Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. chịu mặn có khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp IAA từ đất canh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre

Bên cạnh đó, vi khuẩn vùng rễ còn có tác dụng tăng khả năng hấp thụ chấtdinh dưỡng từ đất, có ý nghĩa rất quan trọng đối với thực vật sống trong điều kiện đấtnhiễm mặn, bởi hàm lượng muố

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO _

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP VÀ TUYẾN CHON CHUNG VI KHUAN

Pseudomonas spp CHỊU MAN CÓ KHẢ NANG

CO DINH DAM VA SINH TONG HOP IAA

TU DAT CANH TAC NONG NGHIEP

TINH BEN TRE

Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌCSinh viên thực hiện : NGUYEN THỊ ANH QUYEN

Mã số sinh viên : 19126141

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thú Đức, 08/2023

; BỘ GIAO DUC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

PHAN LAP VÀ TUYẾN CHON CHUNG VI KHUAN

Pseudomonas spp CHIU MAN CO KHA NANG

CO DINH DAM VA SINH TONG HOP IAA

TU DAT CANH TAC NONG NGHIEP

TINH BEN TRE

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG NGUYEN THỊ ANH QUYEN

ThS LE PHUGC THO

TP Thú Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại Khoa Khoa học Sinh học TrườngĐại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã học đượcnhững kiến thức rất bổ ích, đồng thời cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ từphía thầy cô, anh chị và bạn bè xung quanh Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban giám hiệu, quý thay cô Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh nóichung và Khoa Khoa học Sinh học nói riêng đã tận tình chỉ dẫn, giảng dạy những kiếnthức và truyền đạt kinh nghiệm trong thời gian ở trường, cũng như đã tạo điều kiện thuậnlợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Trương Phước Thiên Hoàng và ThS Lê

Phước Thọ, cảm ơn cô và anh đã tạo điều kiện, cũng như truyền đạt rất nhiều kiến thứctrong lĩnh vực vi sinh giúp tôi hoàn thành tốt hướng nghiên cứu của mình Tôi cũng xingửi lời cảm ơn đến KS Võ Trần Quốc Thắng, cảm ơn anh đã luôn hỗ trợ, chia sẻ nhữngkinh nghiệm quý báu Cảm ơn tập thé phòng vi sinh ứng dụng đã luôn động viên, chia

sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Sau cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, gia đình đã luôn là chỗdựa tinh than vững chắc, là động lực to lớn để tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Thị Ánh Quyên, MSSV: 19126141, Lớp: DH19SHA (Số di động:

0396653463, Email: 19126141(2st.hemuaf.edu.vn thuộc ngành Công nghệ Sinh học

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt

nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu làhoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng

về những cam kết này

Tp Hồ Chi Minh, ngày31 thángÚ7 nam 2023

Người viết cam đoan(Ký và ghi rõ họ tên)

il

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiễn hành nhằm phân lập các chủng Pseudomonas spp có khảnăng sinh trưởng trong điều kiện mặn, sinh tổng hợp IAA tốt và có định được đạm, cungcấp cho cây từ đất canh tác nông nghiệp tỉnh Bến Tre Từ 10 mẫu đất thu nhận tại huyệnChâu Thành, tiến hành phân lập trên môi trường King B có bổ sung 1 % NaCl, nhằmchon lọc sơ bộ được các chủng Pseudomonas có khả năng phát huỳnh quang dưới đèn

UV Tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối

từ 3 % - 7 % (khoảng cách giữa các nồng độ muối là 1 %) Kha năng sinh tổng hợp IAA

của các chủng sống ở nồng độ muối cao được xác định bằng thuốc thử Salkowski cải

tiến và khả năng cô định đạm được khảo sát bằng phương pháp chưng cất Kết qua phânlập được 10 chung vi khuẩn khác nhau về hình thái, kích thước trên môi trường King B

bổ sung 1 % NaCl, trong đó có 8 chủng sinh trưởng tốt ở nồng độ 7 % bao gồm Al, A2,A3, A4, A5, A6, A8 và A10, các chủng A5, A8 và A10 có kha năng sinh trưởng thấphon han so với các chúng còn lại Cả 5 chủng chịu được mặn tốt nhất đều có khả năngsinh tổng hop IAA với nồng độ ở mức khá từ 3,95 pg/mL đến 12,26 ug/mL, trong đó

chủng AI, A2 và A3 có hàm lượng IAA tăng qua các ngày khảo sát, các chủng còn lạiđạt tối đa ở ngày 5 và giảm dan từ ngay 6 Các chủng sinh tổng hợp IAA tốt không cókhả năng cố định đạm qua các ngày khảo sát, lượng amoni có sẵn trong môi trường bịgiảm qua các ngày khảo sát so với mẫu đối chứng âm Kết quả định danh chủng A2 vàA3 có trình tự tương đồng với loài Pseudomonas aeruginosa với mức tương đồng lần

lượt là 97% và 100%.

Từ khóa: Pseudomonas spp., chịu man, IAA, có định dam

ill

The study was conducted to isolate strains of Pseudomonas spp that can grow in saline conditions, have good biosynthesis of IAA and fix nitrogen, to provide plants from agricultural land in Ben Tre province From the 10 soil samples obtained in Chau Thanh, isolation was carried out on King B medium supplemented with 1 % NaCl, to preliminarily select Pseudomonas strains capable of fluorescing under UV light Survey the salt tolerance of bacterial strains at salt concentrations ranging from 3 % to 7 % (the distance between salt concentrations is 1 %) The IAA biosynthetic ability of strains

living at high salt concentrations was determined by modified Salkowski reagents and

nitrogen fixation was investigated by the distillation method The results isolated 10

bacterial strains with different morphology and size on King B medium supplemented

with 1 % NaCl, of which 8 strains grew well at 7 % concentration, including Al, A2, A3, A4, A5, A6, A8 and A10, strains A5, A8 and A10 had much lower growth abilities than the remaining strains All 5 strains with the best salt - tolerance were able to biosynthesize IAA with a good concentration from 3.95 pg/mL to 12.26 ug/mL, in which strains Al, A2 and A3 had an increase in IAA content over the survey days, the remaining strains reached the maximum on day 5 and gradually decreased on day 6 The

good JAA biosynthesis strains were not able to fix nitrogen through the survey days, the

amount of ammonium available in the medium was decreased over the survey days compared with the negative control The results of the identification of strains A2 and

A3 have similar sequences to Pseudomonas aeruginosa, with a similarity of 97 % and

100 %, respectively.

Keywords: Pseudomonas spp., saline stress, IAA, nitrogen fixation.

IV

CHƯƠNG 1 MO ĐẦU 22-©2222222E22E222122122112212211221221211211211211211211211 21 xe |1.1 Đặt vấn đề - ++s22s221232122121121212112111211212111212111212102111012111221 21 se |1.2 Mục tiêu đề tài: 5-52 222S121212212212112111211212121121111211211212112121211212 01212 e 31:5 NỘI đụng THỰ HIỂT loa nensestressisinDaSiSSSASVSGISSISEEISSRDSESSGIIIESSSEBSSOSSENNSMNGgiEHAS-ĐnHdioniEss & 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAI LIBU w cccccsscssssssscssesssssssessssesnssssosseessrvessenieeveesesssenets 32.1 Tổng quan về xâm nhập mặn 2 2+2©22+E++EE+zE++Exzxzrxerxzrrzrxerxsrrcex 03

2.1.1 Khái niệm xâm nhập mặn - - - + + + +2 +22 E E231 E 221822118 1115211 231E 211.11 1 eree 3

0)5IÊ22/RIh 72419/2418414711E.578ati01I 2S 1S ẻẽnẽốố ốc2.1.3 Đặc điểm của đất nhiễm mặn 2-2 2+ S+SE2EE2E9E12E121212212111211 21112122 xe 33.1.4 Xãn tin trặn.ở Hnh Bến T6 -cicikii-iAEiiAEdLEe Big e7 42.1.5 Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của cây 42.2 Tổng quan về vi khuẩn Psendomonds 5:©22-52©5222222222E22ES22E2E+z£SzEzzz+ os 525.1, Đặc điểm phi ÌH8Ìsenesegnn an Htg Hh dã 3yy gi ng gu Di Gi56600 G08)0143i306-038100301040 30000048880 52.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh ha o.oo ceccecsesccecseeseecsecseesesseesesseesseeseesseeseesee 6

2.3 Sự tương tác của Pseudomonas spp với vùng rễ thực vật - 7

2.4 Cơ chế tác động của PGPR - 2: 2-51 212212212212121121121121121121112111 2121 re 92.5 Cac nghién cur trong UGC 0 11 3,6 Các nghiện: cứu NSOAl HƯI eo eb6see45512116109801614666180S8356359S44885080836G0000820GG88 12CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP -2 22©22222222+22+zzzzzzxzez 163.1 Thời gian và địa điểm nghiên CO -2- 2-22 ©22+22+2zE2EE+EEezrErrxerrerrrrrrree 16

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - +5 +22 52 +22S+*2£2x 22 zzrrrrrrerree 16 3.2.1 Vật HOU ooo eecceeeccseeccsseessssesssssesesseessssesessuesssseesssuessssesssieesssuessssssssuesesisesssuecssiesssssees 16 3.2.2 PHƯƠNG phap nelle CUU semen mmen mm sueyur erm 173.2.2.1 Phan lập các chủng vi khuan Pseudomonas spp từ dat nhiễm mặn 173.2.2.2 Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn 222525522 183.2.2.3.Khảo sát kha năng sinh tong hợp IAA bằng phương pháp Salkowski (Glickmann

và Dessaux, 1995) Khao sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của các dòng vi khuẩn trên

