Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp. từ tôm thẻ chân trắng

Qua thời gian học tập và nghiên cứu về chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại Trường, em đã được quý Thầy/Cô ở Khoa tin tưởng cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp “Phân lập và định danh vi kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG DOI

KHANG VỚI Vibrio spp TỪ TOM THE CHAN TRANG

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện =: NGO THỊ THANH THUY

Mã số sinh viên : 19126277

Niên khóa : 2019 — 2023

TP Thu Đức, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TOT NGHIỆP

PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUAN CÓ KHẢ NĂNG DOI

KHANG VỚI Vibrio spp TỪ TÔM THẺ CHAN TRANG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN HOÀNG DŨNG NGÔ THỊ THANH THÚY

ThS LÊ QUỲNH LOAN

TP Thủ Đức, 03/2024

LOI CAM ON

Thời gian bốn năm gắn bó tại trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM đặc biệt là khoa

Khoa học Sinh học không phải là hành trình quá dài, nhưng những gì em nhận được từ các

thầy cô là vô cùng to lớn Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giảng viên trường Đại

Học Nông Lâm TP.HCM đã trang bị cho em những kiến thức và những chia sẻ kinh nghiệm

vô cùng quý báu đề làm hành trang vững chắc bước vào đời

Qua thời gian học tập và nghiên cứu về chuyên ngành Công nghệ Sinh học tại

Trường, em đã được quý Thầy/Cô ở Khoa tin tưởng cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp

“Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp từ tôm thẻ chântrắng” Đây là đề tài rất thiết thực và ứng dụng thực tế vào giai đoạn phát triển hiện đạingày nay giúp cho chúng em có thêm những kiến thức, trải nghiệm thực tế cụ thể và sâu

sắc hơn về đề tài nghiên cứu

Em xin cảm ơn sâu sắc đến toàn thể quý Thầy/Cô khoa Khoa học Sinh học nói chung

cũng như gửi đến thầy Tiến Sĩ Nguyễn Hoàng Dũng, cô Thạc Sĩ Lê Quỳnh Loan nói riêng

cùng với đó là phòng Vi sinh Ung dụng thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới đã tận tình giúp đỡ,

hỗ trợ hướng dẫn và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, thực hiện đề

tai.

Trong quá trình thực hiện đề tài, tuy thời gian không quá dai nhưng em đã cô gắnghết sức dé hoàn thiện nhưng cũng không thé tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận

được sự thông cảm và tận tình chỉ bảo, góp ý của quý Thây/Cô

Kính chúc quý Thay/C6 dồi dào sức khoẻ dé có nhiều cống hiến hơn nữa trong sựnghiệp phát triển của ngành và cũng như tiếp tục diu dắt những thế hệ trẻ tương lai của datnước ngày một phát triển tốt hơn

Chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên: Ngô Thị Thanh Thúy, MSSV: 19126277, Lớp: DH19SHB (Số di động:

0866122471, Email: 19126277@sthcmuaf.edu.vn) thuộc nganh Công nghệ Sinh họcTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan tất cả kết quả đạt được trong

khóa luận tốt nghiệp: Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibriospp từ tôm thẻ chân trang” do chính tôi thực hiện, các số liệu, thông tin trong nghiên cứu

này là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hộiđồng về những cam kết này

Tp H6 Chí Minh, ngày thang nam

Người viet cam đoan

il

TÓM TẮT

Bệnh do nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây ra được xem là bệnh nguy hiểm gây thiệthại nghiêm trọng đến ngành nuôi trồng thủy sản nói chung và ngành nuôi tôm nói riêng,

trong đó bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease - AHPND)

hay còn gọi là bệnh hội chứng chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS) được xem là

một bệnh nguy hiểm trên tôm đã ảnh hưởng đến nhiều trang trại nuôi tôm trong khu vựcĐông Nam A Ngoài ra chủng Vibrio harveyi cũng là một chủng gây bệnh nguy hiểm trêntôm, chúng không chỉ gây bệnh tôm phát sáng mà còn liên quan chặt chẽ với bệnhAHPND/EMS, đây là những chủng vi khuẩn nguy hiểm khó kiểm soát gây thiệt hại nghiêm

trong cho ngành nuôi tôm Việc phân lập vi khuẩn lactic và Bacillus từ nguồn mẫu tôm ao

và mẫu nước thu từ ao nuôi tôm được đánh giá có khả năng đối kháng với Vibrioparahaemolyticus va Vibrio harveyi gây bệnh trên tôm Khi khảo sát khả năng đối khángcủa 9/25 chủng vi khuẩn phân lập được tuyển chọn có khả năng là vi khuẩn Lactobacillus

và Bacillus bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, kết quả phân lập va sang lọc thu

được 1/9 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn Ching Lactobacillus fermentum R3.1 cókhả năng kháng khuẩn tương đối mạnh với đường kính vòng phân giải lớn nhất đạt 10,2 +

0,4 mm Ngoài ra, L fermentum R3.1 có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bảo

Từ các khả năng trên, Lactobacillus fermentum R3.1 là chủng vi khuẩn tiềm năng trong

ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học

Từ khóa: Lactobacillus, Bacillus, Vibrio, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, EMS/AHPND, enzyme

11

The disease is caused by the group of bacteria Vibrio spp is considered a dangerous disease that causes serious damage to the aquaculture industry in general and the shrimp farming industry in particular, including acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND), also known as acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) Early Mortality Syndrome (EMS) 1s considered a dangerous shrimp disease that has affected many shrimp farms in Southeast Asia In addition, the Vibrio harveyi strain 1s also a dangerous pathogenic strain on shrimp They not only cause glowing shrimp disease but are also closely related to AHPND/EMS disease These are dangerous bacterial strains that are difficult to control and cause damage serious for the shrimp farming industry Isolation

of lactic bacteria and Bacillus from shrimp pond samples and water samples collected from shrimp ponds was assessed as having the ability to oppose Vibrio parahaemolyticus and Vibrio harveyi that cause disease in shrimp When examining the antagonistic ability of 9/25 selected isolated bacterial strains that were likely Lactobacillus and Bacillus bacteria using the diffusion method on agar plates, the isolation and screening results yielded 1/9 strains exhibits antibacterial activity Lactobacillus fermentum R3.1 strain has relatively strong antibacterial ability with the largest resolution circle diameter reaching 10,2 + 0,4

mm In addition, L fermentum R3.1 is capable of synthesizing many types of extracellular enzymes From the above capabilities, Lactobacillus fermentum R3.1 1s a potential bacterial strain in biological product production applications.

Keyword: Lactobacillus, Bacillus, Vibrio, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi, EMS/AHPND, enzyme

1V

2.1 Tinh hình nuôi tôm hiện nay ở Việt Nam G522 2222122212221 ree 3

2 Tình hình dịch bệnh trong ngành nuôi (6101 sssc0sc.ccevcscscsnesensessexsvusssencoensesvessesaveenetoveess 4

2.3 Vibrio spp Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên tôm 2 2 22 22S22222+zz+zzzzzsez 52.3.1 Đặc điểm hình thái của Vibrio c.ccccccecccccccsesesessesessesessesessesssesessesessesessesesseseseeeees 5

23.2.Cae bệnh: do: Vibrio spp GAy 0a snore vemeencousesceuen samen eer eI 6

2.4 Anh hưởng của thuốc kháng sinh trong nuôi tôm 2 22 222S+22222z2zz2Zzzzz+zs22 95.5, Chế phim sinh trig PHO WIG scvaccevtasersncievecervervonevrevmsvereavenercnsvrewexvineeastovsneenverciae 10

2.6, Cú04eHHmw Promotie TOs BaD sauoseseiesaaniiisogiiiisiidogigi800440435E80G02480560Lxi.4G00308800660:88008 11

2.7 Các đặc tinh sinh học có lợi của chủng vi khuẩn probiotic s- s2 s2sz2sz5s+2 132.7.1 Đặc tinh sinh tổng hợp enzyme ngoại bảo -2- 2-56 cSS2zcz2zcrerreerreee 132.7.2 Đặc tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh - 2 2 2222+2z+2E+2zz22zzzzzzxzex 142.8 Tình hình nghiên cứu lợi khuẩn trong và ngoài nước ứng dụng trong nuôi tôm 15

