinh ra enzyme làm xúctác trong quá trình phân giải cellulose Trong một số nghiên cứu gần đây, đã ghi nhậnnhiều nhóm vi sinh vật: xạ khuẩn, nắm men, nam mốc, vi khuẩn có khả năng tiết raenzyme cellulase, được ứng dụng rộng rãi đặc biệt trong việc xử lý các chất thải giàucellulose nhằm giảm ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, hiện nay nguồn enzyme cellulaseđược sử dụng ở VIét Nam chủ yếu được nhập khẩu nước ngoài với giá thanh cao.Nước ta là một nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dé sản xuất enzyme

cellulase rất phong phú Cùng với đó thì ngành công nghệ sinh học ngày nay đang phát

triển, việc tuyển chọn các chủng vi sinh vật có kha năng sản xuất enzyme cellulase từ

tự nhiên không những giúp tận dụng các nguồn gen quý hiếm mà còn góp phan bao

|

tồn, cải tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa sau một thời gian sửdụng, đạt nhiều ưu điểm và hiệu quả về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường.

Từ những có sở khoa học và thực tiễn trên, đề tài “Phân lập và tuyển chọn đượcmột số chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose từ phụ phẩm cây chuối” đã

được chọn, với mục tiêu thu thập các chủng vi sinh vật có khả năng tiết enzyme

cellulase với hoạt tính cao có sẵn trong môi trường đất và phụ phẩm, làm cơ sở choviệc sản xuất enzyme cellulase ứng dụng trong việc giảm lượng thải phụ phẩm nông

nghiệp gây ô nhiễm môi trường.

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, tuyển chọn và định danh được một số chung vi sinh vật (vi khuẩn, xạ

khuan, nam) có khả năng phân giải cellulose.

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Thu thập và phân lập các chung vi sinh vật phân giải cellulose từ

phụ phẩm cây chuối

Nội dung 2: Khảo sát khả năng phân giải cellulose của các chủng vi sinh vật.

Nội dung 3: Định danh các chủng vi sinh vật có khả nang phân giải cellulose đã

được tuyển chọn

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về cây chuối

2.1.1 Nguồn gốc

Cây chuối có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Đông Nam Á Giống chuối được

trồng đều xuất phát từ 2 loài chuối dại có hạt trong chi Musa là Musa acuminata (AA)

va Musa balbisiana (BB) Hai loài này có kiểu gen nhị bội, thu tinh được, có cùng sélượng nhiễm sắc thé co ban (n=11) nhưng có các đặc điểm hình thái khác nhau (APG

II, 2003; Tran Thanh Huong, 2011)

Trong đó có nhóm Canvendish mang kiểu gen AAA với rất nhiều giống chuốitiêu thương mại đang được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ, từngchiếm tới 47% tổng sản lượng toàn cầu giai đoạn 1998-2000 Các nguyên cứu về chongiống và phát triển sản xuất chuối chủ yếu được thực hiện với nhóm này (Simmond và

Chi Musa theo truyền thống được phân thành 5 phan chi là Ingentimusa,

Australimusa, Callimusa, Enmusa va Rhodochlamys.

Ho Musacceae có 2 chi Ensele va Musa Chúng rất giống nhau ở bộ lá va dangcây song có một số đặc điểm lại rất khác nhau

Chi Ensele có bộ lá giống lá chuối nên một thời gian dai người ta xếp chúngvào họ Musaceae Đây là cây thân thảo chỉ sinh sản một lần, thân ngầm không bao giờ

rẻ nhánh Hoa và lá dính liền nhau vào cuống buông, chúng sinh sản hữu tính Không

3

giống loài nào trong chi này có quả ăn tươi được vì quả của chúng có có một lớp vỏmỏng bên trong chứa day hạt có đường kính từ 1 — 1,2 cm Chi nay có giống Ensetevetricosum thường trồng ở Đông Phi.

Chi Musa có 4 phân chi Austrilimusa, Callimusa, Eumusa và Rohdochilamy.Trong các phân loại, Austrilimusa là phân chỉ cổ nhất, có cây M Testilis và M Abacachỉ sử dụng làm dây buộc, chúng chỉ có ý nghĩa về khía cạnh nguồn gốc của chuối,không có ý nghĩa về kinh tế

Trong các phân chi trên, Ewmusa là phân chi đáng chú ý nhất không chi vì chilớn nhất, phong phú về giống nhất mà còn về giá trị kinh tế của nó đặc biệt trong lĩnhvực ăn tươi và làm lương thực Buồng quả của Eumusa ít nhiều cup xuống có thé hơingang hay buông thõng xuống Ở mỗi nải, số quả nhiều và được xếp thành hai hàng

Trong Eumusa, các giéng chuối dai ít khi có ích nhưng lại có giá trị trong lĩnhvực nghiên cứu về phân loại Them Simmonds và Shepherd (1995), các loài chuối ăn

được đều xuất phát từ hai loại chuối dại có hạt Ä⁄ accuminata colla và M balbisiana

colla).