CA COW NHI: connsisenniasnaeossbsoosbiEpovsslhgsagitlbstagisfBssssoisbssssgtasissttstsiosisHsvsitsilbuisilssstto 193.2.2.4 Khao sát khả năng cố định dam bằng phương pháp chưng cất 213.2.2.5 Định đanh bằng sinh học phân tử - 22 222222+22E+EE+2E+£EE2E+z2xzzzrzrxeex 223.3 Xử lý số liệu 22222222222212211211211211211211211211211211211211211211211 2e rre 23

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2 22522E+2E22E2£E2EEE2EzzEzxez 24

4.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn 244.2 Khao sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn 22 2+22+s+2z+zzczecxee 284.3 Kết quả khảo sát kha năng sinh IAA của các chủng vi khuẩn chịu mặn tốt và hiệuquả kích thích tăng trưởng của các dòng vi khuẩn trên cây đậu xanh 304.3.1 Kết quả khảo sát khả năng sinh IAA của các chủng vi khuân chịu mặn 304.3.2 Kết quả khảo sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của các dòng vi khuẩn trên cây

CN DI AT TT sscspssbrnsvsgsnrstuerESEESiOugEa80E80L50.g83013ã8:8/2lãn4x001g8i158 nhaR6:33iB06njt35i80,:1%2830i:g80u8/881lNGERinsardfBgBuimkinggEioadda 324.4 Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các chủng có khả năng sinh IAA và chịumặn tốt bằng phương pháp chưng cất -2- ©2222 ©222E+2EE+EE+2EE£EEE2EEzEEzxrzrrcrer 34

AS Kết quá định đa sac e8 kiS0 0a n10 01001460810 6601)100031601561301401648056 0 0180100002406 35

CAS wa A UL A secretes ier et ii eer ie ts i a te a es a 36CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ 2-22 52+S2ssEzEerserrrsrerrrer 38h‹a na - 38J0 0n 38

vl

DANH SÁCH CHU VIET TAT

IAA _ : Indol - 3 - acetic acid

KB : môi trường King B

PCR _ : Polymerase Chain Reaction

pH : độ hoạt động của các ion H” trong dung dịch

PGPR_ : Plant Growth Promoting Rhizobacterrun

ug : microgram

ug/L : microgram per liter

vil

Địa điểm lây 1 a :ssccseneesiiig1x6L13018848189160604146511138818850150014431543411313599535555S 16

Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc -2 -2-552 20Kết quả đo chỉ tiêu mẫu đất - 2-22 22222222E22EE22E2EE2EEzEErrrrerrees 24Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được 25Kết quả xác định hình thái, sinh lý của các chủng phân lap 7gMật độ tế bao vi khuẩn trên môi trường King B có bé sung muối 29Hàm lượng IAA theo dõi qua các ngay nuôi cấy - 3lChiều dai rễ đậu qua các ngày theo đối 2-52 5522S2Ec2zz2zzzzezez 33Hàm lượng amoni theo đõi qua các ngày nuôi cấy -.- 34

vill

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang Hình 2.1 Vi khuẩn Pseudomonas đ€F1IBÏfAOSđ -:-22-©52©2222+222222+22S222+22+c2zzzzcee 5

Hình 2.2 Cơ chế kích thích sự sinh trưởng thực vật bởi PGPR - 10

Hình 4.1 Hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường KB - 25

Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập trên môi trường KB 26 Hình 4.3 Hình thái tế bào một số chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi 26

Hình 4.4 Kết qua thử nghiệm catalase của một số chủng vi khuẩn 27

Hình 4.5 Kết qua thử nghiệm oxidase của một số chủng vi khuẩn 27

Hình 4.6 Biéu đồ biểu thị ảnh hưởng của NaCl đến sinh trưởng của vi khuẩn 28

Hình 4.7 Biéu đồ sự biến thiên hàm lượng IAA (Ug/ML) oo ceeececceeseeceeeeeeee 30 Hình 4.8 Khả năng tong hợp IAA của các chủng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy 32

Hình 4.9 Kha năng tông hop IAA của các chủng vi khuẩn sau 6 ngày nuôi cấy 32 Hình 4.10 Chiều dài rễ đậu xanh sau 1 ngày gieo hat -2- 2-5225: 33 Hình 4.11 Chiều dài rễ đậu xanh sau 3 ngày gieo hat 2-2222 55z<- 33 Hình 4.12 Biéu đồ sự biến thiên hàm lượng amoni (mg/L) -2 2552252252252 34 Hình 4.13 Cây phát sinh chủng loại của chủng A2 _ -. -5 c5+-c+<c<<S2 35 Hinh 4.14 Cây phát sinh chủng loại của chủng A3_ c c<-c<<s+ 36

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Dat van đề

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là phan hạ nguồn của lưu vực sông Mê Kông,

những năm gần đây, các nước thượng nguồn có kế hoạch tăng cường cho sản xuất nông

nghiệp, thủy điện và các hoạt động kinh tế khác dẫn đến sự suy giảm lượng nước đồ về

đồng bằng và gây thiếu nước nghiêm trọng Hiện lượng nước ngọt nảy thường nhỏ nhất

vào tháng 3 hay thang 4, nên độ mặn lớn nhất cũng thường xuất hiện vào giai đoạn này

Vào mùa khô, lượng nước ở thượng nguồn bị suy giảm mạnh, gió lớn đưa nước biển

vào sâu trong đất liền, lượng nước ngọt bi nước mặn thay thế, ảnh hưởng đến năng suấtcây trồng ở các xã và vùng ven biên, từ đó ảnh hưởng đến đời sống của người dân venbiển sống dựa vào nông nghiệp Theo thống kê của Cục Trồng trọt văn phòng phía Nam(Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn), tính đến ngày 20/3/2020, tổng diện tích lúavùng ĐBSCL bị ảnh hưởng do hạn mặn làm thiệt hai nang suất là 41 207 ha; trong đó

vụ Thu Đông, và lúa Tôm là 16 959 ha; lúa Đông Xuân 2019 - 2020 là 39 006 ha Vềthiệt hại trên các cây trồng khác tính đến cùng ngày, tỉnh Sóc Trăng đã có 12,2 ha cây

ăn trái bị thiệt hại, giảm năng suất (chủ yếu là cây bưởi, cam, sầu riêng, đu đủ, mít)

Ngoài ra còn có 44 ha rau màu bị thiệt hại, trong đó có 22,6 ha mat trang Bến Tre có

25 ha rau màu bị thiệt hại từ 30 — 70 % và 0,2 ha cây ăn trái bị thiệt hại trên 70 %.

Những năm gần đây, Bến Tre chịu tác động mạnh mẽ của biến đổi khí hậu, nhiệt

độ trung bình có xu hướng tăng cao, lượng mưa ở nhiều khu vực giảm rõ rệt, nước biên

dâng cao, hạn hán gay gắt Theo Đài khí tượng Thủy văn tỉnh Bến Tre, tình trạng xâmnhập mặn mùa khô năm 2022 - 2023 xảy ra sớm hơn trung bình các năm Từ nửa cuốitháng 12, hạn mặn bắt đầu xâm nhập vào khu vực gần cửa sông Độ mặn cao nhất vàxâm nhập sâu nhất xuất hiện vào tháng 2, tháng 3 - 2023 Dự báo độ mặn 4%o có théxâm nhập cách cửa sông khoảng 45 - 57 km; độ mặn 1 %o có thể xâm nhập cách cửasông khoảng 54 - 68 km.

Vi khuan vùng rễ kích thích sự sinh trưởng và phát triển ở thực vật, có vai trò quantrọng trong nông nghiệp cả về chất lượng, số lượng cũng như tính thân thiện với môitrường Về số lượng, phân đạm sinh học được có định bởi vi khuẩn chiếm khoảng 70 %tổng lượng đạm trên toàn trái đất Về chất lượng, đạm sinh học không gây hiện tượng

dư đạm ở cây trồng, giúp ngăn ngừa tích lũy nitrate cũng như khả năng giảm ô nhiễmnguồn nước Bên cạnh đó, vi khuẩn vùng rễ còn có tác dụng tăng khả năng hấp thụ chấtdinh dưỡng từ đất, có ý nghĩa rất quan trọng đối với thực vật sống trong điều kiện đấtnhiễm mặn, bởi hàm lượng muối trong đất chính là trở ngại hàng đầu trong việc hấp thudinh dưỡng của thực vật (Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp, 2018).

Nhằm thay thé cho phân bón hóa học, tránh gây 6 nhiễm môi trường, tiết kiệm chiphí sản xuất, việc sử dụng phân sinh học có chứa nhóm vi khuẩn vùng rễ có kha năngtiết kích thích t6 tăng trưởng giúp tăng thé tích, số lượng rễ làm tăng kha năng hap thuchất dinh dưỡng giúp cây sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh ngay cả trong điều kiệnngập mặn, thực hiện đề tai: “Phâp lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas spp.chịu mặn có khả năng có định đạm và sinh tổng hợp IAA từ đất canh tác nông nghiệptỉnh Bến Tre”

1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm ra được chủng Pseudomonas spp sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao, có khảnăng sinh tổng hợp IAA và cố định dam tốt

1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập và làm thuần các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn.Khao sát khả năng chịu mặn của các chủng v1 khuẩn đã được làm thuần

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng có khả năng sinh trưởng tốt

ở điều kiện mặn cao bằng phương pháp Salkowski

Khao sát khả năng kích thích tăng trưởng của các dong vi khuẩn trên cây đậu xanh.Khảo sát kha năng cố định đạm bằng phương pháp chưng cat

Định danh sinh học phân tử.

CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Tông quan về xâm nhập mặn

2.1.1 Khái niệm xâm nhập mặn

Nước ngọt được coi là nguồn tài nguyên khan hiếm Theo tổ chức Khí tượng thếgiới, chỉ có 2,5 % tong lượng nước trên trái dat là nước ngọt, phần còn lại là nước mặn.Nguồn nước ngọt lớn nhất năm dưới lòng đất và một phan nước mặt nằm rải rác ở nhiềukhu vực trên thế giới Nước ngầm được sử dụng rộng rãi dé bé sung cho nguồn nướcmặt nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng nước ngày càng tăng Tuy nhiên, một trong nhữngvan đề đối với hệ thống nước ngầm ở những vùng ven biển chính là xâm nhập mặn.Xâm nhập mặn là quá trình thay thé nước ngọt trong các tầng chứa nước ở ven biển bằng

nước mặn do sự dich chuyền của khối nước mặn vào tầng nước ngọt Xâm nhập mặn

làm giảm nguồn nước ngọt dưới lòng đất ở các tầng chứa nước ven biển do cả hai quátrình tự nhiên va con người gây ra (Priyantha Ranjan, 2012).

2.1.2 Nguyên nhân gầy mặn

Đất mặn được hình thành gần các cửa sông nơi có địa hình thấp chủ yếu dưới 1

mét (nơi cao nhất chỉ khoảng 2 mét so với mực nước biển), trên nền đất kết hợp giữaphù sa sông và phù sa biển, phù sa biển trầm tích ở bên dưới, phù sa sông phủ lên trên.Phù sa biển thường thô, phù sa sông mịn hơn và chủ yếu là sét

Đất mặn là nhóm dat phù sa ven biên, chịu ảnh hưởng trực tiếp của nước mặn biểntheo thủy triều tràn vào hoặc gián tiếp do mach nước mặn từ biển ngắm vào Ở ViệtNam, đất mặn phát sinh là do ngập nước mặn ở ven biển; do ảnh hưởng của các mạch

nước mặn ngắm lên mặt đất hay do mẫu chất mặn nội địa trong điều kiện khí hậu bán

khô hạn, về mùa khô, muối hòa tan theo các mao quản dẫn lên làm đất nhiễm mặn; donước bốc hoi dé lại muối hòa tan trong dat

2.1.3 Đặc điểm của đất nhiễm mặn

Đây là nhóm đất có chứa nhiều muối hòa tan Những loại muối hòa tan thường gặptrong đất mặn là: NaCl, NaaSOu, CaCl, MgCla, NaHCO: Có thành phần cơ giới nặng,

tỉ lệ sét từ 50 — 60 %, thắm nước kém Khi đất ướt sẽ dẻo và dính, khi khô thì co lại, nứt

nẻ và rắn chắc, khó canh tác Bên cạnh đó do có chứa nhiều muối tan nên áp suất thâmthấu của dung dịch đất lớn ảnh hưởng đến quá trình hút nước và chất dinh dưỡng của rễ

cây, natri trao đôi ở mức độ cao gây nên sự thay đôi xâu về tính chat vật lý cua dat, ham

lượng các chất dinh dưỡng thiết yếu trong đất bị mat đi khá nhiều làm giảm sự hấp thu

nước và chất dinh dưỡng của cây Nồng độ cao quá mức của các ion muối cũng ảnh

hưởng đến quá trình quang hợp, gây tôn thương lá cây, dẫn đến bị úa và rụng sớm docây không hấp thu được nước nhưng quá trình thoát hơi nước vẫn diễn ra (Nguyễn ĐứcThành và ctv, 2019).

2.1.4 Xâm nhập mặn ở tỉnh Bến Tre

Sông Mê Kông có chín cửa đồ ra biển Đông tại Đồng bang sông Cửu Long thìtrong đó có bốn cửa sông thuộc tỉnh Bến Tre, đây là nguyên nhân cho việc Bến Tre chịuảnh hưởng nặng nề nhất bởi xâm nhập mặn và sạt lở Theo số liệu của Sở Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn tỉnh Bến Tre, trong mùa khô năm 2015 - 2016, mặn tăng cao độtngột và xâm nhập rất sâu vào đất liền, ước tính giá trị thiệt hại của riêng ngành nông

nghiệp là hơn một nghìn tỉ đồng Mùa khô năm 2019 - 2020, tỉnh Bến Tre tiếp tục đối

mặt với đợt xâm nhập mặn khốc liệt nhất trong lịch sử Độ mặn 2 %o hầu như bao phủtrên toàn tỉnh, có thời điểm độ mặn lên đến 5 %o

Theo nhận định của Đài Khí tượng Thủy văn tỉnh Bến Tre, tổng lượng dòng chảy

từ thượng lưu sông Mê Kông về hạ lưu và vùng Đồng bằng sông Cửu Long trong tháng

10 và thang 11 năm 2022 ở mức cao hơn trung bình nhiều năm từ 15 — 25 %, trong thang

12 cao hơn trung bình nhiều năm 10 - 15% Mùa khô 2022 - 2023, nhận định xâm nhậpmặn ở mức sớm hơn trung bình nhiều năm Từ nửa cuối tháng 12 năm 2022, mặn bắt

đầu xâm nhập vào khu vực gần cửa sông Xâm nhập mặn sâu nhất ở mức xấp xi và thấp

hơn mùa khô 2021 - 2022 Độ mặn cao nhất và xâm nhập sâu nhất xuất hiện vào tháng

2 và tháng 3 năm 2023 Dự báo độ mặn 4 %o có thể xâm nhập cách các cửa sông khoảng

từ 45 - 57 km; độ mặn 1 %o có thé xâm nhập cách các cửa sông khoảng từ 54 - 68 km

2.1.5 Ảnh hưởng của đất nhiễm mặn đến đặc điểm sinh lý, sinh hóa của cây

Khi nước mặn xâm nhập vao ao, mương trong vườn sẽ tích tụ các muối hòa tantrong đất Khi tưới nước cho cây trồng, hàm lượng muối hòa tan cao làm cho áp suấtthâm thấu của dung dịch đất lớn hơn áp suất thâm thấu của tế bào Chính sự chênh lệch

áp suất này làm cho hệ thống rễ cây không hút được nước và chất đinh dưỡng, đồng thờilàm cho màng tế bào rễ bị phá vỡ dan đến cây bị mat nước, trường hợp nặng có thé dẫnđến chết cây

Dat nhiễm mặn gây trở ngại cho sinh trưởng va phát triển cây trồng, gây rối loan

sự hấp thu nước và chất đinh dưỡng, phá hủy cấu trúc đất Đất bị nén chặt kìm hãm sự

phát triển bình thường của rễ, giảm tính thấm và thoát nước, gây hạn sinh lý và cây bịhéo lâu dải Khả năng hấp thụ khoáng của cây bị hạn chế dẫn đến thiếu các khoáng chấtcần thiết, thiếu phospho nên quá trình phosphoryl hóa bị kìm hãm và cây bị thiếu năng

lượng Sự vận chuyển và phân bồ các chất đồng hóa trong mạch libe bị kìm hãm làm

các chất hữu cơ tích lũy trong lá, ảnh hưởng đến quá trình tích lũy vào cơ quan dự trữ

Sự dư thừa các ion trong đất làm rối loạn tính thắm của màng nên làm rò rỉ các ion rangoài rễ, quá trình trao đổi chất, đặc biệt là trao đổi protein bị rồi loạn, dẫn đến tích lũycác acid amin va amit trong cây Sự tổng hợp cytokinine bị ngừng vì rễ là cơ quan tổnghợp phytohormone này nên cây thiếu cytokinine ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cơquan trên mặt đất

Không có điểm độ mặn tới hạn nào mà thực vật không phát triển được Khi độ mặntăng, tốc độ tăng trưởng giảm dần cho đến khi cây bị nhiễm độc Clo và chết Thực vật

khác nhau có khả năng chịu được lượng muối khác nhau (Abrol và Yadav, 1988)

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas

2.2.1 Đặc điểm phân loại

Pseudomonas thuộc giới Bacteria, lớp Gamma Proteobacteria, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadaceae và chi Pseudomonas.

dưỡng dé thay đổi và linh động làm cho chúng có thé sống ở nhiều môi trường khácnhau như đất, nước trên cây và trong các động vật Trong số những loài Pseudomonas

nay, có những loài tiêu biéu có thé được sử dụng trong công nghệ sinh học

2.2.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

Pseudomonas spp là chủng vi khuan gram âm hình que, có một hay nhiều cựctiêm mao - một cau trúc giống như sợi tóc nhỏ giúp chúng có thé đi chuyền Tế bào cókích thước từ 0,7 - 0,8 x 2,3 - 2,8 wm Chúng có khả năng tự sản sinh một loạt các sắc

tố Các sắc tố này có thể tan trong nước và khếch tán vào môi trường nuôi cấy hoặc liênkết với tế bao vi khuẩn Pseudomonas spp có thể tạo các sắc tố khếch tán và phát huỳnhquang ở bước sóng 366 nm Các sắc tố đặc trưng có thé kê đến như pyocyanin (PYO)

có màu xanh đậm được tạo ra bởi vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, sinh ra thuận lợitrong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí, dé dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên

môi trường King A; pyoverdin có mau vàng, xanh lá cây va phát huỳnh quang, sinh ra

bởi Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida,Pseudomonas verono, Pseudomonas momiteilla dùng môi trường King B dé phát hiệnsac tố này; pyomelanin có mau nâu nhạt và pyorubrin có màu đỏ (Nguyễn Quang Vinh

và ctv, 2020) Chúng có sự chuyên hóa vô cùng linh hoạt, có kha năng hô hấp hiếu khíhay ky khí trong môi trường không có oxy, hoạt động tốt trong cả 3 môi trường hiểu khí,

ky khí và tùy nghi, nhưng nhiều chủng có khả năng sử dụng nitrate thay cho oxy như làchất nhận điện tử cuối cùng trong suốt quá trình hô hấp của tế bảo

Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas spp là từ 25 — 30 °C, chúngcũng có thé tồn tại ở nhiệt độ thấp tới 0°C cũng như có thé tăng trưởng ở 41 °C Một số

loài như Pseudomonas fluorescens có thé sử dụng xyanua là nguồn nitơ duy nhất của

nó, khi phân hủy sinh học biến đôi xyanua thành xyanat, mà sau đó được chia nhỏ tạothành amonia và carbon dioxide (Nguyễn Thị Như Yến va ctv, 2011)

Về hình thái khuẩn lạc, các loài Pseudomonas spp thường có 3 dang chính: (1)khuẩn lạc nhỏ, thô ở những chủng hoang dai phân lập từ đất, nước; (2) khuẩn lạc to,

tròn, trơn, ria phẳng, nhô cao và (3) khuẩn lạc có dạng nhay Trong diéu kién invitro, 6

môi trường long, các vi khuẩn nay sắp xếp một cách ngẫu nhiên: ở môi trường thạch thì

kết lại thành một dang lưới thô, các vi khuẩn này có khả năng tiết ra một dạng chất nhay

dé liên kết các vi khuẩn lại với nhau (Trần Linh Thước, 2010)

Một số đặc điểm sinh hóa chính như: không lên men glucose; có khả năng thủygiải gelatin; khử nitrate (+); oxdidase (+); sản suất hydrogen sulphide từ thiosulphate;sam xuất 2 — keto - D - gluconate acid từ D - gluconate; sử dung glycerol, succinate, L-arabinose, formate, acetate, lactose, xylose, mannitol.

