Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh vùng rễ chuối đối kháng với nấm Fusarium oxysporum phân lập từ cây chuối bị héo vàng

TÓM TATNghiên cứu được tiến hành dé xác định các dòng vi khuẩn nội sinh vùng rễ, đánhgiá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được đối với nam Fusariumoxysporum gây bệnh héo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHÂN LẬP VÀ TUYẾN CHỌN CÁC CHỦNG

VI KHUAN NỘI SINH VUNG RE CHUOI DOI KHÁNG VỚI

NAM Fusarium oxysporum PHAN LẬP TỪ CAY CHUOI

BI HEO VANG

Nganh hoc : — CÔNG NGHỆ SINH HOC

Sinh viên thực hiện : TRAM THỊ HUYEN TRANG

Mã số sinh viên : — 18126273

Niên khóa : 2018-2023

Tp Thủ Đức, thang 08 nam 2023

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀOTẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LẬP VÀ TUYẾN CHON CÁC CHUNG

VI KHUAN NỘI SINH VUNG RE DOI KHÁNG VỚI

Fusarium oxysporum PHAN LẬP TỪ CAY CHUOI

BI HEO VANG

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

ThS Trần Thị Vân Trầm Thị Huyền Trang

Tp Thủ Đức, tháng 08 năm 2023

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin cảm ơn sâu sắc đến cha, mẹ đã luôn tin tưởng, ủng hộ và tạomọi điều kiện tốt nhất dé tôi hoàn thành bậc đại hoc

Tôi xin gửi lời cam ơn đến Ban Giám hiệu trường Dai học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, quý thầy cô khoa Khoa Học Sinh Học đã tạo điều kiện cho tôi hoànthành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths Trần Thị Vân đã tận tình hướngdẫn, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinh nghiệm quý báotrong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thé lớp DHI8SHA đã đồng hành vớitôi trong 4 năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chi

Minh.

Tran trong cam on!

XÁC NHAN VÀ CAM DOAN

Tôi tên là Tram Thị Huyền Trang, MSSV: 18126273, sinh viên lớp DHI§SHA

Số di động: 0343131224, Emai: 18126273(@st.hemuaf.edu.vn thuộc ngành Công nghệsinh học Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là khóa luận

do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước hội đồng về nhữngcam kết này

TP Thủ Đức, ngày tháng năm 2023

Người viet cam đoan

Tram Thị Huyền Trang

TÓM TAT

Nghiên cứu được tiến hành dé xác định các dòng vi khuẩn nội sinh vùng rễ, đánhgiá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn phân lập được đối với nam Fusariumoxysporum gây bệnh héo vàng trên cây chuối trong điều kiện phòng thí nghiệm Đểxác định các dòng vi khuẩn nội sinh này, từ 15 mẫu rễ chuối và đất lấy từ 5 xã khácnhau của huyện Trà Cú, tinh Trà Vinh, đã phân lập được 12 dòng vi khuan Khả năngđối kháng của các dòng vi khuân phân lập được đối với nam Fusarium oxysporum gây

ra bệnh héo vàng trên cây chuối trong điều kiện phòng thí nghiệm được đánh giá bằngphương pháp cấy kép Kết quả thí nghiệm cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều cókhả năng đối kháng khác nhau, trong tổng số 12 dòng vi khuẩn phân lập được có 1dòng vi khuân có khả năng đối kháng cao nhất đối với nấm Fusarium oxysporum là

CC — NX 3.2 (78,1%) tại thời điểm 5 ngày sau cấy Bên cạnh đó còn có 2 dòng vikhuẩn có tính đối kháng nổi bật trên 61% là CC — TB 2.1 (66,71%), CC — TB 2.3

(65,29%).

Từ khóa: Vi khuẩn nội sinh, Fusarium oxysporum, bệnh héo vàng, đối kháng, cây

chuôi.

1H

The study was carried out to determine the rhizosphere endophytic bacterial strains, evaluate the antagonistic ability of the isolates against the fungus Fusarium oxysporum causing yellow wilt disease on banana plants under laboratory conditions.

To identify these endogenous bacterial strains, from 15 root and soil samples were taken from 5 different communes of Tra Cu district, Tra Vinh province, 12 bacterial strains were isolated The antagonistic ability of the isolates against the fungi Fusarium oxysporum causing yellow wilt on banana under laboratory conditions was evaluated by double inoculation Experimental results showed that all bacterial strains

had different antagonism, among the total 12 isolates, 1 strain had the highest ability to

antagonize Fusarium oxysporum, which was CC — NX 3.2 (78.1%) at 5 days after inoculation Besides, there are 2 strains of bacteria with outstanding antagonistic activity over 61%, namely CC - TB 2.1 (66.71%), CC - TB 2.3 (65.29%).

Keywords: Endogenous bacteria, Fusarium oxysporum, yellow wilt disease, antagonists, banana plant.

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN 2-©22 21 22221221211221211211221121121112112112112112112111112111121211 2 ye iXÁC NHAN VA CAM ĐOAN 2-22 22222 21223221211211211111211211211 011211211112 ii

—C an ru rẽ ra rarra ra ro rernadaarrronrarrrrraenaaeseorsoiooanaioeee iti

KT T151 aan tec i ath hte ihren ssi iv MỤC LUC oe esssscssesssssseesonesseesssessvessnessesesstsesesestsessnessesssiiesnesssetesessieseneeeseseeseeeneeseees V

DANH SÁCH CHỮ VIET TẮTT -2+22+222E22E2E22E22E22E222122122222222221222222222222e2 ixDANE SACH GAG BA NT i siosccssssceucsecnmasonmnancsicmmannnnccsmammanmenicemmammneied x9128.0210019): 0010 7 BHăH ,ÔỎ xiCHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU - 2-22 ©22222122212221221122112211221122112211221121112111211211 211 xe ]VoD Dat dÌẲẳ i

1.2 Mục tiêu đề tai ecccccccccccessescesssssstsessnsssesssestsisssestesssessssutsnssesitsnsetssseseesasseseeeeees 2

13: NỘI dune thite THIỆN ssssscsccsusnnraenns t3 859 15935605 ase arnsaen UESSBEXEEEHSRGSSESGLNS208530338g883808 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2- 2 2222SE+S2+E+£E££zEzzezzezesrszrezesceeeÖ

A, Teg gpa ag? TR R ỚNẽốốếẽốẽốốốốố sisi 32.1.1 Nguồn gốc, phân loaie cccccccccccceccssesssesssessseessessseesseesseessesssesssessesseseeseestesseeseeeess 3T11 1.7 | ee es 3

Qeliel 2, Phat ]OẠI secnxsessntinsntiiU1EEDEDDGGSSESEEIAGSE1IRGDLSISSDXGEGIINGISSSIGSSSLSSSG44BXSSNG.UTSEES/SH2A5000008 3

ACC đổi L“ƯỜNG, ~eeeseskensririhihisisdhirdoetttosttitggtiuigonmgtndiidrgtinuiigundighorenosruroml 4

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối 2 22- 222222222222E22EE222E2222z+zxzzre 42.1.3.1 Sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới 22-22 2+22++22+222++z2++zzzzz+z 42.1.3.2 Sản xuất và tiêu thụ chuối ở Việt Nam 2- 22s SE2E2E221221212111 212 cExe 52.2 Tổng quan về nắm Fusarium OXVSPOrUm cccccccccveecsesceevessessseevesssessessisssessessseeees 5

2290) ĐI Wa TEL PAI LO Ail ốc ốc cố co ere 3

2.2.2 Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học -¿2¿222z22z22+22++zz+zzsze2 5

2.2.3 Hình thức sinh sản - 2 2E 2222211115 E555111 12233111 1123511 11191111 n ng 11 ng x0 6

8/21, nu đường lan luyện ĐIỆN sssenseeugeuinkiniiettGG2Sin00060014810060188036/000:0:G30802(G6071p006 6

2.2.6 Các yêu tô bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh 7

5.5.6.1 Ảnh hướng Ce, ee 7

2.2.6.2 Ảnh hưởng của các nguyên tố đỉnh dưỡng - 22 2222++22++22++zz+zzrxe2 72.2.6.3 Ảnh hưởng của đất - 22 ©2++22+22E+223122112211221122112111221211221 21121 xe 72.2.6.4 Ảnh hưởng của auxin oe ees ecceccseccsecesesssecesesssecssecsseesseeseecsseesusessesteeseeeseeeseeses 72.2.7 Thiệt hai do nắm bệnh héo vang Fusarium trén cay chuốii c-+s+cscszsczs Ế/