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Theo FAO (1976), thành phần dinh dưỡng của trái chuối có chứa protein, lipid,

glucid, calcim, kalium, sat, vitamin C, vitamin Theo Viện nghiên cứu và Phat triển

Nông nghiệp Malaysia (MARDD), chuối là loại trái cây duy nhất hội tụ đầy đủ thànhphần những chất dinh dưỡng cần thiết cho cở thể con người Ngoài ra chuối còn có

công dụng giúp tiêu hóa tốt hơn và ngừa ung thư ruột giả, giảm stress, bớt căng thăng

và giảm bệnh thiêu máu.

2.1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối ở nước ta

Các loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn của Việt Nam bao gồm chuối,

dứa, cam, xoài, nhãn và vải Trong đó, chuối là cây ăn quả có quy mô sản xuất lớnnhất Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2022) cả nước hiện có hơn130.000 ha trồng chuối, với sản lượng 2,1 triệu tắn/năm

Theo Hoàng Bằng An và ctv (2010), phần lớn diện tích chuối ở nước ta trồngphân tán, không thành vùng tập trung Với các đặc điểm là cây ăn quả ngắn ngày,nhiều công dụng và lợi ít tốn diện tích nên chuối được trồng như một cây tận dụng đất

trong các vườn cây ăn quả của hộ gia đình Hiện tại, một số tỉnh ở miền trung như

Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa và các tỉnh miền Nam như Đồng Nai, Sóc Trăng và

Cà Mau có diện tích chuối từ 3000 — 8000 ha Trong khi đó các tỉnh trồng được nhiều

chuối ở miền Bắc như Hải Phòng, Nam Định và Phú Thọ có diện tích trồng chưa đạt

3000 ha.

2.2 Tổng quan về cellulose

2.2.1 Giới thiệu chung về cellulose

Cellulose là một polymer mạch thang, mỗi don vi là một disaccarit gọi là

cellobiose Cellobiose có cấu trúc từ 2 phân tử D-glucose Cấu trúc bậc 2 và bậc 3 rấtphức tạp thành cau trúc dạng lớp ngắn với nhau bang lực liên kết hydro Liên kếthydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, vì vậy cellulose là hợp chất khó phân giải.Cellulose không tan trong nước nhưng có thể bị trương lên do hấp thụ nước Cellulose

bị phân hủy khi đun nóng với acid hoặc kiềm đặc ở nồng độ cao Tuy nhiên, cellulose

sẽ bị phân hủy bởi enzyme cellulase ở nhiệt độ 40-50% (Ding va Himmel, 2006).

Trong tế bào thực vat cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20%đến 40% trọng lượng khô) chat này tương đối dé thủy phân Đây là loại heteropolymerchứa nhiều loại monosaccharide như galactose, mannose, glucose, xylose và các nhómacetyl Ngoài ra, cellulose còn liên kết chat chẽ với lignin (10%-25% trọng lượngkhô) Đây là thành phần ảnh hưởng rất lớn quá trình phân hủy cellulose của enzymecellulase Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất enzyme thủy phân cơ chấtnảy có ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp như hóa chat, thực phẩm, thức ăn giasúc, vải sợi, giấy và bột giấy (Taherzaded và Karimi, 2008)

2.2.2.Enzyme cellulase

Cellulase là một loại enzyme thuộc nhóm glycoside hydrolase, có kha năng tac

động lên cellulose - một loại polysaccharide chủ yếu tạo thành thành tế bào thực vật và

là thành phần chính của cấu trúc gỗ và sợi cây (Ranjan và ctv, 2023) Cellulase là một

phức hệ enzyme có khối lượng phân tử khoảng 30 đến 110 kDa (Gilkes và ctv, 1991),

có khả năng phân cắt cellulose và một số loại polysaccharide tương tự thông qua việcthủy phân liên kết B-1,4-glucoside thành các oligosaccharide và đường đơn (Um vaKim, 2013) Cellulase có bản chất là protein, được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin

được nối với nhau bằng liên kết peptide - CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúc còn có các

thành phần phụ khác tùy thuộc vào vị trí phân bố và chức năng của mỗi loại cellulase.Cellulase từ các nguồn khác nhau có khối lượng phân tử, thành phần cấu tạo, cấu trúc

và trật tự sắp xếp các axit amin khác nhau dẫn đến sự khác nhau về tính đặc hiệu cơchất, nhiệt độ và pH tối ưu (Nguyễn Thị Thơm, 2020)

Phân loại enzyme cellulase được thực hiện dựa trên cau trúc và cơ chế tác động

lên cellulose Có ba loại enzyme chính thuộc nhóm cellulase: (1) endoglucanase hoặc

d -glucan-4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), (ii) exoglucanase, bao gồm

d -glucan glucanohydrolases (còn được gọi là cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và

1,4-B-d-glucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases) (EC 3.2.1.91), (m) B-glucosidase

hoặc B-glucoside glucohydrolases (EC 3.2.1.21).

