Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và khảo sát hoạt tính các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải cellulose và phân giải protein từ nước biển

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOANTôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp “Phân lập và khảo sát hoạt tính các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải Cellul

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CÁC CHỦNG VI

KHUAN CHIU MAN CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI

-CELLULOSE VA PHAN GIAI PROTEIN TU NUOC BIEN

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOC

Sinh viên thực hiện : NGUYEN VĨNH LAM

Mã số sinh viên : 18126075

Niên khóa : 2018 — 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CÁC CHỦNG VI

KHUAN CHIU MAN CÓ KHẢ NANG PHAN GIẢI

-CELLULOSE VA PHAN GIAI PROTEIN TU NUOC BIEN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS Nguyễn Văn Thành Nam NGUYÊN VĨNH LÂM

TP Thủ Đức, Tháng 02/2024

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố HồChí Minh, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và kính trọng nhất đến Ban Giám hiệu, các

thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học “(Nay là Khoa Khoa học Sinh học)” trường Đại

học Nông Lâm Thành Phó Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo mọiđiều kiện thuận lợi nhất dé giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoc tập, nghiên cứu và hoàn

thiện dé tài tốt nghiệp này cũng như tao một nền tảng kiến thức vững chắc dé tôi chuẩn

bị tốt cho công việc sau này

Đặc biệt, tôi xin gởi lời tri ân sâu sắc nhất đến ThS Nguyễn Văn Thành Nam và

KS Nguyễn Thi Linh Chi đã tận tình chỉ bảo, động viên, giúp đỡ và dành nhiều thờigian, công sức hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài khóa luận này

Cảm ơn cô Lê Thị Diệu Trang và tập thể lớp DH18SHB đã luôn bên cạnh chia sẻ,động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Cảm ơn tập thé phòng

Y sinh — Trung tâm Nhiệt đới Việt Nga và bạn bè đã hết lòng giúp đỡ trong suốt quatrình thực hiện khóa luận Bên cạnh đó, con xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và cácthành viên trong gia đình đã quan tâm, chăm sóc và luôn là chỗ dựa vững chắc nhất cho

con vượt qua mọi khó khăn.

Tuy có nhiều cố gắng, nhưng điều kiện về năng lực bản thân còn hạn chế nên

trong đề tài khóa luận này chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Tôi xin kínhmong nhận được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo, các anh chị và bạn bè dé dé

tài này được hoàn thiện và chỉnh chu hơn.

Xin chân thành cảm ơn

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận tốt nghiệp

“Phân lập và khảo sát hoạt tính các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải

Cellulose và phân giải Protein từ nước biển ” là đo chính tôi thực hiện, dưới sự hướng

dẫn khoa học và hỗ trợ về mặt kinh phí của ThS Nguyễn Văn Thành Nam, không cóbat kì sự sao chép hoặc sử dụng kết quả của dé tài nghiên cứu nao tương tự Ngoài ra,trong khóa luận tốt nghiệp có sử dụng một số nguồn tài liệu tham khảo đã được tríchdẫn nguồn và chú thích rõ rang Tôi xin hoản toàn chịu trách nhiệm trước bộ môn, khoa

và nhà trường về sự cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, tháng 02 năm 2024

Nguyễn Vĩnh Lâm

1H

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này, nhằm phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng phân

giải cellulose và protein từ mẫu nước biển thu thập ở huyện Cần Giờ Sau đó thực hiện

các phản ứng sinh hoá dé xác định khả năng chịu mặn, khả năng phân giải cellulose vàprotein của các chủng vi khuẩn phân lập làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất chế phâm

vi sinh trong xử lý chat thải vùng biển đảo Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 23chủng vi khuẩn (từ 10 mẫu nước biển) được lấy ở 10 địa điểm khác nhau ở các điểmthuộc địa bàn huyện Cần Giờ Tiến hành phản ứng sinh lý, sinh hoá cho từng chủng vikhuẩn như: nhuộm gram, đo khả năng thuỷ phân cellulose và protein ngoại bào, đo hoạt

độ enzyme cellulase và protease Qua khảo sát nhận thấy có 5 chủng vi khuẩn có khảnăng phân giải protein và 3 chủng vi khuẩn phân giải cellulose Trong đó chủng vi khuẩn

6 có hoạt độ cellulase cao nhất đạt: 3,17 UI/g sau 14 ngày thí nghiệm, chủng vi khuẩn 5

có hoạt độ protease cao nhất đạt: 0,0443 U1⁄g sau 4 ngày nuôi cấy Về khả năng chịumặn, trong 5 ngày nuôi cay chủng vi khuẩn 2B cho thay có khả năng chịu mặn cao nhất3.5%, sau 5 ngày thí nghiệm mật độ vi khuan ở các nghiệm thức đều cao hơn 1,5 x 10°

CFU/m Hai chủng vi khuẩn được tuyên chọn là chủng 6 và chủng 5 với hoạt độ celluase,

protease cao nhất trong các chủng vi khuẩn phân lập được Các chủng vi khuẩn tuyểnchọn được sử dụng tiếp nối cho công trình nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phân hủyrác thải hữu cơ khu vực biến đảo.

Từ khoá: phân giải protein, phân giải cellulose, vi khuẩn chịu mặn, cellulase,

protease.

In this study, it was aimed at isolating strains of bacteria capable of degrading ellulose and protein from seawater samples collected in Can Gio district Biochemical reactions are then carried out to determine the salinity tolerance, cellulose and protein reakdown capacity of isolated bacterial strains as a basis for the application of microbial preparation production in waste treatment in island waters The research results isolated

23 strains of bacteria (from 10 seawater samples) taken at 10 different locations in Can Gio district Conduct physiological and biochemical reactions for each strain of bacteria such as: gram staining, measuring the ability to hydrolyze cellulose and extracellular proteins, measuring cellulase and protease enzyme activity Through the survey, it was found that there are 5 strains of bacteria capable of proteolytic bacteria and 3 strains of cellulose-delytic bacteria In which, strain 6 bacteria with the highest cellulase activity achieved: 3.17 UIVg after 14 days of experiment, strain 5 bacteria had the highest protease activity achieved: 0.0443 UIVg after 4 days of culture In terms of salt tolerance,

in 5 days of culture strain 2B bacteria showed the highest salt tolerance of 3.5%, after 5 days of testing, the bacterial density in the tests was higher than 1.5 x 108 CFU V m Two strains of bacteria were selected, strain 6 and strain 5 with the highest celluase and protease activity of any isolated strain Selected strains of bacteria are continuously used for research on creating biological products to decompose organic waste in island areas.

Keywords: proteolysis, cellulose degradation, salt-tolerant bacteria, cellulase,

protease.

DANH SÁCH CHU VIET TAT oo.ccscsscsssessesssessesssessesssessesssessessessssssnsansesessesssesiesseeneess viiiDANH SÁCH CAC BẢNG 22222 222222221221127122112112711211211211211211211 21121 xe ix

er a badqwtreanindttidovatslinigrtdftvEGriPsytiNotftexttrisiibiiutftighatpngsesgki x

1.1 Đặt vấn đề 52221 21212121121111211211111121112112221112122121121221 112121 erre 11.2 Mục tiêu đề tài -2-22-222 222 221222122112711271127112711211211211211211111 21121 yee 2

1;5›.Nô1,điio THG HIỆT seasssoisstitoiBöiLitG0NGEEEHS-XGERERGASBEEGRREIISSSHGREIBRESHGRIHSHGEERIDSGDSGSNGSữnEB3Sosggid 2,

CHƯỜNG 5 TONG OUAN TAL LIEU sacncmnremnsecintacnniomntnimesaiectemonanlere he, | 0001742007)

2.2 Thực trang 6 nhiễm chat thải hữu co tai các vùng ven biển ở Việt Nam 3

2.3 Chế phẩm vi sinh trong công nghệ xử lý chat thải tại các vùng biển 52.4 Khái quát về celÏulase 2-22 2+22222E+2E222E2EE22E2E12712112212112112212211221 22.2 xe 7

DyAp Je made HOS UL O86 ic cs sex866exnb8pt0gisll84ggeilg8o0ExsrrtptieoslSgffylOSIESAiGu©2iBlI2AMGuf todfoifBdts'f203g590S01180-03 Som 7