2.3 Sự tương tác của Pseudomonas spp với vùng rễ thực vật

Vùng rễ thực vật được định nghĩa là vùng đất mỏng bao quanh TẾ, giàu dinh dưỡng,

là nơi sống của nhiều loài vi sinh vật quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của câytrồng Trong hệ sinh thái đất vùng rễ, sự tương tác giữa đất, rễ cây và vi sinh vật làm

thay đôi đáng ké tính chất vật lý, hóa học của đất và đặc điểm sinh học của thực vật Vi

khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Rhizobacteria

- PGPR) là nhóm vi khuẩn cư trú ở vùng rễ và có tác động tích cực trực tiếp hoặc giántiếp đến sinh trưởng của thực vật Trong những thập kỷ vừa qua, nhiều loài vi khuẩnPGPR đã được phát hiện và nghiên cứu, bao gồm một số loài thuộc các chi Pseudomonas,Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia (Hoàng Kim Chi và ctv, 2019).

PGPR có thé mang lại lợi ich cho cây trồng và giảm bớt tinh trang căng thang do

ngập mặn bằng nhiều cơ chế: (1) tạo ra mang sinh học giúp tích tụ độ am xung quanh ré

và tránh sự xâm nhập của các ion độc hại hoặc mam bệnh, (2) khả năng cung cấp chatdinh dưỡng, chất nền do quá trình hòa tan phosphat hoặc có định đạm trong khí quyền,(3) kích thích sự tăng trưởng và phát triển của rễ thông qua việc phóng thích các kíchthích tố thực vật và các chất chuyển hóa thứ cấp vào vùng rễ như indole - 3 - acetic acid

(IAA) hoặc các phân tử tín hiệu khác dưới dang oxide nitric, (4) tạo ra siderophores va(5) giảm mức 1 - aminocyclopropane - 1 - carboxylate (ACC), bằng cách tăng ACC-deaminase hoạt động trong vùng rễ, do đó làm giảm nồng độ ethylene trong các mô thựcvật Cũng có báo cáo cho rằng PGPR làm tăng hiệu quả sử dụng nước bằng cách điều

chỉnh sự thoát hơi nước và độ dẫn của khí khống, đồng thời làm tăng hàm lượng các loại

oxy phan ứng trong thực vat (Vicente Vives - Peris và ctv, 2018) Pseudomonas spp cócác phẩm chat PGPR rất khác nhau, bao gồm (i) tăng trưởng in vitro nhanh và khả năngsản xuất sinh khối; (ii) xâm chiêm và chiếm ưu thé trong tinh cầu, vùng rễ và bên trong

cơ thé thực vat; (iii) sản xuất các chất chuyên hóa có hoạt tính sinh học (kháng sinh, chấtkích thích tăng trưởng, siderophores và chất dé bay hoi); (iv) sử dụng nhanh dịch chiết

từ hạt và rễ; (v) cạnh tranh khốc liệt với các vi sinh vật khác; và (vi) khả năng chống lại

áp lực môi trường Do khả năng sản xuất các hợp chất đã nêu ở trên, chúng chịu tráchnhiệm thúc đây tăng trưởng thực vật và sức để khang bam sinh của một số loại đất đốivới mầm bệnh độc hại (Narjes H Dashti và ctv, 2012)

Một số chủng Pseudomonas phát huỳnh quang định cư ở rễ được biết đến với khảnăng kiểm soát nam gây bệnh ở rễ có thé gây thiệt hại đáng ké cho sức khỏe và năng

suất cây trồng Những vi khuẩn có lợi cho cây trồng này tạo ra nhiều chất chuyên hóa

có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng, trong đó 2,4 - diacetylphloroglucinol (DAPG),pyoluteorin (PLT), pyrrolnitrin (PRN), phenazine, hydro xyanua (HCN) va lipopeptidetuần hoàn đã được nghiên cứu ở mức chi tiết vi chức năng quang trong của chúng trongkiểm soát sinh học đối với các bệnh ở rễ DAPG và phenazine góp phần vảo sự ức chế

tự nhiên của một số loại đất đối với mầm bệnh từ dat

Vi khuẩn thúc day tăng trưởng thực vật, được biết đến là vi khuẩn tăng cường sựphát triển của thực vật bằng cách tăng khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng đa lượngtrong quá trình xâm lấn rễ cây của chúng So với bat kỳ chi nào khác, Pseudomonas làchế phẩm sinh học được ưa chuộng nhất do các đặc tinh quan trọng của chúng đối với

cả sự phát triển của thực vật và kiểm soát mầm bệnh trong quá trình cộng sinh với câychủ Những đặc tính nay bao gồm sản xuất siderophore, hòa tan phosphat, có định dam,phenazine, kháng sinh và gây ra sự đề kháng toàn thân được thực hiện bởi các loài

Pseudomonas khác nhau như Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida vaPseudomonas syringae Sự kết hợp của Pseudomonas với cây trồng tạo ra một số cơ chếphản hồi dựa trên điện tử và bài tiết, để điều chỉnh sự phát triển của cây và các hoạt độngkiểm soát mầm bệnh thực vật thông qua việc tiết ra một số kích thích tố thực vật (auxin,gibberellin, indole - 3 - acetic acid), các chất chuyền hóa thứ cấp (flavonoid) và enzyme

(aminocyclopropane - | - carboxylat, phenylalanine amoniac - lyase) Cac ứng dụng

quan trọng về mặt sinh thái của Pseudomonas trong kiểm soát sinh học va tăng cườngsinh học là rất quan trọng dé duy trì an ninh lương thực (Stuti Sah va ctv, 2021)

Hầu hết các chủng Pseudomonas kiểm soát sinh học tạo ra ít nhất một chấtchuyên hóa, chẳng hạn như Pseudomonas fluorescens CHAO tạo ra gần như toàn bộcác hợp chất kháng khuẩn nói trên Các chất chuyên hóa độc hại được biết đến vớihoạt động chống lại nam gây bệnh cho cây trồng nhưng chúng cũng có thé biểu hiệncác hoạt động kháng khuẩn, kháng sinh vật đơn bao, chống ung thư và gây độc tế bao

(Laurène Rochat và ctv, 2010) Pseudomonas aeruginosa được báo cáo có khả nănglàm tăng năng xuất đường, cải thiện độ ngọt của cà chua và tăng sản lượng đáng kế(Narjes H Dashti và ctv, 2012).

Trong số các PGPR, Pseudomonas là chi vi khuẩn sở hữu nhiều cơ chế đa dangtrong việc thúc day tăng trưởng thực vật và cảm ứng tính chống chịu với stress sinh họccũng như phi sinh học.

Cơ chế tác động trực tiếp thúc đây tăng trưởng thực vật

Có định đạm sinh học: tông lượng nitơ có trong khí quyên là 78%, nhưng cây trồngkhông sử dụng được Một trong những cách hiệu quả và thân thiện với môi trường nhất

để tăng tốc độ tăng trưởng và năng suất cây trồng đã được chứng minh là sử dụng vi

sinh vật có định N› làm phân bón sinh học Các PGPR rất hữu ich cho việc có định nitơ

và giúp cây trồng hấp thu một cách dé dàng Một loại enzyme nitrogenase được chúng

sử dung đề chuyên đôi nitơ thành amoniac - là dạng có thé sử dung được cho cây trồng(Muhammad Adnan và ctv, 2022) Năm 1955, Anderson báo cáo về khả năng cé địnhđạm của chi Pseudomonas Cau trúc của gen sản xuất enzyme nitrogenase và điều kiệntối ưu dé nó có ích cho quá trình cố định đạm đã được nghiên cứu bang cách sử dụngPseudomonas stutzeri, được phân lập từ ruộng lúa ở Trung Quốc, Pseudomonasfluorescens cũng như các Pseudomonas huỳnh quang khác, đã được báo cáo là kích

thích tạo nốt san ở cây đậu xanh (Dhananjaya Pratap Singh và ctv, 2016)

Hòa tan phospho: phospho là nguyên tố đa lượng quan trọng sau nitơ đối với sựsinh trưởng và phát triển của cây trồng Một lượng phospho cao hơn ton tại ở dạng khônghòa tan trong đất nhưng không có sẵn cho cây trồng Các vi khuẩn vùng rễ chuyên đôicác dạng phospho không hòa tan thành các dạng có thể sử dụng được thường được gọi

là orthophosphate Vi khuẩn có thé hòa tan phospho không hòa tan bằng các tao ra acidhữu cơ có trọng lượng phân tử thấp Một số vi khuẩn sản xuất acid citric và gluconic

Oteino đã báo cáo rằng các giống vi khuẩn bao gồm Bacillus, Enterobacter,

Rhodococcus, Mesorhizobium, Flavobacterium, Rhizobium, Pseudomonas, Erwinia,

Burkholderia, Microbacterium, Beijerinckia, Serratia va Arthrobacter có thé hòa tan

phosphat (N Oteino va ctv, 2015).

