3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện từ tháng 3/2023 đến tháng 9/2023.
Địa điểm thực hiện: phòng Vi sinh Ung dung Ribe 208 - Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ 10 mẫu đất thu nhận tai các xã thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Vị trí lấy mẫu cụ thé được thé hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Địa điểm lẫy mẫu
Ký hiệu
STT "âu Địa điểm lấy mẫu Tọa độ
1 1 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tỉnh Bến Tre An a ; ` as 2 2 Xó Tõn Phỳ, Huyện Chõu Thanh, Tinh Bến Tre 1 cp ; ằ ng 3 3 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre crs eons 4 4 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tinh Bến Tre mà . 5 5 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre TT Tran 6 Š Tin Phd, Ht Chan Thành Tih Bes Te a 7 T Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre lọ a ¥ S28 ge 8 8 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thanh, Tinh Bến Tre =< = + aes 9 9 Xã Tân Phú, Huyện Chau Thanh, Tinh Bến Tre ee . 10 10 Xã Tân Phú, Huyện Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Ay he sheet
106°18'76.2”E
Mẫu được thu trên đất canh tác nông nghiệp ở các huyện thuộc tỉnh Bến Tre, độ sâu 0 - 30 cm, thu mẫu ngẫu nhiên theo quy tắc đường chéo, 5 mẫu trên 500 m? trộn lại thành 1 mẫu đại diện, cho vào lọ nhựa sạch, ghi rõ thời gian, địa điểm.
16
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. từ đất nhiễm mặn Phương pháp phân lập vi khuẩn Pseudomonas spp.
Mẫu đất sau khi được thu nhận tiến hành đo EC và pH đề xác định được nồng độ các ion có trong đất cũng như độ pH đất.
Cân 10 g mẫu cho vào bình tam giác chứa 90 mL nước đã được hap khử trùng, tốc độ lắc 120 vòng/phút, thời gian lắc 30 phút, dé yên 3 phút. Tiến hành pha loãng đến các nồng độ 103, 101, 10° bằng cách hút 1 mL dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất vô trùng, ta được độ pha loãng 107, sau đó tiếp tục pha loãng đến nồng độ mong muốn. Tiến hành hút 0,1 mL dung dich ở các nồng độ 103, 10, 105 sang đĩa petri chứa môi trường King B agar bao gồm: protease peptone 20 g, KzHPO¿ 1,5 g, MgSO¿.7H2O 1,5 g, glycerol 10 mL, agar 20 g, nước cat vừa đủ 1 lit, đã hấp khử trùng ở 121 °C/20 phút, bổ sung 1 % NaCl và trang đều đến khi khô, úp ngược đĩa dé ủ.
Sau 24 giờ nuôi cấy, quan sát các khuẩn lạc phát huỳnh quang khi chiếu UV bước sóng 366 nm, ghi nhận các khuân lạc nghi ngờ có hình thái khác nhau, sau đó tiến hành cay ria lam thuần trên môi trường King B agar, quá trình này được thực hiện lặp lại nhiều lần cho đến khi trên đĩa chỉ còn các khuẩn lạc đơn đồng nhất về hình dạng, màu sắc, tính chất (Chu Nguyên Thanh và ctv, 2020).
Phương pháp giữ giống vi khuẩn Pseudomonas spp.
Cay truyền giữ giống trong ống thạch nghiêng và glycerol dé bảo quản giống được lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống.
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn nghi ngờ đã làm thuần sẽ được cấy trên bề mặt thạch nghiêng của môi trường King B trong ống nghiệm.
Sau 24 giờ, khuẩn lạc mọc lên sẽ được giữ ở 4°C và cay truyền hàng tháng.
Giữ trong eppendorf chứa dung dich glycerol 20 % có bồ sung 1 % peptone và giữ đông ở nhiệt độ -20 °C. Giữ giống theo cách này sẽ giữ được lâu hơn và khuẩn cần được hoạt hóa trước khi nhân giống.
Xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: đo kích thước, mô tả hình thái khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi, dang bìa khuan lạc, hình dạng tế bảo.
Mô tả một số đặc điểm tế bào:
17
Nhuộm Gram: mục đích cho phép quan sát hình thái, kích thước tế bào, kiểm tra được vi khuẩn thuộc gram âm hay gram dương.