2,8.l« [inh hình: ne bieis cir THỨG NRO sasebspnstie-gaehiablietoegsiokkiiugsigxgi0is8ieescslggkokgsssbesi 15 2.8.2 Tình hình nghiên cứu trong nue - - 5 <2 +*£+*£+*E+*E£vE£vEeeErrerreeeerxerereereere 16

CHUONG 3, VAT LIEU = PHUGNG PHÁP NGHIÊN CỨỮU cả ẰẰSSẰSSieee 17

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ¿ 2 222z+2+£EE+EE+2E+2EE2EE22E22E2E222222222xee 17

221, UAL ee pưngganggstiitigst9igi4gipf4gtfQ0380S810/0 men aerate aaa ees T7

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 2 ¿52 Ss+212S12E22E2212122121121121121221211211211211121121 2 cce 173,37 Dựng |) ee 17

3.2.3 Môi trường nuôi cấy - +: 2 2222222 2E12212212212212112112112112112111121211211 11 xe 18

3.2.4 Hóa chất và thuốc thử : -522++222++22211222211222.1 T re 21

Bd: Ê Hương pháp nghiện BÚIceseeeeanesoaotonodbrdgliotootEgiontuietibdstk.0fGIE0G301851uG044000000800010L-0038 0 0ng 22

3.3.1 Phương pháp thu mẫu -¿- 2 22 S22SE2EE2E22ESEE2EE2EE2E123212212112117121 21112112 13,3,7, Phương pháp xử 19 HH cscoveecexscveceneneenconeqnoreeseeenseneaveeesrevereunierseasenreneesteveoeenevrvene 23

3.3.3 Fhương pháp phân lập ví KHUẨN: seeesesesnaiseeniadiosioLiovrilisokodiongrrutoitbi00840001000 06 233.3.4 Phương pháp hoạt hóa giống ¿22 2 122E2EE22E22EE2E1221221221221212212221221 2 xe 242751518N/01u010106ii701i7770707 7 ÖÒÔốẽẽaẽ ố me neu ae emcee ees ẽ eee 253.3.6 Phương pháp đối kháng với chủng Vibrio Spp 2 2225252+22222222222z<: 25

3.3.7 o8 ạana Ả 26

Su Be Thị t:ng niệm eet assoc sennsaaoeedkiioi0Aa dùGSu9sg1009400L44G010S80151/440001G04004/38000040020800I4GS00Hj 27 3.3.9 Thur nghiém Oxidase 0 28 Bide O., TUE mS Si CEA oe aeseeomenoatere seemed vata te oat a weet teseathensesieniraeaRt 28 3.3.11 Thứ nghiệm lên men carbohrydrate cn0rceniesnncneenenancnnsnesnennsnanenonasenennneaisnens 28

3.3.12 Phương pháp định danh bằng giải trình ty 16S rRNA -2-55 - 29

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUAN 0ooeocecceccecsscssessessessessessesessessetsessssessesseeseaseaeess 31

4.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn từ mau tôm ao và nước ao - alROM a Ng lbsseeegerendogrtrxitoetggcepcrs9l4tg9i6:GBLG500000G004610700900.000006 314.1.2 Kết quả hoạt hóa chủng Vibrio spp .:.-ccscssessessessessessessesseesessessessessessessesseeeseees 3441.3 Khả năng: đồi kháng với Vibrio GDDse«eesssausaeeiieidSnlGiAk0àa 136 Eg880036.1000n880A03e0166.ku s6 0Ó

4.1.4 Định danh vi khuẩn 2- + ++S+E+E£EE+E+E£EEEE+E+EEEEEEEEEEEEEEEEEEE21212111712111E1E2Exe 37

4.1.5 Kết qua thử nghiệm Catalase, oxidase và citrate 2 2©2+cccccsscscrscesce- ST4.1.6 Kết quả lên men đường earbolrydtatienci:esacanzeicxsursencincnsexctnorvencencesennvrweverecanetevesvens 39

VI

4.1.7 Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào -. 2-2: 55- 40

4.1 8 Pt danh sinh Wee THIÊN ẲssepseguainaiddidiatiagtttotritoidioiliSgS042800g0/0010n6304030Áã0gi8608 00a 40 4.2 Thảo luận - 2- 22222222212221221122112112211211211121121121121121112111112111112112112112112 c6 42CHUONG 5 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ - 2-2 s+E+EE£ESEE£ESEEEEEEEEErErrerrerees 44

5.1 Kết luận - +52 S21 3221212212121211212111121111 2111111112211 1121112121111111212121 121g 44

SC suagnannountrtginotilG0NGL0I00095000G800000400000001g05400/4G30t1GIG401I05GG(GG1g0050003301G014G00030046 44TÀI LIEU THAM KHẢO 2-2 2 52+S2+E£EE£EE£EE2EE2EEEE2212212112112111211211211111 1110

PHU LLỤC -2-©2¿222222222E221127122112211221221127121121112111112112211211211211121121121121211211 e6

Phụ lục 1: Hình ảnh kết quả phân lập và làm thuần gồm 25 chủng từ mẫu nước ao và tôm

Phụ lục 2: Kết quả đo ODøoonm của chủng Vibrio spp 52-52-55-55255225222zcszcsccecPhụ lục 3: Kết quả đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10; 10°, mỗi nồng độ 2 đĩa petr Phụ lục 4: Kết qua đếm mật độ khuẩn lạc pha loãng 10°; 105, mỗi nồng độ 2 đĩa petri Phụ lục 5: Kết quả giải trình tự gen 16S bằng cặp mồi 27F — 1492R (Trinh tự thô đã

được xử lý bằng phần mém Bioediif) 2-©+5++S22E22E22E221221211211121121121121211121121121 2y c6

Phụ lục 6: Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phươngpháp trực tiếp bằng khuẩn lạc - 2 +s+2S+SE+EE2E221221221221211211212111221211211212121121 1 e6Phụ lục 7: Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h

theo phương pháp trực tiếp bằng khuẩn lạc 2222 5s+22222S22E22E2EE2EE2222522121222222222 22-5

Phụ lục 8: Kết quả kích thước kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h theo phương

Đ9È1)989)1000015197)001 02 .

Phụ lục 9: Kết quả kích thước kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h

theo PNR ñhp: dịch TO HÀ saxeeasseeeeebdiibidndA410u0lAi 0080 062000d0006018061883000/683088i/36440312923501200 4030:8085

VII

DANH SÁCH CAC CHỮ VIET TAT

Polymerase Chain Reaction

Luria Bertani Broth Luria Bertani Agar Man Rogosa Sharpe Man Rogosa Sharpe Agar Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Mueller Hinton Agar

Tryptic Soy Broth Carboxymethyl Cellulose

Đồng bằng sông Cửu Long

Early Mortality Syndrome Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease Vibrio parahaemolyticus

Vibrio harveyi Lactic Acid Bacteria Bacillus subtilis Optical Density Simmons Citrate Agar Kích thước trung bình

Vill

DANH SÁCH CAC BANG

Bảng 3.1 Danh mục dụng cụ trong quá trình thực hiện | PP 17Bang 3.2 Danh mục thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài -22 22 5222z22z2522522 18Bang 3.3 Thành phần môi trường LB Brotth -2- 2 222+2E22E£2EE2EE2EE2ZE2E22222222zxze 18Bang 3.4 Thành phần môi trường MMRS 2-2222 2S+SS2EE2E22E2E22122122122221221221221 22 Xe2 19Bang 3.5 Thành phần môi trường TCBS 22 2 2+SE+2E22E22EE2EE2EE22122522222222222x 19Bảng 3.6 Thanh phần môi trường MHA 22- 22 ©2222222E++EE+2EE+2E+2EE+2E2zZE+zzxzzzrez 20Bang 3.7 Thành phần môi trường TSB 2 2222+2S22E22E22EE2EE22E221221223222222222xe 20Bang 3.8 Thành phần môi trường CMC (Carboxymethyl Cellulose) -.-2- 2 +- 20Bảng 3.9 Thành phần môi trường Starch -2- 22 ©2222222E££EE+2EE22E+2EE22EEzZE+zzxrrrree ralBảng 3.10 Thanh phần môi trường Skim Milk oo cecece ccs eceesceesesseseesseeseeeeeenesees 21Bang 3.11 Thanh phần môi trường thử nghiệm kha năng lên men Carbohydrate 21Bang 3.12 Thanh phan phản ứng PCR thu gen mã hóa trình tự 16S rRNA 30Bảng 4.1 Ching vi khuẩn có hình que Gram (+) phân lập từ mẫu tôm ao và nước ao 32Bang 4.2 Kết quả thử nghiệm sinh hóa của chủng R3.1 2- 2552522 5222z2222z22522 39Bảng 4.3 Một số kết quả kháng lại vi khuẩn Vibrio spp được nghiên cứu 42

