Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập nấm Fusarium từ vùng rễ cây chuối bệnh vàng lá và xác định phương pháp chủng bệnh hiệu quả

Sản xuất chuối ở nước ta gặp nhiều trở ngại do các bệnh gây hại đặc biệt là bệnh héo vàng do nắm Fusarium oxysporum gây ra và nó cũng là mối lo ngại nghiêm trọng đối với việcsản xuất lươ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LAP NAM Fusarium TỪ VUNG RE CÂY CHUÓI BỆNH VANG LA VA XAC DINH PHUONG PHAP CHUNG BENH

HIEU QUA

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : VĂN THỊ THIÊN THƯ

Mã số sinh viên : 19126177

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Hồ Chí Minh, 03/2024

; BỘ GIAO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

PHAN LAP NAM Fusarium TU VUNG RE CAY CHUÓI BỆNH VANG LA VA XAC DINH PHUONG PHAP CHUNG BENH

HIEU QUA

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS TRAN THỊ VAN VAN THI THIEN THU’

TP Hồ Chi Minh, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành dé tài tốt nghiệp “ phân lập nam Fusarium từ vùng rễ cây chuốibệnh vàng lá và xác định phương pháp chủng bệnh hiệu quả” em nhận được rất nhiều

sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu cùng tất cả quý Thầy CôTrường Đại học Nông Lâm TP.HCM cùng tất cả quý thầy cô Khoa Khoa học Sinh học

đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong thời gian theo học tại trường

Con xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Dinh Đôn, ThS Trần Thị Vân và ThS TôThị Nhã Trầm đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho con những kiến thức quý báu cũngnhư tạo điều kiện và giúp đỡ đề con hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Xin gửi lời cảm ơn các anh và các bạn tại phòng thí nghiệm Chân đoán bệnh cây

luôn sẵn sàng giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Minh xin gửi lời cảm ơn đến với tập thé lớp DH19SM đã đồng hành và giúp đỡmình trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn của bản thân đến gia đình Cảm ơn gia đình

đã luôn là chỗ dựa vững chắc, luôn theo dõi và ủng hộ con trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận tốt nghiệp cũng như trong quá trình học tập tại trường

Tran trọng cảm on !

XÁC NHAN VA CAM DOAN

Em tên Văn Thị Thiên Thu, MSSV: 19126177, Lớp: DH19SM, thuộc ngành Công nghệ

Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luậntốt nghiệp do bản thân em trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu

là hoàn toàn trung thực và khách quan Em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội

TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 03 năm 2024

il

TÓM TẮT

Fusarium oxysporum được xếp hạng thứ năm trong danh sách các loại nắm gây

bệnh hàng đầu cho cây trồng dựa trên tầm quan trọng về mặt khoa học và kinh tế Sản

xuất chuối ở nước ta gặp nhiều trở ngại do các bệnh gây hại đặc biệt là bệnh héo vàng

do nắm Fusarium oxysporum gây ra và nó cũng là mối lo ngại nghiêm trọng đối với việcsản xuất lương thực trong tương lai Nghiên cứu được tiễn hành nhằm xác định một sốmẫu nam Fusarium oxysporum gây bệnh vàng lá trên cây chuối phân lập trong vùng rễchuối và xác định phương pháp chủng bệnh hiệu quả 17 mẫu chuối được thu thập từvườn chuối tại các tỉnh Đồng Nai, Bình Dương, TP HCM, Long An và Tiền Giang.Tiến hành phâp lập mẫu rễ, củ chuối bị bệnh trên môi trường WA, sau 3-5 ngày cấytruyền sang các môi trường PGA, SNA, OMA, CLA để quan sát đặc điểm hình thái màusắc tan nam Trong đó, đã thu được 5 mẫu nam Hầu hết các loài Fusarium oxysporum

sản sinh ra ba loại bào tử bao gồm đại bào tử, tiểu bào tử và bào tử chống chịu tồn tại

lâu dài trong đất nhiều năm Phương pháp đồ dịch bào tử trực tiếp lên cây chuối ở nghiệmthức 6 cho thấy kết quả ôn định hơn 4 phương pháp còn lại, biểu hiện ở hiện tượng héobên ngoài, đổi màu bên trong rễ, củ Hơn nữa, phương pháp này có thé chủng đồng thời

số lượng lớn cây mỗi giờ, và có khả năng ứng dụng rộng rãi đối với các loài Fusariumspp ảnh hưởng đến các loại cây trồng khác nhau

Từ khóa: Fusarium spp., Fusarium oxysporum

1H

Fusarium oxysporum is ranked fifth on the list of leading plant pathogens based

on scientific and economic importance It is ranked fifth on a list of top fungal plant pathogens based on scientific and economic importance Banana production in our

country faces many obstacles due to harmful diseases, especially yellow wilt disease caused by the fungus Fusarium oxysporum, and it is also a serious concern for future food production The study was conducted to identify a number of samples of Fusarium oxysporum fungus causing yellow leaf disease on banana plants isolated in the banana

root zone and determine effective inoculation methods For research purposes, 17 banana samples were collected from banana gardens in Dong Nai, Binh Duong, Ho Chi Minh City, Long An and Tien Giang Isolate diseased banana root and tuber samples on

WA medium, after 3-5 days transplant to PGA, SNA, OMA, CLA medium to observe morphological characteristics Among them, 5 fungal samples were collected Most Fusarium oxysporum species produce three types of spores macrocondia, microcondia and the presistent chlamydospores that persists in the soil for many years The method

of pouring spore solution directly onto banana plants in treatment 6 showed more stable results than the other 4 methods, manifested by external wilting and internal discoloration of roots and tubers Furthermore, this method can simultaneously inoculate

a large number of plants per hour, and is widely applicable to Fusarium spp affects

different types of crops.

Keywords: Fusarium spp., Fusarium oxysporum

IV

MỤC LỤC

Trang

Ce ee iXÁC NHAN VA CAM ĐOANN 5-5-5222 222125521212112121212121121211121211212101 212 xe ii

AB TRA CI | iásecexsnssxs15116106818058101601631303101658150130156109408380500308.06.1/3E30875ĐS0SEEDMDYEEĐSDH138836430035Ẵ 1V

Ñ TU (Ce ee ee eee ee ee eee ee eee V

DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT -2222¿2222++22EEEttrrrrkrrrrrrrrrrrrrrrke viiDANH SÁCH CAC BANG 0 c:ssseesssssseessssseeessssessssseeesseeessssusecesseesesnesecesneeseenseess viiiTAO HH CAA cncecensseeenuaeennnenen enemas ix

LoL Dat c7 11.2 Mục tiêu đỀ tài - s5 s s2 T1 211712121111212112121111212211102111122111121EEEerre |