Sản xuất hormone thực vật: phytohorrmone rat can thiết cho sự phát triển của câytrồng Hau hết các hormone quan trọng là gibberellin, indole - 3 - acetic acid (IAA) vacytokinine IAA có vai trò quan trọng trong sự khác biệt va phát triển của củ và hat,cũng như sự phân chia tế bào Nó cũng kiểm soát sự phát triển sinh dưỡng và bắt đầusản sinh rễ bên và rễ bất định (Ajay Kumar va ctv, 2017)

Cơ chế gián tiếp thúc đây tăng trưởng thực vat

Hoạt động kháng nam: một số PGPR có khả năng phân hủy acid fusaric doFusarium spp tao ra, liên quan đến bệnh héo rũ và do đó ngăn chặn quá trình phát sinhbệnh Pseudomonas stutzeri tạo ra các enzyme có thê phá vỡ các tế bào của Fusariumsolani Gần đây, Pseudomonas fluorescens được đề xuất là tác nhân kiểm soát sinh học

vì chúng bảo vệ thực vật chống lại một số bệnh nắm, như bệnh thối đen rễ cây thuốc lá,bệnh thối rễ lúa mì và bệnh thối rễ đậu Hà Lan (M Najaf và ctv, 2023)

PGPR

vùng rễ eee `

Hình 2.2 Cơ chế kích thích sự sinh trưởng thực vật bởi PGPR Nguôn:

springer.com.

Có khả nang hap thụ các ion Fe?” trong môi trường với ái lực cao nhằm phục vu

trực tiếp cho sự sinh trưởng, hô hấp của vi sinh vật, làm giảm lượng sắt trong môi trườngxung quanh, dẫn đến các loại vi sinh vật khác không đủ ion Fe** cho quá trình sinh

10

trưởng, phát triển của chúng Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, chẳnghạn như tiết các hợp chat siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe.2.5 Cac nghiên cứu trong nước

Kết quả nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2005), cho thấy rằng chủng vi khuẩn nốtsan cây họ đậu và vi khuẩn Pseudomonas spp làm gia tăng chiều cao cây, số gié/m?, sốhạt chắc/gié, trọng lượng 1 000 hat và giảm tỉ lệ số hạt lép Bon vi khuẩn nốt san cây ho

đậu và vi khuẩn Pseudomonas spp gia tăng năng suất từ 25,38% đến 29,38% va từ

20,36% đến 37,02% so với đối chứng, theo thứ tự; tiết kiệm được 70 kg N/ha đồng thờihàm lượng protein trong hạt gạo chủng vi khuẩn không khác biệt với ham lượng proteintrong hạt gạo có bón 100 kg N/ha, với kết quả này cho thấy các dòng vi khuẩn hữu hiệu

có thê kích thích sự phát triển và gia tăng năng suất lúa cao sản

Dòng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên môi trường NFb cho kết quả tổnghợp IAA tốt nhất với nồng độ IAA là 3,16 g/mL (Nguyễn Thị Huỳnh Như và ctv, 2013)

Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn nội sinh phân lập từ các vùng sinh thái khác nhau

của Nguyễn Hải Vân và Nguyễn Thị Minh (2017) đã so sánh trình tự 16S rRNA của các

chủng phân lập được vơis trình tự tham chiếu trên cơ sở đữ liệu Genbank, cho thấychủng 3TDG4 có mức độ tương đồng 99 % với Pseudomonas putida strain E1-4

Nghiên cứu năm 2018 của Chu Nguyên Thanh và ctv, đã cho thấy được 2 chủngthuộc chi Pseudomonas có khả năng kích thích tăng trưởng thực vat, cho thấy tiềm năngcủa chúng trong thực hành nông nghiệp bền vững

Nguyễn Đức Thành và ctv (2019), đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn

Pseudomonas oryzihabitans T2917 và Burkholderia sp T3602 từ vùng đất trồng bưởi

Da xanh ở tỉnh Bến Tre có khả năng chịu nồng độ muối NaCl > 3 %, có hoạt tính phangiải lân vô cơ (Cas(PO¿)a với đường kính vòng phân giải 3,7 + 0,16 và 2,2 + 0,44 cm).Hai chủng này có tiềm năng trong sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong nông nghiệp,

đặc biệt ở vùng đất bị nhiễm mặn

Nghiên cứu phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa sinh hoạt chất kháng khuẩnPyocyanin của Nguyễn Quang Vinh và ctv (2020) đã sử dung cặp mỗi PA-F; 5’-GGGGATCTTCGGACCTCA-3’ va PA-R: 5’-TCCTTAGAGTGCCC ACCCG - 3’ đặchiệu dé khuếch đại đoạn gen PA 956 bp ở các chủng vi khuan nghiên cứu, có độ djawehiệu và độ nhạy 100 % với chủng Pseudomonas aeruginosa Chu trình nhiệt cho phanứng gồm 95 °C - 5 phút, 35 chu kỳ (94°C - 30 giây; 58°C - 30 giây; 72°C - 45 giây) va

11

kết thúc phản ứng ở 4 °C Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5 %, đệmTAE 1X cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập dựa vào các đặc tính hình thái và sự tiếtPYO đều dương tính với một băng ADN duy nhất có kích thước khoảng 1 000 bp.

Việc ứng dung vi khuẩn vùng rễ thúc đây tăng trưởng thực vật đã có một lịch sử

lâu đài và dần trở nên phổ biến hơn trong những năm gần đây Các loài thuộc chiPseudomonas phân bé6 rộng rai trong đất và vùng rễ, có kha năng thích nghi cao vớinhững yếu tố bat lợi từ môi trường nhờ việc sở hữu các quá trình biến dưỡng và sinh lý

đa dạng, khả năng tổng hợp các chất biến dưỡng có giá trị, khả năng làm sạch môi trường,

điều kiện nuôi cấy đơn giản và tốc độ tăng trưởng nhanh (Chu Nguyên Thanh, 2022)

Trong nghiên cứu của Thái Thành Được và Nguyễn Hữu Hiệp (2022), sau 2, 4, 6

ngày khảo sát cho thấy Pseudomonas có khả năng cô định đạm thông qua việc tổng hợpNH** cao nhất ở ngày 4 là 3,57 mg/L Khuynh hướng của chủng vi khuẩn này là lượngNH** tổng hợp tăng dan từ 0 đến ngày thứ 4 và giảm xuống ở ngày thứ 6

2.6 Các nghiên cứu ngoài nước

Các chủng Pseudomonas fluorescens được kiểm tra về khả năng ức chế mầm bệnhthối thân và rễ của cây đậu phộng Theo P Ganesan và S.S Gnanamanickiam (1987).Kết qua cho thay Pseudomonas fluorescens đã hạn chế sự phát triển sợi nam củaSclerotium rolfsii trong các thử nghiệm in vitro Hach nam cho thấy tỉ lệ nảy mầm lần

lượt là 10 — 20 % và 50 — 60 % sau khi chúng được ngâm trong huyền phù tế bảo vi

khuẩn tương ứng trong 1 giờ và 1 tuần Trong các thí nghiệm ở nhà kính, 99 % cây đậuphộng được bảo vệ khỏi sự tạp nhiễm Sclerotium rolfsii, khi được cấy Pseudomonasfluorescens ở nồng độ 108 CEU/mL

Nghiên cứu của Gail M Preston (2004), cho thay Pseudomonas liên quan đến thựcvật sống hoại sinh và ký sinh trên bề mặt thực vật và bên trong các mô thực vật Nhiềuloài Pseudomonas có khả năng thúc đây sự phát triển của thực vật bằng cách ức chế các

vi sinh vat gây bệnh, tổng hợp các hormone kích thích tăng trưởng và thúc day tăng khả

năng kháng bệnh của thực vật.

Nghiên cứu của E Baehler va ctv (2005), cho thấy chủng vi khuẩn Pseudomonasfluorescens CHAO tao ra ba chất chuyển hóa kháng nam 2.4 - diacetylphloroglucinol

(DAPG), pyoluteorin (PLT) và pyrrolnitrin (PRN) ở mức cân bang.

Cac Pseudomonas fluorescens được phan lập từ ving rễ của cây đậu phộng cho

thay sự ức chế mam bệnh thực vật do Macrophomina phaseolina gây ra bệnh thối trên

12

đậu phộng - một loại nông sản quan trọng về mặt kinh tế Khi được sử dụng làm chế

phẩm trong canh tác đậu phộng, chúng làm tăng cường khả năng nay mam lên đến 15 %

và 30 %, năng suất hạt tăng lần lượt là 66 % và 77 % (Bhatia Shweta và ctv, 2008)

Theo Xu Cheng va ctv (2017), chủng Pseudomonas fluorescens SS101 (P£SS101)thúc day sự phát triển của cây Arabidopsis thaliana, tăng cường khả năng phủ xanh vahình thành rễ bên, đồng thời tạo ra sức đề kháng toàn thân (ISR) chống lại vi khuẩn

Pseudomonas syringae pv gây bệnh ở cà chua.