1X

https://mintutech.vn/hoi-chung-ems-o-tom-nguyen-nhan-va-cach-dieu-tri-hieu-qua/) 9

Hình 2.6 Đặc điểm hình thái tế bào Bacillus

(Nguén:https://vibo.com.vn/vn/7-tac-dung-cua-bacillus-subtIlis-trong-nuoi-trong-thuy-san.htim]) - 5-5 55+ +c+scseeexeeeeerres 12Hình 2.7 Đặc điểm tế bao Lactobacillus (N guỗn: Kateryna Kon /Shutterstoek) 12

Hình 3.1 Mẫu nội tạng tôm và nước ao tôm + 5-55 4 Sx+t2 + ckgrrrrkrrererree 23

Hình 4.1 Một số hình dạng khuẩn lạc phân lập được trên môi trường LBA sau 24h 31Hình 4.2 Một số hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường MRSA sau 24h - 48h 31Hình 4.3 Một số hình dạng khuẩn lạc phan lập được trên môi trường LBA sau 24h 3 lHình 4.4 Một số hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường MRSA sau 24h - 48h 32Hình 4.5 Hình thái của vi khuẩn Vibrio harveyi (A) Hình thái đại thé của vi khuẩn V.harveyi; (B) Hình thái vi thể của vi khuẩn V harveyi 5 5©5s5c5cs-se -.- 34Hình 4.6 Hình thái vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (A) Hình thái đại thé của vi khuẩn

V parahaemolyticus; (B) Hình thải vi thé của vi khuẩn V Parahaemolyticus 35

Hình 4.7 Kết qua khang Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h -5- 2 52552- 35Hình 4.8 Kết quả khang Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h 35Hình 4.9 Kết quả kháng Vibrio parahaemolyticus của chủng R3.1 sau 24h 36Hình 4.10 Kết quả kháng Vibrio harveyi của chủng R3.1 sau 24h -5 - 36Hình 4.11 Hình thái đại thé của chủng R3.1 2 252 2S22E+EE+EE22Z2E22E2EEczxcrecree 37Hình 4.12 Hình thái vi thé của chủng R3.1 (vật kính 100X) (A) Nhuém Gram; (B) Nhuộm

DOGG nEEEEDSSIEEEEEEDDDEOTHIEDEE(GIEEUDIGEGRIVHAGENINRIItrllBttalBltairnottyNNuiNtoolqudaa 37

Hình 4.13 Kết qua thử nghiệm khả năng sinh enzyme catalase và enzyme oxidase củachủng R3.1 (4) Kết quả thí nghiệm oxidase; (B) Kết quả thí nghiệm catalase 38Hình 4.14 Kết qua thử nghiệm khả năng sinh enzyme citrate của chủng R3.1 Bén trái [DC

(-)] là đĩa thạch đối chứng âm; Bên phải là đĩa kết quả thử nghiệm Citrate 38

Hình 4.15 Kết quả khảo sát khả năng sinh acid của chủng R3.1 Ong nghiệm (A) Lactose;

ống nghiệm (B) Glucose; ống nghiệm (C) Maltose; ống nghiệm(D) Saccharose 39

Hình 4.16 Vòng phân giải enzyme ngoại bao của chủng vi khuẩn R3.1 (A) Vong phân giải

CMC từ dich enzyme cua chung R3 1; (B) Vòng phân giải Starch từ dich enzyme cua chung R3.1; (C) Vong phân giải Skimmilk từ dich enzyme của chung R3 Ì - 40

Hình 4.17 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen 16S —

XENG cản chúng ee 41

Hình 4.18 Mức độ tương đồng của chủng R3.1 với chủng trên cơ sở dit liệu NCBI 42

XI

CHUONG 1 MỞ DAU

1 Dat van dé

Ngành nuôi trồng thủy sản là một ngành sản xuất mũi nhọn với tiềm năng xuất khẩu

lớn của Việt Nam, trong đó có nuôi tôm thẻ chân trắng (Nguyen & Nguyen, 2019) theo Cục

Thủy Sản (Bộ NN & PTNT) hang năm ngành nuôi tôm đã đóng góp khoảng 40 - 45% tổnggiá trị xuất khẩu thủy sản của nước ta Trong đó sản lượng nuôi chủ yếu tập trung vào tômthẻ chân trắng, sản lượng tăng từ 119.700 tấn vào năm 2010 lên 735.000 tấn vào năm 2023

Trong những năm qua dịch bệnh đã và đang xảy ra nhiều trên tôm nuôi gây thiệt hạinghiêm trọng cho người nuôi tôm, điển hình là bệnh đường ruột do vi khuẩn Vibrio spp và

vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopanaei (EHP) gây ra Tôm bệnh thường biểu hiệnmột số dấu hiệu bệnh lý điển hình liên quan đến gan tụy như sưng mềm, nhạt màu, cùngvới các dâu hiệu đường ruột như ruột đứt khúc hoặc rỗng, phân lỏng và phân trắng

Bên cạnh đó do tình hình nuôi tôm ở nước ta với quy mô lớn, diện tích ngày cảngtăng dẫn đến tỷ lệ bệnh trên tôm cũng tăng theo Một trong những nguyên nhân cũng gây

thiệt hại nghiêm trọng về sản lượng ở tôm là do bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) cònđược gọi là hội chứng tôm chết sớm (EMS) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra vàbệnh tôm phát sáng do vi khuẩn Vibrio harveyi Khi môi trường nước trong ao bi ô nhiễm

do lắng tụ chất thải và thức ăn thừa đã tạo điều kiện cho những vi sinh vật có hại cho tômphát triển mạnh, đặc biệt là nhóm vi khuẩn Vibrio spp

Đề kiểm soát dịch bệnh và xử lý nguồn nước bị ô nhiễm người nuôi tôm thường sửdụng thuốc kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn Việc sử dụng kháng sinh không kiểm soátdẫn đến hiện tượng khang kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh, ảnh hưởng đến môi trườnglàm mắt cân bằng sinh thái, gây hại tới cả người sử dụng và các động vật xung quanh Hiện

nay trên thị trường đã có các chế phẩm sinh học là giải pháp mới để người dân thay thế

thuốc kháng sinh và được tin dùng vì chất lượng kiểm soát vi sinh vật gây hại, độ an toàncho môi trường nước dưới ao nuôi Các chế phẩm sinh học chứa những vi sinh vật có lợi

đem lại nhiêu lợi ích cho tôm và ao nuôi, chúng phát triên cạnh tranh gây ức chê các vi sinh

vật gây bệnh, hỗ trợ tiêu hóa cho tôm cân bằng hệ vi sinh đường ruột kích thích sự thèm ăncủa tôm, giúp phân hủy chất hữu cơ trong nước hấp thu xác tảo chết, làm giảm sự gia tăng

của lớp bùn đáy, ngăn chặn được các tác động xấu xảy ra trong môi trường ao tôm nhờ vào

khả năng sinh các loại enzyme amylase, protease, cellulose, ngoại bào Chế phẩm là sự

phối trộn của các vi sinh vật có lợi trong đó nhóm vi khuẩn Lactobacillus và Bacillus được

quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Với những lợi ích trên chế phẩm sinh hoc là một giải phápkhoa học hữu hiệu cho ngành nuôi tôm phát triển 6n định và bền vững

Tuy nhiên hiện nay các chế phẩm chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giáthành cao, với điện tích nuôi trồng thủy sản lớn như nước ta thì chi phí tiêu hao dé nhậpnhững chế phẩm sinh học probiotic là rất lớn, những chế phẩm này được sản xuất ở nướcngoài cũng có những vấn đề liên quan ảnh hưởng đến chất lượng của chế phẩm như điều

kiện môi trường, khí hậu khác với ở Việt Nam.

