Từ 10 mẫu đất thu tại 5 vườn trồng chanh bị ảnh hưởng xâm nhập mặn,trong nghiên cứu này đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năngchịu mặn và giúp cây trồng giảm căng
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.
TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
TUYẾN CHỌN VI SINH VAT CHIU MAN CÓ KHẢ NĂNG CÓ ĐỊNH DAM VÀ SINH TONG HOP IAA CHO VUNG TRÒNG
CHANH TAI TINH LONG AN
Nganh hoc: CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện: PHẠM BẢO KHANG
Mã số sinh viên: 19126074Niên khóa: 2019 — 2023
Thủ Đức, 04/2024
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH
KHOA KHOA HỌC SINH HỌC
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP
TUYỂN CHỌN VI SINH VAT CHIU MAN CÓ KHẢ NĂNG CO
ĐỊNH DAM VÀ SINH TONG HOP IAA CHO VUNG TRONG
CHANH TAI TINH LONG AN
Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện
TS LE THỊ ANH HONG PHAM BAO KHANG
TP Thủ Đức, 04/2024
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Dai học Nông Lâm Thành phó HồChí Minh, cùng toàn thé các thầy cô Khoa Khoa học Sinh học đã giảng day và truyền datkiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường
Em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Lê Thị Ánh Hồng, người đã hết lòng hướng dẫn,chỉ bảo, giúp đỡ tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thựchiện đề tài
Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới, đã tạo điều kiệnthuận lợi, dé em có thê thực hiện đề tài tốt nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới
Em cảm ơn tất cả các anh, chị thân yêu và các bạn trong Phòng Công nghệ Biến đổi
Sinh học đã hỗ trợ, chia sẻ động viên và nhiệt tình giúp đỡ cho em trong thời gian thực
Trang 4XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
Tôi tên Pham Bao Khang, MSSV: 19126074, Lớp: DHI9SHA, số di động:
0373555687, Email: 19126074(2sthcmuafedu.vn thuộc ngành Công nghệ Sinh họcTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan răng tất cả kết quả và dữ liệucủa khóa luận: “Tuyền chọn vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định dam và sinh tổnghợp IAA cho vùng trồng chanh tại tỉnh Long An” là do tôi thực hiện
Ảnh cá nhân:
Tp Ho Chi Minh, ngày 10 tháng 04 năm 2024
Người viết cam đoan(Ký và ghi rõ họ tên)
II
Trang 5TÓM TAT
Đề tài “Tuyên chon vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định dam và sinh tổnghop IAA cho vùng trồng chanh tại tinh Long An” được tiến hành nhằm chon được chủng
vi sinh có tiềm năng sử dụng làm chế phâm phục vụ vùng trồng chanh đặc biệt vùng đất
bị xâm nhập mặn Từ 10 mẫu đất thu tại 5 vườn trồng chanh bị ảnh hưởng xâm nhập mặn,trong nghiên cứu này đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năngchịu mặn và giúp cây trồng giảm căng thang, bổ sung được nguồn đạm cần thiết cho hoạtđộng sống, giảm sử dụng phân bón hóa học, giảm ảnh hưởng xấu đến môi trường Từ 35chủng được phân lập trên môi trường Jensen đã loại bỏ 10 chủng không có khả năng cỗđịnh đạm bằng phương pháp Bromthymol blue Trong đó, chủng C420-2 cho kết quả cókhả năng cố định đạm cao nhất là 4.2321 umol/ml được định danh là chủngBrevibacterium casei strain AS-9 với độ tương đồng 98% Đối với môi trường Burk’skhông đạm phân lập được 21 chủng, trong đó có chủng C1420-3 có khả năng tổng hợpIAA cao nhất là 66,032 g/ml được định danh là chủng Bacillus siamensis strain 3.248với độ tương đồng 98% Như vậy nghiên cứu đã tuyển chon được 2 chủng có thé chịu
mặn và có tiềm năng dé tạo chế phẩm vi sinh phục vụ cho vùng trồng chanh
Từ khóa: Cố định đạm, tông hợp chất kích thích sinh trưởng IAA, chịu mặn, Bromthymolblue.
IH
Trang 6The project "Salt tolerant nitrogen fixation and biosybthesis JAA for lemon growing areas in Long An province" was conducted in an effort to select microbial strains with the potential to be used to prepare products for service Lemon growing areas, especially areas affected by saltwater intrusion From 10 soil samples collected from 5
lemon gardens affected by saltwater intrusion, in this study, bacterial strains with salt
tolerance were isolated and selected to help plants reduce stress and supplement dangerous sources necessary for life activities, reducing the use of chemical analysis, reducing negative effects on the environment From 35 strains isolated on Jensen medium,
10 strains that were not capable of immobilization were eliminated using the Bromthymol
blue method Among them, strain C420-2 showed the highest immobilization ability of 4.2321 tmol/ml and was identified as Brevibacteria casei strain AS-9 with a compatibility rate of 98% For Burk's environment, 21 strains could not be analyzed, including strain CI420-3 with the highest ability to synthesize IAA of 66.032 ug/ml, identified as Bacillus siamensis strain 3.248 with 98% compatibility Thus, the research has selected two strains that can tolerate salt and have the potential to create a microbial product regimen for lemon growing areas.
Keywords: Nitrogen fixation, synthesis of growth stimulants IAA, salt tolerance, Bromthymol blue.
IV
Trang 7MỤC LỤCLOL CAM 00 iXÁC NHAN VA CAM DOAN vccccsssesscscssesesscsecsecssceseecsecsecsessesessecsecsececsassevsecseceveaveeveeceee ii
1 en iii
MUC LUC 922:::-:-: -::::::â+—ŒALAẢAẢA.ẢAÁAẢ V
DANH SÁCH CÁC CHU VIET TẮTT -2222¿2222++222EEEtrtEEkxrrrrrrrrrrrtrrrrrrrrrie viiiDANH SÁCH CÁC TAING secsceccorenssesussntasencenaa acres saves encase asesiasiamemaenesiet ixEES Ee |) |; geaaraengerrrootrrtoigrtriottoiatoW008500003000808S20g08 x
1.1 Đặt vấn đề 25-5-2122 1212121121211212112111111121112111210121121211111111112121121111122 2e |1.2 Mục tiêu đề tài: ¿- 5s s21 E221 1212112121111 21111 21121 01111111121111211111211111 2c erre 11,3 NGL dũng (f6 HIỆN cccsccascrcnaceraaesmanannaananamnenamanaeinssemmmmnaspesaannmanecsmmoneermnets 2CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU - 2: ©-222S+2EE2EE22EE2EE22EE22E222E22222222222222222e 32.1 Trở ngại của đất mặn đến cây trồng - 2 2 2+2E+SE2E1221221271711212211221221 222 -Xe2 32.1.1 Nguyên nhân ngập mặn ở đồng bằng sông Cửu Long - 2 22-222zzzz+=s22 32.1.2 Dat mặn ảnh hưởng đến cây trỒng 2-2 2 ©2+2E+2E+2EE£EE2EE£EEEEEE2EE2EESEEerrrrver 32.2 Ảnh hưởng của sự nhiễm mặn đến chanh: -2- 2© 22222SE+2E2E+£E22E22E222+22Ezzxze: 42.3 Vai trò của vi sinh vật đối với cây trồng bị nhiễm mặn 2 2 2222 2S+2z22zzzzz22 62.4 Tổng quan về vi sinh vật cố định đạm và tổng hợp IAAA 2-222222222s+2522 82.4.1 Tổng quan về vi sinh vật cố định dam c.ccccccccceceseecsessessesseseesessessesseesetesesesseenees 82.4.2 Tông quan về Indole — 3 —acetic avid (LAA) sscscicscsecssusrscessavseersensserueeavereaenerneiees 92.4.3 Vi sinh vậi Chịu HT caeneoaasbionniltieiiilbutEyEESGIEESGASETLASESEELIABESEPRSSEESCEES405883 E908 112.5 Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật cố định đạm và tổng HT TA Ẩueuaaaesasssdaoauzesane 12