Pseudomonas stutzeri M]L19, một loại vi khuẩn cư trú trong vùng rễ thúc day sự

phát triển của thực vật, có tác động tích cực đến sự nảy mầm của hạt giống, sự phát triển

va khả năng tăng trưởng của cây trồng dưới điều kiện ngập mặn (MJ Lami và cvt, 2020)

Vi khuẩn không gây bệnh Pseudomonas putida KT2440 là một loại vi khuan vùng

rễ tuyệt vời của các loại cây trồng, có tầm quan trọng về mặt nông học và đã được chứngminh là có khả năng kích hoạt tính kháng của thực vật dé đáp ứng với một số mầm bệnh

trên lá Trong nghiên cứu của Stefanie B Costa - Gutierrez và ctv (2020), đã phân tíchcác tính năng thúc đây tăng trưởng thực vật bé sung của chủng nay, cho thấy chúng cóthể chịu được nồng độ NaCl cao và xác định độ mặn ảnh hưởng như thế nào đến các đặcđiểm như sản xuất các hợp chat indole, tổng hợp siderophore và hòa tan phosphat CayPseudomonas putida KT2440 cải thiện đáng kê kha năng nảy mam của hạt, chiều dài rễ

và thân của cây đậu tương và ngô trong điều kiện mặn so với cây không được cấy.Vicente Vives - Peris và ctv (2018), cho thay Pseudomonas putida KT2440 ức chế sựtích tụ clorua va proline ở rễ dé đối phó với stress do mặn ở cây có múi

Những phát hiện tổng thể trong nghiên cứu của Sangeeta Pandey và cvt (2020),cho thay rằng Pseudomonas sp strain S3 có thé được khám phá như một chất kích thíchtăng trưởng thực vật hiệu quả, kích thích tăng trưởng và cải thiện khả năng phục hồi của

cây cà chua trong điều kiện nhiễm mặn

Chung Pseudomonas aeruginosa FG106 được phân lập từ vùng rễ của cây cà chua

và được xác định thông qua phân tích hình thai học, giải trình tự gen 16S rRNA va giải

trình tự toan bộ bộ gen Các thí nghiệm invitro và invivo đã chứng minh rằng chủng nảy

có thể kiểm soát một số mầm bệnh trên cà chua, khoai tây, khoai sọ và đâu tây Các chấtchuyên hóa dé bay hơi và không bay hơi do chủng này tạo ra được biết là có ảnh hưởngxấu đến các mam bệnh được thử nghiệm FG106 cho thay sự đối kháng rõ ràng vớiAlternaria alternata, Botrytis cinerea, Cllavibacter michiganensis subsp Michiganensi.

13

FG106 tạo ra protease và lipase đồng thời tạo ra khả năng hòa tan phosphat cao, tao rasiderophore, amoniac, indole - 3 - acetic acid (IAA) và hydro xyanua (HCN) đồng thờihình thành mang sinh học giúp thúc day sự phát triển của thực vật và tạo điều kiện kiểmsoát sinh học Những kết quả này cho thấy chủng vi khuẩn này cung cấp khả năng bảo

vệ tốt, chống lại mầm bệnh của một số cây trồng, quan trọng trong nông nghiệp thôngqua các phương thức hoạt động trực tiếp và gián tiếp và do đó có thé là một tác nhânkiểm soát sinh học có gia trị (Farideh Ghadamgahi va ctv, 2022)

Một nghiên cứu trên cây ca chua của Maria Micaela Pérez - Rodriguez va ctv(2022), cho thay Enterobacter 6481 va Pseudomonas 42P4 là những ching khang manhiệu qua nhất Cả hai chủng đều được phân loại là kháng mặn (NaCl) trung bình và duy

trì các hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật của chúng, chang han nhu cé dinh dam

và hòa tan phosphat, ngay cả khi nồng độ muối cao Pseudomonas stutzeri ISE12 kíchthích tăng trưởng và giảm thiểu áp lực do nhiễm mặn đối với lúa mạch Tăng cườngkiểm soát sinh học cho cây trồng với các chủng vi khuẩn chịu mặn có thé làm giảm căngthang do mặn và thúc đây sự phát triển của cây trồng (Sonia Szymanska va ctv, 2022)

Qian Li và ctv (2022), đã nghiên cứu tác động của các chủng Pseudomonas CM11

đối với hiệu suất của cây trồng, tập trung vào sự phát triển của rễ và cho thấy chúng có

khả năng thúc đầy tăng trưởng thực vật trong mô hình và các loài cây trồng khác nhau,cải thiện các đặc điểm về thé trạng của cây trồng, như chéi lớn và đâm chồi nhanh hon,năng suất hạt cao hơn Kết quả của nhóm nghiên cứu chỉ ra rằng cấu tạo hệ thống rễ có

thé được thúc day bang cách kích hoạt các vị trí tiền nhánh bên được sơn lót phụ thuộc

PLETHORA 3, 5,7 khi cây CM11, điều này tạo ra tiềm năng lớn dé hiểu rõ hơn về tính

déo của rễ Trong nghiên cứu của R Qesaoui va ctv (2019), các chủng Pseudomonas sp.

phân lập được giúp tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, thúc đây chiều cao cây non, tất cả cácdòng phân lập được đều làm tăng chiều dài cây và mở rộng đường kính thân đồng thờităng số lượng lá cây Chiều dài cây tăng 31,5% và đường kính thân tăng 48,57 % và số

lá tăng 83,33 % so với đối chứng

Ảnh hưởng của bộ kiểm soát sinh học (Pseudomonas fluorescens) đối với cân bằng

dinh dưỡng và chất lượng năng suất của dưa (Cucumis melo L.) đã được đánh giá trong

điều kiện đồng ruộng trong nghiên cứu của Joaquin Ignacio Martinez và ctv (2019) Ứngdụng Pseudomonas fluorescens thúc day đáng ké khả năng hòa tan của muối (416 và

1128 uS em”), nồng độ Cu khả dụng (3,8 và 4,3 mg kg”), P khả dụng (104 và 123 mg

14

kg’!) và sinh khối vi khuân C (56 và 93 mg C kg”) tương ứng cho các lô đối chứng và

xử lý Ngoài ra, ứng dụng kiểm soát sinh học không làm tăng đáng kế hàm lượng Nitơtổng trong đất và nồng độ Na, Mg và K trao đổi Pseudomonas fluorescens cũng thúc

đây quá trình hấp thụ Mn, N, Zn và P, gây ra sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng, hạn

chế sự hấp thụ Cu, Na, Ca và K của dưa Hoạt tính B - glucosidase cũng có tác dụng giảiphóng Fe, Zn, Cu, Mn, P và N trong đất Cuối cùng, ứng dụng Pseudomonas fluorescenslàm tăng kích thước va trọng lượng quả (lần lượt là 3,0 kg đến 3,8 kg và 3,3 kg đến 4,3

kg đối với phương pháp xử lý và kiểm soát sinh học); do đó, bón phân sinh học với vikhuẩn này là một giải pháp thay thế bền vững giúp tăng năng suất, chất lượng trái cây

mà không lạm dụng phân bón hóa học và thuốc trừ sâu

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện từ tháng 3/2023 đến tháng 9/2023

Địa điểm thực hiện: phòng Vi sinh Ung dung Ribe 208 - Viện Nghiên cứu Công

nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

STT "âu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ

1 1 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tỉnh Bến Tre An a ; ` as

2 2 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tinh Bến Tre 1 cp ; » ng

3 3 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre crs eons

4 4 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tinh Bến Tre mà

5 5 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre TT Tran

6 Š Tin Phd, Ht Chan Thành Tih Bes Te a

7 T Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre lọ a ¥ S28 ge

8 8 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tinh Bến Tre =< = + aes

9 9 Xã Tân Phú, Huyện Chau Thanh, Tinh Bến Tre ee

10 10 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Ay he sheet

106°18'76.2”E

Mẫu được thu trên đất canh tác nông nghiệp ở các huyện thuộc tỉnh Bến Tre, độ

sâu 0 - 30 cm, thu mẫu ngẫu nhiên theo quy tắc đường chéo, 5 mẫu trên 500 m? trộn lạithành 1 mẫu đại diện, cho vào lọ nhựa sạch, ghi rõ thời gian, địa điểm

16

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn

Phương pháp phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp

Mẫu đất sau khi được thu nhận tiến hành đo EC và pH đề xác định được nồng độcác ion có trong đất cũng như độ pH đất

Cân 10 g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước đã được hap khử trùng, tốc

độ lắc 120 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, dé yên 3 phút Tiến hành pha loãng đến các

nồng độ 103, 101, 10° bằng cách hút 1 mL dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mLnước cất vô trùng, ta được độ pha loãng 107, sau đó tiếp tục pha loãng đến nồng độmong muốn Tiến hành hút 0,1 mL dung dich ở các nồng độ 103, 10, 105 sang đĩa petrichứa môi trường King B agar bao gồm: protease peptone 20 g, KzHPO¿ 1,5 g,MgSO¿.7H2O 1,5 g, glycerol 10 mL, agar 20 g, nước cat vừa đủ 1 lit, đã hấp khử trùng

ở 121 °C/20 phút, bổ sung 1 % NaCl và trang đều đến khi khô, úp ngược đĩa dé ủ

Sau 24 giờ nuôi cấy, quan sát các khuẩn lạc phát huỳnh quang khi chiếu UV bướcsóng 366 nm, ghi nhận các khuân lạc nghi ngờ có hình thái khác nhau, sau đó tiến hànhcay ria lam thuần trên môi trường King B agar, quá trình này được thực hiện lặp lạinhiều lần cho đến khi trên đĩa chỉ còn các khuẩn lạc đơn đồng nhất về hình dạng, màusắc, tính chất (Chu Nguyên Thanh và ctv, 2020)

Phương pháp giữ giống vi khuẩn Pseudomonas spp

Cay truyền giữ giống trong ống thạch nghiêng và glycerol dé bảo quản giống được

lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống

Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn nghi ngờ đã làmthuần sẽ được cấy trên bề mặt thạch nghiêng của môi trường King B trong ống nghiệm.Sau 24 giờ, khuẩn lạc mọc lên sẽ được giữ ở 4°C và cay truyền hàng tháng

Giữ trong eppendorf chứa dung dich glycerol 20 % có bồ sung 1 % peptone và giữđông ở nhiệt độ -20 °C Giữ giống theo cách này sẽ giữ được lâu hơn và khuẩn cần đượchoạt hóa trước khi nhân giống

Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý

Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: đo kích thước, mô tả hình thái khuẩn lạc bao gồm các

chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dang bìa khuan lạc, hình dạng tế bảo

Mô tả một số đặc điểm tế bào:

17

Nhuộm Gram: mục đích cho phép quan sát hình thái, kích thước tế bào, kiểm tra

được vi khuẩn thuộc gram âm hay gram dương

Các bước thực hiện: chuẩn bị lam sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam

kính, đùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối khuẩn lạc phết vào giọt nước và hơ nhẹqua ngọn lửa đèn cồn đến khi khô dé cố định mẫu Nhỏ một đến hai giọt crystal violetlên mẫu chờ 1 phút, rửa mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ Tiếp tục phủ lugol trong 1 phút,rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Nhỏ cồn 90° lên lam, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồnchảy khắp bề mặt lam, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ và lặp lại cho đến khi vừa phai hếtmau tím trên lam kính Nhỏ 1 - 2 giọt safranine, đề yên trong 30 giây, rửa đưới vòi nướcchảy nhẹ Tham khô lam kính giữa 2 lớp giấy thấm, quan sát bang vật kính dầu (100X)

và ghi nhận kết quả

Kết quả: mẫu có màu tim là gram dương (+), màu hồng đỏ là gram âm (-) và xácđịnh được hình dạng tế bào vi khuẩn

Phản ứng catalase: mục đích đề phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme catalase

Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B agar trong 24 giờ Nhỏ 1 - 2 giọtthuốc thử H›Os 3 % lên lam kính sạch, sau đó dùng que cấy lay một khuẩn lạc đưa vàogiọt thuốc thử, quan sát hiện tượng Phản ứng dương tính (+) sẽ tạo ra bọt khí, ngược lạiphản ứng âm tính (-) sẽ không tạo bọt khí (Jame G.C).

Phan ứng oxydase: mục đích dé xác định sự có mặt của enzyme cytocrom oxydasecủa vi khuan Day là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyền electron đến oxy phân tử tạothành nước trong chuỗi hô hấp

Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra phết lên đĩa giấy có tâm dung dịchthuốc thử phản ứng oxydase Phản ứng dương tính khi đĩa giấy xuất hiện màu tím đen.3.2.2.2 Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn đã thuần được nuôi cấy tăng sinh trong 50 mL môi trườngKing B lỏng, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, tiễn hành đo OD

bước sóng 600 nm (mật độ tế bào khoảng 108 CFU/mL) hút 1 mL dich khuẩn có cùng

mật độ cho vào bình tăng sinh chứa 50 mL môi trường King B có bồ sung NaCl ở cácnồng độ khác nhau từ 3 - 4 - 5 - 6 — 7 %, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ, ở nhiệt

độ phòng Sau đó, hút 1 mL dịch khuẩn từ bình tăng sinh cấp 2 cho vào các ống nghiệmchứa 9 mL nước cất vô trùng, pha loãng thành các nồng độ thích hợp, cấy trải 0,1 mLdịch pha loãng ở các nồng độ muối lên môi trường thạch King B, mỗi nồng độ lặp lại 3

18

lần Sau 24 giờ tiến hành đếm số lượng khuan lạc trên từng đĩa, ghi nhận kết qua và tínhmật độ theo công thức:

N

ni.V]I.fi + na.V2 + + n¡.Vi.ñ

A (CFU/g hay CFU/mL) =

trong do:

A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 0,1 g hay 0,1 mL mẫuCFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc riêng rẽ)

N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dich mẫu (mL) cay vào trong mỗi dia

fi: độ pha loãng tương ứng của dịch được nuôi cấy

3.2.2.3.Khảo sát khả năng sinh tổng hop IAA bằng phương pháp Salkowski

(Glickmann và Dessaux, 1995) Khảo sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của cácdòng vi khuẩn trên cây đậu xanh

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng có khả năng chịu mặn caobằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995)

Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao được nuôicấy trong 50 mL môi trường King B trên máy lắc với tốc độ lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt

độ phòng trong 24 giờ Sau đó, hút 1 mL dịch tăng sinh vào bình chứa 100 mL môitrường King B có bé sung 1 g/L tryptophan (tiền chất tổng hop IAA) lỏng, tốc độ lắc

120 vòng/phút, trong môi trường tối hoàn toan Thực hiện ly tâm dịch nuôi cấy ở ngày

2, ngày 3, ngày 4, ngày 5 và ngày 6 sau khi tăng sinh và thu dịch trong Tiến hành kiểmtra khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn bằng cách hút 2 mL dịch trong, thêm vào

đó 8 mL thuốc thử Salkowski cải tiến (2 % FeCl; 0,5M và HCIO¿ 35 %), lặp lại 3 lầnđối với mỗi dòng vi khuẩn Với mẫu đối chứng là 2 mL môi trường tăng sinh không có

dịch khuẩn và 8 mL thuốc thử Salkowski cải tiến

Sau 25 phút ủ, vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ xuất hiện màu hồng vớithuốc thử Tiến hành so mau trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm, kết quả đượcthay vào phương trình đồ thị đường chuẩn với chất chuẩn là IAA, từ đó suy ra đượcnồng độ IAA sinh ra bởi các chủng vi khuẩn tương ứng

Dựng đường chuẩn:

19

Cân chính xác 10 mg IAA, cho vào bình định mức dung tích 10 mL, thêm nướccất đến vạch định mức và trộn đều Dung dịch thu được là dung dịch chuẩn gốc IAA(IAA stock), có nồng độ 1000 ug/mL Chuan bị 10 bình định mức dung tích 10 mL,

đánh số thứ tự từ 1 đến 10 Dùng pipet lần lượt hút các thể tích như Bảng 3.2, thêm nước

cất đến vạch định mức và lắc đều

Bảng 3.2 Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc

Thể tích dung dich IAA stock (1000 ng/mL) Nông độ dung dich chuẩn

50, 60, 70, 80, 90 ng/mL cho vào các bình Thêm thuốc thử Salkowski cải tiến đã chuẩn

bị đến vạch định mức va lắc đều U hỗn hợp trên trong tối khoảng 25 phút dé phản ứngxảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành đo độ hap thu quang phố (OD) ở bước sóng 530 nm.Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biéu diễn tương quan giữagiá trị OD và nồng độ dung địch chuẩn IAA (TCVN 10784:2015)

Khao sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của các dòng vi khuẩn trên cây đậu xanh.Sau khi đã chọn được các chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA tốt, tiến hànhkiểm tra khả năng kích thích nảy mầm của các dòng vi khuẩn lên đậu xanh

Vi khuẩn được nuôi cấy trong 50 mL môi trường King B, sau 48 giờ thu sinh khốibang cách chuyển dịch nuôi cay vào ông Falcon 12 mL, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5

phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần Tiếp tục

cho thêm 10 mL nước khử khoáng vô trùng, tiến hành ly tâm loại bỏ phan dich nỗi, thusinh khối vi khuẩn bên dưới, lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo loại bỏ hoàn toan môi

20

trường nuôi cấy Sau đó, tiến hành hiệu chỉnh dung dịch vi khuân về OD 600 = 0,1 bằngnước khử khoáng vô trùng (Lê Thị Xã và ctv, 2020).

Hạt giống sản xuất từ Công Ty TNHH Sản Xuất Thương Mại Dịch Vụ Việt Thiên,

đồng đều về kích thước và độ no của hạt được khử trùng bề mặt bằng ethanol 95 % trong

30 giây và ngâm trong javen 20 % trong 5 phút Tiếp theo, hạt giống sẽ được rửa lại 5lần bằng nước cất vô trùng Các hạt sau khử trùng được mang đi ngâm với dịch huyềnphù trong 10 phút, làm khô và gieo trên thạch mềm agar 0,5 % Nghiệm thức đối chứng

được thực hiện tương tự nhưng hạt đậu xanh chỉ ngâm với nước cất vô trùng thay cho

dịch huyền phù vi khuẩn Quan sát sự nảy mầm và đo kích thước rễ liên tục sau 3 ngày(Tạ Ngọc Ly và ctv, 2015).

3.2.2.4 Khảo sát khả năng cố định đạm bằng phương pháp chưng cat

Các chủng vi khuan được nuôi cấy tăng sinh trong 350 mL môi trường dich théAshby vô đạm bao gồm: mannitol 20 g/L, KzHPO¿ 0,2 g/L, MgSO¿.7H›O 0,2 g/L, NaCl0,2 g/L, KaSO¿ 0,01 g/L, CaCO; 5 g/L, trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút Chungcất bang máy cất dam, mã thiết bi: T.09, model: K350, 1000187846

Định lượng lượng amoni sinh ra bang phương pháp chung cất và chuẩn độ ở 2, 4

và 6 ngày nuôi cấy

Nguyên lý: đây muối amoni ra thể tự do bằng một chất kiềm mạnh hơn amoniac

nhưng không quá mạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3) Dùng hơi nước kéo amoniac đã

được giải phóng ra thé tự do sang bình chuẩn độ và định lượng bằng HCl 0,02 N với

acid boric lam chỉ thị màu.