Từ những van đề trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu dé tài “Phân lập, định danh

vi khuẩn có khả năng đối kháng với Vibrio spp từ tôm thẻ chân trang”

2 Mục tiêu đề tài

Phân lập, sang lọc chủng vi khuẩn có khả năng chống lại vi khuẩn Virio spp từ mẫu

nước ao và tôm ao tại Sóc Trăng.

Định danh chủng vi khuẩn có khả năng kháng lại chủng vi khuẩn Vibrio spp dé ứngdụng trong chế phẩm probiotic

3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn từ mẫu tôm ao và nước ao thu tại ao nuôi

Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng lai Vibrio spp từ các chủng đã phân lập va

khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của chủng có hoạt tính

Nội dung 3: Định danh chủng có hoạt tính kháng lại Vibrio spp.

CHUONG 2 TONG QUAN

2.1 Tinh hình nuôi tôm hiện nay ở Việt Nam

Việt Nam có hơn 700.000 ha diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng và tôm sú và là mộttrong những quốc gia sản xuất và xuất khẩu tôm đứng hàng đầu thế giới với sản lượng300.000 tan mỗi năm Năm 2022, ngành tôm kết thúc với kết qua ấn tượng là sản lượng vàgiá trị kim ngạch xuất khâu đều có sự tăng trưởng đáng ké Trong đó, kim ngạch xuất khâu

ước đạt 4,1 - 4,2 tỷ USD, tăng trên 10% so năm 2021 Theo báo cáo của Tổng cục Thủy

sản, năm 2022, tổng diện tích nuôi tôm nước lợ tại Việt Nam đạt 737.000 ha, cơ bản không

tăng so với năm 2021 Trong đó, diện tích nuôi tôm sú ước đạt 622.000 ha, diện tích nuôi

tôm thẻ chân trắng ước đạt 115.000 ha Sản lượng tôm nước lo ước đạt 745.000 tấn, giảm21% so với cùng kỳ năm 2021 Trong đó, sản lượng tôm sú đạt 271.000 tấn và tôm thẻ chântrang đạt 474.000 tan

So sánh sản lượng tôm nước lợ Việt Nam năm

2021 - 2022

Đơn vị: nghìn tấn Năm 2021 mNam 2022

Tôm nước Ilo Tôm thẻ chân trắng Tôm sú

Hình 2.1 So sánh sản lượng tôm nước lợ năm 2021 = (N guỗn:

https://nguoinuoitom.vn/nganh-tom-viet-nam-2023-san-sang-vuot-kho/).

Trong đó, ĐBSCL là khu vực trong yếu về ngành nuôi tôm ở nước ta, chiếm hơn

90% về diện tích nuôi và hơn 95% về sản lượng nuôi tôm nước lợ Một trong những tỉnh

đã và đang là thủ phủ nuôi tôm ở ĐBSCL, là một tỉnh ven biển của Việt Nam có chiều dai

bờ biên chiêm 2,21% chiêu dài bờ biên của cả nước, có nguôn tài nguyên phong phú, với

đa dạng hệ sinh thái vùng ngập mặn ven bờ Sóc Trăng đã nhanh chóng trở thành ngư trường

rộng hàng đầu khu vực ĐBSCL có trữ lượng hải sản lớn, với sản lượng khai thác được hàng

năm đạt khoảng 400.000 tấn

Theo thông kê của ngành Nông nghiệp trong năm 2022, diện tích thả nuôi thủy sản

của tỉnh hơn 79.000 ha, trong đó, tôm nước lợ thả nuôi hơn 54.600 ha, sản lượng đạt trên

201.000 tan, giá trị kim ngạch xuất khẩu thủy san đạt trên 1,4 tỷ USD, riêng tôm nước lo

đạt khoảng 1 tỷ USD Tỷ lệ tôm nuôi bị thiệt hại ở tỉnh khống chế ở mức 5,3% Theo kế

hoạch năm 2023, Sóc Trăng tiếp tục phát triển diện tích nuôi trồng thủy sản, dự kiến sản

lượng tôm nuôi nước lg khoảng 206.700 tan Hiện tinh đang tích cực triển khai các giải

pháp ứng dụng công nghệ cao vao thực tế nuôi tôm dé bảo đảm cho ngành này phát triểnbên vững

Với sự gia tăng diện tích nuôi tôm mức độ thâm canh hóa ngày càng cao dịch bệnh

diễn ra càng nhiều trên diện tích lớn khó có thể kiểm soát được, làm ảnh hưởng đến năngsuất và sự phát triển bền vững của ngành nuôi tôm của nước ta Năm 2023, theo dự báo củaCục Thủy sản (Bộ NN&PTNT) ngành tôm có thể vẫn tiếp tục phải đối mặt với nhiều khókhăn, thách thức là nguyên nhân gây ra những yếu tố bất lợi cho tôm nuôi, tăng nguy cobùng phát dịch bệnh và gây khó khăn cho sản xuất

2.2 Tình hình dịch bệnh trong ngành nuôi tôm

Trong những năm qua do biến đổi khí hau, thời tiết thay đổi bat thường, làm chomôi trường thay đổi lớn đã ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất, đặc biệt là trong ngành nuôi

tôm của những người dân Chính vì vậy, tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi cũng diễn biếnphức tạp, dịch bệnh còn xảy ra nhiều nơi, kéo dải làm thiệt hại lớn cho người nuôi tôm

Trong thập kỷ qua, ngành tôm đã bị ảnh hưởng nặng nề bởi một số bệnh mới xuất

hiện và tái xuất hiện, đặc biệt là các bệnh do chủng Vibrio spp Một trong những bệnhchính ở tôm đó là AHPND còn được gọi là hội chứng tôm chết sớm (EMS), là một bệnh do

vi khuẩn V parahaemolyticus gây ra Bệnh này đã dẫn đến tỷ lệ tôm chết nghiêm trọng (lên

đến 100%) trong quan thé tôm thẻ chân trắng và tôm st đã gây những tổn thất kinh tế đáng

kể cho ngành nuôi tôm Theo những nghiên cứu gần đây bệnh AHPND/EMS còn liên quanchặt chẽ đến V harveyi chủng vi khuẩn mà thường biết đến là gây bệnh tôm phát sáng

Những năm vừa qua, tình hình dịch bệnh tôm nuôi ngày càng diễn biến phức tạp,chủ yếu là bệnh hoại tử gan tụy cấp và bệnh đốm trắng đã xảy ra ở nhiều địa phương, gâythiệt hại lớn cho người dân nuôi tôm Người nuôi tôm phải đối mặt với tình trạng tốn thấtlớn về trữ lượng do dịch bệnh định kỳ lây lan, việc sử dụng kháng sinh để phòng và điềutrị bệnh không phù hợp, dẫn đến hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh ở

tôm.

Hiện nay, trên thế giới chưa có vacxin để chủ động phòng bệnh cho tôm, vì vậy cácbiện pháp phòng bệnh chủ yếu phải dựa vào các biện pháp an toàn sinh học và quản lý ao

nuôi Cùng với đó là xây dựng quy trình nuôi phù hợp với từng vùng nuôi, đặc biệt là xử lý

nguồn nước ao nuôi, kiểm soát nguồn tôm giống, điều chỉnh quy trình chăm sóc aonuôi Tuy tình hình nhiễm bân của ao nuôi đã được khắc phục bằng giải pháp thay nước

sạch thường xuyên đã xử lý nhưng phần bùn ao mới là nơi tích tụ các chất thải trong quátrình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi sinh vật gây hại phát triển đặc biệt nhóm vi

khuẩn Vibrio spp

2.3 Vibrio spp Vi khuẩn gây bệnh chủ yếu trên tôm

2.3.1 Đặc điểm hình thái của Vibrio

Vibrio spp là nhóm vi khuẩn hình dau phay được phân loại khoa học như sau

Ngành: Proteobacteria

Lớp: Gammaproteobacteria

Bộ: Vibrionales

Họ: Vibrionaceae

Chi: Vibrio (PACINI 1854)

La vi khuan Gram âm, có tính di động cao, ky khí tùy nghi (không can oxy) Đặc

điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio như sau: Gram âm, hình que thang hoặchơi uốn cong, kích thước 0,3 — 0,5 x 1,4 — 2,6 pm Chúng không hình thành bào tử và có

khả năng chuyển động nhờ một tiên mao (ro1) hoặc nhiều tiên mao mảnh

Là nhóm vi khuẩn chiếm da số trong môi trường nước biển tự nhiên, nước lo ở cáccửa sông, chúng tôn tại chủ yếu trong đường ruột tôm, một số loài còn là tác nhân gây bệnh

cho người và động vật biên Kha năng gây bệnh của các chủng Vibrio được tạo điêu kiện

thuận lợi bởi một loạt các yêu tô độc lực được mã hóa bởi các gen độc Năm yếu tố độc lựcchính được tìm thấy ở Vibrio: polysaccharide dang nang, các yếu tô kết dính, độc tố tế bao,

lipopolysaccharide và roI.