oD oda AS SATE, (i1 TEGWG THƯỚC eeeesueieu.eg2 0 0L H-nụchHHDHÌE0g4 H601 ania tana 202070 7.600700 12 2.5.2 Nghién UU NgOal NUGC 2111 13Chương 3 VAT LIỆU VA PHƯƠNG PHAP ca eeneaeesondbhondiEiooosulBoisdaonodose 153.1 Thời gian va địa điểm thực Wi6t oe cece ccc eeceessessesseesesseeseseeseesseeseesessesseeeeeseeeeees 153.2 Déi THOS Waal MCUs HIẾN C UU weccsan cncnnncuensance mananesnancnm nea succnmmaneninseean eawanmemamanens 15
Trang 83.2.1 Đối tượng nghiên cứu 2 25s 21+2E22E222122122152112112112112112112111121211211 2112 ye0 153.2.2 Dung 0n ẼẼ 15
9 DA Mỗi trưởng HUÔI GAY onncsnareaissnancacesnnannndssencenassaneentsnnechassneanecasesncnsasanneanastnenndsenserncasne 153.5 ) bine, php hiển QU ecnnncnwcnennncnn mer EES 17
3.3.1 Thu mẫu, phân tích giá tri pH va độ dẫn điện (EC) -2 2-22-25++5++x+2++: t7
3.3.2 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vat có khả năng 6 định đạm 2 ss+ss¿ 173.3.3 Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA 203.3.4 Đánh giá khả năng chịu mặn của vi sinh vật được tuyến chọn -5- 223.3.5 Kiểm tra hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phân tử vi sinh vật chịu mặn cókha năng cố định đạm và tổng hợp IAA cao nhất -2- 2: 52222222222222+22S222zzzzz+ 23CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN - 2+ 222222E22EE2EE2EE2EE22E22222222222 xe 304.1 kết quả thu mẫu, độ pH và độ dẫn điện (EC) 22+ 2222222222E22E+EE2Ez22z22zcxe2 30AVL (ro on .HHẶHẶẬH 304.1.2 Kết qua giá trị pH và độ dẫn điện (EC) 2222©2222222E22E2EEeEErrErrrrrrerrrree 304.2 Kết qua phân lập và tuyên chọn vi sinh vật có khả năng cô định đạm S14.2.1 Kết qua phân lập vi sinh vật cố định đạm 22 2+222E22E22E22E+EEzEz22z2zz2Se2 314.2.2 Kết quả sàng lọc vi sinh vật có khả năng GỖ đính GAIN c.ceieensisasasess=eso DD4.2.3 Kết quả định tính khả năng cố định đạm của vi sinh vật -2 252522 354.2.4 Kết quả định lượng khả năng cô định đạm của vi sinh vật - 2-2 22522552 374.3 Kết qua phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng tổng hop IAA 394.3.1 Kết quả phan lập vi sinh vật sinh tổng hợp IAAA -2- 2522 55225225+22+2z++ss2 394.3.2 Kết quả định tinh khả năng tổng hop IAA của Vi sinh - 2-22 55222222222z22+2 414.3.3 Kết quả định lượng khả năng sinh tổng hợp IAA của vi sinh vật 434.4 Kết quả đánh giá khả năng chịu mặn của vi sinh vật được tuyên chọn 454.4.1 Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của vi sinh vật có kha năng có định đạm đượctye CMON 454.4.2 Kết quả khả khảo sát năng chịu mặn của vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAAđược tuyển chọn - 2-5 522S+22E92125921219212111211212112121111211111121112111211012101101211 0 x0 46
VI
Trang 94.5 Kết quả kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phân tử chủng visinh vật chịu mặn có khả năng cô định đạm và tổng hợp IAA cao nhất - 474,5.1,KẾt quš nhuậm Gp ttt cs canannconcannscasnanconsconaceasodennnsannanrssdsinnndadasaaninasngurasessnsneseansnceshton 474.5.2 Kết qua khả năng di động, citrate và catalase 0.0.0 cecccscccsessesseesseesessessesseeseeeeeeeeees 47
4.5.4 Kết qua định danh sinh học phan tử 2 222¿2222E+2EE+£E+2EE2E+22Ez2zzzxrcr 50CHUONG 5 KET LUẬN VÀ DE NGHỊ, 2-2 sSESEE+EEEE2EEE12EE212E212171121 2E cxee 54TAT T.TÊU THANH KHẨU tán gBìú ngõ ng 0 B110 30 i2g8102G031820816.030S8034538G038.043/0040.801.d6 55
PHU LUC
vil
Trang 10DANH SÁCH CÁC CHỮ VIET TAT
IAA: Indole — 3 — acetic acid
IPA: Indole — 3 — Pyruvate
ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long
NB: Nutrient Broth
LE: Luria Bertani
TSI: Triple Sugar Iron Agar
EDTA: Axit etylenediaminetetraacetic
ROS: Reactive Oxygen Species
PGPR : Plant Growth Promoting Rhizobacteria
PGPB: Plant Growth Promoting Bacteria
ISR: Induced Systemic Resistance
SAR: Systemic Acquired Resistance
EPS = Exopolysaccharides
Vil
Trang 11DANH SÁCH CAC BANG
Bang 3.1 Nồng độ dung dịch (NH¿)zSO¿ xây dựng đường chuẩn . 2- 19Bang 3.2 Thành phan và thể tích phản ứng PCR - 2-52 52S22222E22E22E22E2E22222222ze2 28
Bằng 4.1 Kễtqnà do pil và đồ dan điệu Oe seesesesteeisdddesioootoolsarggsscbbrGiGrgggg20sgisE 30Bảng 4.2 Ký hiệu và hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật được phân lập trênMMOL ƠI: JSS OD, sersssssnnaersenosoeoodBoeditgigineboSgi10988005512G030015010110081004001-101g53100030G00010.Đ5/700GG001009/00108300000/009% 31Bang 4.3 Kết quả sơ bộ khả năng có định đạm của 35 chủng vi sinh vật 34Bảng 4.4 Kết quả sàng lọc có định đạm của 25 chủng vi sinh vật .3ÓBang 4.5 Hàm lượng amoni của chủng vi sinh vật được đo bằng độ hap thụ quang 37Bảng 4.6 Ký hiệu và hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật được phân lập trên
OL (8U OS KHÔNG AA eessenronnannnnddnnnirbogtilieokorkg330/80000600-nL6010033/19180000080/20000u010001402001 39Bang 4.7 Kết quả định tinh của 21 chủng vi sinh vật - 2 2222222+22222222zzczze: 42Bảng 4.8 Kết qua tong hợp IAA của chủng vi sinh vat bằng đo độ hap thụ quang 44Bảng 4.9 Mật độ vi khuẩn được nuôi cấy ở các nồng độ NaCl 2- 2525522 45Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra sinh hóa khả năng di động, citrate và catalase đã được tuyểnJ0 48Bang 4.11 Kết quả kiểm tra TSI của chủng vi sinh vật đã được tuyên chọn 49Bảng 4.12 kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên ngân hang gen - 52
IX
Trang 12DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Vườn chanh bị thiếu nước tưới do hạn, mặn . - 2 222 2+£+zs+£+z+zzzzzzzz 5
Minh 3.1 Chí bi thigt TH sasaaaseannansioittodgioogitigtdse1i3iG50/011800G300001I-380832501/ISI0GI8004000G/0086 29
Hình 4.1 Khuan lac được phan lập trên môi trường Jenson -. -: - 33Hình 4.2 kết quả chủng có ký hiệu C530-2 đổi màu thạch sang vàng đậm, C530-3 vàC530-1 đổi màu thạch sang vàng nhạt, C530-4 không có làm đôi màu thạch 35Hình 4.3 kết quả thử khả năng cố định đạm - ¿2-22 +s+E2EEEE2EEEE2EE2121121211 2121221 cEee 35Hình 4.4 Sự tạo màu với thuốc thử Nessler được xếp từ cao đến thấp so với đối chứng
0 37Hình 4.5 Khuan lạc vi sinh vật được phân lập trên môi trường Burk’s không dam 41Hình 4.6 So sánh sự tạo màu với đối chứng âm 2 2+ 2222+EE+EE+EE+£E22E22222222zx2 42Hình 4.7 Sự tạo màu với thuốc thử Salkowski xếp từ thấp đến cao so với đối chứng âm
=5 11.1 1 1! ` ` ` 43
Hình 4.8 Mật độ khuẩn lạc trên đĩa thạch NA của chủng có khả năng có định đạm kýTHÍ U-E HÌNHP CC Se 080180663830868i008000460NHGISGEMNE0MIESGESENNGGMKGDMRSIHUSIGIGSU53/00 904iĐ6888 46Hình 4.9 Mật độ khuẩn lạc trên đĩa thạch LB có agar của chủng có kha năng tổng hopIAA ký hiệu chủng C1420-3 -©22222+22221111222111112221111122220112222222 re 46Hình 4.10 Hình thái tế bao vi sinh vật ở vật kính 100x 5-5 2SE2EzEz£zEzEzzzxzxez 47
Hình 4.11 Phan ứng sinh hóa của 3 chủng vi sinh vật có tổng hợp IAA được tuyén chọn
ie ie a a ee sg a rf ge cee 48Hình 4.12 Phản ứng sinh hóa của 3 chủng vi sinh vật có khả năng cố định đạm được
"2910 017 an 5Ừ 48Hình 4.13 Phan ứng sinh hóa TSI của chủng vi sinh vật được tuyển chọn 50Hình 4.14 Kết quả kiểm tra PCR của 2 chủng được tuyén chọn -2- 2-52: 51Hình 4.16 Cay pha phat sinh loài chủng CI420-3 - - ¿55252 2+ ++s£+e£+eeevexereees 53 Hình 4.15 Cây phát sinh loài chủng C420-2 0 csscccccssssssssseessessssevessssssveesseessveesseeseveveseeee 53