P2cled: LMC HALO VIỆT, Naitlccoscaseccnannienmmceruneremn mm 8

2.2.8 Lich sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối - 8

2.2.8.1 Lich sử nghiên cứu ở Việt Nam - - 55+ ++**** 2 E*xeEeerrrrrrrrerrrerrrerre 8

2.2.9 Phòng trừ nam Fusarium oxysporum trên CHUGi ccececsceesseeseesseesessessesetessee 92.3 Tổng quan về các chủng vi khuẩn nội sinh .5 72©cs+ceccceczxrreecee 102.3.1 Khái niệm về vi khuẩn nội sinh -. 222¿c2222¿22222+rttEkrrrrrrtrrrrrrrrrree 102.3.2 Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh 2 2 2+222222E22E2E2E2E+zEzzzzxrzzrzzez 102.3.3 Ảnh hưởng của các hoạt động nông nghiệp đối với quan thé vi khuẩn nội sinh 113;3:4 Weal trỏ vì Khuẩu nội gÌHll. esesesseseieiiike.4inHA E42.001T 1100200g100000812000.-X6 112.3.4.1 Kha nang cố định đạm sinh học của vi khuẩn nội sinh -5- 55 5z¿ 12

2.3.4.2 Kha năng phân giải lân khó tan của vi khuẩn nội sinh - - 12

2.3.4.3 Khả năng tong hợp indole-3-acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội sinh 132.3.4.4 Kha năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh thực vật - 13CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2-2 55c 173.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu -2-©22+222222++22E++EEE+2EEEz2Exrrrrrrrrrrrer 17

3.2 Vat 8i 020 iu 17 Deeg Fee LN as mt a eee accor ce para vaca eR aI OSS 17

3.2.2 Dụng cu và thiết bị máy MOC ccc cecsecseessessessessesesessessessessesssessessiessesseesseesees 173.2.3 Môi trường và hóa chất - 2-2 ©22+2s+2222E1221221271211271211211 21221121 2 xe 17

3.3 PhfGTiE PHap 1S DICH CUE sc sexse: acenssenecinazons mums 68185 1351888645605016961300848048408353384638858uS8 18

3.3.1 Thu thập và phân lập các mẫu nam gây bệnh héo vàng trên cây chudi 18

#511, Trt ieee eee ee 183.3.1.2 Phân lập mẫu nấm _ ¿ 2¿22¿22++2+++2++vzExrrrrrrrrrrrreee 203.3.2 Định danh mẫu nam bằng đặc điểm hình thái 2-2 2222222z22z222z222zz2 213.3.3 Thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng 2-22 252222222522 213.3.3.1 Thu thập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng - 2-22-2222 52552 BÀI

3.3.3.2 Phân lập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng 2 2 2252+5222222z22z25+2 21

3.3.4 Định danh vi khuẩn nội sinh đối kháng - -2- 2 22 22S22S22E£zEz2zz2zzzzzz+2 223.3.4.1 Xác định gram bằng dung dich KOH 3% -2¿2¿©22222+z22+z2zzzcs+ze2 2/0)

3.3.4.2 NHUGM Bram 32

3.3.4.3 NhUOM bao th 5< 23

3.3.4.4 Dinh danh vi khuẩn bang các phản ứng sinh hóa -2 52©522 552: 233.3.4.5 Khả năng phát triển của vi khuẩn trong điều kiện ky khí - 243.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối với nắmFusarium oxysporum trong điều kiện in vifro 5-552272222 22c 2cscczcrscrrrcrrerree 24

34 gì TẾ ee 25CHƯƠNG 4 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 222222+2+2E+2E2E22E2EzEzzezzez 264.1 Kết quả xác định một số loại nam gây bệnh héo vàng trên cây chuối 264.1.1 Kết quả phân lập mẫu bệnh - 2 2 22+22+2E+2E+2EE+EEE2EE+EE+E+zzxzzrrzrxerrr 264.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trong đất bằng các phan ứng kiểm tra hình

HT 2/ối:8THHLHỦsesssssrrndaassireipeeeiogilbseugtisiiejattfnosdluesfseiuidisiTgslitiastiekirdgsagrluagglzzgtogrogicnsdlbbdiosHioeisrsbzcnte 28

4.2.2 Kết quả định danh vi khuân phân lập được trong đất -2- 2552 304.2.2.1 Xác định Gram bằng KOH 3% 2: 2222222E22E22EE223222122322212212222222 2e 30

LÔ 22900 06.0 31

A223; JNHữÔfiÓT TỐT Dã THỨ scenes crcmarenseenennenentneemm arene 32

4.2.2.4 Định danh vi khuan bang các phan ứng sinh hóa -2- 22 52552 34.2.2.5 Khả năng phát triển trong điều kiện ky khí -2-2¿©2222+z2z++2zxz+2 334.3 Khả năng đối kháng của các dong vi khuẩn phân lập được trong đất đối với nam

LEUSATUUIN ONPSPOKUMN, cane sncin TSSn nan na an hố cố ốc 35

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2-52 22222 E211211211211211211 2111 xe 38

a 38j8 5 38TÀI LIEU THAM KHẢO - 2-52 2SE2SE2EEEEEEE2EEE151125212112121111111111 111.1 xe 39

PHI , DU bán ng i66sooc006g1286023028-905138404050.R04EESS02.825EGH004)958gSGQRGBZUSSI.EUSHEELS/87D8589008200085369g80/6001:30 08387 44

vil

DANH SÁCH CHU VIET TAT

Ctv Cong tac vién

GSC Giờ sau cay

ISR Induced Systemic Resistance

KBA Môi trường King’ B Agar

TLL Lan lap lai

MPL Mau phan lập

NSC Ngay sau cay

NT Nghiệm thức

PDA Môi trường Potato Dextrose Agar

PGA Môi trường Potato Glucose Agar

WA Môi trường Water Agar

BKTN Bán kính tản nắm

HSDK Hiệu suất đối kháng

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bang 2.1 Đặc điểm hình thái nam trên một số môi trường -2-2- 52552 6Bảng 3.1Mẫu bệnh thu thập trên cây chuối - 22 22222+22++22+z2E+2z+zzzze2 19Bảng 3.2 Kí hiệu và địa điểm thu hoạch mẫu - 2++2+ts+E+EE£E+E+EE+EzErxzzzrxzed 21Bảng 4.1 Kết qua quan sát đặc điểm khuẩn lạc của 12 dong vi khuẩn trên môi trường

oxysporum trong điều kiện phòng thí nghiệm 22-©22¿222222+222zz2zxzsrrrczer 45

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Tac dụng của vi khuẩn nội sinh thực vật và WHO UNG sang assaaosessasasae 11Hình 3.1 Vi khuan nội sinh đối kháng nam trên đĩa petri -2-22-2 24Hình 4.1 Triệu chứng bệnh héo vàng do Fusarium oxysporum gây hại trên chuối 25Hình 4.2 Hình thái tan nam và sợi nam xem ở vật kính 40X của các mẫu nam

Fusarium oxysporum phân lập được trên mẫu bệnh -2- 2 25222+2c++2+ 26

Hình 4.3 Hình thái tan nam và sợi nắm xem 6 vật kính 40X của các mẫu nam

Fusarium oxysporum, phan lập được trên n 0n TT" ẻẻẽ 26

Hình 4.4 Hình thái tan nam và sợi nam xem ở vật kính 40X của các mẫu nam

Fusarium oxysporum, phân lập được trên mẫu bệnh -2- 2 2525z22z2s+5+2 27

Hình 4.5 Khuan lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được trong đất trên môi trường

Le ee 28

Hình 4.6 Yỉ khuẩn tạo sợi lkết iit ssc sassesnesnasvanennecrsnpacanssansanossnnsnesanasttcsnnectssinnenndes 30

Hình 4.7 Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn dưới thấu kính 100X - - 31

Hình 4.8 Kết quả nhuộm nội bào tử 2 ¿©22222E2E£2E2E22E22E22E22E2222222222222222e2 32Hình 4.9 Kết quả của phản ứng catalase - 2+ 252222222E22E22EE2EE2EESEErrrzrrrrer 32Hình 4.10 Kết quả của phản ứng oxidase 2-©5252222sc2cszsezsesrserscese-sc- 33

Ci RM Kết nh thất s\n:

Hình 4.12 Khả năng đôi kháng của các dòng vi khuân đôi với nam Fusarium

oxysporum tại thời điểm 5 NSC theo trình tự từ mạnh đến yếu 2 2 2552 37

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chuối là tên gọi các loài cây thuộc chi Musa có thân thảo lớn và là cây mang lạinguồn thu chủ yếu cho phần đông cư dân tại các vùng ẩm trên thế giới Đa số cácgiống chuối trồng thuộc thé tam bội, loài Eunnisa, họ Musaceae Việt Nam thuộc khuvực khởi nguyên cây chuối, do vậy có một nguồn tài nguyên di truyền cây chuối ratphong phú bao gồm giống chuối trồng, chuối bán hoang dại và hoang đại Ở ViệtNam, chuối được trồng khắp từ Bắc vào Nam, là nguồn cacbonhydrat, đường vàvitamin quan trọng trong đời sống hằng ngày, là cây trồng góp phần nâng cao thu nhập

và mức sống cho người dân Ngoài việc tiêu thụ nội địa, hiện nay chuối còn xuất khẩusang thị trường thé giới

Tuy nhiên, nhiều nam và vi khuẩn gây bệnh là những hạn chế nghiêm trọng đốivới sản xuất chuối, cả xuất khẩu và thị trường nội địa Trong đó, bệnh héo do

Fusarium (hay còn gọi là bệnh héo vàng Panama, bệnh héo rũ) do nam Fusarium

oxysporum trong đất gây ra, hiện là mối đe doa nghiêm trọng đối với ngành côngnghiệp chuối trên toàn thé giới, làm anh hưởng lớn đến năng suất, giá trị thương phẩm

và dinh dưỡng của chuối Bệnh thường gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng củacây nhưng mạnh nhất là giai đoạn cây trưởng thành, ra hoa, tạo quả, lây lan chủ yếutheo cây chuối con và đất nhiễm bệnh Nắm xâm nhập vào cây thông qua rễ và xâmnhiễm vào hệ thống mạch ngăn chặn hấp thu chất dinh dưỡng gây chết cây (Stover vàWaite, 1960) Theo FAO, bệnh héo vàng Panama đang đặt ra một mối đe dọa nghiêmtrọng đến sản xuất và xuất khâu chuối ở nhiều nước trên thế giới, tác động xấu đếnchuỗi giá trị và sinh kế của người nông dân

Nhiều biện pháp được áp dung để giảm thiểu thiệt hại do nam Fusariumoxysporum gây ra, hóa chất được sử dụng rộng rãi dé quản lý nam bệnh Tuy nhiên,việc sử dụng hóa chất vừa không làm giảm được thiệt hại, làm tăng chi phí cho sảnxuất mà còn để lại hậu quả nghiêm trọng về môi trường và sức khỏe của con người.Ngày nay, mọi người đặc biệt quan tâm về sức khỏe nên những nhu cầu về sảnphẩm sạch được ưa chuộng Từ nhu cầu đó, các phương pháp phòng trừ bệnh hại câytrồng bằng phương pháp hóa học dần được thay thế bằng các phương pháp sinh học,dau tranh sinh học là một trong những giải pháp được sử dụng rộng rãi Nhiều nhóm vi

1

khuẩn nội sinh vùng rễ có đặc tính đối kháng với tác nhân gây bệnh đã được sử dụngBacillus subtilis, Burkholderia và Pseudomonas có khả năng tiết ra nhiều loại khángsinh ức chế nhiều loại nam gây bệnh có nguồn gốc trong đất Xuất phát từ thực tế trên,

dé tài “Phân lập và tuyến chọn các chủng vi khuẩn nội sinh vùng rễ đối kháng vớiFusarium oxysporum phan lập từ cây chuối bị héo vàng” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Chọn lọc các chủng vi khuan nội sinh vùng rễ có khả năng đối kháng cao với namFusarium oxysporum được phân lập từ cây chuối bị héo vàng

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập chủng Fusarium oxysporum phân lập từ cây chuối bị héo vàng

Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh vùng rễ cây chuối đối kháng với namFusarium oxysporum được phân lập từ cây chuối bị héo vàng

Khao sát kha năng ức chế nam Fusarium oxysporum của một số vi khuẩn nội sinh

vùng rễ trong điều kiện in vitro

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tổng quan về cây chuối

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại

(Simmond và Shepherd, 1955).

2.1.1.2 Phân loại

Theo Simmond và Shepherd (1955), cây chuối nằm trong bộ gừng Zingiberales,

họ Musaceae, chi Musa Chi Musa theo truyền thống được phân chia thành 5 phân chi

là Ingentimusa, Australimusa, Callimusa, Enmusa và Rhodochlamys.

Ở ho Musaceae có 2 chi Ensete va Musa Chúng rất giống nhau ở bộ lá và dangcây song có một số đặc điểm lại rất khác nhau:

Chi Ensete có bộ lá giống lá chuối nên một thời gian dài người ta xếp chúng vào

họ Musaceae Đây là loại cây thân thảo chỉ sinh sản một lần, thân ngầm không bao giờ

đẻ nhánh Hoa và lá bắc dính liền nhau vào cuống buông, chúng sinh sản hữu tính.Không giống nào trong chỉ này có quả ăn tươi được vì quả của chúng chỉ có một lớp

vỏ mỏng bên trong chứa day hạt có đường kính từ 1 — 1,2 em Chi này có giống Ensetevetricosum thường trồng ở Đông Phi Be của chúng dùng làm rau ăn hoặc lay chất bột

trong bẹ ủ lên men làm bánh ăn.

Chi Musa có 4 phân chi là Austrilimusa, Callimusa, Eumusa và Rohdochilamy.

Trong các phân chi, Australimusa là phân chi cỗ nhất, các cây M testilis và M abacachi sử dung làm dây buộc, chúng chi có ý nghĩa về khía cạnh nguồn gốc của chuối,không có ý nghĩa về kinh tế Calimusa chỉ có một loài dùng làm cảnh do lá bắc màu đỏtươi Musa coccinea Rhodochlamys tuy có NST cơ sở là 11 nhưng có đặc điểm là bôngđứng và rat ít hoa trong mỗi lá bắc (từ 1 — 5 hoa) Cây chuối cảnh đỏ Musa ornata có

lá bắc màu hồng tím nhạt, hoa màu vàng tươi, loại này giống Calirmusa chi trồng dé

balbisiana colla (ký hiệu là B) Hai loài M acuminata colla va M balbisiana colla là

hai loài quan trọng nhất trong chi Musa Hai loài này có xuất xứ từ Đông Nam châu A

Trải qua nhiều quá trình di truyền đã tạo ra loài chuối không hạt, ăn được Hiện

nay lý thuyết này được hầu hết các tác giả công nhận

2.1.2 Giá trị dinh dưỡng

Chuối là một loại trái cây có thành phần của hầu hết những vi chất cần thiết cho cơthể Ngoài ra chuối có thể điều hoà hoạt động của hệ thần kinh và làm giảm nguy cơnhững bệnh về tim mạch do hàm lượng Kali tự nhiên rất cao có trong chuối và cả 10loại axit amin thiết yếu của cơ thể

Theo phân tích của khoa học, chuối chín bao gồm nhiều chất bột, chất đạm, chất

xơ và khoáng chất Theo Viện nghiên cứu và Phát triển Nông nghiệp Malaysia(MARDI), chuối là loại trái cây duy nhất hội tụ đầy đủ thành phần những chất đinhdưỡng cần thiết cho cơ thé con người Do đó, chuối đặc biệt thích hợp dé bé sung khẩuphần dinh dưỡng cho trẻ em và người già

2.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ chuối

2.1.3.1 Sản xuất và tiêu thụ chuối trên thế giới

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (FAO), sản lượngchuối trên thế giới năm 2019 khoảng 116,8 triệu tan Trong đó dẫn dau là An Độ 30,5triệu tấn, tiếp đến là Trung Quốc 11,7 triệu tan, Indonesia 7,3 triệu tan, Brazil 6,8 triệutấn, Ecuador 6,5 triệu tấn, Philippines 6 triệu tấn Việt Nam xếp thứ 14 về sản lượng

với trên 2,2 triệu tân.