1S od NOLO UG I Cll eee eee eee ee eee 1

CHUNG 2 DEI CUA TAT LTB V0 Ẻ.Ố`.ốốố 22.1 Tổng quan về cây chuỐi - 2 2+22++2E+2E++2E++2EE22EE2EE2221221221221 22122 re 22.1.1 Nguồn gốc và lịch sử về chuối 2-22 25++2222EE£2E+2EE22E222E2212222221 222222 22.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối 22 2 2+SSE+£22E+EE+E22E+£E2EzzEzzxzzxe 32.1.2.1 Sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới 2 2¿22+©2++22++2zxvtrrvrxrrrrree 32.1.2.2 Sản xuất chuối ở việt nam + 2+ 2+E+2E+EE2EE2EEEE2121221211212121121 111.1 xe 32.2 Tổng quan về bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên chuối - - 42.2.1 Bệnh Fusarium oxysporum trên các cây trồng 2-©22©222222222xccxczxe 42.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên cây chudi 5971.1, ee 52.2.2.2 Ở Việt Naim 2 5< S139 1 12122121211212111121111111111111111111111111 201111101 Eecxe 62.2.3 Giới thiệu nam Fusarium oxysporum f.sp Cubense (F0€) -. - 62.2.3.1 Đặc điểm phân loại - 2 2222222122E2EE2EE2E12212112212711211221211221 21 xe ¢

22,32 Triew chun brew Hiển: ben sssscocszseitisioticBtbSGEUEEEIEEISSESIRENHIGBEASSSISIGIGBESSSE38380388 ý

2.2.3.3 Tính gây bệnh của nấm FOC ¿22 -<55522522122322122121121112010020025011000 c0 82.2.3.4 Các con đường lan truyền bệnh 2- 2+22+2E2EE+2E2EE2EE22EE22E2222222z2ezrxee 9

2.2.3.5 Phòng trừ nam Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng lá trên chuối 9CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -22©22222222+22z+2z+zzxees 11

3.1 Thới gian vä.địa điểm nghiền gữu «e0 H413 11

3.2 Vat lien va phirons PHấp HEME CHU sossreseccnssemnomnemnmnsemememmrsanmeennn 11

3.2.2 Hoá chat, dung cụ và thiết Di cece ccccecesscssessessessessessessessessessessessessesseeseeees ll3.2.3 Phương pháp thu thập và phân lập nắm 2-2 2222z+2z222++2x+zz+zzxeez 113.2.3.1 Chuan bị môi truO1ng eee ccee ee cceesesecesesessessesesseesescecsessessesssessesssneeeesaeeseseees 123.2.3.2 Phan lap nam bệnh ở chuối bệnh trên môi trường WA - c.ccece- 123.2.4 Định danh bằng hình thái các mẫu nắm đã phân lập -2 2- 5z: 133.2.5 Xác định phương pháp chủng bệnh dé đánh giá các mẫu Fusarium oxysporumphân lập trong vùng rễ chuối vàng lá 2-2-©2+222++2E+2EE+2EE+2EE+2EE+2ZErzrxverrvr 133.3 Xử lý số liệu -+222E221221221212212112121212112112112112121212121121222 2e 18CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -. -2- 2+2222+E22E22E2EE2E22E2222E2xcrxze, 194.1 Kết quả thu thập mẫu chuối bị bệnh vàng lá - -5-©55+©cxcccssrcseee 194.2 Kết quả phân lập mẫu nắm bệnh 2: 2 22 +2222E22E22EE2EE+2EE2EE2ZE222EzzEzzzzzzxe 204.3 Kết quả định danh hình thái tản nấm - 2-2 22 S+SE+SE+EE+EE+EE+EE22E22E22222222Xe2 pal4.3.1 Kết qua định danh hình thái mẫu nam DNI.1 -2252252z222z22z22z>2s2 214.3.2 Kết quả định danh hình thái mẫu nắm IDNI.2 - 2-22 22 22222+2z2>2zzz>s22 324.3.3 Kết quả định danh hình thái mẫu nam IDNI.3 2-22 2s2222z£+zz2zzzzzz22+2 234.3.4 Kết quả định danh hình thái mẫu nắm TP 1 . - 2-22 25222s+2+2zzzzzz>s+2 244.3.5 Kết quả định danh hình thái mẫu nấm BDI . 22 22222z222zz2z222zzz+2 254.4 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cay đến hình thái các mau nấm 264.5 Xác định phương pháp chủng bệnh hiệu quả dé đánh giá các mẫu Fusarium

oxysporum phân lập trong vùng rễ chuối bị bệnh vàng lá -2- 225525222552 27

lây 0 88a .ốố 34 4.6.1 Đánh giá bệnh sau khi chủng bệnh ee + +52 +22 *2+*+z£+zE+zerverrerrrrrrrree 34

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VA DE NGHỊ 2-222222222+22E22EE2EE2EE2EEerrrerrres 36

1 TH an caneiceeobkecruratiotgrrftirptdnisatisingteOtistgsggSig0i00n0810ndnsndne 36

SD DS ghd eee ‹j 36TAI LIEU THAM KHẢO - 2-2 S2+S2+E£SE9EEEEEEEEEE2E2521251212212112121211211121 21 xe 37

VI

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

PGA Potato glucose agar

PDA Potato dextrose agar

OMA Oat meat agar

WA _ Water agar

CLA Carnation Leaf piece Agar medium

SNA Spezleller Nahrstoffarmer agar

DANH SÁCH CAC BANG

Bang 2.1 Diện tích và sản lượng các loại cây ăn quả 2020 - 4

Bảng 3.1 Triệu chứng bên ngoài của bệnh héo vàng lá trên chuối 17Bang 3.2 Triệu chứng bên trong củ của bệnh héo vàng lá trên chuối 17Bảng 4.1 Kí hiệu mẫu và địa điểm lay mẫu 2 2+2222z+Ez+Ez2E+zzxzcxez 19

Bảng 4.2 Các mẫu Fusarium oxysporum đã phân lập được 20

Bảng 4.3 Đường kính tản nam sau 6 ngày trên các môi trường nuôi cấy (mm) 26

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Bồ trí nghiệm thức chủng nắm trong nhà lưới - 2 22552552: l6Hình 4.1 Triệu chứng chuối bị bệnh VATE 1B csssssnnssvsnssnesnanevusensuexpasnssnasmaermusensesnemences 20Hình 4.2 Đặc điểm hình thái mẫu nắm DI Í ssccvsscisrccsssenversrscsnasvecrvesonsnmsiiniecanmenee 21Hình 4.3 Đặc điểm hình thái mẫu nấm IDƯNI.2 - 2-22 +2+2E+2E22E22E+2E222z2zz2ze2 22Hình 4.4 Đặc điểm hình thái mẫu nắm DN1.3 - 2-2 2 +S22E+2E+2E£E+zEzEzzzze, 23Hình 4.5 Đặc điểm hình thái mẫu nấm TPI.L -2¿2¿+222£+2E+2E2zE+zE+zzzzzzs+2 24Hình 4.6 Đặc điểm hình thái mẫu nắm BI l - 2 2 2+222E£S£+E££E+Ez+Ezzzzzxzza 25Hình 4.7 Đặc điểm hình thái các mẫu nam Fusarium phan lập từ cây chuối trên các mơitrường sau 7 ngày nuơi cấy ở 25C -©2- S2 23221221211211211211211211211211212121 21 xe 26Hình 4.8 Diễn biến bệnh biểu hiện trên lá và củ sau 10, 20, 30 ngày chủng bệnh ở mẫu