Trang 13CHUONG 1 MỞ DAU
1.1 Đặt vấn đề
Chanh được dùng làm gia vị, pha nước giải khát và còn là một vị thuốc chữa vàphòng bệnh rất hiệu quả Trong y học, cây chanh có tác dụng làm thuốc bổ Chữa chảymáu chân răng Ho, lợi tiểu, chướng bụng Vỏ quả chanh có chứa tinh dầu, loại tinh daunày có tác dụng hiệu quả với bệnh tram cảm, tâm thần có sự hoảng hốt, sợ hãi, lo âu múi chanh chính là nơi chứa nhiều vitamin C nhất Vitamin C là thành phần có thể giúpgiúp kích thích đề kháng, hỗ trợ hệ tiêu hóa
Bên cạnh những lợi ích trên chanh còn là một trong những loại cây trồng mang lạikinh tế cho người dân ở Long An những năm gần đây Sự giảm sút năng suất, cây trồngkém phát triển bởi tình hình nhiễm mặn xảy ra nghiêm trọng
Nhiễm mặn là một trong những yếu tố môi trường quan trọng nhất cản trở năngsuất nông nghiệp Nguyên nhân có thé gây ra một số thay đối về hình thái, sinh lý, sinhhóa và trao đổi chat thông qua các cơ chế khác nhau, cuối cùng ảnh hưởng đến sự tăngtrưởng, phát triển và năng suất của cây trồng Các yếu tô này có ảnh hưởng mạnh mẽ đếnphản ứng của thực vật và liên quan đến thích nghi có xảy ra hay không
Chính vì những ảnh hưởng của xâm nhập mặn đối với nền nông nghiệp cũng nhưảnh hưởng đến khu vực trồng chanh tại tỉnh Long An, để tìm hiểu khả năng cô định đạm
và kích thích sinh trưởng với mục đích b6 sung vào chế phẩm sinh học trong trồng trot vàcũng như hạn chế giá thành sản phẩm giúp người nông dân có thêm thu nhập cao đời sốngngày càng phát triển Tôi tiến hành thực hiện đề tài “Tuyên chọn vi sinh vật chịu mặn cókhả năng cô định đạm và sinh tổng hợp IAA cho vùng trồng chanh tại tỉnh Long An”
1.2 Mục tiêu đề tài:
Mục tiêu của đề tài là phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật chịu mặn có khảnăng cố định đạm va tông hợp chất kích thích sinh trưởng, có tiềm năng sử dung dé tạochế phẩm sinh học
Trang 141.3 Nội dung thực hiện:
Phân lập, làm thuần và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng cô định đạm
Khảo sát kha năng cố định đạm và ham lượng amoni của vi sinh vật được tuyên chon.Phân lập, làm thuần và tuyên chọn vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA
Khao sát khả năng sinh IAA và hàm lượng IAA của vi sinh vật được tuyển chọn.Khao sát khả năng chịu mặn các vi sinh vật được tuyên chọn
Kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phân tử
Trang 15CHUONG 2 TONG QUAN TÀI LIEU
2.1 Trở ngại của dat mặn đến cây trồng
2.1.1 Nguyên nhân ngập mặn ở đồng bằng sông Cửu Long
Do hạn hán dẫn đến mực nước sông thấp, ảnh hưởng của triều biển xâm nhập vàođất liền ĐBSCL lại chịu ảnh hưởng của chế độ gió mùa (mùa khô và mùa mưa), hau nhưmùa khô những vùng ven biến điều bị nhiễm mặn từ biển đưa vào
2.1.2 Dat mặn ảnh hưởng đến cây trồng
Khi đất nhiễm mặn, cây bị căng thắng về thiếu nước làm chậm tăng trưởng, thiếuhụt đinh dưỡng Trong quá trình tiếp xúc với muối, bên cạnh mắt nước, cây thiếu ion dẫnđến là già và suy giảm khả năng quan hợp
Vùng nhiễm mặn, sự sinh trưởng và trao đổi chất của thực vật bị ảnh hưởng tiêucực, liên quan đến sự tích tụ ion Na” cao trong mô thực vật Sự tích tụ các ion Na” nàytrong mô thực vật sẽ ức chế quá trình quang hợp và tăng cường hình thành các loại oxyphản ứng (ROS) Những (ROS) này có nhiều tác dụng phụ đối với cây trồng như đâynhanh các phản ứng độc hại, có thé là đột biến DNA, thoái hóa protein và tổn thươngmang tế bao (Islam va ctv, 2015; Sudhir và Murthy, 2004)
Độ mặn ở vùng rễ có thé anh hưởng xấu đến sự phát triển của thực vat, vì rễ khôngthé hút nước từ những vùng tích tụ muối Hàm lượng ion Na" va Cl’ đồi dao trong đất gây
ra khả năng thâm thấu cao của dung dịch trong đất và sự thiếu hụt trong việc hấp thu chấtdinh dưỡng (Marschner, 1995; Sairam và Tyagi, 2004) Nồng độ ion Na” va Cl’ cao trongdat ảnh hưởng đến sự hiện diện của các nguyên tố quan trọng khác trong đất và có thé làmgiảm kha năng tiếp cận và hấp thu các chất dinh dưỡng và khoáng chất thiết yếu của câytrồng (Carmen và Roberto, 2011) Mức độ căng thang mặn cao cũng có tác động rất cóhại đến các giai đoạn khác nhau của vòng đời thực vật, chang hạn như sự tổng hợp sựphát triển của thực vật như quang hợp bằng cách tăng cường quá trình quang hô hấp vàcân bằng nội môi bình thường của tế bào tạo ra lượng lớn các loại oxy phản ứng Các quátrình khác cũng có thể bị ảnh hưởng bởi stress muối là sự phát triển của rễ và thân, hìnhthái thực vật, vận chuyên ion và hoạt động của enzyme hòa tan, hấp thu chất dinh dưỡng
Trang 16và sự trưởng thành của cấu trúc tế bao (Xiong và Zhu, 2002) Dưới áp lực thâm thấu cao,chiều dai rễ, chiều cao thân và trọng lượng khô giảm đáng kể Do nồng độ NaCl, rễ hapthụ lượng natri cao, trong khi sự hấp thu magie photpho, kali và nitơ giảm đáng kể, làmrối loạn cân bằng ion nội bào (Gunes va ctv, 1996; Abdel-Ghaffar và ctv, 1998;Rengasamy, 2010) Trong những trường hop như vậy, rễ cây không thé hap thụ lượngnước thích hợp dé phát triển và tiêu tốn phần lớn năng lượng đề điều chỉnh cân bằng thâmthấu bằng cách tích tụ các chất hòa tan tương thích (Robinson và Jones, 1986; Kempf vàBremer, 1998).
Muối cũng góp phan gây ngộ độc natri, ức chế sự hấp thu K* và các chat dinhdưỡng quan trọng khác vào tế bao rễ, điều này gây ra sự trao đổi chất thực vật không đều,gây độc cho enzyme ở cấp độ di truyền (Wuet và ctv, 2012) Bằng chứng chỉ ra rằng,trong điều kiện nhiễm mặn, các enzyme tổng hợp N và axit amin bị điều hòa quá mức,trong khi các hoạt động thủy phân như ribonuclease, dehydrogenase và protease đượcđiều hòa tăng lên (Condeet va ctv, 2011) Ngoài ra, thực vật còn có thể tích trữ lượng Na”
dư thừa trong không bào của chúng, nhưng tăng lượng Na” nồng độ cũng có thé làm tăng
áp suất thâm thấu trong khoang tế bào, dẫn đến tổn thương tế bao và cơ quan (Blumwald,1987; Ruiz-Lozanoet và ctv, 2012).
2.2 Anh hưởng của sự nhiễm mặn đến chanh
Tính đến đầu tháng 11/2021, toàn tinh Long An hiện có khoảng 11500 hectachanh, tăng hơn 7000 hecta so với 10 năm trước đây Ước tính, tốc độ tăng diện tích trồngchanh bình quân hàng năm là 13,5% Chanh được trồng tập trung chủ yếu ở các huyệnBến Lite, Đức Huệ, Đức Hòa, Thủ Thừa và Thạnh Hóa, sản lượng hơn 150000 tắn/năm
Tỷ lệ chanh không hạt, chất lượng cao đang dần chiếm ưu thế và được thị trường chấpnhận, trong đó, hơn 110 hecta chanh được cấp mã số vùng trồng dé xuất khâu sang thịtrường khó tính Ngoài ra, việc đưa vào hoạt động nhà máy chế biến trái cây (Nafoods tạiĐức Hòa và Lavifood tại Bến Luc) tạo cơ hội dé diện tích chanh tăng và duy trì phát triểnbên vững loại cây này trên đất Long An
Long An thuộc những tỉnh bị ảnh hưởng xâm nhập mặn ở ĐBSCL, theo Sở Nôngnghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Long An, từ giữ tháng 11/2019 xâm nhập mặn bắt đầu
Trang 17xuất hiện và nhập sâu vào hệ thống sông Vàm Cỏ (Vàm Cỏ Đông, Vàm Cỏ Tây) Đượcđánh giá xuất hiện sớm hơn một tháng cùng thời điểm năm 2018 - 2019 và sớm hơn nửatháng so với năm 2015 — 2016 Tổng điện tích lúa Đông Xuân bị thiệt hại do bị ảnh hưởngxâm nhập mặn năm 2020 là 2746,21 ha.