2.1.3.2 Sản xuất và tiêu thụ chuối ở Việt Nam

Các loại cây ăn quả có diện tích và sản lượng lớn của Việt Nam bao gồm chuối,

dứa, cam, xoài, nhãn và vải Trong đó, chuối là cây ăn quả có quy mô sản xuất lớnnhất Năm 2019, sản xuất chuối đạt tong dién tich 133,638 ha va tao ra san luong2,194,247 tan, cao hon so với các loại cây ăn quả khác

Theo Hoàng Bằng An và ctv (2010), phần lớn diện tích chuối ở nước ta trồng phântán, không thành vùng tập trung Với đặc điểm là cây ăn quả ngắn ngày, nhiều công

dụng và ít tốn diện tích nên chuối được trồng như một cây tận dụng đất trong các vườn

cây ăn quả của các hộ gia đình Hiện tại, một số tỉnh ở miền Trung như Thanh Hoá,Nghệ An, Khánh Hoà và ở miền Nam như Đồng Nai, Sóc Trăng và Cà Mau có diệntích chuối từ 3.000 — 8.000 ha Trong khi đó các tỉnh trồng nhiều chuối ở miền Bắc

như Hải Phòng, Nam Định và Phú Thọ có diện tích chưa đạt 3000 ha.

2.2 Tổng quan về nắm Fusarium oxysporum

Loài: Fusarium oxysporum

2.2.2 Dac diém hinh thai va dic tinh sinh hoc

Nam Fusarium oxysporum có 3 kiểu bao tử vô tinh bao gồm: bào tử lớn(Macroconidia) nhiều nhân, có dạng hình liềm, có 2 — 6 vách ngăn, kích thước 22 — 36

x 4—5 um; bao tử nhỏ (Microconidia) đơn nhân, đôi khi có 2 vách ngăn, hình oval,

một số kéo dài, kích thước 5 — 7 x 2,5 — 3 um; bào tử hậu (Chlamydospores) hình oval

có kích thước 7 — 9 um hoặc hình cầu đường kính khoảng 7 — 7,5 um, có vách dàyđược tạo ra trong cây vào giai đoạn muộn của chu kỳ bệnh, bào tử hậu rất bền và tồntại trong thời gian dài, khi gặp các điều kiện thuận lợi chúng tách ra và mọc các ốngmam (George, 1989)

Theo Ashby (1913), đặc điểm hình thai đặc trưng của nam F oxysporum trên một

sô môi trường như sau:

Bang 2.1 Đặc điểm hình thái nam trên một số môi trường

Môi trường Đặc diém

Thạch chứa aspagagine Hệ sợi nam khí sinh có mau trăng tuyết và

phát triển đạng hình saoChuôi Soi nam khí sinh dây đặc có mau trang sau

đó có nhiêu hạch màu xanh tôi.

Hệ sợi nam khí sinh tạo ra màu đỏ hoặc tím hoa ca

¬ a ; Gôc cuông bao tử sinh ra có mau vàng sau đó Khoai tây lưu giữ lâu ngày ‹ =

là màu xanh tôi 2.2.3 Hình thức sinh sản

Sinh sản sinh dưỡng nắm không hình thành cơ quan sinh sản riêng biệt mà sợi nắmlàm nhiệm vụ dinh dưỡng trực tiếp làm nhiệm vụ sinh sản Đối với nắm Fusariumoxysporum hình thức sinh sản này cho dang bào tử gọi là bao tử hậu Khi sợi nambước vào sinh sản, trên sợi nắm có một số tế bào được các tế bào bên cạnh dồn chất tếbao trở thành tế bào có sức sống mạnh, làm tế bào này phồng lên, màng tế bao dày lên,thay đổi hình dạng chút ít, chứa nhiều chất dự trữ và có thể chịu đựng những điều kiệnbất lợi trong một thời gian khá dài Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm vàphát triển thành sợi nắm mới

Sinh sản vô tính, đặc điểm của hình thức sinh sản này là các bao tử được sinh ratrên cơ quan sinh sản riêng biệt do sợi nam sinh trưởng đến giai đoạn thuần thục hìnhthành nên Fusarium oxysporum có thê tồn tại lâu dài trong đất cũng như trong tàn ducủa cây trồng từ vụ nay sang vụ khác Chúng có thé tồn tại dudi dạng sợi nam, cácdạng bảo tử lớn, bào tử nhỏ và có thé tồn tại trong đất trong hơn 20 năm, nhưng cóbằng chứng thực nghiệm rằng giai đoạn này có thể còn lâu hơn (Luis và ctv, 2014).2.2.4 Con đường lan truyền bệnh

Nam Fusarium oxysporum là loại nam cư trú trong đất Các bào tử có vách day cóthể sống ở trong đất, trong xác cây bị bệnh, trong rễ cây chủ trung gian tới 30 năm.Chúng có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác theo cách: lan truyền chủ yếubằng sự di chuyên của thân củ, cây con giống, đất bị nhiễm bệnh và các phương tiện

vận chuyền như xe tải, xéng, cuôc Ngoài ra, gió và nước cũng là tác nhân lan truyén

bệnh phát tán các loại bào tử đi xa tới nơi chưa có mầm bệnh Tuy nhiên do thời giantồn tại của các bào tử này ở ngoài không khí ngắn cho nên lan truyền bằng con đường

này không đóng vai trò quan trong (Wardlaw, 1961).

2.2.6 Các yếu tố bên ngoài ảnh hướng đến sự phát triển của bệnh

2.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đây là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh Người tanhận thấy rằng sự phát triển của bệnh đạt tối ưu khi nhiệt độ đạt tối ưu cho sự sinhtrưởng của cây Thông thường nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh là 25°C —35°C Khi nhiệt độ trên hoặc dưới ngưỡng này, sự phát triển của bệnh chậm lại Trong

thời gian mùa đông va ở những vùng có độ cao trên 700 m như Jamaica người ta nhận

thấy bệnh phát triển rất chậm Ngược lại ở những vùng nhiệt đới sức tấn công của

bệnh cao hơn các vùng khác (Wardlaw, 1961).

2.2.6.2 Ảnh hưởng của các nguyên tổ dinh dưỡng

Ở Canary Islands người ta nhận thay hàm lượng Zn thấp, tỉ lệ Ca: Mg và K: Mgcao thì khả năng tấn công của bệnh cao hơn Điều đó được giải thích rằng hàm lượng

Zn thấp có liên quan đến giảm hình thành tyloza, trong khi tỉ lệ Ca: Mg và K: Mg cóliên quan đến hình thành pectin của thành tế bào cây chủ Như vậy, các yếu tố dinhdưỡng cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh (Wardlaw, 1961)

2.2.6.3 Ảnh hưởng của dat

Kha năng sinh trưởng và sống sót của nam Fusarium oxysporum ở đất cát nhẹ, axitcao hơn so với vùng đất sét hoặc đất kiềm có hàm lượng Ca cao (Wardlaw, 1961) Cácđiều kiện như độ âm đất cao, đất kém thoát nước, đất nghèo dinh dưỡng tạo điều kiệncho bệnh phát triển mạnh (Tôn Thất Trình, 1973)

2.2.6.4 Ảnh hưởng của auxin

Theo Wardlaw (1961), axit idol - axetic va indolcacetonitril có tác dụng kìm hãm

sự phát triển của nam Fusarium oxysporum

2.2.7 Thiệt hai do nắm bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối

2.2.7.1 Thiệt hại trên thế giới

Bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên cây chuối lây lan rất rộng ở khắp cácvùng trồng chuối như châu Á, châu Phi, Úc, Nam Mỹ và Trung Mỹ Bệnh gây ranhững thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp xuất khâu chuối ở Nam Mỹ và Trung

Mỹ, phá hủy khoảng 40.000 ha chuối trong những năm đầu nửa thế kỷ XX (Stover,

7

1962) Trên cơ sở kiến thức thu được về bệnh các nhà nghiên cứu hy vọng tìm ra biệnpháp hiệu quả nhằm hạn chế sự lan rộng của bệnh trên phạm vi thế giới VÌ vậy, cácnghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium oxysporum được sự quan tâm của nhiều quốcgia và các tô chức quốc tế

2.2.7.2 Thiệt hại ở Việt Nam

Mặc dù chưa gây thành dịch lớn song bệnh héo vàng Fusarium van được coi làmột trong số bệnh đáng chú ý nhất gây hại chuối ở Việt Nam do bệnh có phạm vi phân

bố rộng và khả năng gây hại lớn Năm 1968, Vakili đã nhận xét về bệnh sau khi điều

tra, khảo sát bệnh ở Việt Nam rằng có tới 70% diện tích trồng chuối tây ở miền Nam