Di DCC MUN SGiÌscssnsisiagpsisisagddeiotoaBBinogn löinbugidkEtilsierebillisssirdotiSBaidtuietgigrogsuilitrtiodoiSisrctEiBiStictbi3gigsuipinsitctsisE 7

2.4.2.1 Khái niệm và cơ chế hoạt động - 2-22 2S+2E+2E+EE£2E+2E22E22E221222222222-ze 7

2.4.2.2 Vi sinh vat phân giải celÏulOSe - 5 + ceeeceeeceeeeceecescsecseeesceeeeeeeeees 8

2.5 Khái quát VỀ protease c.ccccccccsscscsessessessessesseseesscssessessessessessesseesessessessessesseeseesesseess 9

28 Nes BHẦH: TU ĐTOEITIiaes.cekssrsoscsgsasosebogas 535000895 0y386S8L.6383u1659L38850865835 15/6800289080)n2 503133860838 ,8Ẻ 9

“h6 na aa 10

2.5.2.2 Cơ chế hoạt động 2-2 ®+SE+SE+SE+EE£EE£EE9E12212171212121212112112121 22.222 10

5.525 Ĩng Ố VN nurannseneordtiotdaigaoroiitiiGOSSEG0IGN05108GR2NG0S0QSIS/NSNEEBSSGHSIAGUĐNNEIS0E 11

CHƯƠNG 3 VAT LIEU VA PHƯƠNG PHÁP iek.e 12

3.1 Thời gian va địa điểm nghiên Cir oo cece eccecseecesseeseeseeeseesseeseetieestestesseeeeeeees 12

3.2.1 DOi tuong i0 8 4 Ả 123.2.2 Môi trường và hoá chat sử dụng nghiên cứu 2-2-2 5s+2z+2z2E+zzzzzzxzze 123.5.3 Thiết bị vỗ đụng 6I S212 c1 00 5 HH HH 2113061166316 62 12

3:0; FHHữŒHĐ phap aie Wet (€Ữisscsseesbosiitiiie92156005301S013090043340930113468301041680300330/30000395002018936% 12

EU la | asnaecueseceueenisErtrttfrrtnEieikiftdtieARronrfgetirsstggbwebieoiiofiiokipfiEtxabiiti2tt,yrbrtalc: 12 3.3.2 KU DY nản 133.3.3 Phân lập va làm thuann c.cccccccccecsessesssessesssessessvessessessessesssessestieesesenesseeseeesees 13

fasted Umea HẠNH, (2 0) eee orice eee ere eee eee eres 13

cách 9E ni “z“ ẽ ốc 133.3.4 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lí 2 2-22 Sz£+xeEv.EExe2xEtrvrrrzrrrrrsere 14

3.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh hoá G22 2222213221321 E22EEE21 122112112121 eezxee 14 3.3.5.1 Khảo sát khả năng phân giải cellulOsSe +5-+5<>+£++eezeesereererrerree 14 3.3.5.2 Khảo sát khả năng phân giai DTOf€1T cee eeeeeeeeeeeeeeceeeeeeeecneeerens 16 3.3.5.3 Khao: sắt khả rằng Chiwan ain tcscccrieesccveerisuevantincernaivorstermventexenivecieuanceetescuet 17

3.3.6 Phương pháp phân tích số liệu - 22 2¿©22+2E++2E++EE++EE++EE++EE+zzz+zrsrer 18CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN -2- 2+222E+EE£E2EE£EEzEEEeExzErrkerxres 194.1 Phân lập và làm thuầằn 2-2 s+SS+SE+EE£SE£EE£EESEE22127121121212121111217121 21 xe 194.2 Đặc điểm hình thái và sinh lí 2: + 2 s+S2E+E£EE2E£E2E2E221212112121121212112121 12 xe 204.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lac 2 + 2 2+S2SE+EE£E2EEEEEEE21212212111 211 xe, 204.2.2 Đặc điểm hình thái tế bào 2 2-S2+22E£2E2E22E2212212121221211211121121211 2121 xe 21

4.3 Khảo sát hoạt tính sinh hoa 2 22 222 2211211331323 1 2212511212511 21 12112151 xEe 23 4.3.1 Khao sát khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bảo 5-+ 55+ 23

4.3.2 Khao sát hoạt độ cellulase của các chủng vi khuẩn 22+ 2+222s+zzz24 23

4.3.3 Khao sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bảo c-c+c sec 25

4.3.4 Khảo sát hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn 2 22 2252225222 264.3.5 Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuân 2 5252z+552 21CHUONG 5.KẾT LULAN VA KIÊN NHI] seaassseeeesesdasnnadesnessoooibaugigs2oi4ciesgoao.e T5

i 33

AS | eeTÀI LIEU THAM KHAO o.oo cccccccceccscsessessscssesvssecsveesevereevsvsecevssevevsissvessevetsesevenseveveees 34

PHU LUC coccecsccccsescssecsssecssvesssecssseessesssuesssessssesssesssesssuesssuesssesssuesssesssesesuessseessneessseessee 36

Vil

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

USD : United States dollar

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 3.1 Phương pháp pha các ống Glu dé xây dựng đường chuẩn D - Glu 15

Bang 3.2 Phương pháp pha các ống dung dịch dé xây dựng đường chuẩn tyrosine 17

Bang 3.3 Phương pháp pha loãng dé xây dung đường chuẩn OD/CEU 18

Bảng 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc của 7 dòng vi khuẩn phân lập được -. 20

Bảng 4.2 Hình thái tế bào của 6 chủng vi khuẩn mục tiêu 22-52 25s+=z+54 21

Bảng 4.3 Kha nang sinh enzyme cellulase ngoại bảo - 75+ ++<s+cc++cserexers 23Bang 4.4 Hoạt độ cellulase của các chủng vi khuân -2¿©52©525222z+22z22z55+2 24

Bảng 4.5 Khả nang sinh enzyme protease ngoại bảo - sees 552cc S2cccsecereree 25

Bang 4.6 Hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn mục tiêu -2- 22 22s =sz24 26

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Thực trang ô nhiễm biển Cần Giờ 2-2 222S2SE2SE+EE+EE2EE22E2ZE.2Ezzeze 3

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử cellulose -2- 2 2 22++2x2EE+EE+EE£ZE+EEzEEEEerxrrxrzxrred 7

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử profein 2 2+2<+2S+EE22E2EE221221221212121212121 212 re 9

Hình 4.1 Các chủng vi khuẩn phân giải Protein trên môi trường P2 - 19

Hình 4.2 Các chủng vi khuẩn phân giải Cellulose trên môi trường CMC sau khi nhuộm

h0 20

Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn: 1, 1A, 2B, 2C, 5, 6, 9A 21

Hình 4.4 Hình thái tế bao của các chủng vi khuẩn mục tiêu -. 2: 2222522 2Hình 4.5 Vòng thuỷ phân CMC bởi các dòng vi khuẩn -2222 5525525525522 23Hình 4.6 Vòng thuỷ phân protein của các chủng vi khuẩn 1A, 2C, 5 26Hình 4.7 Biểu đồ Hoạt độ protease của các chủng vi khuan qua các mốc thời gian 27Hình 4.8 Biéu đồ thé hiện khả năng chịu mặn của chủng v1 khuẩn 1 qua các mốc thời

Hình 4.13 Biéu đồ thể hiện kha năng chịu mặn của chủng vi khuẩn 6 qua các mốc thời

ID TU TU ch can ca ch cac can cac run 31

Hình 4.14 Mật độ sáu chủng vi khuẩn mục tiêu sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường bổsung nồng độ NaCl - 2 2¿22222122E122122112212211211221211211211211211121111211211 21c xe 31

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm qua, Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu trên tất cả lĩnh vực:

công nghiệp, nông nghiệp và dịch vụ Nền kinh tế được phát triển nhanh chóng, đạt được

những kết quả tăng trưởng ấn tượng: quy mô nền kinh tế năm 2020 tăng 42,6 lần so vớinăm 1989 đạt 268,4 tỷ USD, thu nhập đầu người tăng 17,3 lần đạt 2750 USD/năm Qua

35 năm đổi mới, kinh tế nước ta đã có sự chuyên dịch vô cùng rõ rệt, từ một nước nônglâm ngư nghiệp chuyên đổi dần sang một quốc gia hiện đại có sự đầu tư về công nghiệp

và địch vụ, nhờ đó thu hút được nhiều nguồn lực quan trọng từ nước ngoài và từng bướchội nhập sâu rộng vào nền kinh tế toàn cầu