Hình 2.1 Vườn chanh bị thiếu nước tưới do hạn, mặn
Đầu năm 2019, hàng ngàn hộ nông dân trồng chanh tại huyện Bến Lức (Long An)như ngồi trên đồng lửa Hàng ngàn ha chanh của nông dân đang đối mặt với nguy cơ cháykhô, rụng lá do hạn mặn Cùng thời điểm nước từ sông Bến Lức dẫn vào các kênh nộiđồng trong huyện đều đã bị nhiễm mặn nghiêm trọng, độ mặn lên đến 2,5 — 6 g/l Trongkhi đó, độ mặn tối đa có thé dẫn nước tưới cho cây chanh không quá 2 g/l, do đó hơn 3tháng, nội đồng huyện Bến Lức không có nguồn nước tưới bổ sung, hàng ngàn ha chanhcủa nông dân đang bi đe dọa Có gần 5000 ha chanh thì hầu như toàn bộ diện tích trên đều
bị anh hưởng Trong đó, diện tích bị thiệt hại nghiêm trọng từ 30 - 70% trở lên chiếm gần
1000 ha, số còn lại cũng đều rơi vào tình trạng suy kiệt Tại các xã trồng chanh trọngđiểm của huyện như Thạnh Hòa, Thạnh Lợi, Lương Hòa, Lương Bình, nông dân nhưđang ngồi trên đồng lửa Xã Thạnh Hòa có khoảng 1800 ha chanh thì 100% diện tích trên
bị ảnh hưởng bởi nước mặn xâm nhập sâu vào nội đồng, trong đó có 16 ha chanh bị chếtkhô, 144 ha bị thiệt hại từ 30 - 70%.
Đến tháng 8/2020 hạn, mặn 2019 — 2020 đã khép lại tuy nhiên, ảnh hưởng của nóvẫn còn xảy ra trên nhiều diện tích chanh của huyện Bến Lức, tỉnh Long An Trong đó,không ít điện tích bị thiệt hại gần như hoàn toàn, người dân phải phá bỏ, chờ đợi sự hỗ trợcủa các cấp, các ngành liên quan để tái sản xuất Theo thống kê của Phòng Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn huyện Bến Lire, huyện có gần 7000 ha chanh Chanh được xem là
Trang 18cây trồng chủ lực của huyện, bởi phù hợp với điều kiện tự nhiên và hiệu quả mang lại chongười dân Tuy nhiên, mùa hạn, mặn vừa qua, nhiều diện tích chanh bị ảnh hưởng nặng
do thiếu nước tưới Dù mùa hạn, mặn đã đi qua nhưng ảnh hưởng của nó vẫn đang tiếpdiễn Cụ thể, trên 2000 ha chanh của huyện bị thiệt hại, tập trung ở các xã: Thạnh Hòa,Thạnh Lợi, Lương Hòa, Bình Đức , trong đó có trên 500 ha bị thiệt hại từ 70% trở lên.Nguyên nhân chính dẫn đến cây chanh bị suy kiệt và chết là do thiếu nước ngọt tưới cây,trong vườn không có mương dự trữ nước ngọt Song song đó, hiện tượng rò rỉ nước mặnthấm sâu trong các mương vườn sẽ tích tụ muối hòa tan trong đất, hạn, mặn càng kéo daithì lượng muối trong đất sẽ càng tăng dẫn đến hệ thống rễ cây không hút được nước vàdinh dưỡng khiến cây chết Mặt khác, một số điện tích chanh van cho hoa, trái trong giaiđoạn han, mặn làm tiêu hao nhiều năng lượng, dinh dưỡng cho quá trình nuôi trải Đặcbiệt, giai đoạn sau khi thu hoạch, nhiều diện tích chanh lại tiếp tục gặp điều kiện hạn, mặntrong thời gian dài nên không có đủ nước, dinh dưỡng đề phục hồi bộ rễ và lá dẫn đến câyngày càng suy kiệt và chết
2.3 Vai trò của vi sinh vật đối với cây trồng bị nhiễm mặn
Nhiều loại vi khuẩn Rhizobacteria (PGPR) thúc đây tăng trưởng thực vật trong đấttiêu diệt nhiều mầm bệnh thực vật và cải thiện sự phát triển của thực vật bằng nhiều cơchế khác nhau, chang hạn như sản xuất trực tiếp và gián tiếp các loại phytohormone khácnhau, khoáng hóa và phân hủy chất hữu cơ và cải thiện khả dụng sinh học của các chấtdinh dưỡng khoáng khác nhau như sắt và phốt pho (Valencia - Cantero và ctv, 2007).PGPR thường được sử dụng làm chế pham cho quá trình kích thích sinh học, kiểm soátsinh học và bón phân sinh học Tác dụng của PGPR đối với cây trồng là thúc đây sinhtrưởng và tăng năng suất cây trồng Các cơ chế mà PGPR có thé thúc đây tăng trưởngthực vật bao gồm tăng sự phát triển của rễ va chồi bằng cách sản xuất các phytohormonekhác nhau như auxin và cytokinin (Mantelin và Touraine, 2004; Lopez - Bucio va ctv, 2007; Yang va ctv, 2009).
Tac dụng cua vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vat (PGPR) là v1 khuẩn vùng
rễ, sống tự do ở trong đất, tác động trực tiếp hoặc gián tiếp kích thích sinh trưởng bộ rễ vàtoàn bộ cây trồng (Mayak va ctv, 1999) Tác động gián tiếp, khi tương tác với rễ cây
Trang 19thông qua rất nhiều cơ chế khác nhau tạo ra tính kháng của cây chống lại các tác nhân gâybệnh cây Tác động trực tiếp lên cây trồng như khả năng cố định nito, phân giải lân, sat,sản sinh ra phytohormone, enzym 1-aminocyclopropane-1- carboxylate (ACC), (Glick,1995; Hayat va ctv, 2010) Hiện tượng này được gọi là tính kích kháng hệ thống (ISR),cũng giống như tính kích khang hệ thống có điều kiện (SAR) (Ryu va ctv, 2005) Nhiềunghiên cứu đã ghi nhận việc ứng dụng vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vat trongtrồng trọt làm tăng sức đề kháng và năng suất của các loại cây trồng khác nhau trong cảđiều kiện bình thường và bat lợi Các nghiên cứu trước đây cho thay PGPR có khả năngthúc day tăng trưởng thực vật và nâng cao khả năng chịu mặn của chúng vì nó cải thiệnphản ứng sinh lý của thực vật và khả năng chống oxy hóa PGPR kích hoạt một sốhormone như gibberelin (GA), axit indole axetic (IAA), axit abscisic (ABA), cytokinin(CK), đồng yếu tố pyrroquinoline quinone (PQQ) va ethylene thúc day tăng trưởng thựcvat (Perrig va ctv, 2007).
Sau khi cây PGPR vao cây, người ta quan sát thấy sự thay đổi về cau trúc rễ, chủyếu là sự gia tăng số lượng lông rễ và rễ bên cũng như sự ngắn lại của chiều dai rễ Nhìnchung, tổng bề mặt rễ tăng lên, dẫn đến tăng cường hấp thu khoáng chất từ đất và sự thoát
ra của rễ (kích thích thêm sự xâm chiếm của rễ bằng PGPR) Trong nhiều thập kỷ, nhữngthay đôi về hình thái này của rễ được cho là do vi khuẩn sản xuất auxin và các nghiên cứuvới các đột biến được thay đổi trong quá trình sản xuất IAA đã xác nhận vai trò quantrọng của nó Tác dụng thúc đây tăng trưởng thực vật của vi khuẩn, mà người ta đã chứngminh rằng có liên quan đến auxin, được gọi là kích thích thực vật (Stijn Spaepen and JosVanderleyden, 2023).
Các chất thâm thấu hữu cơ do vi khuẩn tạo ra bao gồm các hợp chất hữu cơ hòa tancao, chăng hạn như đường, rượu đường, glucosyl glycerol, betaines, axit amin vàtetrahydropyrimidine (Ciulla và ctv, 1997) Ở thực vật, sự tích lũy thâm thấu diễn ra déchống lai stress mặn Sự tích tụ chất thẩm thấu trong tế bao chất giúp duy trì áp suất thẩmthấu cân bằng của tế bào Các chất thẩm thấu thực vật chính bao gồm đường, glycine,betaine, proline va glutamate (Chen va Jiang, 2010; Suprasanna va ctv, 2016) Duong, chủ yêu là các disaccharide như sucrose, trehalose, oligosaccharides raffinose va fructan,
Trang 20đóng vai trò là chất bảo vệ thâm thấu và là động lực chính trong cơ chế chống chịu stresscủa thực vật ngoài chức năng bảo vệ thâm thấu, các chất thâm thấu hữu cơ này còn thựchiện một số chức năng quan trọng khác, chẳng hạn như hỗ trợ sự sống sót của hệ vi sinhvật sống trong thực vật Sự tích lũy Sucrose có liên quan đến sự sống sót củaCraterostigma plantagineumtrong tình trạng mất nước của mô thực vat (Norwood va ctv,2000).