Hình 4.9 Diễn biến bệnh biểu hiện trên lá và củ sau 10, 20, 30 ngày chủng bệnh ở mau

TEP ¿42x 1z532525135210103H017B02EIBG3BBRIGSRBBHSGBISRSEGRE-GUSRIEBNE-IBIRGEEECIEBGEELEOSBGSORIRGGRSPRABIESA82G: 30

Hình 4.10 Diễn biến bệnh biểu hiện trên lá và củ sau 10, 20, 30 ngày chủng bệnh ở mẫu

Hình 4.11 Tác nhân gây bệnh được tái phân lập từ cây chuối bị bệnh sau khi chủng 30

TB AY Hhgittsng6iiSitG3ls53430088058035901505Et:48gi9VEyEiiaki3GR/Giád4S01dùx ener Eee nema mous 31

1x

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng 4m nên thuận lợicho cây công nghiệp, cây ăn quả phát triển như chuối, cam, bưởi, nhãn, phục vụ cungcấp trong nước vụ và cho việc xuất khâu

Trong quý I năm 2022, kim ngạch xuất khâu các loại trái cây của Việt Nam ghi

nhận mức tăng trưởng 6n định Theo dit liệu thu thập của BSA (Business Studies and

Assistance Center) được tổng kim ngạch xuất khẩu của 11 loại trái cây chính tăngkhoảng 10% so với cùng kì năm 2021 Trong đó, các loại trái cây như chuối, mít và sầuriêng ghi nhận mức tăng trưởng ấn tượng, từ 30 - 200% giá trị Về chuối có kim ngạchxuất khẩu 135 triệu USD, tăng 72% so với cùng kì năm 2021, sản phẩm xuất khâu chủyếu vẫn và chuối tươi Thị trường chính của chuối Việt Nam tiếp tục là thị trường TrungQuốc, chiếm đến 80% tổng sản lượng xuất khẩu

Ở nước ta, chuối là cây ăn quả quan trọng, đứng hàng đầu về diện tích và sảnlượng Tuy nhiên sản xuất chuối ở nước ta gặp nhiều trở ngại do các bệnh gây hại đặcbiệt là bệnh héo vàng do nam Fusarium oxysporum gây ra Đây là một loại bệnh gâyảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của chuối, gây bệnh mạnh nhất là giai đoạn cây trưởngthành, ra hoa, tạo quả làm cho cây bị héo vàng rồi chết

1.2 Mục tiêu đề tài

Xác định được phương pháp chủng bệnh đánh giá các mẫu Fusarium oxysporum

phân lập trong vùng rễ chuối vàng lá

1.3 Nội dung thực hiện

Thu thập và phân lập tác nhân gây bệnh héo vàng ở vùng rễ chuối bị vàng lá.Định danh các mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái trên môi trường nuôi cấy nhân

tạo.

Xác định phương pháp chủng bệnh hiệu qua dé đánh giá các mẫu Fusarium phânlập trong vùng rễ chuối bị bệnh vàng lá

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tống quan về cây chuối

2.1.1 Nguồn gốc và lịch sử về chuối

Chuối là tên gọi các loài cây thuộc chi Musa Cây chuối là cây thân thảo, là cây ănqua quan trọng, đứng hàng đầu về điện tích và sản lượng, chúng mang lai giá trị kinh tế,

dé trồng và cho sản lượng khá cao đối với thị trường trong nước cũng như trên thé giới

Chuối ban đầu được tìm thấy ở Đông Nam A, chủ yêu ở An Độ Cho đến nay,người ta đã tìm thấy sự đa dạng về nguồn gen cây chuối không chi ở nơi phat sinh nguồngốc mà còn ở khu vực Nam Mỹ, Đông Phi và Tây Phi Việc sản xuất chuối hàng loạtbat đầu vào năm 1834 và thực sự bắt đầu bùng nỗ vào cuối những năm 1880

Chi chuối (Musa) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu A và được thuần hóa rấtsớm ở vùng Đông Nam Á Nguồn gốc các giống chuối ăn được xuất phát từ 2 loài chuốiđại có hạt trong chi Musa là Musa acuminata và Musa balbisiana Chính sự tai tổ hợptrong điều kiện tự nhiên và qua nhiều đời giữa 2 loài này đã hình thành rất nhiều nhómgiống chuối Trong đó nhóm Cavendish mang kiểu gen AAA với rất nhiều giống chuốitiêu thương mại được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ (Simmond và

2.1.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối

2.1.2.1 Sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới

Chuối là một trong những loại trái cây được sản xuất, buôn bán và tiêu thụ nhiềunhất trên toàn cầu Hơn 1000 giống chuối tồn tại trên thế giới, cung cấp các chất dinhdưỡng quan trọng cho người dân ở các nước sản xuất cũng như nhập khâu Trong đóloại được giao dịch nhiều nhất là chuối Cavendish, chiếm gần một nửa sản lượng toàncầu với khối lượng sản xuất hang năm ước tính là 50 triệu tan Chuối có thé đóng góp

không chỉ vào an ninh lương thực hộ gia đình như một loại lương thực chính mà còn

tạo thu nhập như một loại cây công nghiệp Chuối được sản xuất chủ yếu ở Châu Á,Châu Mỹ Latinh và Châu Phi Các nhà sản xuất lớn nhất cho tiêu dùng nội địa là Ấn Độ

Liên Bang Nga.

2.1.2.2 Sản xuất chuối ở Việt Nam

Các loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn ở Việt Nam như chuối, xoài, vải,dứa, nhãn, cam, bưởi Trong đó chuối là cây ăn quả có quy mô sản xuất lớn nhất Năm

2020, sản xuất chuối đạt tổng diện tích 136.569 ha với sản lượng 2.267.520 tấn cao hơn

so với các loại cây ăn quả khác.

Theo Hoàng Bằng An và ctv (2010), ở nước ta chuối là loại trái cây có điện tích

và sản lượng cao Diện tích trồng chuối lại không tập trung, do đây là loại cây ngắnngày, có nhiều công dụng và ít tốn điện tích nên chuối được trồng ở rất nhiều nơi trongcác vườn cây ăn trái và hộ gia đình Một số tỉnh miền Trung và miền Nam có diện tíchtrồng chuối khá lớn (Thanh Hóa, Nghệ An, Khánh Hòa, Đồng Nai, Sóc Trăng, Cà Mau

có diện tích từ 3000 ha đến gần 8000 ha) Trong đó, ở các tỉnh miền Bắc có diện tích

trồng chuối lớn nhất như Hải Phòng, Nam Định, Phú Thọ diện tích trồng chuối chưađạt đến 3000 ha.

Bảng 2.1 Diện tích và sản lượng các loại cây ăn quả 2020

TT Chúng loại Diện tích (ha) Sản lượng (tan)

(Nhãn, vải: Nguồn từ Tong cục thông kê, 2020).