Bên cạnh những thành tựu to lớn mà chúng ta đã đạt được, vẫn còn nhiều vấn nạn

đi cùng sự phát triển vô cùng nhanh chóng đó là cơ sở hạ tầng không bắt kịp nhịp độphát triển, đó là nền giáo dục vẫn còn non trẻ, chậm hơn thế giới và đó là một hệ sinhthái bị tàn phá nặng nề bởi những chính sách công nghiệp hoá Hiện nay, Việt Nam cóhơn 183 khu công nghiệp trong cả nước, có trên 163 khu công nghiệp chưa có hệ thống

xử lý chất thải tập trung, tại các khu đô thị chỉ có khoảng 60 — 70% rác thải rắn đượcthu gom, cơ sở hạ tầng thoát nước và xử lí nước thải, chất thải cần được quan tâm thêm

Việt Nam có 112 cửa bién và 28 tỉnh thành ven biển nên lượng rác thải chưa được

xử lí chảy ra từ đất liền vào biển là rất lớn, theo số liệu thống kê từ chương trình Môitrường liên hợp quốc công bố năm 2018, nước ta đang là quốc gia đứng thứ 4 thế giới

về tinh trang ô nhiễm rác thải biến Tinh trạng các khu vực ven biển va ven các quầnđảo hải đảo tràn ngập các loại rác thải sinh hoạt đã và đang tiếp diễn trở thành một vấn

nạn mà bất kì ai cũng có thể thay duoc Dé giai quyét tình trạng đó, trong dai han can

tuyên truyền dé người dân nâng cao nhận thức, phân loại và vứt rac đúng nơi quy định,giáo dục con trẻ biết bảo vệ môi trường Về ngắn hạn cần có giải pháp xử lí, với rác thảinhựa cần thu gom phân loại, tái chế hoặc xử lí, với rác thải hữu cơ cần có sự can thiệpcủa khoa học kĩ thuật đề đây nhanh tốc độ xử lí nguồn chất thải ra bên ngoài môi trườngnhư bổ sung các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn hoặc enzyme phân huỹ

Trong thành phần rác thải hữu cơ, phần lớn chứa protein và cellulose, đây là haithành phần có khả năng phân giải thành các chất hữu cơ có ích, giúp làm giàu cho đất

Tuy vậy, do nguồn rác thải quá lớn nên tốc độ xử lí của tự nhiên là chưa đáp ứng được,

dé tăng tốc độ xử lí rác thải, biện pháp tốt nhất là sử dụng các chế phẩm sinh học cónguồn gốc từ vi sinh vật đặc biệt là nhóm vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose và

vi khuẩn có khả năng phân giải protein Nhận thấy tính cấp thiết và hiệu qua của nhóm

vi khuân phân giải cellulose và vi khuân phân giải protein đến hiện trang ô nhiễm môitrường biển ở nước ta, dé tài “Phân lập và khảo sát hoạt tính các chủng vi khuẩn chịumặn có khả năng phân giải cellulose và phân giải protein từ nước biển” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm ra các chủng vi khuẩn chịu mặn có khả năng phân giải cellulose và phân giảiprotein hướng đến làm cơ sở cho các nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học trong xử lý chất

thai vùng bién dao

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn phân lập được từ nước biển.Nội dung 2: xác định hình thái và đặc điểm sinh lý các chủng vi khuẩn mục tiêu.Nội dung 3: khảo sát hoạt tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn mục tiêu từ đótuyển chọn 2 chủng vi khuẩn thích hợp làm cơ sở cho nghiên cứu sau này

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Khái quát vùng biển Việt Nam

Việt Nam là một quốc gia ven biển với vùng biển rộng gấp ba lần diện tích lãnhthổ, chiếm gần 30% diện tích Biển Đông (cả Biển Đông gan 3,5 triệu km”) Vùng biểnnước ta có khoảng 3000 hòn dao lớn, nhỏ và 2 quan dao xa bờ là Hoàng Sa và Trường

Sa, tài nguyên vùng biển phong phú, chứa đựng tiềm năng kính tế biển rất lớn Với bờbiển dài trên 3260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc giaven biên, các quốc dao và các lãnh thé trên thế giới Trong 64 tỉnh, thành phố trực thuộctrung ương, trong đó có 28 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương có biển với 125 huyệnven biển và 12 huyện dao Đây là những don vị hành chính đóng vai trò quan trọng đốivới sự nghiệp phát triển kinh tế và bảo vệ an ninh, chủ quyền biển đảo của Tổ quốc.2.2 Thực trạng 6 nhiễm chất thải hữu cơ tại các vùng ven biến ở Việt Nam

Trong những năm gan đây, với sự gia tăng dân sé, phát triển kinh tế - xã hội, điềukiện sống của người dân ngày một nâng lên, dẫn tới việc gia tăng nhanh chóng của rácthải khó phân hủy Khối lượng rác thải khó phân hủy phát sinh ngày càng nhiều, trongkhi công tác quản lý, xử lý rác thải gặp nhiều khó khăn, chưa đáp ứng được nhu cầu của

` Ñ

See

Hình 2.1 Thực trang 6 nhiễm biên Cần Giờ (Nguồn: nguoiduatin.vn)

hoạt khó phân hủy thải vào đại dương từ 6,4 tỷ người, chiếm 93% dân số toàn cau, sốngtrong phạm vi 50 km so với đường bờ biển ở 192 quốc gia Rác thải khó phân hủy sau

đó trôi dat theo dòng chảy của sông, đại dương hay thuy triều, đến và tích lũy chủ yếu

3

ở các hệ sinh thái ven biển, trong đó có hệ sinh thái rừng ngập mặn Rac thải hữu cơ từsinh hoạt con người, từ các hoạt động nông nghiệp hay đánh bắt thủy sản cũng là van décần được nghiên cứu và xử ly, nhằm tận dung những nguồn rác thai hữu co dé làm giàuchất dinh dưỡng hơn cho vùng đất bị ngập mặn tại các vùng ven biển.

Chất hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học, chu trình đinhdưỡng của thủy sinh vật Hàm lượng chất hữu cơ thường được tính bằng hàm lượngcacbon hữu cơ tổng số (TOC) Tuy nhiên nếu chúng được tích lũy quá cao trong môitrường sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng môi trường và sức khỏe sinh thái,chất hữu cơ từ các nguồn ban đầu qua thời gian sẽ bị rửa trôi và lắng xuống trầm tíchcác thủy vực Quá trình phân hủy các chất hữu cơ không bền như tinh bột, đường, đạm,chất béo thông qua hoạt động của vi sinh vật hiếu khí và ki khí như Pseudomonas,

Bacillus, Alcaligenes, Cytophaga, Micrococcus, Lactobacillus sẽ làm giảm oxy hòa

tan trong nước, dan dén chét sinh vat va anh hưởng xấu đến chu trình vật chất tự nhiên

(Eckenfelder và Conon, 1961) Những nhóm hợp chất hữu cơ bền khó phân hủy bởi visinh vật (hợp chất phenol, nhóm hoá chất bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu, điệt cỏ, kích

thích sinh trưởng ) tồn lưu lâu dài trong môi trường và tích luỹ sinh học trong cơ thésinh vật, thông qua chuỗi thức ăn và từ đó gây bệnh nguy hiểm cho con người

Nhiều phương pháp xử lý rác hữu cơ được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng như

biện pháp đốt hay chôn lấp lại biểu hiện những nhược điểm như chi phí cao, công nghệ

cao, tốn diện tích đất chôn lắp, Qua phân tích thành phan rác thai sinh hoạt ở nước tacho thấy, thành phan rác thải hữu cơ chiếm khoảng 45 —55% thậm chí lên đến hơn 80%,

là tỉ lệ cao nên rất thích hợp với phương pháp xử lí bằng công nghệ sinh học

Nhiều công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước (Odum, 197]; Pitodo, 1998;Primavera, 2004; Hà và ctv, 2002; Hằng, 2002, Trang và Hằng, 2002) cho thấy rừngngập mặn là nơi lưu giữ và phân huỷ các chat thải ké cả các hợp chất hữu cơ khó phânhuỷ từ nội địa chuyên ra, các chat 6 nhiễm ven biển, như dau mỏ Nhờ các vi sinh vật

mà các chất này trở thành chất dinh dưỡng cho nhiều sinh vật khác và môi trường đượctrong sạch Kha năng sinh kháng sinh của nhiều loài vi khuẩn, nam men, đặc biệt là nắmsợi có hoạt tính kháng sinh mạnh có tác dụng ức chế các VSV gây bệnh cho động, thực

vật, làm sạch môi trường bị ô nhiễm ven biển Trong đất rừng ngập mặn có vi khuẩn

số loài côn trùng gây hại cho người và động thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọnẹt, âu trùng muỗi, sốt rét và sốt xuất huyết.