Vibrio spp là nhóm vi khuẩn cơ hội, khi điều kiện bat lợi xảy ra (tôm nhiễm virus,

nắm, ký sinh trùng, môi trường nước ao thay đổi, tôm bị sốc) chúng sẽ chiếm ưu thế phát

triển mạnh và gây bệnh cho các loài động vật sống chung trong môi trường

TCBS Agar — Với tên đầy đủ là Thiosulfate Citrate Bile Sucrose Agar, là một môi

trường chọn lọc dé phân lập vi khuẩn Vibrio spp Môi trường TCBS Agar giúp xác định và

phân biệt các loài Vibrio dựa trên hình thái khuẩn lạc đặc trưng của chúng.Thiosulfate và natri citrate, cũng như độ kiềm của môi trường, ức chế đáng ké sự phát triểncủa Enterobacteria Mật bò và natri citrate làm chậm sự phát triển của enterococci và ứcchế sự phát triển của vi khuẩn gram dương Sự axit hóa môi trường do quá trình lênmen sucrose của Vibrio làm cho màu xanh của bromothymol từ từ chuyền dan sang màuvàng, Bromothymol Blue và Thymol Blue là chất chỉ thị pH Sử dụng thiosulfate làmnguồn lưu huỳnh, việc sản xuất hydrogen sulfide được hình dung với sự có mặt của ferriccitrate Chiết xuất nắm men và peptone cung cấp nitơ, vitamin và axit amin trong TCBSAgar Natri clorua mang lại sự tăng trưởng và hoạt động trao đổi chất tối ưu cho Vibrio spp.Công thức ban đầu được phát triển bởi Nakanishi sau đó đã được sửa đôi bởi Kobayashi et

al dé phân lập chọn lọc các loài Vibrio gây bệnh

2.3.2 Các bệnh do Vibrio spp gay ra

Vi khuẩn Vibrio spp đang là mầm bệnh chính gây thiệt hại nghiêm trọng đến nghềnuôi tôm, trên cả tôm sú Penaeus monodon và tôm chân trắng Penaeus vannamei đều démắc bệnh do chủng Vibrio gây ra Ching V parahaemolyticus và V harveyi đã được mô

tả là loài gây ra nhiều bệnh chính trên tôm

2.3.2.1 Bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn V harveyi gây ra

Bệnh phát sáng ở tôm là một hiện tượng đặc biệt chỉ được phát hiện vào ban đêm.

Bệnh hầu như xuất hiện quanh năm trên cả tôm sú và tôm thẻ, xảy ra trong tất cả giai đoạn

trong vòng đời của tôm Thường gặp ở các ao nuôi có độ mặn cao (>15%), và nhiệt độ nướctăng, hàm lượng chất hữu cơ cao, oxy hòa tan thấp Vi khuẩn V.harveyi trong gan của tôm

tiết ra enzyme Luciferase được gọi là điều hòa cảm biến đại biéu có khả năng phát quang

gây ra sự phát sáng ở tôm Trong số nhiều yếu tố điều hòa khác, các gen /+/, namtrong 7x operon trước /uxC, và /„x, liền kề trực tiếp với operon với khung đọc theo hướng

ngược lại, có liên quan đến quy định cảm biến đại biểu [25] Hơn nữa, mức độ của các chất

tự động cảm ứng và các enzym tông hợp của chúng, các chất điều hòa phiên mã, các kinaseliên quan đến các tầng phosphoryl hóa/khử phospho và các tầng truyền tín hiệu và thậm chí

cả các RNA điều hòa đại biểu nhỏ cũng đóng một vai trò trong cơ chế điều hòa phức tạp

này và ảnh hưởng đên mức độ biêu hiện của các gen trong /ux operon.

Hình 2.2 Bệnh phát sáng trên tôm (Nguồn:

https://mybinh.com.vn/tai-lieu-ky-thuat-nuoi-tom/dieu-tri-tan-goc-benh-phat-sang-tren-tom.html).

Hiện tượng phát sáng không khiến tôm chết hàng loạt nhưng làm tôm giảm ăn, tôm

phát triển không cân đối, bỏ ăn, lâu dần sẽ xuất hiện tôm chết rải rác Tôm có thé bị nhiễm

bệnh trong tất cả giai đoạn của vòng đời Khi trưởng thành hoặc trong giai đoạn sản xuấtgiống, khi mầm bệnh bị lây từ tôm bố mẹ sang ấu trùng

Tôm thường phát bệnh sau một tháng đo thời gian này các chất thải trong quá trìnhnuôi tôm néu không được xử lý kịp thời sẽ phân hủy và tạo điều kiện cho vi khuẩn gây bệnhtrên tôm Khi tôm bị nhiễm khuẩn V harveyi sẽ có các biểu hiện chung như sau: tôm bơi

không định hướng, điểm sáng sẽ lan rộng ra toàn thân, thân và mang tôm có mau sam, ban,

thịt đục mau, tôm giảm ăn, suy giảm kha nang bắt môi,

Hình 2.3 Vi khuẩn V harveyi (FSHi]EEr, D.J., 2001).

2.3.2.2 Bệnh tôm chết sớm do vi khuẩn V parahaemolyticus gay raBệnh tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome — EMS) còn gọi là hội chứng hoại tửgan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease — AHPND) là bệnh thiệt hại nghiêm

trọng cho tôm nuôi tại Việt Nam (cả tôm thẻ chân trắng lẫn tôm sú) dù là nuôi thâm canh

hay bán thâm canh Bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Trung Quốc năm 2009, tại Việt Namnăm 2010, nguyên nhân chính do vi khuẩn V parahaemolyticus cư trú trong hệ tiêu hóacủa tôm chúng làm cho đường tiêu hóa của tôm trông rỗng, gan mờ nhạt hoặc không màu

Hình 2.4 Vi khuan V parahaemolyticus (Buller, 2004)

AHPND/EMS là bệnh truyền qua đường miệng, nó xâm nhập vào đường tiêu hóa

của tôm, tạo ra các chất độc gây phá hủy mô và gây trục trặc, làm rối loạn chức cho cơ quan

tiêu hóa của tôm được gọi là gan tụy Các protein độc tố Pir tiết ra bởi chủng Vibrioparahaemolyticus và đóng vai trò thiết yếu trong cơ chế bệnh sinh của AHPND Protein

PirA dường như đóng một vai trò phụ trợ trong sinh bệnh học của AHPND, trong khi chỉ

riêng PirB có thé gây tổn thương tế bao, chang hạn như hoại tử, apoptosis và các ton thươngsinh lý bệnh khác liên quan đến AHPND Đây là nguyên nhân làm cho tôm có tỉ lệ chết

nhanh và lên đến 100% ở giai đoạn 20 - 45 ngày tuôi sau khi thả nuôi Tôm nhiễm bệnh có

những dấu hiệu, biểu hiện như: bơi lờ đờ, ngừng ăn chậm lớn và chết đưới đáy ao tôm biếnmàu, vỏ mềm, gan tụy có biểu hiện sưng to, mềm nhữn hoặc teo Dịch bệnh xảy ra hau hết

các tháng trong năm Gần đây nhiều nghiên cứu đã ghi nhận bệnh EMS/AHPND ngoài

V.parahaemolyticus còn liên quan chặt chẽ với Vibrio Owensii(Liu và cộng sự,

2015), Vibrio harveyi (Kondo va cộng sự, 2015), Vibrio campbellii (Dong và cộng su,

[Giáp đầu ngực và than |

| “tach rời” nhau Cơ

| đục mờ

Hình 2.5 Tôm bị nhiễm EMS/AHPND do vi khuẩn

V parahaemolyticus (Nguồn:

https://mintutech.vn/hoi-chung-ems-o-tom-nguyen-nhan-va-cach-dieu-tri-hieu-qua/).