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, quá trình phân hủy cellulose được thực hiện thôngqua hệ enzyme cellulase của v1 sinh vật rong điều kiện hiếu khí và kị khí Sự đa dạng

về số lượng chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase trong tự

nhiên rất phong phú Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi

sinh vật các chủng thường sử dụng:

Vi khuân: Hệ vi sinh vật trong dạ dày của động vật ăn cỏ, vi dụ: Cillobacterium cellulosolvens, Ruminococcus albus, Ruminobacter parum, Celliuibrio giÌvus,

Acetobacter xylinum, (Lê Hồng Phú, 2012)

Nam sợi: Chủ yếu là nam sợi và nam quả thé, đa số có khả năng sinh tổng hophai hoặc nhiêu exocellulase, một vài endocellulase va một ít -glucosidase Cac enzyme này déu la enzyme ngoại bao (được nam tiệt ra ngoài môi trường nuôi cây) Một sô

chủng nắm như: 4 flavus, A niger, A Oryza, Aspergillus fumigatus, A sydovii,

A terrus, Trichoderma koningi, T lignorum, T roseum, T reesei, Penicillium spp Altenaria tenuis, Fusarium culmorum, F oxysporum, F solani,

Xa khuẩn: Actinomyces spp., Chiếm ưu thé là loài xạ khuẩn chịu nhiệtThermonospora cruvata được phân lập từ phân rác ủ.

2.2.3 Vi sinh vat phan giai cellulse

Cellulose là nguồn carbon hữu co trong tự nhiên, chúng tồn tại nhiều trong cácphụ phế phẩm nông nghiệp, công nghiệp và lâm nghiệp Khảo sát khả năng sinhenzyme cellulase phân hủy cellulose dé sản xuất phân bón hữu cơ thay thế cho việc sửdụng phân bón hóa học giúp làm giảm ô nhiễm môi trường, và sự suy thoái của đất(Nguyễn Hoàng Phúc và ctv, 2014) Vì thế tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng

phân giải cellulose mang ý nghĩa quang trọng.

Trong tự nhiên, nếu không có sự tac động của hệ vi sinh vật thi cellulose sẽ phânhủy trong khoảng thời gian rất lâu Các VSV có khả năng phân giải cellulose ngàycàng trở nên quan trọng hơn do có nhiều ứng dụng trong đời sống, nhất là trong phânhủy chất hữu cơ và sản xuất phân hữu cơ vi sinh Việc nghiên cứu tuyển chọn cácchủng vi sinh vật có khả năng phân giải các phế phụ phẩm trong nông nghiệp trongsản xuất phân bón hữu cơ sẽ đem lại nhiều lợi ích Một mặt, vừa giúp giảm ô nhiễm

môi trường, giảm phát thải khí nhà kính, mặt khác, giúp cung cấp nguồn dinh dưỡng

cần thiết cho cây trồng Cellulose bị phân hủy nhờ hệ enzyme cellulase gồm ba loại

7

enzyme chính (Exoglucanase, Endoglucanase, B- glucosidase) thông qua phân cắt liênkết 1,4-B-glucoside trong cellulose tạo sản phẩm chính là glucose, cellobiose, cello-

oligosaccharides.

2.2.4 Cac ứng dung của nhóm cellulase

Hiện nay việc sản xuất chế phẩm cellulase từ vi sinh vật đã được tiến hành ởquy mô công nghiệp và được ứng dụng rỗng rãi vào nhiều lĩnh vực khác nhau ở nhiềunước trên thế giới Cellulose có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệpnhư dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực pham, thức ăn gia súc

Các ứng dụng chủ yếu như sau: Trong nông nghiệp, cellulase được dùng déphân hủy cellulose từ các phế phụ pham dé sản xuất phân bón hữu cơ thay thé cho cácloại phân bón hóa học truyền thống làm ô nhiễm môi trường cũng như sự thoái hóađất Hiện nay, enzyme cellulase là thành phần quan trọng của chế phẩm sinh học ( cácchế phẩm EM) trong xử lý ô nhiễm môi trường Đặc biệt là xử lý rác thải, rác đượcphân hủy bằng hỗn hợp vi sinh vật, dưới tác dụng của các enzyme do vi sinh vật sinh

ra sử dụng làm phân bón.

2.3 Một số nghiên cứu trong nước và nước ngoài

2.3.1 Những nghiên cứu trong nước

Lê Thị Hồng Nga (2005) nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase và

cellulase của một sô chủng nâm môc.

