Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng cố định đạm và sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA tại vùng trồng lúa bị xâm nhập mặn tỉnh Long An

Nguyễn AnhHuy và ctv, 2018 Xuất phát từ ý tưởng trên đề tài tập trung nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng rễ có khả năng chịu mặn, có định đạm và chủng có khả năng bồ sung chất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRUONG ĐẠI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HOC

TUYẾN CHON VI SINH VAT CÓ KHẢ NĂNG CÓ ĐỊNH DAM VÀ SINH TỎNG HỢP CHÁT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG IAA TẠI

VUNG TRONG LUA BỊXÂM NHAP MAN TINH LONG AN

Nganh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh viên thực hiện : LAI NGUYEN NHẤT SANG

Mã số sinh viên : 19126148

Niên khóa :2019— 2023

TP Thủ Đúc, 03/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP

TUYẾN CHỌN VI SINH VAT CÓ KHẢ NANG CÓ ĐỊNH DAM VÀ

SINH TỎNG HỢP CHÁT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG IAA TẠI VUNG TRONG LUA BỊXÂM NHAP MAN TINH LONG AN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS LÊ THỊ ANH HONG LAI NGUYÊN NHẤT SANG

Tp Thủ Đức, 03/2024

LỜI CẢM ƠN

Dé hoàn thiện bài khoá luận này, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quýthầy cô trong Khoa Khoa học Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tìnhgiảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học

tại trường.

Em xin cảm ơn TS Lê Thị Anh Hồng, người đã định hướng, đồng hành và hỗ trợ em

từ những ngày đầu nghiên cứu Đồng thời em muốn cảm ơn tất cả các anh, chị công tác tại

Phòng Công Nghệ Biến đổi Sinh học, Viện Sinh học Nhiệt Đới đã luôn giúp đỡ em thêmcác kinh nghiệm và kiến thức dé hoàn thiện khoá luận

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình va bạn bè đã luôn ủng hộ và động viên dégiúp em có thêm sức mạnh dé vượt qua khó khăn và hoàn thiện bài nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn tât cả mọi người.

TP Thủ Duc, 03/2024

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Lại Nguyễn Nhất Sang, MSSV: 19126148, Lớp: DHI9SHA thuộc ngànhCông nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây làKhóa luận tốt nghiệp do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong

nghiên cứu là hoàn toàn trung thực và khách quan Tôi xin hoàn toan chịu trách nhiệm trước

Hội đồng về những cam kết này

TP Thủ Đức, tháng 03, năm 2024

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

ul

TÓM TẮT

Trong nghiên cứu này nhằm phân lập được các chủng vi sinh vật có lợi từ các khuVỰC trồng lúa từng bị nhiễm mặn vào năm 2020, sau đó tuyển chọn và định danh các chủng

có khả năng chịu mặn, có định đạm, sinh IAA, làm cơ sở cho việc ứng dụng các chế phẩm

vi sinh cho vùng trồng lúa bị xâm nhập mặn Từ các mẫu đất được thu nhận từ các vùngtrồng trồng lúa tại huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An đã tuyển chọn 19 chủng có kha năng cốđịnh dam bằng phương pháp Nessler với hàm lượng amoni được sinh ra từ 0,7714 - 3,0516umol/mL Đối với các chủng có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA đã tuyểnchọn được 12 chủng bằng phương pháp Salkowski với hàm lượng IAA được sinh ra từ5,045 — 65,822 ug/mL Tuyén chon được 3 chủng 112-30, 2L3-20, 2L3-30 là 3 chủng cóhàm lượng amoni sinh ra là cao nhất và 3 chủng 1L4-20B, 2L4-20B, 2L5-20B có khả năngsinh tông hợp IAA cao nhất Khảo sát khả năng chịu mặn bằng phương pháp cấy dé dia ởcác nồng độ muối cơ bản và 2%, 4%, 6% cho thấy đa số các chủng vi sinh vật đều có khảnăng sinh trưởng ở nồng độ muối cao nhất là 6%, trong đó chủng 1L2-30 có tên khoa họcBacillus subtilis là chủng có khả nang có định đạm và chịu mặn cao nhất Chủng 1L4-20B

có tên khoa học Bacillus amyloliquefaciens là chủng có khả năng sinh IAA và chịu mặn

