DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2022 đến tháng 8 năm 2023. Tại Xưởng thực
nghiệm vi sinh A2 Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Vật liệu: Các mẫu bệnh (rễ, thân) được thu thập từ các cây chuối có triệu chứng bệnh điển hình do nắm Fusarium oxysporum. Các mẫu rễ và mẫu đất vùng rễ cây chuối (Musa balbisiana) được thu thập từ khu vực tỉnh Trà Vinh.
3.2.2. Dụng cụ và thiết bị máy móc
Dung cụ: Đĩa petri (15 x 90 mm), ống nghiệm (18 x 180 mm), nước cất khử trùng, cồn 96°, dụng cụ cấy, que cấy, vải lọc, quặng đong, số ghi chép.
Thiết bị: Tủ cấy, máy hấp, máy sấy, máy lắc, kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), cân điện tử, bếp điện từ và các thiết bị khác
3.2.3. Môi trường và hóa chất
Hóa chất sử dụng: cồn 70%, cồn 90%, Natri hypochlorite 1%, KOH 3%, dung
dich Crystal Violet, dung dich Lugon, dung dich Fuchsin, dung dich luc Malachite 5%, H202, NaOH 40%, Dextrose, Malt extract, Peptone, Glycerol, KzHPOx khan, MgS0Ou4.7H20, MgSO¿ 1,2%.
Môi trường WA (Water Agar medium)
Thành phan môi trường: Nước cất (1000 ml), Agar (20 g).
Phương pháp điều chế: Hap khử trùng ở 121°C, 1 atm, trong 20 phút.
Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar)
Đây là môi trường giàu dinh dưỡng dùng dé nuôi cấy làm thuần nam dé quan sát các đặc điểm hình thái, màu sắc, đo kích thước sợi nam, sắc tố tản nắm sinh ra trên môi trường là các chỉ tiêu dé phân loại nam.
Thành phan môi trường: Khoai tây (200 g), Agar (20 g), đường Glucose (20 g), nước cất (1000 m]).
Phương pháp thực hiện: Rửa sạch 200 g khoai tây. Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoai tây và nước luộc bằng ray (hoặc vải
17
màn) rồi vức bỏ phan bã đi. Hòa tan 20 g đường glucose va 20 g Agar vào 1000 ml nước cat với nước lọc khoai tây. Hap khử trùng ở 121°C, 1 atm, 20 phút
Môi trường LB
Thành phan môi trường: peptone (10 g), cao nam men (5 g), NaCl (10 g), agar (20 g), nước cat (1000 ml).
Môi trường KBA (King’B Agar)
Thanh phan môi trường: Peptone (20 g), Glycerol (10 g), K2HPO, khan (1,5 g), MgSO¡.7H¿O (1,5 g), Agar (15 g), nước cat (1000 ml).
Dung dịch đệm phosphate (1X PBS): NaCl (8g), KCl (0,2g), NazHPO¿ (1,42g), KH:PO¿ (0,24g), nước (800ml).
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Thu thập và phân lập các mẫu nắm gây bệnh héo vàng trên cây chuối 3.3.1.1. Thu thập mẫu nắm
Thu thập và bảo quản mẫu nắm theo phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật của
Shivas va Beasley (2005).
Thu thập các mau bệnh có triệu chứng điển hình do nam gây ra trên cây chuối.
Thời điểm thu mẫu cây bệnh thích hợp nhất là ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh, khi nắm hại vẫn đang ở trạng thái hoạt động.
Sử dụng túi giấy để giữ mẫu bệnh. Đóng gói mẫu cân thận tránh va đập và hơi nước ngưng tụ. Sử dụng bút để viết tên nhãn cho từng mẫu. Quy ước đặt tên mẫu:
được mã hóa theo triệu chứng bệnh, loại cây trồng, địa điểm thu thập. Ví dụ: Héo vàng trên chuối thu thập tại xã Kim Sơn ở huyện Trà cú (HV— KS).
Mau thu thập bao quản trong điều kiện 4°C và sử dụng dé phân lập trong thời gian
3 ngày.