Cao Ngọc Diệp và Võ Văn Phước Huệ (2011) đã phân lập vi khuẩn phân giải

cellulose trong đất trồng lúa va da cỏ bò với mục tiêu dé phân giải rơm ra và rác thảihữu cơ Kết quả nghiên cứu cho thấy tổng cộng có 59 dòng vi khuẩn được phân lậptrong đó có 4 chung phân lập được từ dạ có bò có kha năng phân giải 53-55% rom ra

sau 10 ngày.

Lê Thị Vân Anh (2013) phân lâp và tuyển chọn các chủng vi khuẩn hiếu khí cókhả năng phân giải cellulose từ vỏ trái ca cao Trong số 20 chủng có khả năng phângiải cellulose có 2 chủng PD2 và PD5 có vòng phân giải CMC có đường kính lớn nhất(11,33 mm và 11 mm) sau 24h nuôi cấy Kết quả khảo sát cho thấy chủng xạ khuẩn

PD5 thủy phân vỏ ca cao hiệu quả nhất với hàm lượng đường khử 2,225 mg/mL sau 5ngày ủ lắc ở nhiệt độ phòng.

Nguyễn Ngọc Tú Trúc Ngân, Phạm Thị Ngọc Lan (2014) đã nguyên cứu khả

năng phân giải cellulose của vi sinh vat phân lập từ chat thải ran của nhà máy Fococevtỉnh Thừa Thiên Huế để tìm ra những chủng phân giải mạnh nhất xử lý khối ủ chất thảirắn, góp phần giảm thiêu ô nhiêm môi trường và tạo ra phân hữu cơ sinh học Kết quả

nghiên cứu phân lập được, 92 chủng xạ khuẩn, 112 chủng vi khuẩn và 55 chủng nắm

mốc có khả năng phân giải cellulose Đồng thời chọn được 3 chủng có hoạt tính mạnh

nhất Số lượng vi sinh vật có thé biến động lớn và chênh lệch rất rõ giữa các nhóm, caonhất là vi khuân (dao động trong khoảng từ 56,02 x 10° đến 343,32 x 105 CFU/g maukhô), tiếp đó là xạ khuẩn (từ 5,63 x 105 đến 96,24 x 10° CFU/g mẫu khô) và nắm mốcchiếm số lượng thất nhất (từ 2,43 x 10° đến 34,78 x 105 CFU/g mẫu khô)

Nguyên Hữu Hiệp va ctv (2016) đã phân lập vi khuẩn phân hủy cellulose từ

sùng và trùn đất thu được 25 dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme cellulase Trong số

đó, có 3 chủng đặc biệt chú ý nhất CS2, CH8, TS3 có lượng đường khử cao lần lượt là63,1 pg/mL, 60,3 wg/mL, 59,6 ug/mL Cả 3 chủng vi khuản khi được định danh sinhhọc phân tử đều cho kết qua là chủng Bacillus sp

Nguyễn Thu Thủy va ctv (2018) đã tiễn hành tuyên chọn và định danh vi khuẩn

có khả năng phân giải cellulose dé sản xuất phân bón hữu co vi sinh Kết quả của việcphân lập là 18 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose, trong số đó chủng6NHI có khả năng phân giải cellulose mạnh nhất và được nhân sinh khối dé sản xuấtphân hữu cơ vi sinh Chủng 6NHI phát triển tốt nhất ở 30 °C và pH 6 — pH 7 Khi ủrơm rạ với chủng này, hàm lượng cellulose giảm 49,6% so với đối chứng Kết quả

định danh chủng 6NHI là loài Bacillus amyloliquefaciens tương đồng 99%

Năm 2020, Nguyễn Liêu Ba và ctv đã phân lập được 21 chủng có khả năngphân giải cellulose được phân lập từ các mẫu đất và gỗ khác nhau như lá, rơm và gỗmục thu thập trên địa bàn thành phố Hà Nội và phân thành 6 nhóm màu khuẩn lạc:tím, hồng, trắng, xanh lá, xám và vàng Ching G1, D4 va G3 thể hiện vòng phân giảilớn nhất với đường kính vòng halo lần lượt là 40 mm, 40 mm và 39 mm

Năm 2022, Trần Quốc Khánh và ctv đã nguyên cứu chọn 3 chủng xạ khuẩnS.thermocoprophilus, S.lividoclavatus, S.griseosporeus là những chủng vừa có hoạttính phân giải cơ chất cellulose cao, vừa có hoạt tính phân giải ligin mạnh ( vòng phângiải cellulose là 60mm, vòng phân giải ligin là 61mm) Khả năng phân cắt cơ chất giàu

cacbon của S.thermocoprophilus giảm 27,3%, S.lividoclavatus giảm 29,1 % và S.griseosporeus giảm 29,1 % sau 48 giờ.