Sản xuất siderophore là một trong những tinh năng chính của PGPB, vi khuẩn thúcđây tăng trưởng thực vật tăng khả năng cung cấp các nguyên tố khoáng như Cu, Fe, Mn,Zn, Cho cây trồng bang cách thải sắt và axit hóa đất (Etesami và ctv, 2014), các nghiêncứu cho thấy hoạt động của vi sinh vật đóng vai trò chính trong việc tích lũy Fe trong rễ
và vận chuyền Fe đến lá (Masalha va ctv, 2000) Sắt là kim loại phổ biến thứ hai trong lớp
vỏ trái đất Nó cần thiết cho một số enzyme phức hợp sắt - lưu huỳnh và protein chứa sắt
và đóng vai trò chính trong sự phát triển của thực vật bằng cách tham gia vào quá trìnhtổng hợp chất diệp lục Độ mặn làm tăng tình trạng thiếu hụt liên quan đến Fe, tức là bệnhnhiễm clo ở thực vật Khả năng sử dụng Fe cũng giảm trong điều kiện nhiễm mặn do sự
ức chế bơm proton (Akhilesh Kumar và ctv, 2019)
2.4 Tổng quan về vi sinh vật cố định dam và tổng hợp IAA
2.4.1 Tổng quan về vi sinh vật có định đạm
Nito là loại khí đồi dao trong bầu khí quyên với 79% và là nguyên tổ cần thiết chomọi dạng sống trên trái đất Cô định đạm sinh học chỉ được thực hiện bởi sinh vật nhân sơsống tự do trong tự nhiên hay cộng sinh và là quá trình quan trọng của vi sinh vật, cónhiều tài liệu chứng minh rằng cố định đạm sinh học qua trung gian của enzymenitrogenase là quá trình quan trọng đối với quá trình sinh học của trái đất Hoạt độngnitrogenase là đặc trưng của thực vật, nitrogenase trong đất phụ thuộc vào điều kiện môitrường với khả năng có định đạm của vi sinh vật và kiểu gen thực vật trong các điều kiện
Trang 21Cố định đạm sinh học và cộng sinh: nitơ đồi dao trong khí quyền nhưng không
có thực vật nào có thé khử dinitrogen thành amoniac và sử dụng trực tiếp cho sự pháttriển của nó, dường như chỉ có vi sinh vật nhân sơ, khuẩn lam là có khả năng có địnhdinitrogen Sự cộng sinh giữa thực vật và vi sinh vật cung cấp cho vi sinh vật có chỗ hoạtđộng sông, thực vật có được nguồn nitơ mà bản thân hấp thụ được Thực vật có khả năngtiết dịch giúp cho vi sinh vật hoạt động sông va có định đạm ở vùng rễ thực vật, bên cạnhkhả năng có định đạm về mặt sinh học, nhiều vi sinh vật có khả năng sản xuất hormone vànhững chất này có thê ảnh hưởng đến sự phát triển của cây trồng một cách hiệu quả
Tương tác có lợi giữa vi sinh vật và thực vật: Chất hỗ trợ nông nghiệp được định
nghĩa là tác nhân sinh học hoặc phi sinh học làm giảm thời gian tăng trưởng, tăng sản
lượng và chất lượng nông sản cũng như thời gian ra hoa đậu quả, kích thước quả, Sự
tham gia của vi sinh vật với vai trò là chất tăng cường có liên quan đến hoạt tính enzymecủa chúng, khả năng cố định đạm là một đặc tính của một số sinh vật nhân sơ Được biết,trong quá trình sinh trưởng, cây tương tác mật thiết với các vi sinh vật trong đất Sự tươngtác giữa các vi sinh vật và thực vật có thé có lợi, trung tính hoặc bat lợi Ba nhóm vi sinhvật có lợi cho cây trồng có thể được xác định là nhóm vi sinh vật có khả năng tăng cường
bổ sung các chất đinh dưỡng khoáng cần thiết cho sinh trưởng như dam, lân Nhóm các visinh vật kích thích sự phát triển của thực vật ở dạng gián tiếp bằng cách ức chế các sinhvật gây bệnh, những vi sinh vật này được sử dung đề kiểm soát sinh học và tiết dịch đánhđuổi côn trùng Nhóm các vi sinh vat điều khiển sự phát triển sinh học của thực vật
2.4.2 Tổng quan về Indole — 3 — acetic acid (IAA)
Auxin là chất kích thích thực vật được phát hiện đầu tiên Năm 1930, thuật ngữAuxin được đặt ra bởi các nhà hóa sinh, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là tănghay tăng trưởng Indole — 3 — acetic acid (IAA) là hormone thực vật phô biến nhất của lớpauxin thúc đây tăng trưởng và phát triển ở thực vật Do đó thuật ngữ Auxin và [AA được
sử dung thay thé cho nhau mặc dù tầm quan trọng của sinh tổng hợp IAA còn hạn chế Cónhiều nghiên cứu chỉ ra thực vật, vi khuẩn, nắm đều có thé tạo ra IAA
Con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn và thực vật rất giống nhau, mặc dù sửdụng một số chất trung gian khác nhau, có hai con đường sinh tông hợp IAA là phụ thuộc
Trang 22va không phục thuộc vào tryptophan (Trp) đều cùng tồn tại trong thực vật, tuy nhiên phanlớn các nghiên cứu trước đây chỉ ra con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc vào Trp Ởthực vat, 4 con được sinh tổng hop IAA phụ thuộc Trp gồm: indole-3-acetamide (IAM),
axit indole-3-pyruvic (IPA), tryptamine (TRA) va con đường indole-3-acetaldoxime Các
loài thực vật có con đường sinh tổng hop IAA tối ưu khác nhau, nhưng chúng được kỳvọng là các cơ chế có lỗi về mặt tiến hóa cho quá trình sinh tổng hợp IAA Một số chấttrung gian của con đường sinh tổng hợp IAA có thể được chuyên đôi thuận nghịch thànhcác hợp chất dự trữ, mặc dù chức năng chính xác của các hợp chất này vẫn chưa đượcbiết Ở thực vật, phần lớn các phân tử IAA được tìm thấy liên kết cộng hóa trị với đườnghoặc axit amin, được gọi là liên hợp IAA (Woodward va Bartel, 2005) Các hợp chất này
có vai trò đa dạng, chang han nhu bao vé chéng lại sự thoái hóa, lưu trữ va van chuyển vàrất quan trọng dé duy tri cân bằng nội môi IAA trong tế bào (Cohen và Bandurski, 1982;Seidel và ctv, 2006) Sự phân hủy IAA có thể xảy ra thông qua quá trình dị hóa khửcarboxyl của IAA (biến đổi cả chuỗi bên va indole), thông qua quá trình oxy hóa khôngkhử carboxyl của vòng indole hoặc thông qua các liên hợp auxin có thé bị phân hủy Sựphân hủy IAA cũng đã được chứng minh ở nhiều vi khuẩn và một số chất trung gian đãđược xác định (dé biết tổng quan về con đường phân hủy vi khuẩn được đề xuất, xemLeveau và Gerards 2008).
Ở vi khuẩn, con đường IPA, IAM và IAN được coi là con đương sinh tổng hợpchính Những con đường sinh tổng hợp IAA ở vi khuẩn được phát hiện tồn tại trongAzospirillum brasilense, một loại vi khuân cỗ định đạm được tìm thấy trong vùng rễ củacác loài cỏ Azospirillum brasilense tổng hop IAA phụ thuộc vào Trp thông qua cònđường IAM, IPA và cả IAN (Zakharova và ctv, 1999) Riêng nắm quá trình sinh tổng hợpIAA bằng con đường IAM là chủ yếu
Con đường indole — 3 — pyruvate (IPA) là con đường auxin chính ở thực vật Con
đường IPA có thể được thể hiện ở nhiều loại vi khuẩn như phytopathogens (P.agglomerans),vi khuẩn có lợi thực vật (Azospirillum, Bacillus, Bradyrhizobium,Enterobacter cloacae, Paenibacillus, Pseudomonas, và Rhizobium) và thậm chi cả vikhuẩn lam, con đường bao gồm ba bước Trong bước đầu tiên, tiền chat tryptophan được
10
Trang 23chuyển hóa thành IPA nhờ aminotransferase Hoạt tính Aminotransferase đã được théhiện ở các vi khuẩn sản xuất IAA khác nhau như Azospirillum brasilense Va Azospirillumlipoferum (Ruckdaschel và ctv, 1988; Baca và ctv, 1994) Trong bước hai, IPA được khửcarboxyl thành indole — 3 — acetaldehyde, sau đó chat này bị oxy hóa thành IAA bởidehydrogenase Bước khử carboxyl được xúc tác bởi enzyme chủ chốt indole — 3 —pyruvate decarboxylase Dựa trên phân tích phát sinh loài và sinh hóa, nhóm enzyme nay
có thé được chia thành hai nhóm nhỏ, cho thấy nguồn gốc riêng biệt của các gen mã hóa(Spaepen và ctv, 2007).