Trong thuỷ vực các cửa sông và ven bờ biển, vật chất hữu cơ có nguồn gốc từnhiều nguồn khác nhau Chúng có thé được tạo ra từ quá trình quang tổng hợp của thựcvật phù du, từ các quá trình trao đổi chat qua các bậc dinh dưỡng khác nhau, từ chat thaicủa các loài thủy sinh vật, hoặc chúng được vận chuyên từ biển vào, từ thượng nguồnxuống, và từ quá trình xáo trộn của chất hữu cơ trong nền đáy Tuy nhiên, các chất hữu

cơ này luôn vận động, chuyền hóa bởi một loạt các quá trình lý học, hóa học vả sinhhọc Trong thủy vực, hệ vi sinh vật có vai trò quan trọng trong quá trình phân rã vật chathữu cơ, vi sinh vật sẽ phân hủy các chất hữu cơ đề thu nhận các chất cần thiết cho cáchoạt động sống của chúng Trong quá trình phân rã, vật chất hữu cơ được vi sinh vậtbiến đổi thành các chất nghèo năng lượng, và cuối cùng, trong những điều kiện phù hợpthì chất hữu cơ sẽ được chuyên hóa ngược trở lại thành các chat vô cơ (quá trình khoánghóa chất hữu co)

2.3 Chế phẩm vi sinh trong công nghệ xử lý chất thải tại các vùng biển

Vi sinh vật phan bố rộng rãi trong tự nhiên, là những sinh vật rất nhỏ bé, có mặt ởkhắp mọi nơi, có những hoạt động sinh lý phong phú và đa dang hon bat kỳ loại sinhvật nào khác Vi sinh vật có tinh chất, cau tạo giản đơn, đồng nhất về hình thái, phongphú về loại hình và chúng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau.Trong số các vi sinh vật, có nhiều loại có giá trị lớn nhờ việc sản sinh các chất có hoạttính sinh lý như men, chất kháng sinh, acid amin và vitamin Khả năng trao đổi chất của

vi sinh vật rất quan trọng bởi vì trong thiên nhiên cũng như trong thực tiễn cuộc sống,

vi sinh vật đóng vai trò giống như thuốc thử hóa học sống Vi sinh vật tiếp nhận thức ănqua màng tế bào Dựa vào nguồn sốc Cacbon (C), vi sinh vật được chia thành 2 loại: 1)

Vi sinh vật tự dưỡng: nguồn C lay từ CO›; 2) Vi sinh vật di dưỡng: nguồn C lấy từ cáchợp chất hữu cơ

Tat cả các hợp chất hữu cơ từ chat thải đều có thé bị phân hủy sinh hoc, mức độkhác nhau tùy vào đặc điểm và thành phần của vi sinh vật Các chất hữu cơ bao gồm: 1)Chất hữu cơ dé phân hủy; 2) Chất hữu cơ khó và chậm phân hủy; 3) Chất hữu cơ khônghoặc rất chậm phân hủy

Chế phẩm sinh học là sản phẩm của quá trình b6 sung sinh khối vi sinh vật, có thébao gồm 1 chủng hoặc nhiều chủng trộn với chất mang, đưa vào hệ thống xử lý dé cảithiện hiệu qua xử lý và giải quyết các sự cố bất ngờ về vi sinh của hệ thống.

Vi sinh vật trong chế phẩm sinh học giúp thúc day quá trình phân hủy sinh học,đây nhanh quá trình chuyên hóa các chất 6 nhiễm Vi sinh vật bé sung vào chế phamcần phải đáp ứng: có thể thực hiện quá trình trao đổi chất sinh hóa các chất hữu cơ ônhiễm khi có các chất ô nhiễm gay ức chế khác, sinh trưởng mạnh mẽ và có sức cạnh

tranh với các chủng vi sinh vật bản địa có trong rác thải Ngoài ra, các chủng vi sinh vật

này không được gây bệnh cho người và gây hại cho hệ sinh thái Do đó, mỗi chủng vi

sinh vật cần được lựa chọn cần thận, phải trải qua khảo sát và thử nghiệm

Trong các hệ thống xử lý có bé sung chế phẩm sinh học, dé duy trì hiệu suất xử lý,ngoải vấn đề lựa chọn được chủng vi sinh vật phù hợp, cần duy trì mật độ vi sinh vậttrong chế phẩm Mật độ vi sinh vật phải duy tri ở mức đủ lớn dé có được hiệu quả phânhủy sinh học các chất ô nhiễm trong rác thải tốt nhất

Trong những năm gần dây, đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vậtvào xử lý nước thải, bước đầu đã thu được kết quả đáng khích lệ, một số chế phẩm sinh

học đang được sử dụng như:

Chế phẩm vi sinh EM (EM còn gọi là EM1, AMO) là một cộng đồng của các vi sinh vật

có ích, do giáo sư Teruo Higa (Nhật Bản) tạo ra năm 1978 tại Trường Đại học Tổng hợpRyukyus, Nhật Bản Chế phẩm EM có từ 80 — 125 vi sinh vật khác nhau, bao gồm cácloại vi khuẩn (quang hợp, cố định dam, lactic, acid acetic), các loại xạ khuẩn, nắm men

và nam sợi, Chúng hoạt hóa nhanh chóng, xử lý môi trường hiệu quả: phân giải nhanhcác chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trường: các vi sinh vật trong chế phẩm sinh học

EM tiết ra các enzyme sống (protease, lipase, amylase, cellulase ) phân giải các chatkhó tiêu trong rác thải hữu cơ, thành các chất đễ tiêu EM làm giảm mùi hôi thối của rácthai, phân trong các trại chăn nuôi Các vi sinh vật trong EM ức ché, tiêu diệt các vi sinh

vật gây mùi, gây bệnh thông qua các con đường như: cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh

không gian sống, lấy số lượng lớn chèn ép hoặc tiết ra các chất có khả năng ức chế vàtiêu điệt (chất kháng sinh)

Chế phẩm Biomidoli 2 phân giải cellulose của công ty TNHH Midoli Thanh phần gốm:

Chế phẩm Bioproduct I được sản xuất từ một nhóm vi khuẩn Bacillus phân lập từ nước

hồ, có tác dụng làm sạch nước hồ bị ô nhiễm

Chế phầm TN2D do nhóm tác gia Võ Văn Nhân và cộng sự nghiên cứu với thành phan:

Bacillus subtilis (1012 CFU/g), vi khuẩn phân giải lân (10!2 CFU/g), sử dụng xử lý nước

thải chế biến thủy sản

Chế phẩm EMUNIV chứa các vi sinh vật rất hữu ich: Saccharomyces sp (hay còn gọi lànam men), Actinomyces, Bacillus sp, Lactobacillus sp, Những vi sinh vật này có khảnăng phân giải rất mạnh tinh bột, protein, cellulose, lipid, kitin, Chúng có kha năngphân giải nhanh các chất hữu cơ, các bã xác động vật, xử lí rác thải và nước thải

2.4 Khái quát về cellulase

2.4.1 Phan tử cellulose

Cellulose là hợp chất cao phân tử được trùng hợp (poleme hoá) từ gốc B-D-glucosebang cau nói B-1,4-glycosid nhờ vào khả năng tự dưỡng dưới ánh sáng của thực vật Vìvay, cellulose là hợp chất phô biến nhất trong tự nhiên Cellulose có cau trúc mạch thắngdạng sợi rất bền, khó bị phân huỷ

2.4.2 Cellulase

2.4.2.1 Khái niệm và cơ chế hoạt động

Cellulase là enzyme chính trong việc phân giải cellulose với cơ chế thuỷ phân cầunối B-1,4 giữa hai phân tử glucose cấu tạo nên cellulose

Phức hệ enzyme cellulase bao gồm 3 lớp enzyme ngoại bao là: 4-B-endoglucanase,

1,4-B-exoglucanase và B-glucosidase (hay tên gọi khác: B-D-glucoside, glucohydrolase hoặc cellobiase).