Năm 2023, Nguyễn Thế Khoa và ctv đã phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có

hoạt tính phân giải cellulose cao được phân lập từ mẫu đất tại Thanh Hóa Kết quả

phân lập được 32 chủng, chọn được 2 chủng vi khuẩn (TG2.1, M4.1) và 6 chủng xạ

khuẩn (TG8.1, CM4.3, CM3.1, CM9.2, PU1.1, PU2.1) phân hủy cellulose có hoạt tính

cao ( từ 3 đến 3,5 cm) Các chủng này có khả năng chịu mặn trung bình, nồng độ muối0,05 — 0,6 %, pH từ 6,5 — 7,5 ( pH tối ưu = 7) và kha năng chịu nhiệt cao 37 — 45 °C

2.3.2 Những nghiên cứu nước ngoài

Pratima Gupta va ctv (2012) đã phân lập được 8 chủng vi sinh vật phân hủycellulose từ ruột của các loài động vật như mối, mọt, sâu bướm, ốc sên Trong đó có 2chủng CDB7 và CDB10 có vòng phân giải CMC rat cao 50 mm trong thời gian 48 giờnuôi cay Khảo sát hoạt độ enzyme cellulase trong môi trường chứa giấy lọc thì kếtqua cho thấy chủng CDB10 có hoạt độ cao nhất (0,194 IU/mL)

Năm 2013, Mahmoud va ctv đã nghiên cứu sản xuất, tinh chế và xác định đặc

tính cua cellulase từ Streptomyces sp Dong Streptomyces sinh ra cellulase cao, chủng

C188 được xác định là Streptomyces longispororuber được phân lập từ một mẫu dat ở

Ả Rập Xê Út bằng giải trình tự 16S rDNA Năng suất enzyme của chủng này trongmôi trường long carboxymethyl cellulase dat 8540 U/L sau 96 giờ ủ ở 30 °C Năngsuất cellulase ở chủng thử nghiệm đã được cai thiện (25084 U/L) bằng cách bổ sung

môi trường lỏng carboxymethyl] cellulase với rượu ngâm ngô 1% va pH 6,5 (duy trì

trong suốt thời gian ủ bằng cách sử dụng 0,05 M phosphatebuffer) sắc ký lọc gel Chếphẩm cuối cùng có khả năng phục hồi hoạt tính 13,5% và độ tinh chế xấp xi 38,5 lần

Mohammed Raway va ctv (2017) thực hiện phân lập và xác định các chủng vikhuẩn phân hủy cellulose từ nhiều nguồn khác nhau tại tỉnh Asiut (Ai Cập) Kết quả

10

da phân lập được 120 chủng vi khuẩn từ năm nguồn khác nhau (đất vườn, đất nôngnghiệp, dạ cỏ động vật nhai lại, trầm tích sông Nile, phân hữu cơ) Trong đó có 107chủng vi khuân có khả năng phân hủy CMC Riêng 2 dòng vi khuẩn CDB6 và CDB10

có hoạt độ enzyme cellulase cao nhất là 11,077 U/mL khi được đánh giá bằng phương

pháp CMCase.

Farjana Islam và Narayan Roy (2018) đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm

enzyme cellulase của các chủng phân lập từ mật rỉ đường ở khu vực Bangladesh Bachủng vi sinh vật được tuyển chọn là Paenibacillus sp, Bacillus sp, Aeromonas sp

khảo sát hoạt động enzyme cellulase ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau bao gồmnhiệt độ, pH, nồng độ cơ chat, thời gian nuôi cấy Trong đó chủng Paenibacillus sp cóhoạt độ enzyme cellulase cao hơn 2 chủng còn lại Hoạt độ cellulase là 0,98 U/mL

nuôi cấy trong môi trường có pH = 7, nhiệt độ 40°C, nồng độ cơ chất 1% CMC trong

thời gian nuôi cấy tối ưu là 24 giờ

Năm 2021, Waheeb và ctv, đã phân lập xạ khuẩn có khả năng sinh enzymecellulase từ các mẫu đất Ai Cập, thu nhận 165 chủng xạ khuẩn trên môi trườngcarboxylmethyl cellulose Enzyme cellulase từ các chủng phân lập được giao động từ

146,9 U/L đến 650,5 U/L Chủng sản xuất enzyme cellulase nhiều nhất được xác định

có sự gan gũi với loài Streptomyces coelicoflavus strain NBRC 15399

Năm 2022, Danso va ctv đã phan lập thành công loài Streptomyces sp MS — S2

từ mối ăn gỗ Chủng Streptomyces sp MS — S2 đã được phát hiện có khả năng sử dụnghiệu quả rơm lúa mì làm nguồn carbon duy nhất dé tiết ra enzyme cellulase Các sảnphẩm cellulose cao nhất đã được quan sát trong 10 ngày khi nuôi cấy trên môi trườngđược sửa đổi với l5 g/L rơm lúa mì Trong điều kiện tối ưu hóa, hoạt động củacellulose đã được tính toán đạt 0,0866 U/mL.