Người ta đã xác định rang IAA có vai trò nổi bật trong khả năng kháng muối vàthúc day tăng trưởng thực vat (Ali va Abbas, 2003; Kang va ctv, 2014; Kaya va ctv, 2013,2010; Khalid va ctv, 2013).
2.4.3 Vi sinh vat chiu man
Kha nang chiu man cua vi sinh vat la su thich nghi cua sinh vat sống với điềukiện độ mặn cao Các loài chịu mặn có xu hướng sống ở các khu vực như hồ siêumặn , cồn cát ven biển , sa mạc nhiễm mặn , đầm lầy muối , biển và suối muối nội địa
Các vi khuẩn, nấm có khả năng thích nghỉ với nhiều mức độ khác nhau của môitrường bên ngoài, thâm thấu (Ruppel và ctv, 2013) Tùy thuộc vào khả năng tồn tại vàphát triển trong môi trường nước mặn, vi sinh vật được đặc trưng là chịu mặn hoặc ưamặn Các sinh vật chịu mặn có thé tồn tại trong môi trường chứa nhiều natri clorua lênđến 25%
Vi khuẩn chịu mặn có cơ chế cho phép chúng phát triển và tồn tại trong môi trườngmặn Các cơ chế này gồm: thành phần cụ thể của màng vi khuẩn hoặc thành tế bào cácbiến thé cấu trúc trong màng tế bào thông qua việc thay đối protein, glucans, thành phanaxit béo, chuỗi acyl và polysaccharides cản trở đầu vào có nồng độ muối cao (Klein vàctv, 1999; Paul và Lade, 2014) Quy định nồng độ ion nội bào thông qua việc bom ion rakhỏi tế bao hoặc sử dụng ion chất vận chuyên, đề thích ứng thẩm thấu (Whatmore và ctv,
1990 Tích lũy các chất hòa tan tương thích sucrose, trehalose, trehalose-6-phosphate,ectoines, polyol, glycine betaine va glycosyl glycerol bằng nội sinh, sinh tổng hợp(Lamosa va ctv, 1998; Suarez va ctv, 2008) và điều chỉnh tăng cường tổng hợp các axit
11
Trang 24amin thiết yếu như axit glutamic, alanine, axit aspartic, threonine, lysine va proline(Shahzad va ctv, 2017; Tsuzuki va ctv, 2011) Su thích ứng của protein va enzyme tao raham lượng ion chất tan cao, tăng cường năng lượng của tế bao dung tích va sản xuất EPS(exopolysaccharides) giúp mở rộng màng sinh học và hạn chế sự xâm nhập của lượngmuối cao vào tế bào (Xiang va ctv, 2008; Chen và ctv, 2009; Sandhya và ctv, 2010;Ruppel va ctv, 2013; Kumar va ctv, 2019).
2.5 Tinh hình nghiên cứu về vi sinh vật cố định đạm va tong hop IAA
2.5.1 Nghiên cứu trong nước
Tác giả Nguyễn Thị Pha và ctv năm 2015, phân lập được 290 dòng vi khuẩn từ 114mẫu đất vùng rễ lúa, đều có khả năng tổng hợp NH¡' và xác định được 16 dong vi khuan
có tác động tốt lên sinh trưởng của cây mạ trong điều kiện phòng thí nghiệm Bốn dòng vikhuẩn có kha năng thay thé từ 25-50% phân đạm hóa học cho cây lúa OM6976 trồngtrong chậu ở điều kiện nhà lưới
Theo Nguyễn Anh Huy và ctv năm 2018, đã tìm ra được một trăm mười sáu dòng
vi khuẩn chịu mặn ở nồng độ muối 10%o phân lập được đều có khả năng có định đạm vàtong hop IAA Dòng PL2 cố định đạm cao nhất ở ngày 4 (3,73 ug/mL), tổng hợp IAA caonhất ở ngày 2 (45,31 ug/mL); dòng PL9 cé định đạm cao nhất ở ngày 2 (2,71 ug/mL),tổng hợp IAA cao nhất ở ngày 2 (46,46 ug/mL) Hai dòng vi khuẩn nay có tiềm năng ứngdụng sản xuất phân bón vi sinh sử dụng cho cây lúa trồng trên đất nhiễm mặn
Vào năm 2022, Thái Thành Được và ctv thu thập mẫu đất từ ruộng bắp từ 5 tỉnhĐBSCL như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Trà Vinh kết quả đã phân lậpđược 120 dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ bắp Trong đó, 50 trong tổng số 120 dòng vikhuẩn phát triển tốt trên môi trường không đạm và thử nghiệm khả năng tong hợp NHữ”
Từ các dòng vi khuẩn trên đã chọn được 6 đòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm tốttrong môi trường nuôi cấy lỏng không đạm Dòng vi khuẩn có ký hiệu AAD2 được thuthập tại An Giang có khả năng tổng hợp NH, ' trung bình sau 6 ngày nuôi cấy 4,02 mg/L,dong vi khuẩn ký hiệu DND5 được thu thập tại Đồng Tháp có khả năng tông hợp NH *trung bình sau 6 ngày nuôi cấy 4,02 mg/L, dòng vi khuan ký hiệu COD4 được thu thập tạiCần Thơ có khả năng tong hợp NH,“ trung bình sau 6 ngày nuôi cấy 4,13 mg/L, dòng vi
12
Trang 25khuẩn ký hiệu VMDI được thu thập tại Vinh Long có khả năng tổng hop NH¿ * trungbình sau 6 ngày nuôi cấy 4,05 mg/L, 2 dong vi khuân TCD3 và TCD4 được thu thập tạiTra Vinh có kha năng tổng hop NH: * trung bình sau 6 ngày nuôi cấy lần lượt 4,28 mg/L
và 4,06 mg/L.
2.5.2 Nghiên cứu ngoài nước
Arti Sharmal va ctv năm 2021, tìm được 13 dòng vi khuẩn có khả năng chịu mặn
ở các nồng độ muối khác nhau Tat cả các vi khuẩn chịu mặn được phân lập đã được thửnghiệm thêm về khả năng tạo ra các hoạt tính sinh học khác như thúc đây tăng trưởngthực vật (PGPR), như hòa tan phốt phat Hydro xyanua (HCN), tổng hợp chat kích thíchsinh trưởng (IAA) và có định đạm Tất cả các vi khuẩn chịu mặn đã thể hiện các hoạtđộng PGPR quan trọng Vi khuẩn Rhizobacteria thúc đây tăng trưởng thực vật (PGPR)được phân lập từ đất mặn có thể khắc phục những tác động bat lợi của tình trạng căngthang do mặn đối với thực vật Ngoài ra, vi khuẩn PGPR có thé tác động tích cực đến cácchức năng sinh lý của cây trồng như tăng trưởng, năng suất và vượt qua khả năng khángbệnh Do đó, việc áp dụng chế phẩm vi sinh vật để giảm bớt căng thắng và nâng cao năngsuất cây trồng có thé là một lựa chọn chi phí thấp và thân thiện với môi trường để quản lyđất mặn dé có năng suất cây trồng tốt hơn
Tháng 3 năm 2017, Roopali Roychowdhury và ctv đã phát hiện 2 dòng vi khuẩn từmẫu tro bay của nhà máy nhiệt điện Mejia tai Bankura, Durlovpur, Tay Bengal, An Độđóng vai trò là tác nhân chủ yếu dé ứng dụng làm chế phẩm sinh học trong phục hồi hệsinh thái thảm thực vật ở bãi thải tro bay và bãi thải khai thác mỏ khác Hai dong vi khuẩnđặc trưng cho các đặc tính kháng kim loại nặng và các hoạt động thúc đây tăng trưởngthực vật như sản xuất Siderophore, sản xuất LAA và có định đạm
Dé tìm các giải pháp thay thế cho phân hóa học theo L Chroudqi và ctv (tháng 5năm 2017), tìm thấy § chủng vi khuẩn từ vùng rễ cây lúa mì tại Marrakesh, Maroc đềucho thấy các mức độ khác nhau trong hoạt động thúc day tăng trưởng thực vật và tat cảđều có tác động tích cực đến thực vật đối với tất cả các quá trình xử lý sinh học như là sảnxuất IAA, cô định đạm và hoạt động xenlulaza bên cạnh các đặc tinh kháng nắm củachúng Dựa trên những kết quả này, các chủng được phân lập trong nghiên cứu này có thể
13
Trang 26tạo thành một giải pháp thay thế hiệu quả và thân thiện với môi trường hơn cho phân bónhóa học và thuốc diệt nam trong các quá trình kích thích sinh học, bón phân sinh học vàkiêm soát sinh học.
14
Trang 27Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: từ ngày 1 tháng 2 năm 2023 đến ngày 12 tháng 7 năm 2023.Địa điểm thực hiện: Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt đới.3.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm và tổng hợp chất kích thích sinhtrưởng (IAA) được phân lập từ mẫu đất ở vùng trồng chanh bị ảnh hưởng xâm nhập mặnđược thu tại xã Lương Hòa, huyện Bến Lức, tỉnh Long An
3.2.3 Hóa chất
K›;Hglu, FeCl:, H2SO4, C27H2sBr2058, (NH4)2SO4, L — tryptophan,Peptone, Beef extract, Glucose, Sucrose, Agar, K2HPOs., MgSO,.7H20, NaCl, FeSOs, CaCOa, Na3C6HsO7, NH4H2PO,, CaC];.