Trong đó, enzyme endoglucanase có tác dụng phân cắt ngẫu nhiên liên kết glucosidic đọc theo chuỗi cellulose Exoglucanase có tác dụng phân cắt đoạn cuối cácchuỗi không biến đổi và phân tách các sợi cơ bản của tinh thé cellulose Cellobiase thuỷ

B-1,4-phân cellubiose và cellodextrin hoà tan thành glucose.

Trong thực tế, cơ chế phân giải cellulose của vi sinh vật rất khác nhau, mỗi loại visinh vật có cơ chế phân giải riêng biệt và phức tạp Nhìn chung, sản phẩm cuối cùngcùng của quá trình thuỷ phân luôn là glucose và phục vụ mục đích sống của vi sinh vật

Cellulase có hoạt tính rất thấp đối với celolulose dạng tinh thé nhưng có sự tăngcường xúc tác cao, nguyên nhân do chu kỳ bán rã dai của tinh thé cellulose Day làenzyme đặc biệt vì chúng phân giải cơ chất không hoà tan, dé có thé phân giải các cơ

chất này enzyme phải khuếch tán đến cơ chất và mạng những mẫu cơ chất này đến trungtâm hoạt động, trong khi các cơ chất hoà tan thì khuếch tán và gan vào tâm hoạt động

của những enzyme khác.

Trong nhóm vi sinh vật phân giải cellulose, vi khuẩn ky khí đóng vai trò quan trọnghơn vi khuẩn hiếu khí, chúng sử dụng enzyme hiệu quả hơn các vi khuẩn hiếu khí vìtrong cấu tao của vi khuẩn ki khí hình thành một cơ quan bên ngoài tế bao của chúng,thé này giúp phân giải cellulose gọi là cellulosome Quá trình phân giải cellulose là rấtphức tập, đòi hỏi sự đồng nhất giữa các enzyme trong phức hệ enzyme cellulase, hiệuquả của sự đồng nhất được thé hiện bằng cách kết hợp chúng lại trong cellulosome Đếnhiện tại, cellulosome được em là một trong những cổ máy cấp độ nano có cấu trúc phứctạp nhưng hiệu quả nhất trong thế giới tự nhiên

2.4.2.2 Vi sinh vật phan giải cellulose

Vi sinh vật phân giải cellulose khá phong phú, bao gồm: Nam, xạ khuẩn và vikhuẩn Hầu hấu các vi khuẩn ứng dụng trong xử lý chat thải đều sử dụng chất hữu cơ détrao đối (vi sinh vật di dưỡng), nhưng có một số vi khuẩn khác lại sử dụng chất vô cơ(vi sinh vật tự dưỡng), do đó hai nhóm vi khuẩn này không có sự cạnh tranh về đinhdưỡng nên có thé cùng phát triển trong một môi trường

Một số vi sinh vật phân hủy cellulose: nấm (4/⁄ermaria, Aspergillus sp

Chaetomium globosum, Fusatium moniliforme, Mucor pusillus, Rhizoctonia, ), xa

khuẩn (Actinomyces, Micromonispora Nocardia cellulans, Proactinomyces,

Streptomyces cellulosae, ), vi khuân (Acetobacter xylinum, Achromobacter,

Cellvibrio fulvus, Cytophaga, Cellulomonas biazotea, Pseudomonas fluorescens, Clostridium thermocellum, ).

2.5 Khai quat vé protease

2.5.1 Phan tử protein

Protein là những đại phan tử hữu cơ được cau tao theo nguyén tac da phan ma cacdon phân là amino acid Cac don phân được kết hợp với nhau bằng các liên kết peptidethành chuỗi dài Các chuỗi này có thé xoắn cuộn, gập theo nhiều cách khác nhau dé tạothành các bậc cấu trúc không gian khác nhau

>

Secondary ` x Helix

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử protein (Nguôn: novagen.vn)

Có 4 bậc cấu trúc không gian là: cấu trúc bậc 1, cấu trúc bậc 2, cấu trúc bậc 3 vàcau trúc bậc 4 Cấu trúc bậc 1: các amino acid được sắp xếp thanh chuỗi va liên kết vớinhau bằng liên kết peptide hình thành chuỗi polypeptide Đầu mạch polypeptide là nhómamin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng.Cấu trúc bậc 2: ở bậc 2, chuỗi polypeptide không ở dạng thắng mà được xoắn lại thànhcau trúc ơ và cau trúc nếp gấp B, các mạch này được có định bằng những liên kết hydro

ở những acid amin gần nhau Cấu trúc bậc 3: các xoắn a và có thể cuộn lại với nhauthành từng búi có hình dạng đặc trưng cho từng loại protein Cấu trúc bậc 4: khi protein

có nhiều chuỗi polipeptide kết hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc 4 của protein

2.5.2 Protease

2.5.2.1 Khái niệm

Protease là enzyme xúc tác quá trình phân giải protein (sự thuý phân liên kết NH-) thành các polypeptide nhỏ hơn và cuối cùng là các amino acid Nếu không đượcxúc tác, việc phân hủy liên kết peptide của protein là cực kỳ chậm, có thé mat đến hangtrăm năm Nhiều protease còn có thé xúc tác thuỷ phân este, liên kết amid và phan ứngchuyền vị gốc amino acid

-CO-2.5.2.2 Cơ chế hoạt động

Việc thuy phân protein là một tiến trình khá đa dạng Hoạt động của chúng đượcchia làm 2 loại: Thuy phân giới hạn là quá trình enzyme thuy phân có giới hạn đối vớimột hay một số liên kết peptide có trong phân tử protein tạo thành các polypeptide nhỏ

hơn; thuỷ phân không giới hạn là quá trình enzyme thuỷ phân protein thành các đơn

phân là amino acid Dưới tác dung xúc tác của protease, các liên kết -CO-NH- sẽ bị phân

huỷ, protein bị thuỷ phân thành các amino acid và một ít polypeptide ngắn

Phân loại theo trung tâm hoạt động, protease được chia làm 4 nhóm khác nhau, đặc trưng

bằng từng cơ chế khác nhau theo một số gốc amino acid riêng biệt:

+ Serin protease: trung tâm hoạt động chứa nhóm — OH của gốc Serin giữ vai trò đặc

biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme

+ Cysteine protease: trung tâm hoạt động chứa nhóm — SH.

+ Aspartic protease: trung tâm hoạt động chứa nhóm carboxyl và hoạt động mạnh ở môi trường pH trung tính.

Trung tâm hoạt động của các protease VSV bao gồm một số gốc amino acid vàtrong một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại Nhiều tác giả đã nghiên cứu trung

tâm hoạt động của các tinh thé protease acid như nghiên cứu của Rhizopus chinenis cho

thay phân tử các protease nay gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở khoảng 20 A Khe

hở này là phần xúc tác của enzyme Các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trongkhe ấy Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tínhmềm đẻo hon vi cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầudisulphide (Trần Thị Nhã Uyên, 2010)

Các protease xúc tác phản ứng theo cơ chế chung:

E+S—E-S -E-S’+ Pi >E+P;

E: enzyme, S: cơ chat, E-S: phức chat enzyme-co chất, P: sản phẩm

Theo các tác giả, cơ chế tác dụng của protease của VSV cũng giống với proteaseserine động vật, đều tiễn hành theo kiều xúc tác acid - bazơ (Trần Thị Nhã Uyên, 2010).Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất Những enzyme này đều cóchung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính:

Bước 1, acyl hóa: Nhóm — OH của gốc serine sẽ liên kết cộng hóa trị với nguyên tử Ctrong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ sự hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine

Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl — enzyme sé bị thủy phân bởi phân tử HaO theo

chiều ngược lại của bước một Trong đó, Gốc — OH của serine sẽ được nhóm imidazolechuyền proton cho nhóm amine dé tái sinh lại enzyme