Kết quả điều tra cho thấy bệnh này có mặt trên phạm vi cả nước, tính riêng miềnNam có tới 70% diện tích bị nhiễm trong đó nhiều vùng thiệt hại tới hơn 85% năng suất

2.2 Tổng quan về bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên chuối

2.2.1 Bệnh Fusarium oxysporum trên các cây trồng

Chi Fusarium bao gồm nhiều loại nam gây bệnh thực vật quan trọng nhất Nóđược xếp hạng thứ năm trong danh sách các loại nắm gây bệnh thực vật hàng đầu dựatrên tầm quan trọng về mặt khoa học và kinh tế (Ploetz, 2005b) Các loài thuộc chi

Fusarium như Fusarium oxysporum, Fusarium solani thường gây bệnh cho thực vật,

người và động vật gây thiệt hại đáng kể đến ngành nông nghiệp ở các quốc gia

Trong các loài nam gây hai thì Fusarium oxysporum là một trong những nhómnắm nguy hiểm nhất (Smith va ctv, 1988) Chúng có thé tồn tại dưới dang sợi nam, các

dạng bào tử lớn, bào tử nhỏ và bào tử hau(Agrios, 1997).

Theo mô tả của Srivastava va ctv, (2018) F oxysporum trên môi trường PDA có

màu trắng đến tím, được đặc trưng bởi sự sinh sản đồi dào các tiểu bao tử và bao tử hậu

ở đầu giả hoặc đơn thé bình Dai bao tử dang hình trụ với hai đầu nhọn, có 3 vách ngănmỏng và mật độ lớn trên quả thể màu cam khi nuôi cấy trên môi trường CLA Tiểu bảo

tử hình bầu dục, elip hoặc hình hạt đậu, thường không có vách ngăn Tản nam của F.solani trên môi trường PDA có màu trang đến kem, mặt sau đôi khi có màu xanh lục

Đại bào tử hình lưỡi liềm tương đối thăng, có 3 — 7 vách ngăn, có mật độ lớn trên các

quả thể màu kem trên CLA Tiểu bào tử hình bầu dục, elip hoặc hình hạt đậu, thườngkhông có vách ngăn Tiểu bào tử và bao tử hậu đính trên đầu giả của sợi nam, bào tử

hậu này đôi khi đính theo cặp.

Nam Fusarium oxysporum cô phạm vi ky chủ lớn và tồn tại nhiều dang khác nhautrong đất Các bệnh héo Fusarium do các dang loài của F oxysporum gây ra Mỗi dangloài thường chi có thé gây hại trên một loài ký chủ Ví dụ: F oxysporum f sp.lycopersici gây héo trên cây cà chua, héo Fusarium trên chuối do F oxysporum f.sp

cubense, F oxysporum f.sp zingiberi trên gừng F oxysporum f sp dianthi gây héo

trên cây cam chướng

2.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên cây chuối

2.2.2.1 Trên thế giới

Theo Bancroft (1876), báo cáo và mô tả ban đầu về bệnh héo chuối do Fusariumoxysporum trên thé giới là từ Uc vào năm 1874 Có khả năng căn bệnh này đã ảnh hưởngđến các giống chuối man cảm ở nhiều nơi trên thế giới vào thời điểm nó được mô tả lầnđầu tiên trên giống cây trồng “Silk” (bộ gen AAB) rất man cảm ở Úc vào thế kỷ 19

Sau khi việc sản xuất thương mại giống “Gros Michel” (bộ gen AAA) bắt đầu ởkhu vực Mỹ Latinh/Caribe vào cuối thế kỷ 19 thì căn bệnh này mới trở nên nghiêmtrọng Vào giữa thé ky 20, căn bệnh này đã phố biến ở Gros Michel và có tác động tanphá đối với ngành trồng chuối trong khu vực Vào năm 1910, lần đầu tiên tiến sỹ Erwin

Smith đã phân lập được tác nhân gây bệnh từ mô cây bị bệnh tai Cu Ba và đặt tên là Fusarium cubense E.F Smith (Smith, 1910) Vào năm 1919, Brandes đã có những

nghiên cứu đầu tiên dé xác định quan thé nam và nhận biết một số đặc điểm hình tháitrên một số môi trường nuôi cấy.

Ở Đài Loan các giống chuối Cavendish cũng được phát hiện thấy nhiễm bệnh héovàng, bệnh đã hủy khoảng 23.000 ha chuối ở nước này vào năm 1967 và những nămsau đó (Su va ctv, 1977) Mayer (1983) đã tiến hành phân lập quan thé nam gây bệnh

và đã chỉ ra một chủng mới (chủng 4) gây hại trên nhóm Cavendish.

Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả thì xuất hiện trước tiên làchủng 1 và chủng Người ta đã tiễn hành phân lập và phân tích các mẫu nam gây bệnhhéo vàng chuối từ nhiều nước trên thế giới bằng nhiều phương pháp khác nhau kết quảcho thay quan thé nam gây bệnh được chia thành 4 chủng (Bentley và ctv, 1998):

Chung I và chủng 2 gây bệnh ở các giống Gross Michel (AAA), Silk (AAB), LadyFinger (AAB), Pisang awak (ABB), Bluggoe (ABB) và các nhóm có quan hệ gan gũi

khác.

Chung 3 gây bệnh ở các loài thuộc chi Helicolia.

Chung 4 xuất hiện muộn hơn chủng 1 và chủng 2, chủng này có khả năng gâybệnh rất lớn ở mọi nhóm giống chuối (trên các giống chuối thuộc nhóm Cavendish vàcác giống chuối man cảm với chủng 1 và chủng 2) Theo Buddenhagen giả thuyết rangchủng 4 là kết quả đột biến của chủng 1 và chủng 2 trong các điều kiện nóng, lạnh thayđổi đột ngột (Buddenhagen, 1990)

2.2.3 Giới thiệu nắm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc)

Nam Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc)

Vi tri phan loai

Giới: Fungi

Loai: Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc)

Burgess và Summerell (1993) đã đưa ra cơ sở phân loại nam F oxysporum gồm 7chỉ tiêu như sự hình thành bào tử lớn; hình thành bào tử nhỏ; hình dạng và kiểu bào tử

nhỏ; dựa vào kích thước của bào tử nhỏ và sự có mặt hay không có mặt của bào tử hậu

(bào tử chống chịu) trên môi trường PGA; đường kính tản nắm trên môi trường PGA vàcuối cùng là sự hình thành tản nắm

2.2.3.1 Đặc điểm phân loại

Theo George (1989), hệ sợi nắm mang các bảo tử đính phân nhánh hoặc tạo thànhcụm bào tử đính Các bào từ đính được xuất hiện vào giai đoạn muộn trên bề mặt lá,cuống lá của cây nhiễm bệnh

Tiểu bào tử đơn nhân, đôi khi có 2 vách ngăn, hình oval, một số kéo dải, kích thước

5-7x2.5—3 um.

Đại bao tử dạng thang đến hoi cong hình liềm, từ 2 - 6 vách ngăn, có kích thước

22-36x4- 5 um.

Bào tử hậu có vách dày được tạo ra trong cây vào giai đoạn muộn của chu kỳ bệnh.