3.2.4 Môi trường nuôi cấy
- Môi trường Jenson:
Sucrose 20g K2HPO, lg MgSOx.7HaO 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO, 0,1g CaCOa 2g Agar 20g
15
Trang 28- Môi trường LB (Luria Bertani) bổ sung L - tryptophan:
- Môi trường Simmons Citrate Agar (SCA):
NHaH;PO¿a
KzHPO¿
NaCl
16
Trang 29MgSO, 0,2g Na:CsH:O; 2g Cz;HasBraOsS 0.08g Agar 18g H20 1000mlTất cả hấp ở 121°C trong 20 phút.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thu mẫu, phân tích giá trị pH và độ dẫn điện (EC)
3.3.1.1 Thu mẫu
Thời điểm lay mẫu vao buổi sáng tại 5 vườn chanh ở xã Lương Hòa, Huyện BếnLức, Tỉnh Long An Mỗi vườn chanh thu ngẫu nhiên 3 gốc, thu mẫu xung quanh vùng rễcây chanh ở độ sâu là 20 — 30 em và 20 cm, mẫu sau khi lay được cho vào tui đã tiệttrùng, mẫu được vận chuyên về phòng thí nghiệm va mẫu được trữ lạnh
3.3.1.2 Do giá trị pH và độ dẫn điện (EC)
Các mẫu đất được làm khô tự nhiên ngoài không khí và nghiền nhỏ mẫu có kíchthước khoảng 2 mm Hòa tan dat trong nước với tỷ lệ đất:nước là 1:2 (Jackson, 1973), sau
đó đề tĩnh 30 phút, dùng máy pH và độ dẫn điện (EC) tiến hành đo và đọc kết quả
3.3.2 Phân lập và tuyến chọn vi sinh vật có khả năng cố định đạm
3.3.2.1 Phân lập vi sinh vật cố định đạm
Cân 10 g mẫu dat và bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng khuấytrộn đều mẫu bằng máy lắc trong 1 giờ, để yên 30 phút cho cặn lắng xuống, sau đó dùngpipet vô trùng hút 1ml dich nổi pha loãng mẫu đến 10° với nước muối sinh lý
Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dich đã pha loãng ở 10° vào đĩa petri có môi
trường nuôi cấy Jenson, dùng que cấy trang thủy tinh phân phối dịch mẫu đều khắp mặtthạch, sau đó ủ trong tủ ủ vi sinh ở 35°C 3 - 5 ngày.
Sau 3 — 5 ngày quan sát và chọn khuẩn lạc đặc trưng có khả năng có định đạm,dùng que cấy vòng cấy truyền tiếp lên đĩa thạch chứa môi trường Jenson đến khi hình tháikhuẩn lạc trên đĩa đồng nhất, mã hóa tên chủng và tiến hành lưu trữ giống
17
Trang 30Từ vi sinh vật đã được làm thuần, dùng que cấy vòng cấy truyền vào ống thạchnghiêng môi trường JenSon, sau 3 — 5 ngày vi sinh vật phát triển cho ống thạch nghiêngvào môi trường lạnh khoảng 4°C dé bao quản.
3.3.2.2 Đánh giá khả năng cố định đạm của vi sinh vật đã phân lập
Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc có khả năng chịu mặn và cô định dam đã làmthuần lên đĩa petri có môi trường thạch Jenson có bổ sung 0,05% Bromthymol blue, chovào ủ trong tủ ủ vi sinh ở 35°C 1 - 2 ngày.
Chuan bị đối chứng âm bang cách đổ môi trường Jenson bổ sung 0,05%Bromthymol blue vào đĩa petri và không cấy chủng vi sinh vật vao
Tiến hành đọc kết quả với đối chứng âm:
Dương tính (+): Đường ria có xuất hiện khuẩn lạc và phản ứng đổi sangmàu vàng thì chủng vi sinh vật có kha năng cố định đạm
Âm tính (-): Đường ria chỉ xuất hiện khuẩn lạc không có phản ứng đổi sangmàu vàng thì chủng vi sinh vật không có khả năng cố định đạm
Thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần
3.3.2.3 Dinh tính khả năng cố định dam của vi sinh vật
Các chủng đã được kiểm tra khả năng cố định đạm cho kết quả dương tính đượccho vào bình thủy tinh dung tích 500 ml, chứa 100 ml môi trường NB mang lắc tăng sinhtrên máy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng (35 - 37°C)
Sau đó dùng pipet vô trùng hút 5 ml dich tăng sinh cho vào ống nghiệm được kýhiệu theo mã hóa từng chủng, tiếp theo cho vào mỗi ống Iml thuốc thử Nessler chờkhoảng 5 phút và tiến hành đọc kết quả
Đối chứng âm là ống nghiệm chứa 5 ml dung dich tăng sinh NB (Nutrient broth)
Trang 313.3.2.4 Định lượng khả năng cố định đạm của vi sinh vật
Cân amoni sunfat (NH4)zSO¿ cho vào cốc thủy tinh chứa nước cất, ta được nồng độdung dich (NH1)2SOx được thé hiện ở bảng 3.1 Dùng pipet hút 1 ml dung dich (NH4)2SOu
ở các nồng độ vào ống nghiệm và thêm | ml thuốc thử nessler chờ phan ứng tạo màukhoảng 5 phút, sau đó cho vào cuvet tiến hành do hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 450
nm Ghi kết quả, dùng phần mềm microsoft excel lập đồ thị, ta có được phương trìnhtương đương Đường chuẩn NH' được dựng dựa vào phương pháp đo quang phổNesslerization Nồng độ của amoniac được ước tính bằng cách sử dụng đường chuẩn củaamoni sunfat (NH4)zSO¿ trong khoảng 0 — 2,5 nmol/ml.
Các vi sinh vật đã được định tính khả năng cố định đạm cho kết qua dương tinhđược cho vao bình thủy tinh dung tích 500 ml, chứa 100 ml môi trường NB mang lắc tăngsinh trên máy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng (35 - 37°C)
Dùng pipet vô trùng hút 15 ml dịch tăng sinh vào ống falcon dé ly tâm 10000vòng/phút trong 5 phút dé loại bỏ cặn, sau đó thu dịch nổi
Hút 1 ml dich nổi vào ống nghiệm và thêm 1 ml thuốc thử Nessler chờ phản ứngtạo màu khoảng 5 phút, sau đó cho vào ống cuvet tiến hành đo hấp thụ quang (OD) ởbước sóng 450 nm, ghi kết quả
Đối chứng chứa 1 ml dung dịch tăng sinh không nuôi cấy vi khuẩn va 1 ml thuốcthử Nessler.
Thí nghiệm được bồ tri lặp lại 3 lần
Bảng 3.1 Néng độ dung dịch (NH4)zS5O¿ xây dựng đường chuẩn.
Cốc 1 2 3 4 5 6Nong độ mol (NH¿);SO¿ (M) 05 i 15 2 23
Khối lượng (NH4)2SO4 (g) 0 0,66 1,32 1,98 2,64 3,30
Nước cat (ml) 10 10 10 10 10 10
19
Trang 323.3.3 Phân lập và tuyến chọn vi sinh vật có khả năng sinh tong hợp IAA
3.3.3.1 Phân lập vi sinh vật sinh tổng hợp IAA
Cân 10 g mẫu đất và bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng khuấytrộn đều mẫu bằng máy lắc trong 1 giờ, để yên 30 phút cho cặn lắng xuống, sau đó dùngpipet vô trùng hút 1ml dịch nỗi pha loãng mẫu đến 105 với nước muối sinh lý
Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml dich đã pha loãng ở 10 vào đĩa petri có môi
trường nuôi cây Burk’s không dam, dùng que cấy trang thủy tinh phân phối dich mẫu đềukhắp mặt thạch, sau đó ủ trong tủ ủ vi sinh ở 35°C 3 - 5 ngày
Sau 3 — 5 ngày quan sát và chọn khuẩn lạc đặc trưng có khả năng cố định dam,dùng que cấy vòng cấy truyền tiếp lên đĩa thạch chứa môi trường Burk’s không đạm đếnkhi hình thái khuẩn lạc trên đĩa đồng nhất, mã hóa tên chủng và tiễn hành lưu trữ giống
Từ vi sinh vật đã được làm thuần, dùng que cấy vòng cấy truyền vào ống thạchnghiêng môi trường Burk’s không dam, sau 3 — 5 ngày vi sinh vật phát triển thì cho ốngthạch nghiêng vào môi trường lạnh khoảng 4°C dé bao quản
3.3.3.2 Dinh tính khả năng tong hợp [AA của vi sinh vật
Các vi sinh vật đã được phân lập làm thuần trên môi trường Burk’s không đạm chovào bình thủy tinh dung tích 500 ml, chứa 100 ml môi trường LB (Luria Bertani) có bốsung L - tryptophan mang lắc tăng sinh trên máy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng (35 -57°C).