Bảng 3.1. Mẫu bệnh thu thập trên cây chuối năm 2022
STT Tên Mẫu Tên Triệu Chứng Khu vực thu thập mẫu
1 HV-KS Lá vàng, nứt thân, bó mạch
"' Kim Sơn, Trà Cú, Trà Vĩnh
2 HV- TB La vang Tan Bién, Tra Cu, Tra Vinh 3 HV-TB Nut than Tân Biên, Tra Cú, Tra Vinh 4 HV- TB La vang Tân Biên, Trà Cú, Tra Vinh 5 HV-NX Lá vàng, nút thân Ngãi Xuyên, Trà Cú, Trà
Vĩnh
6 HV-NX Nứt thân Ngãi Xuyên, Tra Cú, Trà Vĩnh
7 HV-NX Nut thân, nut gôc, bó mach Ngãi Xuyên, Tra Cú, Trà hóa nâu Vĩnh
8 HV-DA Lá vàng, nứt gốc Định An, Trà Cú, Trà Vĩnh
9 HV- DA Lá vàng Định An, Trà Cú, Trà Vinh 10 HV-DA Lá vàng, nứt thân, bó mạch -
ơ" Định An, Trà Cỳ, Trà Vinh
11 HV-ĐA Nút thân, củ hóa nâu Đại An, Trà Cú, Trà Vĩnh
12 HV-DA Nứtgốc, bó mạch hóa nâu Đại An, Trà Cú, Trà Vinh
Ghi chú: Tên mẫu: Triệu chứng bệnh — Tên cây trong — Xã lay mẫu
3.3.1.2. Phân lập mẫu nam
của Burgess và ctv, (2009).
Các mẫu được mang về phòng thí nghiệm và phân lập tác nhân theo phương pháp
Các bước phân lập nắm bệnh từ mô cây bệnh như sau: Rửa mẫu bệnh bằng nước để loại bỏ đất và bụi bân. Rửa mẫu bằng cồn ethanol 70% để loại bỏ các vi sinh vật hoại sinh trên bề mặt vết bệnh. Cắt mô vét bệnh thành mẫu nhỏ tại điểm tiếp giáp giữa
mô bệnh và mô khỏe. Nhúng mô bệnh vào dung dịch Natri hypochlorite 1% và trong
cồn ethanol 10% khoảng 1 — 5 phút dé khử trùng bề mặt. Lay mẫu ra khỏi dung dich khử trùng bề mặt và rửa lại bằng nước cat, sau đó làm khô mẫu bằng cách đặt mẫu lên giấy lọc đã tiệt trùng. Cắt mẫu bệnh thành từng miếng nhỏ khoảng 2 x 2 mm sau đó
19
đặt lên môi trường WA. Sau khi cấy xong, đặt ngược đĩa Petri dé tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy. Làm thuần mẫu nam bằng phương pháp cấy đỉnh sợi nam.
3.3.2. Định danh mẫu nắm bằng đặc điểm hình thái
Việc xác định các chủng nam khác nhau dựa trên các đặc điểm hình thái của loài đang phát triển như được mô tả bởi Lacap (2003) và Ainsworth (1973).
Phương pháp tiến hành:
Cay mỗi khoanh nắm (đường kính 5 mm) lên dia petri chứa môi trường PGA.
Chỉ tiêu theo dõi:
Ghi nhận màu sắc tản nắm va đặc điểm của sợi nam. Quan sat hinh thai bao tu nam: hinh dang, số vách ngăn của bảo tử.
3.3.3. Thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn đối kháng 3.3.3.1. Thu thập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng
Mẫu được thu thập theo phương pháp của Bertani và ctv (2016). Mẫu rễ được thu thập trên những cây chuối hột (Musa balbisiana) khỏe mạnh và giai đoạn sinh trưởng 5 đến 6 tháng tuôi. Túi zip được dùng để thu thập mẫu. Đất được lấy ở phần xung quanh rễ chuối và phan rễ chuối sau đó cho vảo túi zip. Mẫu từ các khu vực khác nhau được cho vào các túi zip khác nhau, và đánh dấu theo khu vực lấy mẫu. Dùng găng tay và đôi găng tay mỗi lần thu mẫu dé tránh nhiễm chéo giữa các mẫu. Các mẫu rễ cây thu thập được được bảo quản ở 4°C cho đến khi thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
Bảng 3.2. Kí hiệu và địa điểm lấy mẫu
: Giống l Thời gian
STT Tén mau „ Địa điềm - chuôi thu mầu
1 CC —KS Chuối hột Kim Son, Trà Cú, Tra Vinh 2022 2 CC —- TB Chuối hột Tân Biên, Trà Cú, Tra Vinh 2022 3 CC-NX Chuốihột Ngai Xuyên, Tra Cú, Trà Vinh 2022 4 CC-DA Chuối hột Định An, Trà Cú, Trà Vinh 2022 5 CC-ĐA Chuối hột Đại An, Trà Cú, Trà Vinh 2022
Ghi chú: Tên mau: Tên cây trồng — xã lay mẫu.