11

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: Thí nghiệm được tiến hành thực hiện từ tháng 08/2023 đến tháng

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dùng dé phân lập vi sinh vật là mẫu phụ phẩm cây chuối (đất, rễ, lá) tạiNông trường chuối Đăk Ram, xã Đăk Yã, huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Dụng cụ: dia petri, ống nghiệm, đèn côn, các loại que cấy, micropipette, céc

thủy tinh, ống đong, túi nilon, bút ghi mẫu và một số dung cu cơ ban của phòng thi

nghiệm.

Thiết bị phục vụ cho thực hiện các nội dung nghiên cứu thuộc Phòng thínghiệm Nắm ăn và Nam dược liệu (Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học Và Môitrường thuộc Trường Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, bao gồm: Tủ cấy vô trùng,noi hap khử trùng, tủ lạnh, cân phân tích 2 số lẻ, kính hiển vi, lò vi sóng

Hóa chất: pepton, cao thịt, D-glucose, agar, Yeart extract, NaNO3, KH¿zPOa,NaCl, CMC, MgSOa.7HaO, Congo Red, nước cất

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu phân lập vi sinh vật

Lấy mẫu: 9 mẫu phụ phẩm cây chuối ( 4 mẫu đất, 3 mẫu rễ, 2 mẫu lá) được lấytại Nông trường chuối Đăk Ram, xã Đăk Yã, huyện Mang Yang, tỉnh Gia Lai

12

Mẫu thu được đựng trong túi PE sạch, giữ kín, ghi vào các túi chứa mẫu các

thông tin sau: số thứ tự mẫu, ngày và giờ lấy mẫu Bảo quản mẫu ở nhiệt độ 4°C - 5°C

3.3.2 Phương pháp phân lập

Vi sinh vật được phân lập trên môi trường CMC bao gồm các thành phần: CMC

10 g, NH¿)zSO¿ 1 g, KzHPO¿ 1 g, MgSO4.7H20 0,5 g, NaCl 0,001 g, agar 20 g Môi

trường được hap khử trùng ở 121°C, 20 phút trước khi sử dung

Cân 10 g mẫu vào trong bình chứa 90 mL nước cất vô trùng Lắc dé đồng nhất

mẫu trong 30 phút, dé yên 15 phút sau khi lắc

Tiến hành pha loãng dịch huyền phù ban đầu ở nồng độ 10' đến các nồng độcần thiết 10° Hút 1 mL dich mẫu ban đầu vào ống nghiệm có chứa 9 mL dung dịchpha loãng đã chuẩn bị sẵn ta thu được dịch huyền phù có nồng độ pha loãng 107 Laplại bước này dé thu được đến nồng độ pha loãng 10°

Sau đó hút 0,1 mL ở 3 nồng độ liên tiếp Dùng que cấy thủy tinh cấy trải đềutrên đĩa petri có chứa môi trường CMC đã chuẩn bị trước và ủ ở 30°C, ở mỗi nồng độ

cay 3 đĩa Quan sát sự xuất hiện của khuẩn lạc vi khuẩn sau 24 giờ, khuẩn lạc nam và

xạ khuẩn sau 3-5 ngày Đối với vi khuẩn: bề mặt nhẫn, ướt, khi dùng que gạt khôngcòn lại trong thạch Đối với xạ khuẩn: khuẩn lạc khô, có dạng phóng xạ Đối với nam:

có hệ soi.

3.3.3 Làm thuần và giữ giống

Dùng que cấy vòng cay chuyền các khuẩn lạc nghi ngờ qua dia petri chứa môitrường nuôi cấy chuyên biệt, đối với vi khuân môi trường NA, đối với xạ khuẩn môi

trường ISP4, đối với nam môi trường PDA Thực hiện cấy chuyền nhiều lần đến khi

khuẩn lạc đồng nhất

Giữ giống thuần trên môi trường thạch nghiêng: Các chủng vi sinh vật phân lậpđược sẽ được giữ theo kiểu zic zac trên bề mặt thạch nghiêng trong ống ngiệm Đối

với vi khuẩn sau 24 giờ, đối với xạ khuẩn và nắm sau 3 — 5 ngày mọc lên sẽ được giữ

ở 4°C, cấy truyền hàng tháng Hoặc giữ trong dung dich glycerol 20% có bổ sung

13

pepton 1% dé giữ đông ở nhiệt độ - 4°C, giữ giống theo cách này có thé giữ được lâu

hơn và cần được hoạt hóa lại trước khi nhân giống.