Dé kiểm soát dich bệnh người dân thường sử dung khang sinh và hóa chất bừa bãidẫn đến hiện tượng phat tán gen kháng thuốc kháng sinh va 6 nhiễm môi trường ảnh hưởngđến cả con người và các động vật xung quanh, điều này cũng dẫn đến việc tái nhiễm bệnhrất cao ở khu vực đã nhiễm bệnh

2.4 Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh trong nuôi tôm

Khi có dịch bệnh người dân thường sử dụng thuốc kháng sinh dé phòng trị vì dùng

thuốc mang lại nhiều lợi ích như tiêu diệt các tác nhân gây bệnh tăng năng suất khi sử dụngđúng thời điểm và liều lượng Tuy nhiên người dân nuôi tôm chưa hiểu rõ những loại thuốc

họ đang dùng dẫn tới việc sử dụng tràn lan các loại thuốc đặc trị thủy sản cũng như thuốc

kháng sinh một cách không kiểm soát chính là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng “lờn” thuốc

của các loại vi khuẩn gây bệnh trên tôm, từ đó việc sử dụng kháng sinh đề phòng trị khôngcòn hiệu quả.

Gần đây việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản đã bị chỉ trích do sự pháttriển, thích nghi của các chủng kháng kháng sinh, sự xuất hiện của dư lượng kháng sinhtrong vật chủ, sự thay đổi quan thé vi sinh vật trong đường ruột, trong hệ thống nuôi và

giảm khả năng miễn dịch Việc lạm dụng các loại kháng sinh và thuốc đã mang lại những

ảnh hưởng tiêu cực như: Ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu đùng do dư lượng thuốc còntồn đọng trong hoạt động xuất nhập khẩu, gây hiện tượng kháng kháng sinh, gây chết các

vi khuân có lợi trong ao nuôi, giảm sức dé kháng, vi khuẩn lon kháng sinh, làm ảnh hưởng

tới môi trường làm mắt cân bằng sinh thái Với những ảnh hưởng của việc sử dụng hóa chatthuốc kháng sinh trong nuôi tôm thì việc tìm ra một biện pháp an toàn hiệu quả là một vấn

đề cấp thiết, ứng dụng probiotic trong nuôi tôm là một giải pháp hữu hiệu và an toàn đãđược các nhà khoa học nghiên cứu và đánh giá rất tốt

2.5 Chế phẩm sinh học Probiotic

Với những ảnh hưởng tiêu cực từ việc sử dụng hóa chất và kháng sinh, hiện nay

probiotic đã được sử dụng như một chất thay thé cho kháng sinh và hóa chat, vì nó có khả

năng được chuyền hóa bởi các vi khuẩn có lợi giúp cho vật nuôi tăng trưởng tốt, tiêu hóa

thức ăn hiệu quả, cải thiện khả năng miễn dịch cho vật nuôi Probiotic giúp cải thiện tỷ lệ

sống, chất lượng nước, khả năng miễn dịch và khả năng kháng bệnh thông qua sự cạnh

tranh trong không gian với các vi khuẩn gây bệnh, chang hạn như Vibrio spp Ngoài ra, vikhuẩn probiotic còn hỗ trợ tiêu hóa bằng cách phân hủy các hợp chất phức tạp thành những

chất đơn giản hơn mà cơ thể có thể hấp thụ dễ đàng hơn Cơ chế này cải thiện hiệu suấttăng trưởng về trọng lượng, chiều dai va tỷ lệ chuyền hóa thức ăn

Probiotic còn đóng một vai trò bên ngoài (cải thiện chất lượng nước), bên cạnh cácvai trò bên trong ma chúng mang lại Chế phẩm sinh học giúp giảm lượng chất hữu cơ trongnước do phân, chất thải, sinh vật chết và thức ăn viên thừa trong nước nuôi trồng thủy sảngây ra Các chế phẩm probiotic b6 sung vào nước ao tôm các vi khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp các chất chống vi trùng như hydro peroxide, các enzyme ngoại bào (amylase,

protease) phân giải các chất hữu cơ và các chất bài tiết thành carbon dioxide và nước,

chuyên hóa các chất độc hại (như amoniac, nitrite, ) thành các chất không độc (nitrat,ammonium) giảm mùi hôi của nước, ôn định pH và màu nước ao Điêu này đặc biệt quan

10

trọng vì chất hữu cơ trong nước có thê biến thành amoniac, một hợp chất có độc tính cao

có thê gây tỷ lệ tử vong lên tới 100% trong nuôi tôm thẻ chân trắng Probiotic làm giảm

hàm lượng amoniac trong nước thông qua quá trình nitrat hóa và khử nitrat Ngoài ra, ham

lượng oxy hòa tan trong nước tăng lên khi có mặt men vi sinh vì chúng phân hủy các chất

hữu cơ mà sau đó sản xuất oxy có thé sử dụng làm chất dinh dưỡng cho quá trình quang

hợp Các vi khuẩn có lợi nay còn có khả năng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây

bệnh, cạnh tranh thức ăn tranh giành vi trí bám của các loải vi sinh vật có lợi với các vi sinh

vật gây hại [36].

Các chế phẩm probiotic có thể được dùng bằng đường uống, tiêm hoặc bé sung vào

nước nuôi trồng thủy sản Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các vi khuẩn

như Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alteromonas và Arthrobacter spp có thé cai

thiện các thông số hiệu suất trong nuôi tôm giúp hiệu suất tăng trưởng, ty lệ sông, khả năngmiễn dịch, khả năng kháng bệnh và chất lượng nước được cải thiện thông qua nhiều cơ chế,

bao gồm xâm chiếm ruột, hoạt động đối kháng, tiết enzyme tiêu hóa, loại bỏ chất thải hữu

cơ và sản xuất các chất dinh dưỡng bé sung như biotin, Vitamin B12, acid béo, acid aminthiết yếu và các yếu tố tăng trưởng cần thiết khác [36]

2.6 Các chủng Probiotic thường gap

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) và Tô chức Y tế

Thế giới (WHO) chế phẩm sinh học được định nghĩa là “các vi sinh vật sống, khi được sửdụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” Probiotic gồm

những vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn acid lactic khác nhau như Lactococcus, Carnobacterium,

Pediococcus, Enterococcus va Streptococcus.

Cac loai vi sinh vat phô biến nhất được sử dụng làm chế phẩm sinh học là vi khuanacid lactic và vi khuẩn bifidobacteria Đây là nhóm chiếm ưu thế và chiếm ưu thế tương

ứng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa Tuy nhiên chủng vi khuẩn Bacillus cũng được sử

dụng làm chế phẩm sinh học vì có những yêu cầu tăng trưởng và đặc tính ồn định rất khácnhau [30], [31].

Bacillus: Bacillus là trực khuân Gram đương, tế bào có hình dạng hình que thang,

có kích thước 0,5 — 2,5 pm x 1,2 — 10 pm và thường được sắp xếp thành từng cặp hoặc

11

chuỗi, có đầu tròn Bacillus có phổ chịu nhiệt, pH và độ mặn rộng, con đường biến dưỡngbằng hình thức lên men hoặc hô hap, hầu hết có catalase đương tính (Holt et al., 1994).Theo phân loại khoa hoc của Bergey chi Bacillus được phân loại như sau:

Chi: Bacillus (Cohn 1872)

Hinh 2.6 Dac diém hinh thai té bao Bacillus(Nguén-https://vibo.com.vn/vn/7-tac-dung-cua-

bacillus-subtilis-trong-nuoi-trong-thuy-san.html).