Hút 15 ml dịch tăng sinh vào ống falcon bang pipet vô trùng, dem ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút dé loại bỏ cặn, thu dịch nỗi
Cho vào ống nghiệm 1 ml địch nổi và 1 ml thuốc thử Salkowski dung máy vortextrộn đều hỗn hợp rồi đem ủ trong tối 30 phút, sau đó tiền hành đọc kết quả
Đối chứng là ống nghiệm chứa 1 ml dung dich tăng sinh LB không nuôi cấy vikhuẩn và 1 ml thuốc thử Salkowski dùng máy vortex trộn đều hỗn hợp ủ trong tối 30phút.
Chỉ tiêu đánh giá:
Dương tính (+): Dịch tăng sinh có phản ứng tạo màu với thuốc thửSalkowski chuyển sang màu hồng hoặc đỏ
20
Trang 33Âm tính (-): Dịch tăng sinh không phản ứng tạo màu với thuốc thửSalkowski.
3.3.3.3 Dinh lượng kha năng sinh tong hợp IAA của vi sinh vật
Phương pháp tiến hành: theo Gordon và Weber (1951)
Cân 10 mg IAA cho vào bình định mức 10 ml thêm nước cat đến vạch định mức tađược dung dịch chuẩn gốc IAA có nồng độ 1000 ug/ml, chuẩn bị 10 bình định mức 10 mlđánh số từ 1 đến 10 Dùng pipet hút dung địch chuẩn gốc IAA vào bình định mức 10 mltương ứng với các nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ug/ml rồi thêm nước catđến vạch định mức, trộn đều Hút 2 ml ở các nồng độ vào ống nghiệm và thêm 8 ml thuốcthử Salkowski ủ trong tối 30 phút, đo OD ở bước sóng 530 nm ghi được kết quả lập đồ thịđường chuẩn có được phương trình tương đương
Các chủng đã được phân lập làm thuần trên môi trường Burk’s không đạm cho vaobình thủy tinh dung tích 500 ml, chứa 100 ml môi trường LB có bổ sung L - tryptophan,đem lắc tăng sinh trên máy lắc trong 48 giờ
Hút 30 ml dich tăng sinh vào ống falcon bằng pipet vô trùng, dem ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn, thu dịch nỗi
Hút 2 ml dich nỗi vào ống nghiệm và thêm 8 ml thuốc thử Salkowski ủ trong tối 30phút, sau đó cho vào ống cuvet tiến hành đo hap thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm vaghi kết quả
Mẫu đối chứng hút 2 ml dung dich tăng sinh LB không nuôi cấy vi khuan va 8 mlthuốc thử Salkowski dùng máy vortex trộn đều hỗn hợp ủ trong tối 30 phút
Thí nghiệm được bồ trí lặp lại 3 lần
21
Trang 343.3.4 Đánh giá khả năng chịu mặn của vi sinh vật được tuyển chọn
Vi sinh vật có khả năng cố định dam được tăng sinh trong môi trường NB có bésung NaCl lần lượt là: 2%, 4%, 6% Lắc tăng sinh trên máy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độphòng (35 - 37°C), sau đó dùng pipet vô trùng hút 1 ml dich tăng sinh pha loãng đến 10°,
107, 10 Hút 1 ml dịch pha loãng ở 105, 107, 10°, cay khuẩn lạc vào môi trường NAbằng kỹ thuật cấy đồ Ủ trong tủ ủ vi sinh ở 35°C 1 - 2 ngày Đếm số khuẩn lạc trên đĩathạch, ghi kết quả và thay vào công thức tinh được mật độ CFU/ml
Vi sinh vật có khả năng tông hợp IAA được tăng sinh trong môi trường LB có bổsung NaCl lần lượt là: 2%, 4%, 6% Lắc tăng sinh trên máy lắc trong 48 giờ ở nhiệt độphòng (35 - 37°C), sau đó dùng pipet vô trùng hút 1 ml dich tăng sinh pha loãng đến 107,10%, 10° Hút 1 ml dich pha loãng ở 107, 10°, 10°, cay khuẩn lạc vào môi trường NAbằng kỹ thuật cấy đồ U trong tủ ủ vi sinh ở 35°C 1 - 2 ngày Đếm số khuẩn lạc trên đĩathạch, ghi kết quả va thay vào công thức tính được mật độ CFU/ml
ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ ¡
V: Thể tích dịch mẫu cấy và ở trong mỗi đĩa
fi: Độ pha loãng tương ứng.
Thí nghiệm được bồ trí lặp lại 3 lần
22
Trang 353.3.5 Kiểm tra hình thái, sinh hóa và định danh sinh học phân tử vi sinh vật chịumặn có khả năng cố định dam va tong hop IAA cao nhất.
3.3.5.1 Kiểm tra hình thái, sinh hóa vi sinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm
và tong hop IAA cao nhất
Nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp đặc biệt do nhà khoa học Dan Mạch Chriatian Gram tìm ra năm 1884.
Nguyên tắc: khi nhuộm theo phương pháp này, ở vi khuân Gram dương có lớp vỏ
tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có mau tím, còn vi khuẩn Gram âm co lớp vỏ tế bao
mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) và được bao bọc bởi một mảng mỏng sẽ có màu
hong
Cách tiến hành: cho một giọt nước cat lên lam kính sạch, dùng que cấy lay một ítsinh khối vi khuẩn (sau khi cấy 24 giờ), dàn đều và dé khô tự nhiên Ho nhanh vết bôitrên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần để có định tế bao Phủ hoàn toàn lên vết bôi với thuốcnhuộm crystal violet, để yên trong 30 giây sau đó nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm bangnước, thấm khô Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 30 giây, rửa nước, thấm khô
Giữ lam kính ở góc nghiêng nhỏ và cần thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang quavết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo Ngay lập tức rửa vết bôi lạivới nước Vết bôi dày có thé cần phải được khử màu lâu hơn Tuy nhiên thời gian dé vếtbôi tiếp xúc với cồn không nên lâu quá 5 giây Thời gian khử màu bước này đóng vai tròquan trọng quyết định kết quả của quá trình nhuộm
Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và dé yên trong 30 giây, rửa lại với nước Thamkhô phiến kính với giấy thấm một cách nhẹ nhàng Khi phiến kính khô hoàn toàn, quansát dưới kính hiển vi với vật kính dầu 100X
Kết quả vi khuẩn Gram dương có màu xanh tím, vi khuẩn Gram âm có màu hồng.Kiểm tra khả năng di động
Nguyên tắc: vi sinh vật di động nhờ cau trúc protein được gọi 1a tiêm mao có ở vikhuẩn hình que, hình cầu Khả năng di động là một trong những đặc điểm có thể được
23
Trang 36dùng dé phân biệt giữa các vi sinh vật, có thé quan sát dựa vào sự tăng trưởng và di độngcủa vi sinh vật vào bên trong môi trường thạch mềm.
Cách thực hiện: chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường NB cho chủng vi sinh vật
có kha năng cố định dam va LB cho chủng vi sinh vật có khả năng tong hợp IAA bé sung0,5% agar cao 5 - 6 cm, hấp khử trùng Dùng que cấy thang thu sinh khối từ khuẩn lạcthuần và đâm thắng que cấy xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm tới độ sâukhoảng 2 - 4 cm U ở 35°C trong 24 giờ và quan sát
Đọc kết quả thử nghiệm là dương tính (+) khi vi sinh vật mọc lan khỏi đường cấy
và làm dục môi trường xung quanh, âm tính (-) khi vi sinh vật chỉ mọc dọc theo đườngcấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong
Kiểm tra citrate
Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có kha năng sử dung citrate làm nguồn carbon duynhất dé thu lấy năng lượng và vật chất Sự biến dưỡng citrate thường thông qua sự kếthợp với acetylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình tricarboxylic acid (chu trìnhKrebs) Sản phẩm biến đưỡng citrate thay đổi tùy pH của môi trường Khi pH tăng, môitrường chuyển sang kiềm, lượng acetate và formate tạo thành sẽ tăng trong khi lactate vàCO: giảm Ở pH trung tính sản phẩm chủ yếu là CO và acetate Ở pH acid, sản phẩm tao
ra chủ yếu là acetoin và lactate Như vậy sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo raCO: làm kiềm hóa môi trường Mặt khác mọi vi sinh vật có khả năng sử dung citrate làmnguồn carbon duy nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất
Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn dam trong môi trường sẽ sinh NH;làm kiềm hóa môi trường Như vậy trong môi trường thử nghiệm khả năng sử dụng citratelàm nguồn carbon duy nhất có chứa đạm ở dạng muối ammonium, khả năng tăng trưởngcủa chủng sẽ thể hiện qua khả năng biến dưỡng nguồn carbon citrate và nguồn đạm
ammonium làm tang giá tri pH của môi trường Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị
bằng sự đôi màu của chỉ thị pH trong môi trường
Tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate là môitrường ran Simmons Citrate Agar (SCA) Môi trường SCA chứa sodium citrate làmnguồn carbon duy nhất, chi thị bromothymol blue Chung thuần được cấy ria trên bề mặt
24