3.3.4 Khảo sát đặc điểm hình thái chủng vi sinh vật

3.3.4.1 Quan sát hình thái

Cấy ria các chủng vi sinh vật trên môi trường chuyên biệt Đối với vi khuẩn trênmôi trường NA, quan sát mau sắc, hình dạng, kích thước, độ nổi và dạng bia của

khuẩn lạc Đối với xạ khuẩn trên môi trường ISP4, quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu

sắc của khuẩn ty cơ chất (KTCC), mau sắc của khuẩn ty khí sinh (KTKS) Nắm trênmôi trường PDA, quan sát hình dạng, màu sắc, số lượng bao tử, quan sát sự nảy chdi

và các hình thức sinh sản dưới kính hiển vi Quan sát kính hiển vi: Nhỏ 1 giọt NaCl

0,9% lên lame Dùng que cấy thu một ít sinh khối bỏ vào giọt nước trên lame Đậylame và quan sát đưới kính hiển vi vật kính 10X, 40X, 100X

nhuộm ban đầu Còn vi khuân Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít

peptidoglycane hơn), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béonày sẽ bị hòa tan kéo theo màu thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu

hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschsin Như vậy, sau khi nhuộm vi khuẩn Gram âm có

mau hong, vi khuân Gram dương có mau tím.

Phương pháp nhuộm Gram: Làm tiêu ban bằng cách nhỏ một giọt nước cat vôtrùng lên giữa lam Dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn rồi lay một ít sinhkhối trải mỏng lên kính Để khô tự nhiên hoặc hơ nhanh mặt dưới của lam kính có mẫu

trên ngọn lửa đèn cồn dé có định vết bôi trên lam

Nhuộm bang 1 — 2 giọt Crystal Violet trong 1 phút, rửa nhanh với nước

Nhỏ 1 — 2 giọt dung dịch Lugol để trong 1 phút, rửa nhanh với nước

14

Rửa lại bằng cồn thật nhanh trong 15 giây dé tay màu cho đến khi giọt cồn không

còn màu tím nữa, rửa nước.

Nhuộm tiếp bằng 1 — 2 giọt Fuschsin dé trong 1 phút, rửa lại bằng nước và dé khô

Quan sát dưới kính hiền vi ở vật kính 40X va vật kính 100X có giọt dầu

Nguyên tắc: VSV di động nhờ tiêm mao, VSV có khả năng di động sẽ mọc lan

ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh, ngược lại nếu VSV chỉ mọc

trên đường cấy không lan ra ngoài thì không có khả năng di động

Cách thực hiện: sử dụng môi trường Luria broth (LB) bán lỏng có bé sung 0,7%

agar Môi trường đun tan, phân phối vào ống nghiệm 5 mL, hấp 120°C trong 15 phút

va làm nguội ở trạng thái đứng và bao quản ở 4 — 10°C Sau đó, cấy đâm sâu xuyênqua lớp thạch giữa ống nghiệm khoảng 2 em, ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ, ống đốichứng không cấy VSV VSV có khả năng đi động sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy valàm đục môi trường xung quanh, kết luận dương tính (+) Ngược lại, nếu VSV chỉ mọc

trên đường cấy, không lan ra ngoài thì không có khả năng di động, kết luận âm tính (-).

15

3.3.5.2 Khao sát hoạt tinh catalase

Nguyên tắc: Phần lớn các VSV hiểu khí và ky khí tùy ý chứa điện tử

cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ các tế bào khỏi tổn thương bởi các

dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy Các VSV có khả năng biến dưỡng năng lượngtheo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tửtạo H2O2 Catalase thủy phân hydrogen peroxide (HaO2) thành HaO và giải phóng O2,

gây hiện tượng bọt khí.

Cách thực hiện: Dùng que cấy lấy một ít sinh khối VSV, phết lên giữa lamekính sạch và khô, sau đó nhỏ giọt HaOz 30% lên vét VSV Đọc kết qua sau khoảng 15giây Quan sát hiện tượng nếu có hiện tượng sui bot thi phản ứng dương tính (+), nếukhông có hiện tượng sủi bọt thì phản ứng âm tính (-).

3.3.5.3 Thử nghiệm khả năng lên men đường

Nguyên tắc: VSV có khả năng lên men carbohydrate sẽ tạo axit làm giảm pHmôi trường và có khả năng sinh khí CO: trong ống durham.Dé xác định khả năng lên

men đường người ta bỗ sung vào môi trường thuốc thử Phenol Red, acid tao ra làm pH

trong môi trường giảm làm cho Phenol Red chuyên màu đỏ thành màu vàng Nếu môi

trường sau khi lên men không tạo acid thì Phenol Red giữa nguyên màu đỏ.