Chúng rất bền và tồn tại trong thời gian dài, khi gặp các điều kiện thuận lợi chúng tách

ra và mọc các ống mầm Chúng có thê phát triển đơn hoặc thành chuỗi, các bào tử hậuhình oval có kích thước 7 — 9 um hoặc hình cầu đường kính khoảng 7 - 7,5 um

2.2.3.2 Triệu chứng biệu hiện bệnh

Bệnh héo vàng gây ra bởi nam F oxysporum có thê xảy ra ở bat cứ giai đoạn sinhtrưởng nào của cây Tùy theo mức độ gây hại mà triệu chứng bệnh biéu hiện khác nhau

Chu kỳ bệnh của Fusarium spp bat đầu với sự lây nhiễm của hệ thống rễ và sau

đó là sự xâm lấn của mô mạch dẫn đến tình trạng thiếu nước, mat điệp lục và héo rũ(Ploetz, 2015) Cây bị nhiễm bệnh thường chết trước khi ra chùm, do đó bệnh héoFusarium làm giảm đáng kể năng suất trên những ruộng bị nhiễm bệnh (Stover vaPloetz, 1990) Bệnh héo vàng ở cây chuối thường gây hại ở tat cả các giai đoạn sinh

trưởng của cây nhưng mạnh nhất ở giai đoạn trưởng thành, ra hoa tạo quả làm cho cây

bị héo vàng rồi chết (Pegg va ctv, 1996; Ploetz, 2006)

Các chủng 1 đã gây ra một trong những dai dich thực vat tồi tệ nhất trong lịch sử

và tàn phá ngành công nghiệp thương mại trồng chuối Gros Michel ở Trung Mỹ vàonhững năm 1950 (Ploetz, 2005) Kết quả là“Gros Michel” đã được thay thế bằng cácdòng Cavendish kháng thuốc và hiện đang được nuôi trồng trên toàn cầu Mặc dù nhữngloại này đã dập tắt dịch bệnh do chủng 1 gây ra, nhưng nhiều giống chuối quan trọngtrong khu vực vẫn man cảm với các chủng này và không chống chọi nổi với căn bệnh

này (Ploetz, 2006).

Triệu chứng biểu hiện bên ngoài được ghi nhận đầu tiên ở các lá phía dưới của lácây, có màu vàng nhạt ở xung quanh mép lá, sau đó màu vàng lan dần vào phía gânchính của lá Các lá già dần dần bị héo toàn bộ, gãy gục, rũ xuống xung quanh thân giả.Đặc điểm quan trọng đặc trưng được nhận thấy là xuất hiện mạch màu nâu đỏ ở thân cu,

thân giả va cả be lá trong các cây bị bệnh (Bentley và ctv, 1998; Moore va ctv, 1993;

Ploetz, 2015).

Khi cắt thân củ và thân giả ở các cây bình thường có màu trắng trong khi đó cáccây bị bệnh xuất hiện màu đỏ nâu ở hệ mạch dẫn ở thân giả, thân củ và cả rễ Màu đỏcũng có thể quan sát thấy ở bẹ lá và cuống buồng của các cây bị bệnh nặng Tuy nhiênkhông xuất hiện màu nâu đỏ trong quả ở các cây bị bệnh như bệnh héo vàng gây ra bởi

vi khuẩn (George, 1989; Moore va ctv, 1995; Ploetz, 1995 và Wardlaw, 1961)

2.2.3.3 Tính gây bệnh của nam Foc

Foc là một trong khoảng 100 dạng đặc biệt của F oxysporum gây ra hiện tượng héo mạch ở thực vật có hoa (Gerlach và Nirenberg, 1982).

Foc gây bệnh trên các loài chuối và chi Helicolia Nam Foc được chia thành 4chủng dựa trên cơ sở gây nhiễm với các giống cây chủ trên đồng ruộng:

Chung 1 gây bệnh ở giống Gross Michel (AAA) và nhóm giống chuối tây Silk

(AAB), Pisang awak (AAB), Lady Finger (AAB).

Chủng 2 gây bệnh ở Bluggoe (ABB) và các giống chuối có quan hệ họ hàng gần

gũi với chúng.

Chung 3 gây bệnh ở các loài trong chỉ Helicolia (có quan hệ gần gũi với chi Musa)

và chỉ gây nhiễm nhẹ ở chuối

Chủng 4 gây bệnh hại ở mọi giống chuối thuộc nhóm Cavendish (AAA) và cácgiống man cảm với chủng | và 2, xuất hiện muộn hơn chủng 1 và chủng 2.

2.2.3.4 Các con đường lan truyền bệnh

Fusarium oxysporum là loại nam cư trú trong đất Cac bào tử có vách dày có thésông ở trong đất, trong xác cây bị bệnh, trong rễ cây chủ trung gian tới 30 năm Chúng

có thé lan truyền từ vùng này sang vùng khác như lan truyền bằng sự di chuyên củathân củ, cây con giống, đất bị nhiễm bệnh và các phương tiện vận chuyên như xe tải,xẻng, cuốc Đây là con đường lan truyền chủ yếu Trong đó, gió và nước cũng là tácnhân lan truyền bệnh phát tán các loại bào tử đi xa tới nơi chưa có mầm bệnh Tuynhiên, do thời gian tồn tại của các bào tử này ở ngoài không khí ngắn cho nên lan truyềnbằng con đường này không đóng vai trò quan trọng (Wardlaw, 1961)

Các yếu tố anh hưởng đến sự phát triển của bệnh như nhiệt độ là yếu tố quan trọngnhất ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh Sự phát triển của bệnh đạt tối ưu khi nhiệt

độ đạt tối ưu cho sự sinh trưởng của cây Thông thường nhiệt độ thích hợp cho sự pháttriển của bệnh là 25 - 35°C Khi nhiệt độ trên hoặc dưới ngưỡng này, sự phát triển của

bệnh chậm lại Trong thời gian mùa đông và ở những vùng có độ cao trên 700m như

Jamaica người ta nhận thấy bệnh phát triển rất chậm Ngược lại ở những vùng nhiệt đớisức tan công của bệnh cao hơn các vùng khác, các yếu tố dinh dưỡng cũng có ảnh hưởngđến sự phát triển của bệnh (Wardlaw, 1961)

2.2.3.5 Phòng trừ nam Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng lá trên chuối

Hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ nào thực sự hiệu quả với bệnh héo vàngchuối do nam Fusarium oxysporum gây ra trên chuối Việc sử dụng thuốc trừ nam hóahọc chỉ tác động được vào nam bệnh đang phát triển mà không tác động được đến bảo

tử nam, đồng thời tồn dư hóa chất sẽ ảnh hưởng đến con người, môi trường và chấtlượng nông sản (Ploetz, 2015) Các biện pháp như hóa học, luân canh cây trồng, bổ sungcác chất hữu cơ hay đề cho đất nghỉ đều không có hiệu quả (Ploetz và Pegg, 1997) Bào

tử chống chịu sinh ra có thê tồn tại trong đất nhiều năm mà không cần sự có mặt của cây

ký chủ (Stover, 1962) Hiện nay, các giống chuối thuộc nhóm Cavendish cũng đang bịtấn công bởi nắm gây bệnh héo vàng chủng 4 (Plucknette, 1987) Chủng 4 hiện là mối

đe dọa lớn mới nhất cho nền sản xuất và thương mại chuối Sự xuất hiện hoặc lây lan

đến các khu vực sản xuất chuối lớn của châu Mỹ Latinh, vùng Caribe hoặc Tây Phi gây

ra thiệt hại lớn về năng suất Người ta ước tinh rằng khoảng 80% sản lượng toàn cầu

đang bị đe dọa bởi chủng 4 (Ploetz, 2005).