Việt Nam bị bệnh héo vàng Fusarium oxysporum, trong đó có nhiều vùng bị mất tớihơn 85% năng suất Cho đến nay chưa có nhiều thống kê về thiệt hại do bệnh này trênchuối

2.2.8 Lịch sử nghiên cứu bệnh héo vàng Fusarium trên cây chuối

2.2.8.1 Lịch sử nghiên cứu ở Việt Nam

Những nghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium oxysporum trên chuỗi ở Việt Namđược tiễn hành bởi các tác giả trong và ngoài nước (Vakili và ctv, 1968) đã tiến hànhkhảo sát bệnh này lần đầu ở miền Nam Việt Nam vào những năm 1967 — 1968 và lầnthứ hai ở cả miền Bắc và miền Trung vào năm 1995 Kết quả điều tra cho thấy bệnhnày có mặt trên phạm vi cả nước, tính riêng miền Nam có tới 70% diện tích bị nhiễmtrong đó nhiều vùng thiệt hại tới hơn 85% năng suất Năm 1995, Pegg và ctv thôngbáo giống chuối Tây và Tây tia (ABB) là những giống man cảm với nam Foc chủng 1.Năm 1998, Bentley và ctv công bố kết quả thu thập 21 mẫu bệnh ở cả miền Bắc, miềnTrung và miền Nam bằng phân tích DNA trên chuối Tây và chuối Ngốp cũng bị bệnh,các mẫu nắm này cũng được nhận định thuộc chủng 1

Các nghiên cứu về bệnh héo vàng Fusarium oxysporum của các tác giả trong nướccũng đã được công bố như: Năm 1967 — 1968, các đợt khảo sát được tiễn hành bởiViện Bảo vệ thực vật, cho thấy bệnh héo vàng gây hại chuối tây ở các tỉnh như Long

An, Bến Tre, Cần Thơ Tôn Thất Trình (1973) cũng thông báo bệnh xuất hiện lẻ tẻ,gây hại ở chuối Tây, Già Huong, Sứ va Gross Michel tại một số vùng trồng chuốimiền Nam Việt Nam Bên cạnh đó qua nghiên cứu tình hình bệnh hại chuối trên cácgiống thuộc tập đoàn quỹ gen tại Trung tâm nghiên cứu cây ăn quả Phú Hộ cũng chothấy bệnh héo vàng Fusarium trên các giống chuối Mật bồ kết, chuối Ngự, chuối Hot,

Mật miền Nam, Bom với tỉ lệ bệnh phổ biến là 25% Cũng năm 1997, Chu Bá Phúc

và ctv sử dụng phương pháp phân tích tương hợp sinh dưỡng trên 12 mẫu bệnh thuthập được ở miền Bắc cho thấy nắm gây bệnh thuộc chủng 1 Mai Văn Trị (1997),cũng đã phân tích 8 mẫu bệnh thu thập từ chuối Xiém (chuối tây) ở miền Nam bằngphương pháp tương tự phát hiện ra nam gây bệnh thuộc chủng 1 Nguyễn Văn Khiêm(2000) đã phân tích 42 mẫu thu thập từ 13 huyện ở 7 tỉnh khác nhau bằng phươngpháp tương hợp sinh dưỡng cũng kết luận nắm gây bệnh héo vàng nước ta thuộc chủng

1, chưa phát hiện thấy giống Cavendish bị nhiễm bệnh Như vậy các kết quả nghiêncứu trước về bệnh héo vàng Fusarium ở Việt Nam cho rằng chủng 1 hại nhóm giốngchuối tây trên khắp cả nước, chưa xuất hiện chủng 3

2.2.9 Phòng trừ nam Fusarium oxysporum trên chuối

Hiện nay chưa có phương pháp phòng trừ nào thực sự hiệu quả với bệnh héo vàng

chuối do nam Fusarium oxysporum gây ra trên chuối Các biện pháp như hóa học, luâncanh cây trồng, b6 sung các chất hữu cơ hay dé cho đất nghỉ đều không có hiệu quả

khang Trichoderma spp, một trong những biện pháp sinh học quan trọng trong phòng

trừ bệnh nam đất (Harman và ctv, 2004)

Như vậy, cùng với việc nghiên cứu ra giống kháng bệnh, việc sử dụng các dòngnắm đối kháng cũng mở ra một hướng phòng trừ mới đối với bệnh héo vàng trênchuối Song song với các biện pháp phòng trừ một số yếu tố liên quan đến sinh trưởng

9

của cây và tác nhân gây bệnh cũng cần được lưu ý như: điều kiện thoát nước, môitrường đất (pH, các nguyên tổ vi lượng, loại đất Tăng cường kiểm dịch, hạn chế sự lâylan của bệnh sang những khu vực chưa bị nắm bệnh, sử dụng cây giống bằng nuôi cấy

mô tế bào, trồng chuối trên đất trước đó chưa trồng chuối cũng có thể hạn chế đượcbệnh trong một thời gian đáng kẻ

2.3 Tổng quan về các chủng vi khuẩn nội sinh

2.3.1 Khái niệm về vi khuẩn nội sinh

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng ré,thân, lá, quả của thực vật Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuan nội sinh chui vào rễ,thân, lá dé sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vi trí xâmnhập hoặc di chuyền đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa Vìvậy, vi khuẩn nội sinh thường được phát hiện ở rễ với mật độ cao ngay từ những giaiđoạn đầu của sự phát triển

Rễ được xem là vị trí ưa thích nhất, từ đó vi khuân xâm nhập vào bên trong cơ thểthực vật Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm tế bào nội mô từ các vị trí như bề mặt rễ, lônghut, chop rễ và điểm phát sinh rễ bên, thúc day các quá trình chuyền hóa trong cây, sựphát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ Hiện nay các nhà nghiêncứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuân nội sinh vùng rễ có đặc tính tốt như vikhuẩn có khả năng cé định nito trong không khí, tổng hợp kích thích tố auxin, giúploại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường, tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khảnăng kháng bệnh, hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất đinh dưỡng

2.3.2 Sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh

Thành phần vi khuẩn nội sinh thực vật rất đa dạng, chúng được phân lập từ cả thực

vật một lá mầm và hai lá mầm, từ các loài thân gỗ (sồi, lê, keo), thân bụi (cà phê), thân

leo (hồ tiêu) đến các thực vật thân thảo (lúa, củ cải đường, ngô, nha đam và cỏ chănnuôi) Rất nhiều tác giả đã tổng hợp sự đa dạng của vi khuẩn nội sinh thực vật Gầnđây nhất, Miliute và ctv (2015) đã tóm tắt các chủng vi khuẩn nội sinh phân bé rộng vàpho biến nhất trong nhiều loại cây trồng nông nghiệp Tuy nhiên, danh sách này vanchưa được thống kê day đủ vì các chủng vi khuẩn và loài cây trồng mà chúng nội sinhrất đa dạng Mỗi loài thực vật đều có một hay nhiều loài vi khuẩn nội sinh cư trú

Sự da dạng của vi khuẩn nội sinh giảm khi môi trường bị ô nhiễm, đất đai bị khaithác quá mức và lạm dụng phân hóa học Ngoài ra, mật độ vi khuẩn nội sinh còn bị

ảnh hưởng bởi nhiệt độ, lượng mưa, kỹ thuật canh tác và các chất cải tạo đất Thànhphần vi khuẩn nội sinh ở nơi có điều kiện khí hậu ôn đới đa dạng hơn so với ở vùng

kỹ thuật canh tác làm thay đổi số lượng, chất lượng cũng như sự phân bố theo khônggian của tàn dư thực vật trong dat, thông qua sự thay đối các chất dinh dưỡng và cácyếu tô đầu vào (Miliute và ctv, 2015)

2.3.4 Vai trò vi khuẩn nội sinh

Vai trò của vi khuẩn nội sinh thực vật đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứucủa các tác giả trong và ngoài nước Tác dụng và ứng dụng của vi khuẩn nội sinh thựcvật được trình bay tóm tắt trong Hình 2.1

Kiểm soát 6 nhiễm Ting trưởng & năng suất

L3 3 LÁ & phân hay sinh học

Công nghiệp &

vhọc

Kháng sinh, kháng virus,

trừ sâu sinh Soa lÍ ñ

Pagudowiores Staphylococcus sp hactlieean Cupriavidus sp.

ray Azotobacter sp Burkholderia sp.