Các bước thực hiện: chuẩn bị lam sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam kính, đùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối khuẩn lạc phết vào giọt nước và hơ nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn đến khi khô dé cố định mẫu. Nhỏ một đến hai giọt crystal violet lên mẫu chờ 1 phút, rửa mẫu dưới vòi nước chảy nhẹ. Tiếp tục phủ lugol trong 1 phút, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Nhỏ cồn 90° lên lam, nghiêng đi nghiêng lại để cho cồn chảy khắp bề mặt lam, rửa dưới vòi nước chảy nhẹ và lặp lại cho đến khi vừa phai hết mau tím trên lam kính. Nhỏ 1 - 2 giọt safranine, đề yên trong 30 giây, rửa đưới vòi nước chảy nhẹ. Tham khô lam kính giữa 2 lớp giấy thấm, quan sát bang vật kính dầu (100X) và ghi nhận kết quả.
Kết quả: mẫu có màu tim là gram dương (+), màu hồng đỏ là gram âm (-) và xác định được hình dạng tế bào vi khuẩn.
Phản ứng catalase: mục đích đề phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme catalase.
Vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường King B agar trong 24 giờ. Nhỏ 1 - 2 giọt thuốc thử H›Os 3 % lên lam kính sạch, sau đó dùng que cấy lay một khuẩn lạc đưa vào giọt thuốc thử, quan sát hiện tượng. Phản ứng dương tính (+) sẽ tạo ra bọt khí, ngược lại
phản ứng âm tính (-) sẽ không tạo bọt khí (Jame G.C).
Phan ứng oxydase: mục đích dé xác định sự có mặt của enzyme cytocrom oxydase của vi khuan. Day là nhóm enzyme cuối cùng vận chuyền electron đến oxy phân tử tạo thành nước trong chuỗi hô hấp.
Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra phết lên đĩa giấy có tâm dung dịch thuốc thử phản ứng oxydase. Phản ứng dương tính khi đĩa giấy xuất hiện màu tím đen.
3.2.2.2. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn đã thuần được nuôi cấy tăng sinh trong 50 mL môi trường King B lỏng, tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ, tiễn hành đo OD bước sóng 600 nm (mật độ tế bào khoảng 108 CFU/mL) hút 1 mL dich khuẩn có cùng mật độ cho vào bình tăng sinh chứa 50 mL môi trường King B có bồ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau từ 3 - 4 - 5 - 6 — 7 %, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, hút 1 mL dịch khuẩn từ bình tăng sinh cấp 2 cho vào các ống nghiệm chứa 9 mL nước cất vô trùng, pha loãng thành các nồng độ thích hợp, cấy trải 0,1 mL dịch pha loãng ở các nồng độ muối lên môi trường thạch King B, mỗi nồng độ lặp lại 3
18
lần. Sau 24 giờ tiến hành đếm số lượng khuan lạc trên từng đĩa, ghi nhận kết qua và tính
mật độ theo công thức:
N
ni.V]I.fi + na.V2. +... + nĂ.Vi.ủ A (CFU/g hay CFU/mL) =
trong do:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 0,1 g hay 0,1 mL mẫu CFU: Colony Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc riêng rẽ)
N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dich mẫu (mL) cay vào trong mỗi dia fi: độ pha loãng tương ứng của dịch được nuôi cấy.
3.2.2.3.Khảo sát khả năng sinh tổng hop IAA bằng phương pháp Salkowski
(Glickmann và Dessaux, 1995). Khảo sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của các
dòng vi khuẩn trên cây đậu xanh
Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của các chủng có khả năng chịu mặn cao bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995).
Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao được nuôi cấy trong 50 mL môi trường King B trên máy lắc với tốc độ lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, hút 1 mL dịch tăng sinh vào bình chứa 100 mL môi
trường King B có bé sung 1 g/L tryptophan (tiền chất tổng hop IAA) lỏng, tốc độ lắc 120 vòng/phút, trong môi trường tối hoàn toan. Thực hiện ly tâm dịch nuôi cấy ở ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5 và ngày 6 sau khi tăng sinh và thu dịch trong. Tiến hành kiểm tra khả năng sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn bằng cách hút 2 mL dịch trong, thêm vào đó 8 mL thuốc thử Salkowski cải tiến (2 % FeCl; 0,5M và HCIO¿ 35 %), lặp lại 3 lần đối với mỗi dòng vi khuẩn. Với mẫu đối chứng là 2 mL môi trường tăng sinh không có dịch khuẩn và 8 mL thuốc thử Salkowski cải tiến.
Sau 25 phút ủ, vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp IAA sẽ xuất hiện màu hồng với thuốc thử. Tiến hành so mau trên máy quang phổ ở bước sóng 530 nm, kết quả được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn với chất chuẩn là IAA, từ đó suy ra được nồng độ IAA sinh ra bởi các chủng vi khuẩn tương ứng.