2.5.2.3 Ứng dụng

Các sinh vật phân giải protein phục vụ cho nhiều mục đích: Ví dụ, các sinh vậttiết enzyme tiêu hoá phân huỹ protein trong thực phẩm dé thu nhận nguồn amino acid,trong khi chuỗi polypeptide sau khi được tốn hợp có thé cần thiết cho việc tạo ra một

protein có hoạt tính Trong quá trình sinh lý và tế bào, quá trình phân giải protein cũng

đóng vai trò rat quan trong, cũng như giúp tế bào hạn chế quá trình tích tụ protein khôngmong muốn hoặc protein bất thường Do đó, nếu sự phân giải protein không được điềuhoa thì có thé gây bệnh và điều này là tác dụng của một số nọc độc

Phân giải protein là một công cụ rat quan trọng dé nghiên cứu protein trong phòngthí nghiệm, cũng như công nghiệp, ví dụ như trong chế biến thực phẩm và loại bỏ vếtban Protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong côngnghiệp thực phẩm, trong chế biến cá và thịt Protease có thê thủy phân các protein cótrong chất thải, để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡngcho cá hoặc vật nuôi Protease thủy phân các protein không tan được sử dụng dé tậndụng các phế thải từ nguồn protein không còn tác nhân gây ô nhiễm môi trường, dé xử

lý các phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi khôngcòn mùi hôi thối Ví dụ lông gia cầm có thể được coi là nguồn protein cao, được hòa tansau khi xử lý với NaOH, làm tan bằng cơ học và bằng các enzyme thủy phân, nhưprotease thu được từ vi khuẩn Bacillus subtilis tạo thành sản phẩm có dạng bột, mau

xám với hàm lượng protein cao có thê được sử dụng làm thức ăn.

11

CHUONG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHAP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng Y sinh Nhiệt đới, Chi nhánh phía Nam Trungtâm Nhiệt đới Việt Nga Địa chỉ: số 1, đường 3/2, phường 11, quận 10, Thành phố Hồ

Chí Minh.

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chung vi khuẩn được phân lập từ nước biển ở các vị trí ven biển Cần Giờ.3.2.2 Môi trường và hoá chất sử dụng nghiên cứu

Môi trường phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân giải protein: PI

(triptone: 5 g/l, meat extract: 3 g/l, yeast extract: 1 g/l, agar: 25 g/l, sữa tươi: 300 ml,

nước cất vừa đủ 1 lit), P2 (30% sữa tách béo, 0,5 g/l triptone, 5 g/l sodium chloride, 25g/l agar, nước cất vừa đủ 1 lit)

Môi trường phân lập và nuôi cấy các chủng vi khuẩn phân giải cellulose: CMC

(ammonium sulfate 1 g/l, KaHPO:: 1 g/l, MgSOa: 0,5 g/l, sodium chloride: 0,0009 g/1,

CMC (carboxymethylcellulose): 10 g/l, cycloheximide: 0,2 g/l, nước cất vừa đủ 1 lít)

Môi trường dùng tăng sinh vi khuan: Nutrient Broth (10g/1 triptone, 5 g/l dich chiếtnam men, 10 g/l NaCl) Môi trường thạch được bổ sung agar 22 g/l Các môi trườngđược hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút trước khi sử dụng

Hóa chất nhuộm Gram: Crytal violet, Lugol, Ethanol 95%, Safranin, dầu soi kính.Thuốc thử: congo red 0,1%, folin (25%), DNS

3.2.3 Thiết bị và dụng cụ

Tủ cấy vi sinh, máy lắc mẫu, máy ly tâm, nồi hấp khử trùng Autoclave,kính hiển vi Olynpus BX51, tủ lạnh, cân điện tử (Thuy Sỹ), pH kế, lò vi sóng, dia petri,ống nghiệm, bình tam giác, đèn cồn

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu mẫu

Mẫu được lấy ở 10 địa điểm khác nhau thuộc huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ ChíMinh Sau khi đến noi, dùng chai nhựa 11 lay mẫu với thể tích 500 ml Bao quản ở điềukiện < 10°C sau đó mang về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập

Lưu ý: mẫu phải được lay ở vị trí cách mặt nước biển 50 — 100 em, vị trí lay hoàntoàn ngẫu nhiên, mặt nước phải trong và không có rác thải hay dị vật khác.

Quan sát đặc điểm (kích thước, hình dạng, màu sắc, tốc độ sinh trưởng) các khuẩnlạc mọc trên các đĩa, chọn các khuẩn lạc đặc trưng, riêng biệt tiến hành cay ria lên cácđĩa petri chứa môi trường thạch P2, CMC Ủ ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ, quan sát kíchthước, hình dạng và màu sắc của các khuẩn lạc Đối với vi khuẩn phân giải protein, sảnphẩm là các khuẩn lạc có vùng trong suốt xung quanh; đối với vi khuẩn phân giảicellulose, sản phẩm là các khuẩn lạc có vùng mat màu khi nhuộm với congo red Tat cảcác mẫu phân lập được làm thuần và giữ giống ở bước tiếp theo

3.3.3.2 Làm thuần và giữ giống

Trên các đĩa môi trường P2, CMC có khuẩn lac của các dòng vị khuẩn khác nhau,

cần làm thuần các dòng khuẩn lạc tiềm năng đạt điều kiện chọn lọc đã quy định Tiếnhành khử trùng que cấy vòng bang cách đốt đỏ que cấy dưới ngọn lửa đèn cồn, để nguội

va dùng que cấy lay các khuẩn lạc có vòng phân giải trong suốt cấy ria lên môi trườngP1, CMC (khuẩn lạc được lây trên môi trường nảo sẽ được cay ria lại lên môi trườngđó) Lap lại quy trình cấy ria 3 — 4 lần thu được vi khuẩn có độ thuần cao Kí hiệu riêngbiệt cho từng mẫu ở những địa điểm khác nhau thu thập được

Vi khuẩn được lưu giữ trong ống nghiệm thạch nghiêng hoặc Glycerol 20% vàpepton 1% ở -20°C đến 09C.

3.3.4 Xác định đặc điểm hình thái, sinh lí

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn: ghi nhận hình dạng, màu sắc vàkích thước của khuẩn lạc trên đĩa môi trường Hình dạng tế bào được kiểm tra bằng cáchnhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100

Phương pháp nhuộm gram (phương pháp Hucker cải tiến): Vi khuẩn đã thuần khiếtnuôi cây trên môi trường dinh dưỡng từ 18 - 24 giờ được sử dụng dé nhuộm Gram Dùngque cay lấy một ít khuẩn lạc hoà vào giọt nước giữa phiến kính, có định mau bằng ngọnlửa đèn cồn Dùng thuốc nhuộm kiềm Crystal violet nhuộm mẫu trong 1 phút, rửa nướccất tối đa 10 giây, thắm khô Thêm dung dịch Lugol (1% Iot, 2% KI) trong 1 phút, rửanước cất tôi đa 10 giây, thấm khô Nhỏ dịch tay màu Ethanol 95% tối đa 30 giây, rửa

nước cất tối đa 10 giây, thấm khô (cồn sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn, VIkhuẩn Gram đương giữ lai màu tím, còn vi khuẩn Gram âm mắt màu) Tiếp tục nhuộm

với Safranin | phút, rửa nước và thấm khô Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt màu lần này,nhưng vi khuẩn Gram dương không bị đổi màu nhiều, trong khi vi khuân Gram âm trởnên đỏ hồng (nhuộm safranin) Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dau.Kết quả Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím dung địch kết tím kết tinh (Crystal violet)., vikhuẩn gram âm bắt màu đỏ của Safanin

3.3.5 Khảo sát hoạt tính sinh hoá

3.3.5.1 Khảo sát khả năng phân giải cellulose

* Xác định khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào

Ở thí nghiệm này, 3 chủng vi khuẩn có vòng thuỷ phân cao nhất (độ rộng, độ sáng)

sẽ được sử dụng Các chủng vi khuẩn trên sẽ được hoạt hoá trong ống môi trường

Nutrient ở 30°C trong 72 giờ Ly tâm 5 ml dịch sau tăng sinh 6000 vòng/phút trong 10

phút dé thu sinh khối Dùng que cấy nhọn lấy sinh khối các chủng vi khuẩn phân lậpđược cham lên môi trường CMC, mỗi dia 3 lần lặp lại, ủ ở 30°C Sau 72 giờ, nhuộm với

congo red trong 15 phút và rửa với dung dich NaCl 1M Vi khuẩn phân giải cellulose sẽ

tạo vùng không màu xung quanh khuẩn lạc (halo) (Võ Văn Phước Huệ và ctv, 2011)