Azopirillum sp Herbaspirillum sp.

I Pseudomonas sp.

c >

Hinh 2.1 Tac dung cua vi khuẩn nội sinh thực vật và ứng dụng (Ryan và ctv, 2008)

Vi khuẩn nội sinh thực vật thúc đây sinh trưởng của cây chủ một cách trực tiếpthông qua tăng cường tông hợp kích thích tố sinh trưởng thực vật auxin (IAA), tănghàm lượng các chất khoáng, giúp cố định đạm sinh học, phân giải lân khó tan hoặc

II

gián tiếp thông qua tăng khả năng đối kháng với các tác nhân gây bệnh, giảm sự thayđổi của thời tiết gây tôn hại cho cây (Ryan va ctv, 2008) Ngoài ra, chúng còn có thểgiúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm (Ryan và ctv, 2008).

Trong một số trường hợp chúng có thể đây mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúcday su hinh thanh cay con trong điều kiện bắt lợi Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh còn cóthé ngăn chặn mầm bệnh phát triển bang cách tong hợp các chất nội sinh trung gian,qua đó tiếp tục tông hợp các chất chuyền hóa và các hợp chất hữu cơ mới

Vi khuẩn nội sinh cũng có thể có một số tác dụng có lợi khác như sản sinhsiderophore, giúp phần nào thoả mãn nhu cầu về sắt của cây chủ, giúp cây phòngchống lây nhiễm các mam bệnh Như vậy, có thé thay rằng tiềm năng ứng dụng của

vi khuẩn nội sinh trong sản xuất nông nghiệp bền vững là rất lớn

2.3.4.1 Khả năng cố định dam sinh học của vi khuẩn nội sinh

Nito là yếu tố dinh dưỡng hạn chế nhất cho sự phát triển của thực vật mặc du trongkhí quyên, chúng chiếm tới 78% thé tích không khí Tuy nhiên, chúng tồn tại dudidạng khí No, thực vật không có khả năng đồng hóa trực tiếp được Các vi sinh vật cóđịnh đạm có khả năng hút đạm (N2) trong không khí và biến đổi đạm từ dạng cây trồngkhông hap thụ được (N2) thành dang đạm mà cây trồng hấp thụ được nhờ sự xúc tác

của enzyme nitrogenase.

Vi khuẩn nội sinh có định đạm được nghiên cứu nhiều nhất gồm các chủng thuộc

chi: Azoarcus, Burkholderia, Gluconobacter, Herbaspirillum và Klebsiella trong khi

cac chung vi khuẩn nội sinh có khả năng có định đạm tốt nhất được cho là Acetobacter

diazotrophicus, Herbaspirillum sp., và Azoarcus sp (Sturz và ctv, 2000).

2.3.4.2 Khả năng phân giải lân khó tan của vi khuẩn nội sinh

Phân giải lân là một trong những đặc tính pho biến của vi khuẩn nội sinh, do đó,chúng được sử dụng để giải quyết van đề trên Chang hạn như, phần lớn các quan thé

vi khuẩn nội sinh cây lúa mì, gạo, ngô, lạc, cây họ đậu, và hướng dương có thê hòa tanphosphate khoáng trong các thí nghiệm in vitro, và một số lượng lớn các vi khuẩn kíchthích tăng trưởng cây trồng có khả năng hòa tan phosphat đã được ghi nhận, bao gồmcác chủng thuộc giống Burkholderia, Enterobacter, Pantoea, Pseudomonas,

Citrobacter va Azotobacter (Singh và ctv, 2016).

2.3.4.3 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của vi khuẩn nội

sinh

Indole-3-acetic acid (IAA) là một dang auxin, là chất điều hòa sinh trưởng của

thực vật IAA chi phối sự phân chia tế bào, sự giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, phát

triển trái và hat, chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng [AA kích thíchđồng thời sự giãn dài trục lá mầm, ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sựkhởi đầu của rễ bên và sự thành lập lông rễ Rất nhiều vi khuẩn nội sinh thuộc các chỉ

Pseudomonas, Burkholderia, Staphylococcus, Bacillus, Enterobacteria, Azospirillum

va Gluconacetobacter là những vi khuẩn cô định đạm nhưng nhờ vào kha năng sinhtong hop IAA của chúng nên cũng được xem là vi khuân kích thích sinh trưởng thựcvật, góp phần làm tăng năng suất cây trồng (Kloepper và ctv, 1989)

2.3.4.4 Khả năng đối kháng các vỉ sinh vật gây bệnh thực vật

Vi khuẩn nội sinh xâm chiếm cùng 6 sinh thái với các tác nhân gây bệnh làm chochúng trở thành các ứng viên tiềm năng trong việc kiểm soát dịch bệnh (Ryan và ctv,2008) Thật vật, rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh vi khuẩn nội sinh có khả năngkiểm soát các tác nhân gây bệnh, côn trùng

Phần lớn các vi khuẩn nội sinh đối kháng có hiệu quả với các tác nhân gây bệnhđều là vi khuẩn Gram âm và thuộc nhóm Pseudomonas huỳnh quang (Whipps, 2001).Pseudomonas huỳnh quang thường thấy nội sinh ở rễ, làm cho chúng là những ứngviên lý tưởng trong việc kiểm soát sinh học các tác nhân gây bệnh Các chủng đối

kháng thường được ghi nhận là Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas graminis, Pseudomonas putida, Pseudomonas tolaasii và Pseudomonas

veronii Kha năng kiểm soát tỷ lệ bệnh có thé lên tới 80% trong điều kiện nhà kính.Các loài Gram âm khác có hoạt tính kiểm soát sinh học chống lại các tác nhân gây

bệnh là Phyllobacterium rubiacearum, Burkholderia solanacearum, Sphingomonas

trueperi va Serratia plymuthica.

Các vi khuẩn nội sinh gram dương có khả năng đối kháng thường gặp trong chiBacillus (Berg và Hallmann, 2006) Bacillus spp xuất hiện chủ yếu trong đất/vùng rễnhưng cũng được ghi nhận sống nội sinh trong một số loài thực vật (Hallmann vàBerg, 2006) Như được tóm tắt trong Bang 1.1, các vi khuẩn nội sinh thuộc chi

Bacillus và chi Pseudomonas đã được chứng minh là có khả năng kiểm soát đáng ké

các loại bệnh do nắm gây ra

13

Vi khuẩn nội sinh có thé làm giảm hoặc ngăn cản ảnh hưởng bắt lợi của một số tácnhân gây bệnh đối với cây trồng Các ảnh hưởng có lợi của vi khuẩn nội sinh hoạtđộng theo cơ chế giống như đối với vi khuẩn vùng rễ Các cơ chế nay đã được nhiềutác giả mô tả khá chỉ tiết Tuy nhiên, để phát huy tác dụng, vi khuẩn nội sinh cần phảihiện diện bên trong cây trước các tác nhân gây bệnh Hiệu quả của các vi khuẩn nội

sinh trong kiểm soát sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm: kí chủ đặc thù,

biến động quan thê và kiêu xâm chiếm kí chủ, kha năng di chuyền trong mô ký chủ, và

khả năng tạo ra sức đề kháng hệ thông Vi dụ, chung Pseudomonas sp PsJN, nội sinh

hành tay, ức chế nắm gây bệnh Botrytis cinerea Pers và thúc day tăng trưởng nho,được chứng minh là có thé nội sinh ở nhiều kí chủ khác nhau Kha năng xâm chiếmnhiều kí chủ cũng đã được ghi nhận ở nhiều loài nội sinh khác Vi dụ: Pseudomonas

putida 89B-27 va Serratia marcescens 90-166 làm giảm bệnh do Cucumber mosaic

virus gây ra trên cà chua và dưa chuột cho biết nấm nội sinh cây ca cao làTrichoderma spp đã kích thích cây chống lại các tác nhân gây bệnh Tuy nhiên, chếphẩm chứa bào tử nam thường nhạy cảm với môi trường và có tuổi thọ ngắn hơn sovới các chủng vi khuẩn có khả năng hình thành nội bao tử vì các nội bào tử có khảnăng chịu nhiệt và khô hạn Ngoài khả năng ton tại dài của các nội bào tử, vi khuẩnsinh nội bào tử thường có thé được sử dụng kết hợp với một sỐ nông dược Do vậy,các vi khuẩn kiểm soát sinh học có khả năng hình thành nội bào tử là những chủng rất

có tiềm năng trong việc thương mại hóa sản phẩm Kết hợp bón phân hữu cơ ủ từ xác

bã cây dứa với các dòng vi khuẩn nội sinh Burkholderia tropica, Burkholderiatropicalis va Pseudomonas stutzeri cùng với 150 kg N/ha đã làm tăng các yếu tố cấuthành năng suất, năng suất và chất lượng quả Hàm lượng đường trong quả và cả hàmlượng dưỡng chat trong dat ở nghiệm thức này tương đương với nghiệm thức bón 300

kg N/ha Phân hữu cơ vi sinh không những tạo thành một lớp thực bì vừa hạn chế bốcthoát nước, giữ 4m vào mùa khô vừa hạn chế độc tính của đất phèn mà còn là loạiphân bón tốt cho cây dứa, giảm được 50% lượng phân đạm hóa học và cải thiện năngsuất và chất lượng quả