Các giống chuối cải tiến hầu hết là các dòng đột biến của dong Cavendish đã đượcchọn lọc trong các khảo nghiệm trên diện rộng Đây là những công việc tốn thời gian,tốn kém và đôi khi không đáng tin cậy do điều kiện môi trường thay déi cũng như sựphân bồ và sự đa dạng của vật liệu cấy không xác định (Mert và Karakaya, 2003)

Với tình hình này việc tìm ra giống kháng, xác định và giám sát tác nhân gây bệnh

là rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng an ninh lương thực của hàng triệu người trên thế giới

và tác động tới ngành xuất khẩu

Hiện nay phương án sử dụng giống kháng được cho là có hiệu quả và đang đượctiếp tục tìm kiếm Các phương pháp chọn lọc thông qua biến di Soma hay tạo giống độtbiến cũng đang sử dụng để tạo ra kiểu gen kháng

Việc nghiên cứu ra giống kháng bệnh hay sử dung các dòng nam đối khángTrichoderma sp cũng mở ra một hướng phòng trừ mới đối với bệnh héo vàng trên chuốinhư sử dụng nam có ích dé phòng trừ bệnh hại đã được nghiên cứu và áp dung nhiềutrên thế giới Kết quả nghiên cứu cho thấy các enzyme thủy phân đóng vai trò trong ứcchế sự phát triển của nắm bệnh Nam đối khang Trichoderma sp là một trong nhữngbiện pháp sinh học quan trọng trong phòng trừ bệnh nắm đất (Harman và ctv, 2004)

Ngoài ra cần cũng cần lưu ý các yếu tố đến sự sinh trưởng của cây, các tác nhângây bệnh như chú ý đến pH đất, các nguyên tố vi lượng, điều kiện thoát nước và loạiđất trước khi tiến hành trồng chuối để hạn chế sự lây lan của nam bệnh

Tuy nhiên việc sản xuất chuối ở nước ta gặp nhiều trở ngại do các bệnh gây hạiđặc biệt là bệnh héo vàng do nắm Fusarium oxysporum gây ra Đây là một loại bệnhgây ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của chuối, gây bệnh mạnh nhất là giai đoạn câytrưởng thành, ra hoa, tạo quả làm cho cây bị héo vàng rồi chết Vì vậy, việc xác địnhđược phương pháp chủng dé bệnh đánh giá các mẫu Fusarium phân lập trong vùng rễchuối bị vàng lá nhằm tạo ra một giao thức kiểu hình được tiêu chuẩn hóa và chấp nhận

dé đánh giá khả năng kháng bệnh Panama ở chuỗi là rat cấp thiết

10

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ thang 08/2023 cho đến tháng 11/2023 tại Phòng Chan

đoán Bệnh cây, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Mẫu thí nghiệm

Mau thí nghiệm được thu thập từ rễ, củ của các cây chuối có biểu hiện triệu chứng

bị bệnh vàng lá ở các tỉnh Đồng Nai, Long An, Bình Dương, TP HCM và Tiền Giang

dé phục vụ cho phân lập

3.2.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị

Hoá chất phân lập: PGA (Potato Glucose Agar), SNA (Thạch Spezieller

Nahrstoffarmer), CLA (Carnation Leaf piece Agar)và OMA (Oat meat agar), Ethanol

96°, Ethanol 70°, SM (Sporulation media)

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Tủ cay vô trùng, can phân tích, nồihấp, lò vi song, tủ sấy, tủ mát, máy lắc, bếp điện, kính hién vi

Dụng cụ: Ong nghiém, dia petri, dau tuyp cac loai, binh tam giac, cốc thủy tinh,bình thủy tinh, micropipet, ống nghiệm, eppendorf 1,5 mL, đèn cồn, que cấy và một số

dụng cụ nhỏ khác.

3.2.3 Phương pháp thu thập và phân lập nắm

Mẫu được thu thập tại các địa điểm ở Đồng Nai, Bình Dương, TP HCM, Long

An và Tiền Giang Mẫu bệnh được thu thập từ thân giả, củ và cuống lá của các cây cóbiểu hiện triệu chứng bị bệnh vàng lá Phân lập các mẫu này được tiến hành theo mô ta

của Moore và ctv (1995) Mẫu được bảo quản trong túi zip polythene có chứa hạt silical

gel, giữ khô trong tủ mát với thời gian lưu trữ tối đa 3 ngày Ghi chú kí hiệu nhóm bệnh,

số hiệu mẫu và thời gian thu thập mẫu

Các chủng nắm đã phân lập khác nhau được nuôi cấy trên bốn môi trường dinhdưỡng riêng biệt để quan sát hình dạng nắm trong các điều kiện nuôi cây khác nhau:

PGA (Potato Glucose Agar), SNA (Thạch Spezieller Nährstoffarmer), CLA (Carnation Leaf piece Agar)va OMA (Oat meat agar) (Nirenberg, 1976) Kích thước đường kính

1]

của mẫu nâm được đo bằng thước sau 6 ngày nuôi cấy Các đặc điểm phân loại như đạibào tử, tiểu bào tử, sợi nam, bào tử chống chịu được quan sát dưới kính hiển vi.

3.2.3.1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nghiên cứu được hấp tiệt trùng ở1219C/1 atm/20 phút Các môi trường gồm WA (20 g agar, 1000 ml nước), PGA (20 gagar, 20 g glucose, 200 g khoai tây, 1000 ml nước), OMA (20 g yến mach, 20 g agar,

1000 ml nước), CLA (5 g lá cam chướng, 20g agar, 1000 ml nước), SNA (1 g KHzPOu

,1 g KNOs, 0,5 g MgSO4.7H20, 0,5 g KCI, 0,2 g D-glucose, 0,2 g D-sucrose, 20 g agar,

1000 ml nước), SM (0.2 g G-glucose, 10 g yeast extract, 10 g potassium acetate) va phan

phối vào dia petri đường kính 90 mm

3.2.3.2 Phân lập nắm bệnh ở chuối bệnh trên môi trường WA

Phan lập nam Fusarium oxysporum trong mẫu cây chuối bị bệnh héo vàng và xácđịnh các đặc điểm sinh học của nắm dựa theo phương pháp của Groenewald va ctv

(2006).