cao nhất

Từ khóa: Bacillus spp., có định đạm, IAA, chịu mặn

1H

In this study, we aim to isolate beneficial microbial strains from rice growing areas that have been contaminated with salinity in 2020, then select and identify strains with salt- tolerant, nitrogen fixation, [AA production, as a basis for the application of microbial preparations to rice-growing areas subject to saltwater intrusion From soil samples collected from rice-growing areas in Thu Thua district, Long An province has selected 19 strains capable of nitrogen fixation by Nessler method with ammonium content produced from 0.7714 - 3.0516 umol/mL For strains capable of producing growth stimulants, [AA selected 12 strains by Salkowski method with content IAA is produced between 5.045 and 65.822 g/mL Selected 3 strains 1L2-30, 2L3-20, 213-30 are the 3 strains with the highest ammonium content and 3 strains 1L4-20B, 2L4-20B, 2L5-20B have the highest IAA biosynthesis ability Surveying salt tolerance by plate culture method at basic salt concentrations and 2%, 4%, 6% showed that most microbial strains are capable of growing

at the highest salt concentration of 6%, of which strain 1L2-30 with the scientific name Bacillus subtilis is the strain with the highest ability to fix mtrogen and tolerate salt Strain 1L4-20B, scientific name Bacillus amyloliquefaciens, 1s the strain with the highest ability

to produce IAA and salt tolerance.

Key words: Bacillus spp., IAA, nitrogen fixation, saline stress.

IV

MỤC LỤC

TẤN BAN TỪ uaauendasniasesstsotniintittusfirttGaSG01600101080ã0G006:00910001003)130601001300000T800561400/4000NG/01008 iXÁC NHAN VA CAM DOAN ecesssssssssssessssessesessesssessssessuessvessusesssessisesssessuesssssessesssesesseesseess ii

Le TIẾT sussstnaduakoiotistoosgtsrdgiptistoitsttsiSgiB0G0010300000085100101001109010H01001gg0480104G01g01 0pg54iggcgssl iii

Ì;3;, Nội dung THỮG THIẾT cscs gen nh o0 008S00GE1G DTĐISSIGRIGGSGNGETESEIGGSENIISSRUNESEIRGUSONEGEEEGRGEEHHSISNGYSSEEtuaRN 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TAL LIỆU -22-22222222EE222EEEE22222252222251222221222222222222e, 3

2.1 Tình hình nhiễm mặn của nền nông nghiệp Việt Nam 2 2222222222222222zz+ 32.1.1 Khái niệm về xâm nhập mặn 2 2¿++t£2E++2EEE2EE122112271127112711711.2211 211.1 32;l„2„ Cáo yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm HH 012 eee errr eee 3

2.1.3 Hậu quả của sự xâm nhập mặ n - 2 252222 SE SE E2EE9EE1E 121121 12111 111151 11 c2 4

2.1.4 Ảnh hưởng của đất bị nhiễm mặn đối với sự phát triển của OY WO rarinsnossonsbssa 4

2.1.5 Xam nhập mặn tại tinh Long An ou eee eeececcesesceseseseesceecseeceseescsceseescecseeeeseeaeeeeaeees 6

2.2 Cơ chế tác động của vi sinh vật kích thích sinh trưởng vùng rễ (PGPR) 62.2.1 Vi sinh vật cố định đạm - 2-2 ©©+2+2E+22EEE+EEE271127111271171112111711.111211.2.11 11 xe 62.2.2 Vi sinh vật có khả năng sinh tong hợp chất kích thích sinh trưởng IAA 8

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước tuyên chon vi sinh vật giúp giảm stress do han Man và lane natie sual Cay MONE asses sccrsemeseecessrnemeenr nuns desea ENERO 9

2.4 Cac nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của các vi sinh vậtchịu mặn có khả năng có định đạm và sinh TA A -2¿©2222++2EE£2EEE22EEE22EE2+EEztzrzere 10CONG SWAT LIHT VÀ FHUOHHT EHẨP sscscnscnsscasanssarscanssanissnsssssnnsnascnssemnanncesixoie T83.1 Thời gian vã địa điềm ngiiền đÍtu Hang ghHgggdymLcg0.1aggngeicce 12

3.2 Vat GU TSIEN GỮNcasseninnunntogg DEög ổn ihgiBĐNg Sãt3A3G3Đ4RGGIANRSSISĐISSESLG.4G83:80593G.G3S3SGG48R3SE.38838KG11A88 12