Lay 25 - 30 mL dung dich acid boric vào bình hứng (bình tam giác) của máy chưngcất Cần để đầu mút của ống chảy ra từ ống sinh hàn ngập trong dung dich acid boric.Lay mau thử vào bình cất Tiếp theo thêm khoảng 0,25 + 0,05 g magie oxit vào bình cat

và lắp bình ngay vào máy Dun nóng bình cất, NH: giải phóng ra khiến dung dịch hấp

thụ chuyền dần thành màu xanh, sau 5 phút thu được khoảng 200 - 250 mL dịch ở bìnhhứng Dừng quá trình cất và tiến hành chuẩn độ

Chuan độ: chuẩn độ dung dich trong bình hứng bằng HCI 0,02 N đến khi vừa xuấthiện màu hồng thì ngưng Ghi nhận thé tích HCI đã dùng (theo phòng Thử nghiệm Môi

trường, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm

Thành Phó Hồ Chí Minh)

Lap lại tương tự đối với mẫu trang là môi trường không bổ sung dịch khuẩn

21

Thé hiện kết quả: Nồng độ amoni tính theo nito, CN, tính bằng mg/L, được tínhtheo công thức:

( VI - V2) x Nồng độ HCI x 14 x 1000 CN= Vv

trong do:

V: thé tích của mẫu thử (mL)

VI: thé tích của HCl tiêu tốn trong chuẩn độ mẫu (mL)

V2: thé tích của HCI tiêu tốn trong chuẩn độ mẫu trắng, được mặc định là 0,3 (mL)Nồng độ HCI: 0,02 (mol/L)

14: khối lượng của nguyên tử nitơ

3.2.2.5 Định danh bằng sinh học phân tử

Các chủng vi khuẩn có sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao, khả năng sinh IAA tốt

và kích thích tăng trưởng đối với cây đậu xanh, được cấy thuần và nuôi cấy tăng sinh

Hút dịch tăng sinh của chủng vào ống eppendorf, ly tâm 10000 rpm trong 15 phút

Đồ bỏ dịch nổi, tiếp tục thêm dịch tang sinh còn lại vao ống cũ và ly tâm cho đến khihết 10 ml dich tăng sinh hoặc khối lượng tế bào khoảng 0.2 g

Sau khi lượng tế bao đạt yêu cầu thì cho vào ống eppendorf 1000 ul dung dichCTAB- hóa chat có tác dụng phá vỡ màng tế bao, vortex dé hòa tan tế bao U ống trong

bề điều nhiệt 60°C trong 1 giờ Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút Nhẹ nhàng hút 800 uldịch nổi sang ống eppendorf mới

Thêm phenol: chloroform: isoamylalcolhol (25:24:1) vào ống mới chứa dichndi,vortex và dé 6n định trong ngăn lạnh đông của tủ lạnh 2 phút.Sau ly tâm, hỗn hợptách thành 3 lớp, hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới

Thêm isopropanol với tỉ lệ 1:1 v/v mẫu ở 80°C trong 30 phút Ly tâm lạnh 14000

rpm trong 15 phút, bỏ dịch thu tủa trang đục Rửa tủa bang 1000 pl ethanol 70 %, lytâm Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ởtrong buồng cấy DNA tổng số đơjợc hòa trong 50 pl đệm TE và bao quản mẫu ở 4°Ccho các thí nghiệm tiếp theo Kết quả tách chiết DNA bộ gen trên gel được phát hiện

bằng hộp đèn UV Thực hiện phản ứng PCR với các thành phan: 2,5 pl đệm PCR; 0,5

ul DNA tổng số; 0,5 wl dNTPs; 1 wl mỗi loại mỗi và 0,2 ul Taq polymerase Sử dụngcặp môi tổng 27F và 1492R có trình tự

27F: 5° AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’;

22

1492R: 5“ GGTTACCTTGTTACGACTT 3' (Lane D.J., 1991)

Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với 27F/1492R

Tiền biến tính : 90 °C trong 5 phút

Quá trình khuếch đại : 94 °C trong 1 phút

56 °C trong 30 giây

72 °C trong | phút

Số chu kỳ :4

Hậu kéo dài : 72 °C trong 10 phút

Sau đó sản phẩm PCR được gửi ổi giải trình tự gen 16S rRNA tại Viện Sinh họcPhân tử Loci So sánh tương quan di truyền với các đòng vi khuẩn trên cơ sở dit liệuNCBI bằng chương trình BLASTN

3.3 Xử lý số liệu

Số liệu của các nội dung được phân tích ANOVA 1 yếu tố và dé thị dang IntervalPlots được vẽ bằng phần mềm Minitab 16 Vẽ cây phát sinh chủng loại từ trình tự genbằng phần mềm MEGA 11

23

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas spp từ đất nhiễm mặn

Mau dat sau khi được thu nhận và đo các chỉ tiêu như EC, pH dé xác định độ dẫnđiện và độ mặn dat bằng máy do EC Kết qua được trình bay ở Bang 4.1:

Bảng 4.1 Kết quả đo chỉ tiêu mẫu đất

EC là độ dẫn điện của dat, có don vị do là dS/m (1 dS/m = 0,64 %o).

Dựa vào Bảng 4.1 có thể thấy hầu hết các mẫu đất thu thập được đều nhiễm mặn

từ thấp đến trung bình (EC từ 2 - 4 dS/m là loại đất mặn ít, từ 4 - 8 dS/m đất thuộc loạimặn trung bình và ảnh hưởng đến năng suất của nhiều loại cây trồng)

Tiến hành pha loãng đến nồng độ 103, 1074, 10°, hút 0,1 mL ở mỗi nồng độ phânlập trên môi trường King B, thí nghiệm được lặp lại 3 lần Đây là môi trường tiềm năng

dé nhận điện các loài Pseudomonas huỳnh quang, làm xuất hiện sắc tố màu xanh lục khi

chiếu dưới đèn UV bước sóng 366 nm Sau 24 giờ, kết quả chọn lọc được 10 chủng có

khả năng phát huỳnh quang, tiếp tục cấy truyền nhiều lần đến khi các khuẩn lạc đồng

nhất về hình dang, màu sắc, tính chất Tiến hành xác định các đặc điểm về hình thai,sinh lý Sau khi 10 chủng vi khuẩn trên đã được làm thuần, tiến hành khảo sát khả năngchịu mặn của từng chủng ở các nồng độ muối khác nhau sau 24 giờ nuôi cấy

Mau sắc khuẩn lạc: từ 10 chủng phân lập được tiến hành cấy truyền trên môitrường King B cho đến khi đồng nhất về khả năng phát huỳnh quang cũng như hình thái

và kích thước Kết quả ghi nhận được 6/10 chủng có màu xanh lá chiếm 60 %, 1/10

chủng có màu xanh lá mạ chiếm 10 %, 1/10 chủng có màu trắng ngà chiếm 10 %, 2/10chủng có màu trắng đục chiếm 20 %

24

Hình 4.1 Hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường KB Các khuẩn

lạc được khoanh tròn là các khuân lạc điên hình phát quang dưới đèn UV.

b)

Hình dạng và kích thước khuẩn lac: hầu hết các chủng phân lập được có hình trònhoặc ovan, bìa nồi trơn hoặc bìa răng cưa, bề mặt san nhay hoặc nhan bóng Khuẩn lạc

to, kích thước trong khoảng từ 3 - 8 mm Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc của của

10 chủng phân lập được, nhận thấy khuan lạc của chúng có dang tròn, nhăn, phang det,

có tâm ở giữa như A2, A3, A4 và A5 Một số dang nhay, lồi, bìa răng cưa, có tâm hoặckhông có tâm như Al và A7 Da số đều sinh sắc tổ màu xanh lá có thé nhìn thấy rõ bằngmắt thường ngoại trừ A8, A9 và A10 Kết quả nay phù hợp với nghiên cứu của Lê VũKhanh Trang và Lý Hải Triều (2020), đã phân lập được các chủng Pseudomonas có màu

xanh nhạt đến xanh lá, trắng ngã vàng hoặc trắng duc, dạng tròn, bia rang cưa hoặc tròn,

san nhay, có tâm hoặc không

Bang 4.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập được

Ky bigu Mausắc Hinh thai a

chung thước

AI Xanh lục Tròn, bìa răng cưa, to san nhây, không cótâm 5mm

A2 Xanh lục Tròn, to sẵn nhay, có tâm 7mm A3 Xanh lá mạ Tròn, to san nhay, co tam 6mm

A4 Xanh lục Tròn, to san nhay, có tâm khô 8 mm

AS Xanh lục Tròn, to san nhay có tâm 4mm

A6 Xanh lục Tròn, bìa răng cưa, to, sân, nhay, có tâm 5mm A7 Xanh lục Ovan, bìa răng cưa, to sẵn nhay có tâm 6mm

A8 Trắng đục Ovan, trơn nhan bong, viên nôi, có tâm 4mmA9 Trắng đục Tròn trơn nhẫn viên nồi, không tâm 3 mm

AI0 er “al Tron, bia rang cua, san nhay, co tam 4mm

25

Nhuộm gram: tất cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được nhuộm gram và quan sát

é SF ớ

GÀ» d)

Hình 4.3 Hình thái tế bào một số chủng vi khuẩn dưới kính

hiên vi phòng đại 100X (a) Chung A1; (b) Chung A4; (c) Ching

AT: [B) Chững AB.

26

Catalase: kết quả test catalase cho thay 10/10 chủng đều xuất hiện bọt khí, chiếm

Bảng 4.3 Kết quả xác định hình thái, sinh lý của các chủng phân lập

Ký hiệu chủng Gram Catalase test Oxidase test Hình dạng tê bào

AI Gram âm + + Hình que ngắnA2 Gram âm + + Hình que dài

A3 Gram âm SE + Hình que vừa

A4 Gram âm + + Hinh que daiA5 Gram âm + + Hình que ngắnA6 Gram âm + + Hình que vừa A7 Gram âm + + Hình que vừaA8 Gram âm + + Hình que ngắnA9 Gram âm + + Hình que vừa AI0 Gram âm + + Hình que dài (+) Phản ứng dương tính.

4.2 Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn

Sau khi làm thuần, các chủng vi khuẩn phát huỳnh quang dưới đèn UV được nuôi

cấy tăng sinh cấp 1 trong môi trường KB lỏng lắc dé chúng được phát triển tốt nhất Sau

24 gid, tiên hành tăng sinh cap 2 trên môi trường KB có b6 sung mudi ở các nông độ:2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% Sau 24 gid, thao tác pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp

đề khảo sát mật độ vi sinh vật ở từng nông độ mudi.

Sinh trưởng (Log10 CFU/mL)