Các mẫu mô thân giả bị đôi màu do nhiễm bệnh được cắt thành các miếng nhỏSem, khử trùng bề mặt bằng Ethanol 70°, dé khô trong buồng cấy vô trùng, rồi cắt thànhđoạn 5 mm đặt lên môi trường WA Sau 3-5 ngày, các khuẩn lạc nam Fusariumoxysporum được chuyên sang các đĩa có môi trường khác nhau và sau đó được đưa vàobuồng phát triển ở 25°C cho đến khi các khuẩn lạc đạt kích thước 2-3 cm Dé tạo cácmẫu nuôi cấy đơn bào từ thuần nhất, một miếng thạch nơi nắm sinh trưởng (kích thước0,5 cm x lem) của mẫu nam nuôi cấy sau 3 - 4 ngày được lắc trong ống falcon chứa10ml nước cắt vô trùng trong vài phút Sau đó các bào tử đơn được cấy chuyên lên môitrường thạch, sau 24 — 30 giờ nuôi cấy các đơn bào tử nảy mầm được tách ra đưới kínhhiển vi soi nổi và nuôi cấy trong các môi trường dé nghiên cứu đặc điểm hình thái, cácđặc điểm phân loại và phân tích các mẫu nam thành các nhóm khác nhau dựa theo mô

tả phương pháp của Moore và ctv (1995).

3.2.4 Định danh bằng hình thái các mẫu nắm đã phân lập

Sau khi phân lập và làm thuần các mẫu nam bệnh, tiến hành quan sát đặc điểmhình thành sợi nắm, bào tử và đo kích thước Quan sát tiểu bào tử, đại bảo tử, bào tử hậu

để sàng lọc với các loại nắm khác, ghi nhận hình ảnh Các chủng phân lập khác nhauđược nuôi cấy trên bốn môi trường dinh dưỡng riêng biệt dé quan sát hình dạng nam

12

trong các điều kiện nuôi cay khac nhau: PGA, SNA, CLA, OMA.

3.2.5 Xác định phương pháp chủng bệnh để đánh giá các mẫu Fusariumoxysporum phân lập trong vùng rễ chuối vàng lá

Sau khi sàng lọc các mẫu là Fusarium oxysporum tiễn hành nuôi cấy Các mẫunắm được nuôi cấy ở 27-28°C trên môi trường PGA ở 5 ngày trong tối

Cây chuối chủng bệnh là chuối in vitro giống Cavendish 5 tuần tuổi được trồngvào các chậu C5 (cao 10 cm — đường kính 8 cm) có chứa đất hoặc cát và sau đó đượcđặt trong buồng giữ âm ở nhiệt độ 28 + 2°C, 12 giờ chiếu sáng và độ 4m tương đối

~85% Sau 12 giờ chuyển cây vào nhà lưới duy trì độ âm

Sử dụng môi trường tao bào tử SM được chuẩn bị bằng cách hấp 500 ml nước có

bổ sung 2 g dịch chiết đậu xanh đã đun sôi (SMB20; Bai và Shaner, 1996) Các bìnhtam giác được đậy bằng nút bông và khử trùng ở 121°C trong 20 phút

Soi nam được lay từ một đĩa mới phát triển và được chuyền sang môi trường SM

có bổ sung 2 g dịch chiết đậu xanh Các bình tam giác đã cấy được ủ trên máy lắc vớitốc độ 130 vòng/phút ở 25 + 2°C trong 6 ngày phương pháp này được dùng cho nghiệm

thức 2 (NT2), NT3 và NTó.

Fusarium oxysporum phát trién dang sợi nam được trộn với chất nền hấp khử trùnghai lần bao gồm đất, hạt bắp và 500 ml nước cat Sau đó, các bình được ủ ở 25°C trongkhoảng 12 ngày Dat cát hấp khử trùng được làm nhiễm chat nền bị nhiễm bệnh theo ty

lệ 1:12, sau đó các bình chứa hỗn hợp nay được ủ thêm 6 tuần phương pháp này được

dùng cho NTS Hạt bắp bị nhiễm bệnh được tao ra bằng cách cấy 100 g hat đã khử trùngvào bình tam giác với Fusarium oxysporum có nguồn gốc từ một khuẩn lạc tươi đangphát triển trên đĩa PGA Các bình được ủ ở 25°C trong bóng tối trong 10 ngày phương

pháp này được dùng cho NT4.

Phương pháp đếm mật số bào tử

Rot 10 ml môi trường SM (NT2, NT3, NT6) có bồ sung đậu xanh có nam Fusariumoxysporum được nhân nuôi sau 6 ngày ở 25°C Dùng Micropipet hút dịch bao tử rồi lọcdung dịch nắm qua màng lọc sau đó dùng Micropipet nhỏ dung dịch bào tử nắm đầybuồng đếm và đếm tổng số bào tử trong 10 ô đếm của buông đếm hồng cầu Thomas

(Đúc).

13

Cho 10 ml nước cất đã khử trùng (NT4, NT5), cạo nhẹ trên bề mặt môi trường sau

đó lọc dé loại bỏ phần sợi nam Pha loãng dung dich bào tử từ 107! — 103, đặt lamen trên

bề mặt buồng đếm, dùng Micropipet nhỏ dung dich bào tử nam đầy buồng đếm và đếmtổng số bảo tử trong 10 ô đếm của buồng đếm hồng cầu Thomas (Đức)

Bồ trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tô Cây sau khi chủngđược đặt trong buồng chủng ở nhiệt độ 26 + 2°C và độ 4m tương đối 60% - 80% trong

12 giờ Đối với tất cả thí nghiệm chọn 10 cây chuối già có 3 - 5 lá và chiều cao 6 - 12

cm được duy trì trong chậu đề tránh rò ri dich bao tử và lây nhiễm chéo (Mohamed vactv, 2001), nghiệm thức đối chứng 10 cây không chủng nam Đối với tat ca thí nghiệmgiá thê được hấp thanh trùng 2 lần, đặt trong khu cách ly, tưới nước đủ âm Phương phápchủng tương ứng với 1 phương pháp là một nghiệm thức từ NT2 đến NTó, nồng độ lâynhiễm là 10® bào tử/ml đối với NT2, NT3 và NT6 Nong độ lây nhiễm đối với NT4 và

NTS là 10° bào tử/g

NTI nghiệm thức đối chứng không chủng nam có tạo vết thương Vết thương đượctao bằng cách tia rễ, cat bỏ 1 — 4 cm tính từ đầu rễ và ngâm trong nước hấp khử trùngtrong 30 phút, sau khi lấy cây ra khỏi nước đề khô 10 phút và tiến hành trồng cây chuối

vào.