Lactobacillus: Lactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn LAB (tên goi chung cua nhom

vi khuẩn lactic) là một phần quan trọng của hệ vi sinh ở người và động vật, được ứng dungvào trong công nghiệp sản xuất rất nhiều Theo khóa phân loại Bergey (2001) vi khuânlactic được sắp xếp như sau:

Chi I: Lactobacillus Cx = mã ON.

Hinh 2.7 Dac diém té bao Lactobacillus(Nguồn: Kateryna Kon /Shutterstock)

Chi Lactobacillus hiện bao gồm 148 loài được công nhận (co sở đữ liệu phan loại

NGCBI) và có sự đa dang về chức năng và phát sinh loài cao bat thuong Lactobacilli baogồm các loài và chủng ky khí va kháng hiếu khí và được coi là lên men nghiêm ngặt vàđược chia thành ba nhóm dựa trên đặc điểm lên men: Lên men đồng hình (obligately

12

homofermentative), lên men dị hình không bắt buộc (facultatively heterofermentative) vàlên men dị hình bắt buộc (obligately heterofermentative)

Đặt điểm hình thái của nhóm vi khuân lactic có dạng hình que gram dương, không

tạo bảo tử, có phản ứng catalase âm tính, oxidase âm tính, không di động có kích thước từ

dai thang và mảnh, cong, đến hình que ngắn và dày, tùy thuộc vào độ tuôi nuôi cấy và thành

phần của môi trường nuôi cấy Tất cả các chủng đều được tìm thấy tự do hoặc ở đạng chuỗi

ngắn gồm hai hoặc ba tế bào và khoảng một nửa trong số chúng có kích thước nhỏ, chiều

dài tế bào dao động từ 1,6 um đến 2,8 um Hau hết các loài /actobacillus là vi khuan ky khí

tùy nghi và phát triển tốt hơn trong môi trường ky khí không có oxi Chỉ có khoảng 20%các loài phân lập từ con người là vi khuẩn ky khí bắt buộc Acid lactic là sản phẩm trao đổichất cuối cùng chính của /cfobaeillxs trong quá trình lên men glucose [52]

s* Dinh dưỡng va sinh trưởng

Lactobacilli được coi là sinh vật đòi hỏi môi trường nuôi cay phức tap, các loài lênmen đồng nhất tạo ra acid lactic trong quá trình lên men carbohydrate và một số sản phẩmkhác như acid axetic, ethanol và COa được sản xuất thường xuyên với các tỷ lệ khác nhaubởi các loài nảy Môi trường deMan, Rogosa và Sharpe (MRS) hỗ trợ sự phát triển của

nhiều loại lactobacilli khác nhau nhờ vào thành phần dinh dưỡng phong phú và tối ưu như

peptone từ sữa, phân tử đường từ mật ong, mật ong, giúp các vi khuan lactic phát triểntốt hơn Các loài Pediococcus và Leuconostoc cũng phát triển tốt trên môi trường nay Détạo thuận lợi cho việc hình thành khuẩn lạc, quá trình ủ được thực hiện trong 48 — 72 giờ ở

35 °C trong điều kiện ky khí Vì môi trường MRS không có tính chọn lọc cao nên các khuẩn

lạc được kiểm tra tìm cầu khuẩn gram dương, catalase âm tính (lactococc1) hoặc que

(lactobacilli) dé xác định tạm thời là vi khuẩn acid lactic

2.7 Các đặc tinh sinh học có lợi của chủng vi khuẩn probiotic

2.7.1 Đặc tính sinh tổng hợp enzyme ngoại bào

Một số nghiên cứu [39], [43] cho thấy rằng khả năng sinh tổng hợp các enzyme phângiải như amylase, protease, cellulase, của vi sinh vật mang lai lợi ích cho việc nuôi trồngthủy sản Nhiều nghiên cứu cho thay chủng Bacillus và Lactobacillus có khả năng tiết nhiều

13

loại enzyme ngoại bào có khả năng phân hủy tốt các chất hữu cơ, thúc day sự tăng trưởng

và hỗ trợ xử lý môi trường

Enzyme amylase: amylase là nhóm enzyme phân giải tinh bột các vi sinh vật có kha

năng sản sinh được enzyme amylase như vi khuẩn, nam mốc, xạ khuẩn Cac amylase cókiểu hoạt động, tính đặc hiệu của cơ chất và đặc tính khác nhau, nhiều nghiên cứu cho thấy

amylase được tông hợp nhiều từ Bacillus

Enzyme protease: enzyme ngoại bảo protease phân giải protein, enzyme protease cắtmối liên kết peptide trong phân tử polypeptide, protein và cơ chất tương tự khác thành cácamino acid tự do hoặc các peptide phân tử thấp, protease giúp tăng cường sức đề kháng cho

động vật thủy sản, góp phan làm tăng khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng, thúc day sự tăngtrưởng, giúp duy trì dưỡng chất giúp cá tôm phục hồi sau giai đoạn điều trị bệnh và làmgiảm đáng ké chất thải tích tụ trong ao Protease giúp xử lý môi trường nước trong ao nuôi

bang cách tranh nguồn năng lượng với vi khuẩn có hại, hạn chế vi khuẩn xâm nhập vào

đường ruột của tôm giúp ôn định pH duy trì màu nước góp phần phân hủy các chất hữu co

và xác tảo.

Enzyme cellulase: enzyme cellulase có khả năng phân hủy vách cellulose có tác dụng trong việc xử lý xác tảo và giúp duy trì màu nước trong ao nuôi.

Việc sử dụng các enzyme ngoại bảo trong xử lý môi trường nước ao nuôi có tác

động nhanh hơn, chúng có thể hoạt động tốt trong nhiều môi trường Ngoài ra bổ sung

enzyme vao trong ao nuôi thâm canh còn giúp làm sạch đáy ao, giảm độ keo đục giúp sạchnước ao nuôi, hạn chế được các mầm bệnh gây hại cho tôm

2.7.2 Đặc tính đối kháng với vi sinh vật gây bệnh

Vi khuẩn Lactobacillus và Bacillus là nhóm vi khuẩn probiotic được sử dụng rộngrãi trong nuôi trồng thủy san, hai nhóm vi khuan này không chỉ có khả năng sinh các enzymengoại bào giúp phân giải các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm trong ao nuôi tôm còn có khả

năng đôi kháng với các vi sinh vật gây bệnh.

Đôi kháng dựa vào các cơ chê:

Cạnh tranh về vị trí bám với vi khuẩn gây bệnh ở trên ruột đề tranh giành chất đinh

dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra, đây là tiêu chí quan trọng đề đánh giá hiệu quả

14

của vi sinh vat probiotic Khi vi sinh vật gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu dưỡng chất chúngkhông thé sinh trưởng, phát triển được dé khu trú và phát triển gây bệnh cho vật nuôi.

Probiotic có khả năng tao ra nhiều loại hóa chất ức chế, chang hạn như chất kháng

khuẩn, kháng sinh, enzyme tiêu diệt v1 khuẩn, chất ức chế protease, siderophores , protease,

axit lactic và các hợp chất hữu cơ khác (Lee và cộng sự, 2000) có lợi cho vật chủ

Bacteriocin được sản xuất từ men vi sinh là các peptide kháng khuẩn có tác dụng

diệt khuẩn va được sinh vật này sản xuất dé tiêu diệt sinh vật khác (Zacharof và Lovitt,2012) Sản xuất bacteriocin probiotic (Stein, 2005), ức chế sự biểu hiện gen độc lực củamầm bệnh tôm (Miandare và cộng sự, 2016), và sản xuất các enzyme phân giải chống lạimam bệnh ngăn chặn và phá vỡ thành tế bao của mầm bệnh được ghi nhận chủ yếu (Mông

va cộng sự, 2021).

Kha năng sinh các chất ức chế như: protease, bacteriocin, axit hữu cơ, HaO,ethanol Những chất này được sinh ra trong quá trình sống của vi khuẩn, được sinh ra bêntrong hoặc bên ngoài đường ruột có khả năng tiêu diét có chọn lọc các vi khuẩn gây bệnh,tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột

Tăng cường khả năng miễn dịch: chế phẩm probiotic tác động tích cực lên hệ thống

miễn dịch, chúng giúp tăng cường khả năng miễn dịch ở vật chủ bằng nhiều cách Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh đặc tính kích thích miễn dịch của men vi sinh (Bilal và cộng

su, 2021; Kong va cộng sự, 2020; Punetha và cộng sự, 2018; Terada và cộng sự, 2020).