Phương pháp thực hiện: Các dòng VSV phân lập được kiểm tra khả năng lênmen đường dựa trên sự chuyển màu của thuốc thử và lượng khí COa sinh ra Sau 24giờ phát triển sinh khối trong môi trường chuyên biệt 6 30°C, hút 1 mL dung dich tăngsinh vào 9 mL dung dich đường 2% đã được hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút, lắcđều cho dịch tràn vào ống durham úp ngược nằm bên trong ống nghiệm, ủ ở 30°C Sự

chuyên màu thuốc thử và xuất hiện cột khí CO» sinh ra trong ống durham úp ngược và

7,6 VSV có khả năng sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất thì có khả năng phângiải muối ammonium và sinh NH: làm môi trường trở nên kiềm.

Cách thực hiện: Chuẩn bị môi trường Simmon Citrate agar, Môi trường dun tan,phân phối vào ống nghiệm 5 mL, hấp 121°C trong 20 phút và làm nguội ở trạng tháinghiêng và bảo quản ở 4 — 10°C Dùng que cấy vòng lấy và cấy ria chủng VSV vàoống môi trường, ủ ở nhiệt độ phòng 24 giờ Quan sát kết quả, pản ứng dương tính (+)môi trường chuyền sang xanh dương, phản ứng âm tính (-) không đổi màu môi trường

(màu xanh lá cây).

3.3.5.5 Thử nghiệm khả năng sinh indol

Nguyên tắc: VSV có hệ enzyme tryptophanase có thê oxy hóa tryptophan, đây

là một acid amine tạo nên các sản phâm chứ gôc indol.

Cách thực hiện: Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 10 mL môi trường canh trypton,hấp 121°C trong 20 phút và làm nguội Cấy VSV đã phân lập được vào môi trường, ủ

ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm vàquan sát Kết quả phản ứng dương tính (+) xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt môitrường, phản ứng âm tính (-) lớp màu vàng của thuốc thử

3.3.6 Định tính khả năng phân giải cellulose của các chủng vi sinh vật

Chuẩn bị: môi trường CMC 1% trên đĩa thạch bao gồm (NHa)2 SO, 1 g/L,KzHPO¿ 1 g/L, MgSO¿ 0,5 g/L, Nacl 0,001 g/L, CMC 10 g/L, agar 20 g/L, nước cất

vừa đủ 1 lít, thuốc thử Congo red 0.1%, dung dich NaCl 1M

Mục đích: khảo sát khả năng sinh tổng hop enzyme cellulase của các chủng visinh vật đã phân lập được.

Phương pháp tiến hành: Sử dụng phương pháp cấy chấm điểm các chủng vi

sinh vật được lấy từ các đĩa giống, sau đó chấm điểm chính giữa của đĩa thạch môi

trường có chứa 1% CMC Đĩa sau khi cấy được ủ trong 72 giờ đối với vi khuẩn và 4

-5 ngày đối với xạ khuân và nam Sau đó, tiễn hành đo kích thước khuẩn lạc bằng cách

nhuộm với Congo red 0,1% trong 15 phút, rửa sạch bằng NaCl 1M đến khi nhìn thấy

rõ vòng phân giải bao quanh nó, nếu thuốc nhuộm Congo red không bắt màu quanh

17

thỏi thạch tức là vi sinh vật có khả năng phân giải CMC Khả năng sinh tổng enzymecellulase được đánh giá bằng độ lớn vòng phân giải.

Công thức tính độ lớn vòng phân giải: k = D - d

Trong đó: k là độ lớn vòng phân giải (mm)

D là đường kính vòng phân giải (mm) dla đường kính khuản lạc (mm)

(Theo nguyên cứu của Nguyễn Nhu Thủy va ctv (2018) k<10mm: yếu; 10mm < k <

15mm: trung bình; 15mm < k < 20mm; k > 20mm: mạnh).

Chọn ra chủng có vòng phân giải lớn nhất dé làm thí nghiệm tiếp theo

3.3.7 Định danh vi sinh vật

Định danh chủng vi khuẩn và xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gen

Sanger Mẫu phân tích định danh bằng phương pháp giải trình tự bởi Công ty TNHHThương mại và Dich vụ Nam Khoa (Dia chỉ: 798/58 Trần Xuân Soạn, phường TânHưng, quận 7, Thành phó Hồ Chi Minh)

3.3.8 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu

Số liệu được đo đếm, thu thập, sau đó được nhập và xử lý sơ bộ, bằng phầnmềm excel 2016, phân tích ANOVA và trắc nghiệm Tukey một nhân tố (sử dụng phanmềm Minitab 16) để phân tích trung bình, đữ liệu được kiểm tra đặc tính phân bốtrước khi đưa vào phân tích ANOVA Số liệu được trình bày dưới dạng Mean + SD,

sai khác có ý nghĩa với P< 0,05.

18