Một số vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát sinh học, vì tạo ra các hợp chấtkháng vi sinh vật giúp cho cây trồng hạn chế dịch bệnh Các chất kháng sinh là sảnphẩm tự nhiên được xác định là những phân tử hữu cơ có khối lượng phân tử thấp.Nhóm kháng sinh này có khả năng ức chế vi sinh vật ngay cả ở nồng độ rất thấp Các

chat kháng sinh của vi khuẩn nội sinh có khả năng tiêu diệt các yếu tô gây bệnh như vikhuẩn, nắm, virus và động vật nguyên sinh Các nhóm kháng sinh này không chỉ cóhiệu quả kháng bệnh cho cây trồng mà còn có hiệu quả đối với người và động vật.Nhóm chất chống nắm khác là pseudomycin, sản phẩm của Pseudomonas nội sinh

ở thực vật Pseudomycin thuộc nhóm lipopeptid, chứa nhiều amino acid không thaythế như L-chlorothreonine, L-hydroxy aspartic acid, D và L-diaminobutryic acid.Pseudomycine có hoạt tính kháng nam gây bệnh ở người C albicans, C neoformans

và các loại nam gây bệnh thực vật bao gồm Ceratocystis ulmi và Mycosphaerellafijiensis Pseudomycin có hiệu qua trong việc kháng nam Ascomycetes và được sử

dụng trong nông nghiệp.

Tác dụng của vi khuẩn nội sinh không chỉ làm tăng năng suất và chất lượng sảnphẩm nông nghiệp mà còn góp phan quan trọng trong việc bảo vệ môi trường NhuVậy, có thể nói vai trò của các vi khuẩn nội sinh thực vật rất đa dạng, là lĩnh vực đangđược quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp cũng như bảo vệmôi trường Với khả năng cố định đạm sinh học và hòa tan lân khó tan, vi khuẩn nội

sinh đã giúp làm giảm một lượng đáng ké phân bón hóa học cần sử dụng Vi vậy, vi

khuẩn nội sinh có tác dụng bảo vệ nguồn đất mặt, bảo vệ nguồn chất hữu cơ trong đắt,làm giảm sự ô nhiễm môi trường đất và nước Ngoài ra, vi khuẩn nội sinh còn có khảphân hủy sinh học, chúng có thé chuyên hóa các chất độc hại trong môi trường nhưthuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ Burkholderia cepacia G4 có khả năng tồn tại và chuyênhoá toluen trong môi trường cũng nhận thấy rằng một số cây trồng có khả năng pháttriển tốt trong đất nhiễm hóa chất độc Trên những cánh đồng nhiễm hợp chất vòng

thơm chứa N, người ta đã phan lập được vi sinh vật nội sinh thực vật tai đây có kha

năng phân hủy hợp chất vòng thơm chứa N Kết quả nghiên cứu của Germaine và ctv,(2006) khang định vi khuẩn Pseudomonas có khả năng phân hủy thuốc diệt cỏ 2,4-D

sau khi chúng được chủng vào cây đậu Hà Lan Pisum sativum Sự phát hiện những

dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy sinh học giúp chúng ta có thé sử dụng trực tiếpchúng như các chế phẩm sinh học phân hủy độc chất hay chuyền gen có khả năng phânhủy độc chất vào các vi khuẩn khác đề xử lý môi trường

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2022 đến tháng 8 năm 2023 Tại Xưởng thực

nghiệm vi sinh A2 Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại

học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Vật liệu: Các mẫu bệnh (rễ, thân) được thu thập từ các cây chuối có triệu chứngbệnh điển hình do nắm Fusarium oxysporum Các mẫu rễ và mẫu đất vùng rễ câychuối (Musa balbisiana) được thu thập từ khu vực tỉnh Trà Vinh

3.2.3 Môi trường và hóa chất

Hóa chất sử dụng: cồn 70%, cồn 90%, Natri hypochlorite 1%, KOH 3%, dung

dich Crystal Violet, dung dich Lugon, dung dich Fuchsin, dung dich luc Malachite 5%,

H202, NaOH 40%, Dextrose, Malt extract, Peptone, Glycerol, KzHPOx khan, MgS0Ou4.7H20, MgSO¿ 1,2%.

Môi trường WA (Water Agar medium)

Thành phan môi trường: Nước cất (1000 ml), Agar (20 g)

Phương pháp điều chế: Hap khử trùng ở 121°C, 1 atm, trong 20 phút

Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar)

Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng dé nuôi cấy làm thuần nam dé quan sátcác đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nam, sắc tố tản nắm sinh ra trênmôi trường là các chỉ tiêu dé phân loại nam

Thành phan môi trường: Khoai tây (200 g), Agar (20 g), đường Glucose (20 g),nước cất (1000 m])

Phương pháp thực hiện: Rửa sạch 200 g khoai tây Cắt khoai tây thành từng miếngnhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoai tây và nước luộc bằng ray (hoặc vải

17

màn) rồi vức bỏ phan bã đi Hòa tan 20 g đường glucose va 20 g Agar vào 1000 mlnước cat với nước lọc khoai tây Hap khử trùng ở 121°C, 1 atm, 20 phút

Môi trường LB

Thành phan môi trường: peptone (10 g), cao nam men (5 g), NaCl (10 g), agar(20 g), nước cat (1000 ml)

Môi trường KBA (King’B Agar)

Thanh phan môi trường: Peptone (20 g), Glycerol (10 g), K2HPO, khan (1,5 g),MgSO¡.7H¿O (1,5 g), Agar (15 g), nước cat (1000 ml)

Dung dịch đệm phosphate (1X PBS): NaCl (8g), KCl (0,2g), NazHPO¿ (1,42g),

KH:PO¿ (0,24g), nước (800ml).

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thu thập và phân lập các mẫu nắm gây bệnh héo vàng trên cây chuối3.3.1.1 Thu thập mẫu nắm

Thu thập và bảo quản mẫu nắm theo phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật của

Shivas va Beasley (2005).

Thu thập các mau bệnh có triệu chứng điển hình do nam gây ra trên cây chuối.Thời điểm thu mẫu cây bệnh thích hợp nhất là ở giai đoạn đầu hoặc giữa củabệnh, khi nắm hại vẫn đang ở trạng thái hoạt động

Sử dụng túi giấy để giữ mẫu bệnh Đóng gói mẫu cân thận tránh va đập và hơinước ngưng tụ Sử dụng bút để viết tên nhãn cho từng mẫu Quy ước đặt tên mẫu:

được mã hóa theo triệu chứng bệnh, loại cây trồng, địa điểm thu thập Ví dụ: Héo vàng

trên chuối thu thập tại xã Kim Sơn ở huyện Trà cú (HV— KS)

Mau thu thập bao quản trong điều kiện 4°C và sử dụng dé phân lập trong thời gian

3 ngày.

Bảng 3.1 Mẫu bệnh thu thập trên cây chuối năm 2022

STT Tên Mẫu Tên Triệu Chứng Khu vực thu thập mẫu

1 HV-KS Lá vàng, nứt thân, bó mạch

"' Kim Sơn, Trà Cú, Trà Vĩnh

2 HV- TB La vang Tan Bién, Tra Cu, Tra Vinh

3 HV-TB Nut than Tân Biên, Tra Cú, Tra Vinh

4 HV- TB La vang Tân Biên, Trà Cú, Tra Vinh

5 HV-NX Lá vàng, nút thân Ngãi Xuyên, Trà Cú, Trà

11 HV-ĐA Nút thân, củ hóa nâu Đại An, Trà Cú, Trà Vĩnh

12 HV-DA Nứtgốc, bó mạch hóa nâu Đại An, Trà Cú, Trà Vinh

Ghi chú: Tên mẫu: Triệu chứng bệnh — Tên cây trong — Xã lay mẫu

3.3.1.2 Phân lập mẫu nam

của Burgess và ctv, (2009).