Nhóm vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme ngoại bảo mạnh, thì nhómLactobacillus có khả năng đôi kháng mạnh với vi sinh vật gây bệnh thuộc nhóm vi khuẩnlactic chuyển hóa đường thành acid lactic Acid lactic và chat bacteriocin sinh ra trong quátrình sống có hoạt tính kháng khuẩn và ức chế vi sinh vật gây bệnh vì vậy nên chế phẩm visinh thường phối trộn giữa hai nhóm vi khuẩn này dé có hiệu quả

2.8 Tình hình nghiên cứu lợi khuẩn trong và ngoài nước ứng dụng trong nuôi tôm

2.8.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

Đề giảm những bat lợi của việc sử dụng hóa chat, kháng sinh ảnh hưởng đến chat

lượng nuôi và môi trường xung quanh các nhà nghiên cứu đã quan tâm và nghiên cứu các

vi khuẩn có lợi dé ứng dụng sản xuất các chế pham probiotic

15

C.-H Liu và cộng sự (2009) đã phân lập vi khuẩn có lợi B subtilis E20 natto Thức

ăn kết hợp với chủng vi khuẩn thúc đây hiệu suất tăng trưởng của tôm đạt sản lượng vượttrội so với đối chứng và không có tôm chết sau khi tiêm B.subtilis E20

Lactobacillus plantarum phan lập từ đường tiêu hóa của tôm hoang đã làm giảm

Vibrio harveyi bằng cách giảm độ pH hoặc sản xuất hydrogen peroxide (Kongnum và

Hongpattarakere, 2012).

Yang Du và cộng sự (2022) đã thử nghiệm chủng /actobacillus plantarum Ep — M17

phân lập từ ruột cá bổ sung vào chế độ ăn của tôm thẻ Litopenaeus vannamei kết quả chothay Ep-M17 làm tăng tốc độ tăng trưởng đặc hiệu, giảm tỷ lệ chuyên đồi thức ăn, cải thiện

tỷ lệ sông và đạt tỷ lệ bảo vệ tương đối 76,9% sau khi nhiễm Vibrio parahaemolyticus E1

ở tôm.

2.8.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trịnh Thị Phương Thảo và cộng sự (2022) đã phan lập được chung Lactobacillus /Øarciminis HN12 có hoạt tính kháng V.parahaemolyticus mạnh với hoạt độ 460 AU/ml và

thé hiện hoạt tính kháng với 20 chủng Vibrio spp

Đô Thị Thanh Dung (2017) và cộng sự đã phân lập được chủng TA7L1 có khả nang

đối kháng mạnh và được xác định là thuộc loài Lactobacillus được đánh giá là an toàn trong

sản xuất chế phẩm vi sinh phòng bệnh EMS trên tôm

Phạm Thị Tuyết Ngân và cộng sự (2021) đã phan lập được chung Bacillus sp từ ao

nuôi tôm quảng canh có khả nang phân hủy hữu cơ và khang Vibrio parahaemolyticus gay bệnh trên tôm.

Nguyễn Văn Minh và cộng sự (2019) đã nghiên cứu tạo ra hai loại chế phẩm sinh

học CPVS 01 chế phẩm sinh học CPVS 01 bao gồm một số vi khuẩn thuộc chủng: B

Amyloliquefaciens, B.subtilis, Lactobacillus sp., Saccharomyces cerevisiae hiệu quả trong

viéc phòng trừ sinh học bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) do Vibrio

parahaemolyticus NT25 trên tôm thẻ từ in vitro tới quy mô thương phẩm

16

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 07 năm 2023 đến tháng 12 năm 2023

Địa điểm nghiên cứu: Đề tài được thực hiện và nghiên cứu tại Phòng Vi sinh Ứng

dụng - Viện Sinh học Nhiệt Đới.

Địa chỉ: 9/621 Xa lộ Hà Nội, P Linh Trung, Q Thủ Đức, Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Ching vi khuan Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi được nghiên cứu và cungcấp bởi phòng Vi sinh Ứng dụng — Viện Sinh học Nhiệt Doi

Các chủng vi được phân lập từ mẫu nước ao và tôm ao ở tỉnh Sóc Trăng tại phòng

Vi sinh Ứng dụng — Viện Sinh học Nhiệt Đới

3.2.2 Dụng cụ, thiết bị

3.2.2.1 Dụng cụ

Bảng 3.1 Danh mục dụng cụ trong quá trình thực hiện đề tài

STT Dụng cụ STT Dụng cụ

1 Ong nghiệm 10 Giấy dán nhãn

2 Giá đỡ ống nghiệm 11 Lam kinh

3 Dia petri 12 Kim tiém

4 Đèn côn, bat lửa 13 Đầu lọc 0,02 ym

=) Eppendorf 14 Gang tay

6 Dao mồ tôm 15 Dia thủy tinh

7 Bếp, nồi 16 Muỗng kim loại

8 Erlen, cốc Becher 17 Que cấy, cây đục lỗ chữ T

9 Bình định mức 18 Giấy lọc

17

3.2.2.2 Dụng cụBảng 3.2 Danh mục thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài

STT Thiết bị STT Thiết bị

1 Máy PCR 11 May chup gel

2 Cân kỹ thuật 12 Kính hiển vi Le phong dai

3 Dién di 13 Kinh hién vi

4 May ly tam 14 Đèn uv

5 Tủ cấy vi sinh vô trùng 15 Tu mát 4°C

6 Tủ -20°C 16 Tu say

7 May do pH 17 Nồi hấp tiệt trùng

8 Máy nước cất 18 Máy đo protein

9 May nước cất siêu sạch 19 Máy quang phố UV - vis

10 Máy ly tâm lạnh 20 Máy vortex

3.2.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB Broth (Luria Bertani Broth) được sử dụng để hoạt hóa vi sinh vật

(Thành phần môi trường được mô tả qua bảng 3.3)

Bảng 3.3 Thành phần môi trường LB Broth

Thành phần Nồng độ gram/LYeast Extract 5

thạch MRSA thành phần môi trường có thành phần như trên MRS borth có b6 sung 2%

agar.

Bang 3.4 Thành phan môi trường MRS

Thành phần Nong độ gram/L

Glucose 20 Peptone 10 Yeast extract 5 Meat extract 10 Polysorbate 80 | NazHPOxa 2

CH3COONa 5

MgSOxa.7HaO 0,1 MnSOx.H›2O 0,05

Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Sucrose) được sử dung dé phân lập các

vi khuẩn Vibrio spp (Thanh phần môi trường được mô tả qua bảng 3.5)

Bảng 3.5 Thành phần môi trường TCBS

Thành phần Nông độ gram/L

Bacteriological peptone 10 Yeast extract 5 Sodium thiosulphate 10 Sodium citrate 10

Ox Bile 8 Sucrose 20 Sodium chloride 10 Ferric citrate |

Bromothymol blue 0,04

Thymol blue 0,04 Agar 14

Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar) được sử dung dé nuôi cấy phân lập vi

khuẩn Neisseria (Thành phần môi trường được mô tả qua bảng 3.6)

19

Bảng 3.6 Thanh phần môi trường MHA

Thành phần Nông độ gram/L

Acid Digest of Casein 17,5 Beef Extract 2 Starch 1,5 Sodium chloride 5

Agar 17

Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) môi trường kiểm nghiệm vi sinh vật phé biến

trong phòng lab vi sinh, rất giàu dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển Sự kết hợp giữaTryptone va peptone đậu nành cung cấp nguôn nitơ, caron, amino acid và chuỗi peptide

cho sự phát triển của vi sinh vật (Thành phần môi trường được mô tả qua bảng 3.7)

Môi trường khảo sat enzyme ngoại bao.

Bảng 3.8 Thành phan môi trường CMC (Carboxymethyl Cellulose)

Thành phần Nồng độ gram/LYeast Extract 1

KCl 02 MgSO47H20 |

NH 4H2PO,4 1

Carboxymethyl Cellulose 26

Agar 3

20