Dựng đường chuẩn:
19
Cân chính xác 10 mg IAA, cho vào bình định mức dung tích 10 mL, thêm nước
cất đến vạch định mức và trộn đều. Dung dịch thu được là dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock), có nồng độ 1000 ug/mL. Chuan bị 10 bình định mức dung tích 10 mL, đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Dùng pipet lần lượt hút các thể tích như Bảng 3.2, thêm nước cất đến vạch định mức và lắc đều.
Bảng 3.2. Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc
Thể tích dung dich IAA stock (1000 ng/mL) Nông độ dung dich chuẩn
BIT (mL) IAA (g/mL)
1 0,0 00,0 2 0,1 10,0 3 0,2 20,0 4 0,3 30,0 5 0,4 40,0 6 0,5 50,0 7 0,6 60,0 8 0,7 70,0 9 0,8 80,0 10 0,9 90,0
Chuẩn bị thêm 10 bình định mức dung tích 10 mL, đánh số thứ tự từ 1 đến 10, dùng pipet hút 2 mL dung dich chuẩn IAA (IAA stock) ở các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ng/mL cho vào các bình. Thêm thuốc thử Salkowski cải tiến đã chuẩn bị đến vạch định mức va lắc đều. U hỗn hợp trên trong tối khoảng 25 phút dé phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó tiến hành đo độ hap thu quang phố (OD) ở bước sóng 530 nm.
Lập đồ thị đường chuẩn (hoặc phương trình tương đương) biéu diễn tương quan giữa giá trị OD và nồng độ dung địch chuẩn IAA (TCVN 10784:2015).
Khao sát hiệu quả kích thích tăng trưởng của các dòng vi khuẩn trên cây đậu xanh.
Sau khi đã chọn được các chủng có khả năng sinh tổng hợp IAA tốt, tiến hành kiểm tra khả năng kích thích nảy mầm của các dòng vi khuẩn lên đậu xanh.
Vi khuẩn được nuôi cấy trong 50 mL môi trường King B, sau 48 giờ thu sinh khối bang cách chuyển dịch nuôi cay vào ông Falcon 12 mL, ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần. Tiếp tục cho thêm 10 mL nước khử khoáng vô trùng, tiến hành ly tâm loại bỏ phan dich nỗi, thu sinh khối vi khuẩn bên dưới, lặp lại ít nhất 3 lần để đảm bảo loại bỏ hoàn toan môi
20
trường nuôi cấy. Sau đó, tiến hành hiệu chỉnh dung dịch vi khuân về OD 600 = 0,1 bằng
nước khử khoáng vô trùng (Lê Thị Xã và ctv, 2020).
Hạt giống sản xuất từ Công Ty TNHH Sản Xuất Thương Mại Dịch Vụ Việt Thiên,
đồng đều về kích thước và độ no của hạt được khử trùng bề mặt bằng ethanol 95 % trong
30 giây và ngâm trong javen 20 % trong 5 phút. Tiếp theo, hạt giống sẽ được rửa lại 5 lần bằng nước cất vô trùng. Các hạt sau khử trùng được mang đi ngâm với dịch huyền phù trong 10 phút, làm khô và gieo trên thạch mềm agar 0,5 %. Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng hạt đậu xanh chỉ ngâm với nước cất vô trùng thay cho dịch huyền phù vi khuẩn. Quan sát sự nảy mầm và đo kích thước rễ liên tục sau 3 ngày
(Tạ Ngọc Ly và ctv, 2015).
3.2.2.4. Khảo sát khả năng cố định đạm bằng phương pháp chưng cat
Các chủng vi khuan được nuôi cấy tăng sinh trong 350 mL môi trường dich thé Ashby vô đạm bao gồm: mannitol 20 g/L, KzHPO¿ 0,2 g/L, MgSO¿.7H›O 0,2 g/L, NaCl 0,2 g/L, KaSO¿ 0,01 g/L, CaCO; 5 g/L, trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Chung cất bang máy cất dam, mã thiết bi: T.09, model: K350, 1000187846.
Định lượng lượng amoni sinh ra bang phương pháp chung cất và chuẩn độ ở 2, 4 và 6 ngày nuôi cấy.
Nguyên lý: đây muối amoni ra thể tự do bằng một chất kiềm mạnh hơn amoniac
nhưng không quá mạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3). Dùng hơi nước kéo amoniac đã
được giải phóng ra thé tự do sang bình chuẩn độ và định lượng bằng HCl 0,02 N với
acid boric lam chỉ thị màu.
Lay 25 - 30 mL dung dich acid boric vào bình hứng (bình tam giác) của máy chưng cất. Cần để đầu mút của ống chảy ra từ ống sinh hàn ngập trong dung dich acid boric.