Công thức tính khả năng thuỷ phân:

(đường kính halo — đường kính thuỷ phân) / đường kính halo x 100

* Xác định hoạt độ cellulase của các chung vi khuẩn mục tiêu

Tăng sinh các chủng vi khuẩn phân giải celulose trong ông môi trường Nutrient

trong 72 gid Sau đó hút 5 ml dich sau tăng sinh cho vảo bình tam giác chứa 95 ml môi

trường CMC, đặt trên máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút Sau các mốc thời gian 7, 14,

21 ngày nuôi cấy, hút 5 ml địch khuẩn ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút,thu địch nồi để đo hoạt độ enzyme

Tiến hành lấy 0,5 ml dung dịch enzym (dịch nỗi sau ly tâm) cho vào ống chứa 1,5

ml CMC 0,3% và 0,5 ml đệm acetate (dung dich CMC được pha trong đệm acetate 0,1

N pH 5) Hỗn hop enzyme được ủ ở 40°C trong 30 phút sau đó bồ sung 1 ml DNS và

đun sôi cách thuỷ ở 100°C trong 10 phút để dừng phản ứng Lượng đường khử giảiphóng ra được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm (Miller, 1959).Phương pháp lập đường chuẩn: Pha dung dịch D — Glu 500 ug/ml Hút dung dịch vàocác ống theo nồng độ Glu giảm dần như sau:

Bang 3.1 Phương pháp pha các ống Glu dé xây dựng đường chuẩn D — Glu

Ông | s 3 4 5 6Nong độ glucose (ug/ml) 0 5 10 15 20 25Thể tích dung dich Glu mẫu (ml) 0 | 2 3 4 5

Nước cất (ml) 10 9 § 7 6 5Cho 3 ml dung dich glucose chuẩn vào các ông nghiệm sạch và khô đã kí hiệu, thêm

vào 1 ml thuốc thử DNS Dun cách thuỷ 10 phút (tính từ lúc bắt đầu xuất hiện bọt khí

đầu tiên) sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng, đo mật độ quang ở bước sóng 530 nm vớiống đối chứng là nước cất Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang,

trục hoành là nồng độ glucose

Don vi hoạt độ cellulase (UI/g) được xác định như là lượng enzyme phân giải tao ra

lượng đường khử tương đương với 1 wg glucose trong một phút ở điều kiện pH 5, 40°C

Công thức tính hoạt độ enzyme:

m: khối lượng canh trường (g)

t: thời gian phản ứng (phút)

3.3.5.2 Khảo sát khả năng phân giải protein

* Khao sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bao

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein sinh trưởng tốt nhất va có vòngphân giải lớn nhất được sử dụng cho thí nghiệm này Tiến hành nuôi cấy 3 chủng vikhuẩn trên trong ống môi trường Nutrient với thời gian 48 giờ ở 30°C và ly tâm 5 mldịch sau khi ủ ở 10000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối Sau đó dùng que cấynhọn lấy sinh khối cham vào các đĩa petri có chứa môi trường P2 (30°C, pH 6) Vĩ khuanphân giải protein sẽ tạo vùng không màu xung quanh khuẩn lạc, đo đường kính vùngkhông màu và đường kính khuẩn lạc để xác định khả năng phân giải protein của từngchủng vi khuẩn với công thức giống với công thức đo vùng phân giải cellulose

Quan sát và ghi nhận số liệu sau 24, 48, 72 giờ nuôi cấy

* Xác định hoạt độ enzyme protease của các chủng vi khuẩn mục tiêu

Chọn 3 dòng vi khuẩn có khả năng thuỷ phân protein cao nhất nuôi cấy trong 5 mlmôi trường Nutrient Broth 72 giờ Sau đó hút 1ml dịch khuẩn đã tăng sinh vào bình tamgiác chứa 149 ml P2 và đặt trên máy lắc tốc độ 100 vòng/phút Do hoạt độ protease ởcác mốc thời gian: 6 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 48 giờ, 54 giờ, 72 gd, 80 giờ, 96 giờ

hợp trên ở 8000 vòng/phút trong 10 phút Hút 5 ml dịch sau ly tâm ủ với 10 ml NaOH

0,5 N và 3 ml thuốc thử folin trong 10 phút Do OD hỗn hợp trên ở bước sóng 660 nm.Dựa vào đường chuẩn tyrosine đề tính toán kết quả

Công thức tính hoạt độ enzyme:

L: độ pha loãng enzyme

t: thời gian phản ứng (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem đi xác định hoạt tính (g)

v: thé tích enzyme đem phân tích

Dựng đường chuẩn tyrosine:

Pha dung dich gốc tyrosine chuẩn 1 uM/l trong dung dịch HCl 0.2 N Tiến hành dựngđường chuẩn tyrosin với dung dich tyrosin có nồng độ từ 0.03 — 0.15 „M1

Bang 3.2 Phương pháp pha các ống dung dịch dé xây dựng đường chuẩn tyrosine

Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3Lắc mạnh, do OD ở bước sóng 660 nm Vẽ đồ thị tương quan giữa mật độ quang vànồng độ tyrosine với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ tyrosine

3.3.5.3 Khảo sát khả năng chịu mặn

Ba chủng vi khuẩn có khả năng phân giải Protein sinh trưởng tốt nhất và ba chủng

vi khuân có khả năng phân giải Cellulose sinh trưởng tốt nhất được sử dụng cho thi

nghiệm nảy.

Các chủng vi khuan được bố tri thí nghiệm 1 yếu tố với 5 nghiệm thức là nồng độNaCl thay đổi: 0%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại Nuôi cấy tăngsinh 6 chủng vi khuẩn trên trong 5 ml môi trường Nutrient, sau đó hút 1 ml dịch khuẩn

đã tăng sinh cho vào bình tam giác chứa 145 ml môi trường Nutrient bổ sung các nồng

độ NaCl khác nhau Đặt trên máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút Trong thời gian thínghiệm, giá trị OD (600 nm) được kiểm tra tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96giờ và 120 giờ nuôi cấy

Phương trình đường chuẩn CFU/ml và OD (600 nm) của vi khuẩn được xác địnhbằng cách nuôi cấy tăng sinh dịch khuẩn mỗi loại trên trong môi trường Nutrient trong

72 giờ, đo OD và đếm mật độ CFU của các chung trên ở các nồng độ như sau:

17

Bang 3.3 Phương pháp pha loãng dé xây dung đường chuẩn OD/CFU

Độ phaloãng 21 2° a 27 2°

OD

CFU

3.3.6 Phương pháp phân tích số liệu

Các số liệu thí nghiệm được nhập và xử lý sơ bộ, tính các giá trị trung bình và vẽbiểu đồ bằng phần mềm Excel 2016, phân tích ANOVA một nhân tố các chỉ tiêu theodõi bằng phần mềm Minitab 16

CHUONG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập va làm thuần

Tiến hành phân lập trên môi trường Nutrient Broth Agar từ 10 mẫu nước biển thuthập ở huyện Cần Giờ Kết quả thu được 23 chủng vi khuẩn với các đặc điểm nhận dạngkhác nhau Tiếp tục làm thuần, sau đó cấy ria lên môi trường P2 và CMC

Với nguồn cacbon duy nhất là sữa, từ 23 chủng vi khuân ban đầu phân lập được 5

chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein (Hình 4.1) với đặc điểm nhận dang là

vòng không màu xung quanh khuẩn lạc, khi vi khuẩn phát triển sẽ tiết ra protease phânhuỷ protein làm mat màu môi trường Dựa vào Hình 4.1 cho thấy chủng 1A, 2C và 5 là