NT2 chủng chuối bằng địch bào tử có tạo vết thương vào đất Chuối được rửa sạchbằng nước, cắt tia các rễ thừa 1/3 khối lượng ban đầu (cắt bỏ 1 - 4 cm tính từ đầu rễ),ngâm 30 phút trong dung dịch bào tử tạo điều kiện cho mầm bệnh xâm nhập và giữ chocây có đủ nước cho đến khi trồng Sau khi lấy cây ra khỏi dung dịch bào tử đề cây khô

10 phút

NT3 chủng chuối bằng dịch bào tử có tạo vết thương vào cát tương tự NT2

14

NT4 bồ sung hạt bắp đã nhiễm nam Fusarium oxysporum vào đất trồng chuỗikhông tạo vết thương, hạt bắp được đặt đều xung quanh chậu

NTS trồng chuối vào đất đã nhiễm bào tử hậu không tạo vết thương

NT6 đồ trực tiếp 15 ml dich bào tử nắm Fusarium oxysporum lên đất trồng khôngtạo vết thương

Chuẩn bị: Dat, cát vàng được hấp thanh trùng 2 lần

Chuan bị cây: Chuối dùng chủng bénhe là chuối in vitro 5 tuần tuôi, sau khi ravườn ươm ồn định 2 tuần tiến hành lây nhiễm

Chuẩn bị nắm: Mẫu nắm thuần được nuôi cấy trong môi trường cám ngô, cát vàng

am và môi trường SM có bồ sung 2 g dịch chiết đậu xanh

Phương pháp chủng tương ứng với một phương pháp là một nghiệm thức (từ NT2

đến NT6) với nồng độ lây nhiễm là 10° bào tử/ml hay 10° bào tử/g Đánh giá và ghiđiểm các nghiệm thức được bắt đầu ở 10 ngày sau khi chủng với các thông số về chiềucao cây, số lá, số lá nhiễm bệnh, mức độ nghiêm trọng của bệnh và tỷ lệ mắc bệnh hàngtuần, cây được theo dõi hàng ngày Đánh giá biểu hiện bệnh sau 1 tháng lây nhiễm

(Moore và ctv, 1993).

15

chủng nâm trong nhà lưới.

Hình 3.1 Bó trí nghiệm thức

16

Đánh giá bệnh sau khi gây nhiễm:

Sau khi gây nhiễm bệnh, các cây được theo dõi hàng ngày và ghi điểm về các triệuchứng diễn biến của bệnh trong khoảng thời gian hàng ngày Đánh giá các nghiệm thứcđược bắt đầu sau 10 ngày sau khi chủng với các thông số về chiều cao cây, số lá nhiễmbệnh, mức độ nghiêm trong của bệnh và tỷ lệ mắc bệnh hàng tuần Đánh giá biểu hiện

bệnh sau 1 tháng lây nhiễm (Moore và ctv, 1993).

Cây được kiểm tra bên ngoài và bên trong khi bị thối rữa hoàn toàn hoặc khi 75%

số lá chuyên sang màu vàng và kết thúc ở 1 tháng sau khi chủng Các triệu chứng bênngoài tý lệ lá vàng hay héo được cho điểm theo thang điểm từ 1 - 4

Bảng 3.1 Triệu chứng bên ngoài của bệnh héo vàng lá trên chuối

Triệu chứng bên ngoài Điêm sô Phân trăm bệnh Biêu hiện bệnh

1 0>x<25% Không xuất hiện lá vàng hay lá dưới cùng xuất hiện

quan theo thang điểm 1 - 6

Bảng 3.2 Triệu chứng bên trong củ của bệnh héo vàng lá trên chuối

Triệu chứng bên trong củ

Điểmsô Phầntrămbệnh Biểu hiện bệnh

1 0% Không đôi màu ở củ

2 x<5% Rễ, củ bắt đầu xuất hiện màu nâu đỏ

3.3 Xử lý số liệu

Các số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel 2016 và phân tích ANOVA Iyêu tố bằng phần mềm Minitab 1ó

18

CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả thu thập mẫu chuối bị bệnh vàng lá

Mẫu bệnh được thu thập từ thân giả, củ và cuống lá của các cây có biểu hiện triệuchứng bệnh Trong đó, các lá (hầu hết các lá già) có màu vàng rõ ràng (bắt đầu từ mép

lá) hoặc vàng hết toàn lá, kêt hợp với sự đôi mau nâu và vét nứt dọc của các be lá giả

hành Từ những cây có triệu chứng được quan sát trên đồng ruộng, mô mạch dẫn màu

nâu nhạt được thu thập từ củ và rễ Thời gian lay mau là vào mùa khô, sau khi thu thập,các mẫu mô bị nhiễm bệnh được bảo quản trong túi giấy và đặt trong tủ lạnh hoặc hộplàm mát đề tránh giảm chất lượng mẫu khi phân lập

Bảng 4.1 Kí hiệu mẫu va địa điểm lay mẫu

Ký Triệu Giai đoạn sinh a Dia diém

4 BD Củ chudi Chưa có buông 2 Bình Dương

4.2 Kết quả phân lập mẫu nắm bệnh

Trong quá trình điều tra các mẫu rễ, củ của cây chuối biéu hiện giống bệnh héovàng đã được thu thập từ các vùng điều tra, phân lập và xác định tác nhân gây bệnh

trong phòng thí nghiệm (bảng 4.2).

Bảng 4.2 Các mau Fusarium oxysporum đã phân lập được

err Mau F oxysporum Ký chủ Số mẫu oe điểm

phân lập được lây mâu

(c) cu chuối bị bệnh, (4) rê chuối bị bệnh.

ang lá (a) lá chuyển vàng, (b) nứt thân giả ở gân gốc,

Kết quả thu thập mẫu thu được 17 mẫu chuối bao gồm rễ, củ chuối tiêu có triệuchứng bị bệnh vàng lá đã phân lập được 5 mẫu nam Trong đó, 3 mau nam phân lậpđược từ củ, rễ chuối bị bệnh vàng lá ở mẫu lay từ Đồng Nai ở giai đoạn có buồng, 1 mẫuphân lập được từ củ chuối bị bệnh vàng lá ở Bình Dương, 1 mẫu phân lập từ củ chuối bịbệnh vàng lá ở TP HCM, các mẫu chuối thu thập ở các tỉnh Tiền Giang, Long An sau

khi phân lập không có sự xuât hiện Fusarium oxysporum.

20

4.3 Kết quả định danh hình thái tản nam

4.3.1 Kết quả định danh hình thái mẫu nắm DN1.1

Hình 4.2 Đặc điểm hình thái mẫu nam DN1.1; (a) mặt trên và (b) mặt dưới tản nấm trên

PGA sau 7 ngày nuôi cay, (c) đại bào tử, (d) tiểu bào tử, (e) sợi nam, 0) bào tử chống chịu, Scale bar=25um.

Đặc điểm hình thái tản nắm DNI.1 tốc độ sinh trưởng khá nhanh, đường kính 85

mm sau 7 ngày nuôi cấy trên PGA ở 25°C với tản nắm tròn, có vòng tròn đồng tâm, mặttrên tản nắm màu trắng bông, mặt dưới màu trắng gần tâm có màu tím đen Đại bào tử

có dạng từ thắng đến hơi cong với 2 đầu nhọn từ 3 - 5 vách ngăn (thường có 3 vách

ngăn), kích thước 22 - 31 x 3 - 6 um (trung bình 26,23 + 3,9 x 3,58 + 0,5 um, n = 30), tiêu bào tử hình oval không có vách ngăn với kích thước 4 — 8 x 2 — 3,6 uM (trung bình

6,24 + 1,41 x 2,73 + 0,38 wm, n = 30), bào tử chống chịu có vách dày hình tròn đếnoval xuất hiện ở đầu sợi nam hình thành riêng lẻ hoặc mọc xen kẽ bên trong sợi nam với

kích thước 7,7 - 9 x 6 - 8 um (trung bình 7,61 + 0,6 x 7,04 + 0,66 um, n = 30).

21