3.3.3.2. Phân lập mẫu vi khuẩn nội sinh đối kháng
Các mẫu rễ chuối được loại bỏ hoàn toàn đất bùn bằng vòi nước và được khử trùng bề mặt bằng cách rửa hai lần trong nước cất vô trùng, một lần 10 phút trong 70%
etanol, va hai lần trong dung dịch đệm 1X PBS vô trùng. Dé chắc chắn quá trình khử trùng đạt hiệu qua cao, loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật bám trên bề mặt rễ, một phần nước rửa lần cuối được cấy trải trên môi trường đặc LB (Luria Bentani) và nuôi trong môi trường long LB (Luria Bentam)). Kiểm tra sự xuất hiện vi sinh vật trên đĩa môi trường và bình nuôi lỏng sau khi nuôi cấy 3 ngày ở 28°C. Rễ sau khi khử trùng được thấm khô bằng giấy thấm vô trùng được đem nghiền nát trong 1X PBS. Dịch được thu và cay trang trên môi trường canh thạch LB (Luria Bentani). Cay truyền nhiều lần dé thu mẫu vi sinh vật thuần
3.3.4. Định danh vi khuẩn nội sinh đối kháng
Tiến hành phương pháp định danh vi khuân theo Bergey
3.3.4.1. Xác định khả năng kéo sợi bằng dung dịch KOH 3%
Nguyên tắc: dựa vào khả năng tạo nhay (kéo sợi) giữ sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn gram âm sẽ bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhay (dịch nhay), con vi khuân gram đương không có kéo sợi.
Cách thực hiện: dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường KBA trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều càng quan sát rõ). Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn.
3.3.4.2. Nhuộm gram
Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu trữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn gram (+) có lớp vỏ tế bào day tạo peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crystal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn. Còn vi khuẩn gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng (do có ít peptidoglycan) nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuchsin.
Cách thực hiện: Dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch, cô định tiêu ban vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn côn.
Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thé (Crystal Violet) trong 30 giây, rửa lai bằng nước, dé khô. Nhuộm tiếp bang dung dịch lugon dé có định màu trong 30 giây và rửa sạch bằng nước. Tây bằng cồn 90° trong 30 giây sau đó rửa sạch. Nhuộm tiếp mẫu
21
bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa lại bằng nước. Quan sát dưới kính hiển vi với thấu kính 40X và 100X.
Đánh giá kết quả: Vi khuẩn gram âm có màu đỏ hồng, vi khuẩn gram dương có
mau tim.
3.3.4.3. Nhuộm bao tử
Nguyên tắc: Bào tử khó bị bắt màu hơn tế bào sinh dưỡng. Nhưng khi đã bắt màu rồi thì màu sẽ bám rất chặt và khó bị trôi đi. Khi dùng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh như thuốc lục malachite với tiêu bản có đun nóng, thuốc nhuộm xâm nhập vao nội bảo tử và làm chúng nhuộm màu lục. Khi rửa vết bôi bằng nước các tế bào sinh dưỡng sẽ bi mat màu còn bảo tử vẫn giữ lại màu lục. Khi nhuộm bồ sung bằng đỏ fuchsin sẽ làm tế bào sinh dưỡng bat màu đỏ hồng.
Cách thực hiện: Sử dụng phương pháp của Schaefera và Fulton cải tiễn theo các bước: Dùng que cấy thu mẫu vi khuẩn từ môi trường KBA dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch, cố định tiêu ban vi khuẩn bằng ngọn lửa đèn cồn. Đặt tiêu bản lên trên giá đỡ, giá đỡ đặt trên cốc thủy tinh có chứa một ít nước đang đun nóng (85°C — 90°C) trên bếp. Đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi. Nhỏ 2 — 3 giọt dung dich lục Malachite 5% lên vết bôi và tiến hành ho trên nước nóng từ 5 — 10 phút. Nếu thấy thuốc nhuộm trên giấy bị khô thì phải bổ sung. Rửa vết bôi bằng nước cat trong 30 giây. Sau đó đặt miếng giấy lọc lên trên vết bôi, nhỏ 2 — 3 giọt Safranine trong 1 phút. Rửa lam kính
với nước cất và dé khô. Quan sát tiêu bản trên kính hién vi với thay kính 100%.