3 chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy protein vượt trội nhất Ở chủng 1A, vết ria vòng

sáng có sự chênh lệch rõ ràng, cho thấy protein bi phân huỷ triệt dé từ trên mặt đến đáyđĩa môi trường Ở chủng vi khuẩn 2C, vi khuẩn phát triển nhanh và lan rộng trong thời

gian ngắn, đường kính halo (vùng trong suốt) to bằng đường kính khuẩn lạc Ở chủng

vi khuẩn 5, màu trắng của protein trong đĩa môi trường gần như biến mat

Mặt khác trên môi trường CMC, sau 3 ngày ủ ở 37°C chỉ có 3 chủng vi khuẩn cókhả năng sinh trưởng và tạo vòng trong suốt đó là chủng 1, 2B và 6 (Hình 4.2) Quansát hình 4.2, các chủng vi khuẩn đã phân huỷ nguồn cacbon duy nhất là CMC nên khi

19

Hình 4.2 Các chủng vi khuẩn phân giải Cellulose trên môi trường CMC

sau khi nhuộm đỏ congo

nhuộm với congo red 0,1% và rửa lại bằng NaCl 1M, vùng bên dưới khuẩn lạc không

giữ màu đỏ của congo red mà trở nên trong suốt

4.2 Đặc điểm hình thái và sinh lí

4.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc

Tiến hành cấy ria 7 chủng vi khuan mục tiêu dé quan sát đặc điểm hình thái (hìnhdạng khuẩn lạc, màu sắc), đặc điểm sinh lí (tốc độ phát triển đến khi đạt kích cỡ tối đa,màu sắc khuẩn lạc khi đạt kích cỡ tối đa)

Về màu sắc, sau 1 ngày khi cấy ria 100% khuẩn lạc có màu trang; sau 3 ngày có 2chủng khuẩn lạc chuyền sang màu vàng Da số các chủng phân lập được có khuẩn lạcdạng trơn, lồi, không viền Có 85,7% chủng vi khuẩn không có khả năng di động Kết

quả được trình bài trong Bảng 4.1.

Bang 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc của 7 dong vi khuẩn phân lập được

srr Sthieu Màu sắc Hình dạng Thôi gian

mau phat trién

1 1 Trang trong Tron, lồi, không viền 5 ngày

2 1A "Tiếng as mae nee Tron, lồi, không viền 3 ngày

chuyên sang vàng nâu

3 2B as: trong, sau at trung Trơn, lồi, không viền 2 ngày

tâm có màu vàng đậm

4 2C Trắng đục Trơn, lồi, không viền 1 ngày

5 5 Trẳng dus Nham, phang, vién rang Cn

Sau khi nhuộm gram va tiến hành quan sát dưới kính hiện vi quang học, nhận thay

6 chủng vi khuân mục tiêu (3 chủng vi khuẩn phân giải cellulose và 3 chủng vi khuẩnphân giải protein) có đặc điểm như sau: 5/6 chủng vi khuan bắt màu hồng của safranin,chứng tỏ chúng thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, chúng vi khuân 2C bắt màu tim củacrytal violet Trong đó có 4 chủng vi khuẩn có hình dạng que ngắn, 2 chủng vi khuẩn

còn lại có hình dạng que dai.

Bảng 4.2 Hình thái tế bào của 6 chủng vi khuẩn mục tiêu

Tên mẫu Đặc điểm tế bào Gram

1 Que ngan # 1A Que ngan “ 2B Que ngan g

2C Que dai +

5 Que dai

-6 Que ngan 2

21

eer NV“ *\

“À

`

4.3 Khảo sát hoạt tính sinh hoá

4.3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào

Bảng 4.3 Khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bảo

Tênmẫu Dhalo(mm) Du (mm) Dauypia(mm) Khả năng thuỷ phân % + SE

9,0 2,0 7,0

6 8,0 2,0 6,0 75,93* + 1,60

8,0 2,0 6,0 4,0 1,0 3,0

2B 4,0 1,0 3,0 73,818 + 2.06

35 1,0 2,5 4,0 1,0 3,0

1 3,0 1,0 2,0 75,008 + 8,33

3,0 0,5 2,5 D: duong kinh

Theo Bảng 4.3 kha năng thuỷ phân ở các mẫu sau 3 ngày ủ ở 37°C là không có sựkhác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Mẫu 6 có vòng thuỷ phân lớn nhất đạt 8,3 mmnhưng cũng có đường kính khuẩn lạc to nhất đạt: 2 mm, dan đến khả năng thuỷ phân ởmẫu 6 là 75,93% không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê với 2 mẫu còn lại là

75% và 73,93%.

Hình 4.5 Vòng thuỷ phân CMC bởi các dòng vi khuan

4.3.2 Khảo sát hoạt độ cellulase của các chủng vi khuẩn

Trong hệ enzyme cellulase, có 3 loại enzyme chính tham gia vào quá trình thuỷ phân cellulose thành đường glucose đó là: B-1,4-endoglucanase; B-1,4-exoglucanase va B-glucosidase và cả một phức hệ các enzyme cellulase (Pandey và ctv, 2014) Trong thí

nghiệm này, enzyme j-1,4-endoglucanase là enzyme chính được đo hoạt độ Kết quađược thê hiện qua Bảng 4.4

Bảng 4.4 Hoạt độ cellulase của các chủng vi khuẩn

Glucose (t1g/ml) Cellulase (UI/g) + SE Thời gian (ngày)

Giải thích cho điều này là mẫu 2B có tốc độ phát triển nhanh (môi trường sau 1ngày đã lỏng hơn ngày đầu rất nhiều), ở giai đoạn đầu đã có mật độ cao dẫn đến hoạt độcellulase ở giai đoạn đầu cao, sau đó trong giai đoạn tiếp theo nguồn cơ chất bị hao hụt,trong bình nuôi cấy thấy hiện tượng môi trường lỏng hơn theo thời gian, chứng tỏ cơchất CMC đã bị phân huỷ rất nhiều làm hoạt độ suy giảm hơn ở mốc thời gian 14 ngày

Ở 2 mẫu còn lại, tốc độ tăng trưởng chậm hơn mẫu 2B (cùng thời gian nhưng bìnhmôi trường chứa chủng 2B nhanh mắt đi độ sánh hon), vậy nên từ 7 đến 14 ngày,dinhdưỡng còn đủ dé vi khuẩn phat triển và đạt cực dai dẫn đến hoạt độ cellulase được tănglên Đến 14 ngày mật độ và hoạt độ đạt đỉnh chuyên dần sang giai đoạn suy giảm

Ở mốc 21 ngày, 3 mẫu đều có hiện tượng suy giảm hoạt độ, bình môi trường đãrất lỏng cho thấy lượng cơ chất còn lại trong môi trường là rất thấp, dẫn đến vi khuânkhông còn nguồn cacbon dé phân huỹ và không thé tăng lên về mật độ - hoạt độ giảm.

4.3.3 Khao sát khả năng sinh enzyme protease ngoại bao

Bảng 4.5 Khả năng sinh enzyme protease ngoại bao

Kha nang thuy phan (%) + SE Thời gian (g1ờ)

1A + 5

24 66,67 + 3,18 75,692 + 0,79 59,69" + 4,64

48 73,08” + 4,03 66,67° + 3,39 55,30° + 4,73

72 77,24? + 4,45 64,00 + 0,00 56,90* + 6,21

Các giá trị trung bình trong cùng một cột ở mẫu 1A và 2C có các kí tự theo sau khác nhau có

sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (@ < 0,05), các giá trị trung bình trong cùng một cột ở mẫu 5 không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống mặt thống kê (p>0,05)

Qua Bảng 4.5 thay mẫu 1A có khả năng thuỷ phân protein cao nhất đạt 77,24% ở

thời điểm 72 giờ, tiếp đến là mẫu 2C đạt 75,69% ở thời điểm 24 giờ Riêng mẫu 5 không

có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê nên tại các mốc thời gian 24, 48, 72 giờ khả

năng phân giải protein là như nhau.

Giải thích cho điều này có thể do chủng 2C và chủng 5 sinh trưởng nhanh (chỉ mất

1 ngày dé khuẩn lạc đạt cực đại), nên sau 1 ngày khả năng sinh protease ngoại bào khôngtăng trưởng mà chỉ ồn định hoặc suy giảm

Ching vi khuẩn 1A có thời gian sinh trưởng lâu: 3 ngày (theo dữ liệu khảo sát hình

thái khuẩn lạc) nên sau 3 ngày khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn nay chỉ tăng

mà không giảm như 2 chủng vi khuẩn còn lại

4.3.4 Khảo sát hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn

Bảng 4.6 Hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn mục tiêu

Hoạt độ protease (UI/g) Thời gian (g1ờ)