Các mẫu được mang về phòng thí nghiệm và phân lập tác nhân theo phương pháp

Các bước phân lập nắm bệnh từ mô cây bệnh như sau: Rửa mẫu bệnh bằng nước

để loại bỏ đất và bụi bân Rửa mẫu bằng cồn ethanol 70% để loại bỏ các vi sinh vậthoại sinh trên bề mặt vết bệnh Cắt mô vét bệnh thành mẫu nhỏ tại điểm tiếp giáp giữa

mô bệnh và mô khỏe Nhúng mô bệnh vào dung dịch Natri hypochlorite 1% và trong

cồn ethanol 10% khoảng 1 — 5 phút dé khử trùng bề mặt Lay mẫu ra khỏi dung dichkhử trùng bề mặt và rửa lại bằng nước cat, sau đó làm khô mẫu bằng cách đặt mẫu lêngiấy lọc đã tiệt trùng Cắt mẫu bệnh thành từng miếng nhỏ khoảng 2 x 2 mm sau đó

19

đặt lên môi trường WA Sau khi cấy xong, đặt ngược đĩa Petri dé tránh đọng hơi nướctrên bề mặt môi trường cấy Làm thuần mẫu nam bằng phương pháp cấy đỉnh sợi nam.3.3.2 Định danh mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái

Việc xác định các chủng nam khác nhau dựa trên các đặc điểm hình thái của loàiđang phát triển như được mô tả bởi Lacap (2003) và Ainsworth (1973)

Phương pháp tiến hành:

Cay mỗi khoanh nắm (đường kính 5 mm) lên dia petri chứa môi trường PGA

Chỉ tiêu theo dõi:

Ghi nhận màu sắc tản nắm va đặc điểm của sợi nam Quan sat hinh thai bao tunam: hinh dang, số vách ngăn của bảo tử

3.3.3 Thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng

3.3.3.1 Thu thập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng

Mẫu được thu thập theo phương pháp của Bertani và ctv (2016) Mẫu rễ được thuthập trên những cây chuối hột (Musa balbisiana) khỏe mạnh và giai đoạn sinh trưởng

5 đến 6 tháng tuôi Túi zip được dùng để thu thập mẫu Đất được lấy ở phần xungquanh rễ chuối và phan rễ chuối sau đó cho vảo túi zip Mẫu từ các khu vực khác nhauđược cho vào các túi zip khác nhau, và đánh dấu theo khu vực lấy mẫu Dùng găng tay

và đôi găng tay mỗi lần thu mẫu dé tránh nhiễm chéo giữa các mẫu Các mẫu rễ câythu thập được được bảo quản ở 4°C cho đến khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3.2 Kí hiệu và địa điểm lấy mẫu

: Giống l Thời gian

STT Tén mau „ Địa điềm

-chuôi thu mầu

1 CC —KS Chuối hột Kim Son, Trà Cú, Tra Vinh 2022

2 CC —- TB Chuối hột Tân Biên, Trà Cú, Tra Vinh 2022

3 CC-NX Chuốihột Ngai Xuyên, Tra Cú, Trà Vinh 2022

4 CC-DA Chuối hột Định An, Trà Cú, Trà Vinh 2022

5 CC-ĐA Chuối hột Đại An, Trà Cú, Trà Vinh 2022

Ghi chú: Tên mau: Tên cây trồng — xã lay mẫu.

3.3.3.2 Phân lập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng

Các mẫu rễ chuối được loại bỏ hoàn toàn đất bùn bằng vòi nước và được khửtrùng bề mặt bằng cách rửa hai lần trong nước cất vô trùng, một lần 10 phút trong 70%

etanol, va hai lần trong dung dịch đệm 1X PBS vô trùng Dé chắc chắn quá trình khửtrùng đạt hiệu qua cao, loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật bám trên bề mặt rễ, một phầnnước rửa lần cuối được cấy trải trên môi trường đặc LB (Luria Bentani) và nuôi trongmôi trường long LB (Luria Bentam)) Kiểm tra sự xuất hiện vi sinh vật trên đĩa môitrường và bình nuôi lỏng sau khi nuôi cấy 3 ngày ở 28°C Rễ sau khi khử trùng đượcthấm khô bằng giấy thấm vô trùng được đem nghiền nát trong 1X PBS Dịch được thu

và cay trang trên môi trường canh thạch LB (Luria Bentani) Cay truyền nhiều lần déthu mẫu vi sinh vật thuần

3.3.4 Định danh vi khuẩn nội sinh đối kháng

Tiến hành phương pháp định danh vi khuân theo Bergey

3.3.4.1 Xác định khả năng kéo sợi bằng dung dịch KOH 3%

Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo sợi) giữ sinh khối của vi khuẩn vớidung dịch KOH 3% Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vikhuẩn gram âm sẽ bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhay (dịch nhay), con

vi khuân gram đương không có kéo sợi

Cách thực hiện: dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trườngKBA trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều càngquan sát rõ) Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn

3.3.4.2 Nhuộm gram

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu trữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào

vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn Vi khuẩn gram (+) có lớp vỏ tế bào day tạopeptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờiodine) nên không bị khử bởi cồn Còn vi khuẩn gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng (do

có ít peptidoglycan) nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này

sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màuhồng đỏ của thuốc nhuộm Fuchsin

Cách thực hiện: Dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dàn đều lêngiọt nước trên lam kính sạch, cô định tiêu ban vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn côn.Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thé (Crystal Violet) trong 30 giây, rửa lai bằngnước, dé khô Nhuộm tiếp bang dung dịch lugon dé có định màu trong 30 giây và rửasạch bằng nước Tây bằng cồn 90° trong 30 giây sau đó rửa sạch Nhuộm tiếp mẫu

21

bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa lại bằng nước Quan sát dưới kính hiển vivới thấu kính 40X và 100X.

Đánh giá kết quả: Vi khuẩn gram âm có màu đỏ hồng, vi khuẩn gram dương có

mau tim.

3.3.4.3 Nhuộm bao tử

Nguyên tắc: Bào tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng Nhưng khi đã bắt màurồi thì màu sẽ bám rất chặt và khó bị trôi đi Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnhnhư thuốc lục malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vao nội bảo

tử và làm chúng nhuộm màu lục Khi rửa vết bôi bằng nước các tế bào sinh dưỡng sẽ

bi mat màu còn bảo tử vẫn giữ lại màu lục Khi nhuộm bồ sung bằng đỏ fuchsin sẽ làm

tế bào sinh dưỡng bat màu đỏ hồng

Cách thực hiện: Sử dụng phương pháp của Schaefera và Fulton cải tiễn theo cácbước: Dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dàn đều lên giọt nước trênlam kính sạch, cố định tiêu ban vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn Đặt tiêu bản lên trêngiá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thủy tinh có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C — 90°C)trên bếp Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi Nhỏ 2 — 3 giọt dung dich lục Malachite5% lên vết bôi và tiến hành ho trên nước nóng từ 5 — 10 phút Nếu thấy thuốc nhuộmtrên giấy bị khô thì phải bổ sung Rửa vết bôi bằng nước cat trong 30 giây Sau đó đặtmiếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 — 3 giọt Safranine trong 1 phút Rửa lam kínhvới nước cất và dé khô Quan sát tiêu bản trên kính hién vi với thay kính 100%.Đánh giá kết quả: Mẫu vi khuẩn có màu lục, vi khuẩn có cấu tạo bào tử Mẫu vikhuẩn có màu đỏ hồng, vi khuân không có cấu tạo bào tử

3.3.4.4 Định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa

Khảo sát hoạt tính catalase

Nguyên tắc: phan lớn các vi sinh vật hiếu khí và ky khí tùy ý chứa chuỗi điện tích

có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởicác dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy Các vi sinh vật này có khả năng biến đổinăng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng trongchuỗi điện từ tạo H2O2 Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 và

giải phóng Oz, gây hiện tượng sui bọt khí.

Cách thực hiện: Nhỏ vài giọt HaO; lên vi khuẩn phân lập Quan sát và ghi nhận

hiện tượng sủi bọt.