Lay mau thử vào bình cất. Tiếp theo thêm khoảng 0,25 + 0,05 g magie oxit vào bình cat và lắp bình ngay vào máy. Dun nóng bình cất, NH: giải phóng ra khiến dung dịch hấp thụ chuyền dần thành màu xanh, sau 5 phút thu được khoảng 200 - 250 mL dịch ở bình hứng. Dừng quá trình cất và tiến hành chuẩn độ.
Chuan độ: chuẩn độ dung dich trong bình hứng bằng HCI 0,02 N đến khi vừa xuất hiện màu hồng thì ngưng. Ghi nhận thé tích HCI đã dùng (theo phòng Thử nghiệm Môi
trường, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm
Thành Phó Hồ Chí Minh).
Lap lại tương tự đối với mẫu trang là môi trường không bổ sung dịch khuẩn.
21
Thé hiện kết quả: Nồng độ amoni tính theo nito, CN, tính bằng mg/L, được tính
theo công thức:
( VI - V2) x Nồng độ HCI x 14 x 1000 CN= Vv
trong do:
V: thé tích của mẫu thử (mL)
VI: thé tích của HCl tiêu tốn trong chuẩn độ mẫu (mL)
V2: thé tích của HCI tiêu tốn trong chuẩn độ mẫu trắng, được mặc định là 0,3 (mL) Nồng độ HCI: 0,02 (mol/L)
14: khối lượng của nguyên tử nitơ.
3.2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử
Các chủng vi khuẩn có sinh trưởng tốt ở nồng độ muối cao, khả năng sinh IAA tốt và kích thích tăng trưởng đối với cây đậu xanh, được cấy thuần và nuôi cấy tăng sinh.
Hút dịch tăng sinh của chủng vào ống eppendorf, ly tâm 10000 rpm trong 15 phút.
Đồ bỏ dịch nổi, tiếp tục thêm dịch tang sinh còn lại vao ống cũ và ly tâm cho đến khi hết 10 ml dich tăng sinh hoặc khối lượng tế bào khoảng 0.2 g.
Sau khi lượng tế bao đạt yêu cầu thì cho vào ống eppendorf 1000 ul dung dich CTAB- hóa chat có tác dụng phá vỡ màng tế bao, vortex dé hòa tan tế bao. U ống trong bề điều nhiệt 60°C trong 1 giờ. Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút. Nhẹ nhàng hút 800 ul dịch nổi sang ống eppendorf mới.
Thêm phenol: chloroform: isoamylalcolhol (25:24:1) vào ống mới chứa dich ndi,vortex và dé 6n định trong ngăn lạnh đông của tủ lạnh 2 phút.Sau ly tâm, hỗn hợp tách thành 3 lớp, hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới.
Thêm isopropanol với tỉ lệ 1:1 v/v. mẫu ở 80°C trong 30 phút. Ly tâm lạnh 14000
rpm trong 15 phút, bỏ dịch thu tủa trang đục. Rửa tủa bang 1000 pl ethanol 70 %, ly tâm. Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp ống, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ở trong buồng cấy. DNA tổng số đơjợc hòa trong 50 pl đệm TE và bao quản mẫu ở 4°C cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả tách chiết DNA bộ gen trên gel được phát hiện bằng hộp đèn UV. Thực hiện phản ứng PCR với các thành phan: 2,5 pl đệm PCR; 0,5 ul DNA tổng số; 0,5 wl dNTPs; 1 wl mỗi loại mỗi và 0,2 ul Taq polymerase. Sử dụng cặp môi tổng 27F và 1492R có trình tự
27F: 5° AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’;
22
1492R: 5“ GGTTACCTTGTTACGACTT 3' (Lane D.J., 1991) Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với 27F/1492R
Tiền biến tính : 90 °C trong 5 phút Quá trình khuếch đại : 94 °C trong 1 phút
56 °C trong 30 giây 72 °C trong | phút
Số chu kỳ :4
Hậu kéo dài : 72 °C trong 10 phút
Sau đó sản phẩm PCR được gửi ổi giải trình tự gen 16S rRNA tại Viện Sinh học Phân tử Loci. So sánh tương quan di truyền với các đòng vi khuẩn trên cơ sở dit liệu NCBI bằng chương trình BLASTN.
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu của các nội dung được phân tích ANOVA 1 yếu tố và dé thị dang Interval Plots được vẽ bằng phần mềm Minitab 16. Vẽ cây phát sinh chủng loại từ trình tự gen bằng phần mềm MEGA 11.
23