Đánh giá kết quả: Mẫu vi khuẩn có màu lục, vi khuẩn có cấu tạo bào tử. Mẫu vi khuẩn có màu đỏ hồng, vi khuân không có cấu tạo bào tử.
3.3.4.4. Định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa
Khảo sát hoạt tính catalase
Nguyên tắc: phan lớn các vi sinh vật hiếu khí và ky khí tùy ý chứa chuỗi điện tích có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến đổi năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tích cuối cùng trong chuỗi điện từ tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H20 và
giải phóng Oz, gây hiện tượng sui bọt khí.
Cách thực hiện: Nhỏ vài giọt HaO; lên vi khuẩn phân lập. Quan sát và ghi nhận
hiện tượng sủi bọt.
Đánh giá kết quả: vi khuẩn có enzyme catalase xuất hiện hiện tượng sui bọt.
Phản ứng oxidase
Nguyên tắc: Các loại enzyme hiếu khí tuyệt đối có enzyme oxidase. Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi chuyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O› là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện điện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay ky khí tùy ý. Enzyme này phản ứng với tetramethyl- pphenylenediamine dihydrochloride được tâm trong đĩa giấy làm đĩa giấy chuyên sang
mau xanh tím.
Cách thực hiện: Tâm giấy lọc với thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1%. Sau đó cấy vi khuẩn lên miếng giấy lọc đã tam thuốc. Quan sát kết quả trong 10 giây đầu tiên.
Đánh giá kết quả: Nếu vi khuan có màu xanh tím thì phan ứng dương tính, ngược lại vi khuân không đổi màu thì phản ứng âm tính.
3.3.4.5. Khả năng phát triển của vi khuẩn trong điều kiện ky khí
Thực hiện: Cấy đâm sâu vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường LB đã được chuẩn bị trước, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 — 4 ngày. Quan sát sự phát triển của vi khuân và ghi nhận kết quả.
Đánh giá kết quả: Nếu vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đường cấy, không phát triển trên bề mặt môi trường thì đó là vi khuẩn ky khí. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, không phát triển lan ra khỏi đường cấy thì đó là vi khuân hiếu khí.
3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn đối với nam Fusarium oxysporum trong điều kiện in vitro.
B6 tri thi nghiém:
Thí nghiệm được tiễn hành trên môi trường PDA và được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với mỗi chủng vi khuẩn là một nghiệm thức và một NT đối chứng, 3 lần lặp lai (LLL), mỗi LLL là một dia petri.
Cách tiến hành:
Đặt khoanh nắm Fusarium oxysporum được nuôi trên môi trường PDA trong 7 ngày có đường kính 5 mm vào giữa đĩa petri. Sau đó, sử dụng que cấy ria, cấy dịch vi khuan đã tăng sinh thành 2 đường thang song song và cách vị trí đặt thạch nam 2,5 cm.
23
Vi khuân nội sinh Nâm gây bệnh vùng rễ đối kháng
Hình 3.2. Vi khuẩn nội sinh đối kháng nam trên dia petri
Do ban kính trung bình theo công thức:
TL 72
————
Z
Trong đó: r: bán kính trung bình của tan nam rl, r2: bán kính đo từ tâm đến phan tản nắm phân bố theo hướng vi khuẩn.
Do bán kính tản nam và tính hiệu suất đối kháng theo công thức của Moayedi va ctv
(2009) sau 2, 4, 6, 8 ngày.
GT
AE (%) = x 100 C
Trong do:
AE: Hiệu suất đối khang (%)
C: Bán kính tan nam tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)
T: Bán kính tản nam tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng (mm) Theo Soytong (1988) dụa vào hiệu suất đối kháng đánh giá khả năng đối kháng
như sau:
AE > 75%: có khả năng đối kháng rat cao 61% < AE < 75%: có khả năng đối khang cao
51% < AE < 60%: có khảng năng đối kháng trung bình AE < 50%: có khả năng đối kháng thấp
3.4. Xử lý số liệu
Các số liệu được tông hợp, xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Các số liệu xử lý thống kê theo ANOVA, trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm
SAS 9.1.