SN? oán co 8 123.2.2 Dụng cụ và thiết bị 2-5522 2 122111211122111211122112 11211 21121 eeereg 123.2.3 Hoá chất và môi trường, -¿+++2+2+EE++2EE122212271127112711211127112111211 2.11 e6 12

3.3 Phuong phap nghién CU 1 13

3.3.1 Phương pháp thu mau ooo ccssssssesssesseesssesssssssessessuesseesesssessessessusesseesuessueeseesees 133.3.2 Kiểm tra giá trị pH và độ mặn của đất - 22 22¿+22E2222212222212222112721222212 xe 13

3;3.3 Phương pháp phan lap vi sinh Vat c:ssccsscscccsci6s2s bi 06 20140314584664805643085530340443610 40806605086) 13 3.3.4 Các phương pháp thử nghiệm sinh hoa 5-2522 52+ S2+2£+£+E+eEzE+tzexsrreesrzerssee 14

3.3.5 Xác định khả năng có định đạm của vi sinh vật -2-522+2E22EE+2EE2EEezrxrrrseee 16

3.3.5.1 Định tính khả năng cố định đạm ©2sS2xS2E112211127112221121112211211 211 re 16

3.3.5.2 Định lượng khả năng cô định đạm của các chủng vi sinh vật - 183.3.6 Xác định khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA của vi sinh vật 18

3.3.6.1, Dinh tinh kha nang sinh TAA :::::áczzzc ga g6 5101:1058 Lá 14 G4 1183 141381348115151838531 12.6830ã8 18 3.3.6.2 Định lượng khả năng sinh [AA - ese - 52222 2222222222E2315E2E2212522121 222121 19

3.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của vi sinh vật 20

3.3.8 Phương pháp định danh sinh học phân tử: 5-2 555+<+£+t++zsessersreeerrrrreree 20

3.4 Phương pháp phân tích số liệu 22+2222EE++2+2EEE+222EEE22222232222221222222122222122 xe 22

CUT A, ET 3161 is TEA OU 0S TT“ 33

VI

4.1 Kết quả đo pH và độ mặn của mẫu đất phân lập -¿222222+z+222z2+2z+ze2 234.2 Kết quả phân lập và tuyên chọn vi sinh vật có khả năng có định đạm 244.2.1 Kết quả phân lập và một số đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật 244.2.2 Kết quả định tính khả năng cố định đạm - -22©2222EE+22EEE22EEEE2222E2222EEezEErcee Z54.2.3 Kết quả định lượng khả năng cô định đạm của các vi sinh vật - 27

4.2.4 Khao sat các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng có định đạm 29

4.3 Kết quả phân lập và tuyên chọn vi sinh vật có kha năng sinh [AA - 314.3.1 Kết quả phân lập và đặc điểm hình thái cla các vi sinh vật 2+ 314.3.3 Kết má định tính khá năng ginh TÀA se -20.20238.2 H0,1211,.secuE 324.3.3 Kết quả định lượng khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật - 334.3.4 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của các chủng sinh JAA 354.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của các vi sinh vật 374.4.1 Khả năng chịu mặn của các chủng vị sinh vật cố định đạm -5-+cscc¿ 37

4.4.2 Khả năng chịu mặn của các chủng vị sinh vật sinh LAA 55-555 55=5s+s 38

4.5 Kết quả định danh sinh học phân tử -22222V22+2+222EE22+++22EEE22+22222222222222eexcr 39CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, ©22++2++EEEEEE+22EE2211222112111211221 E1 cee 43

5.1 Kết luận -©scSxc2E1221122112211111 T11 111 11 t1 nàn 1n 111 11a e 43SE? ha 43TÀI LIEU THAM KHẢO 2.- 22 5<+22E222EE22EEE2EEEESEEE22E1127112111271121112111211122112 c6 44

0800/20 mm 0

vu

: Electrical Conductivity

: Gam

: hecta : Indole-3-acetic acid : Kilodalton

: Luria Bertani : Nutrient Agar : Nutrient Broth : National Center for Biotechnology Information

: nanometre

: Triple sugar iron

: Tiêu chuẩn Việt Nam

: Optical Dentisy: Mật độ quang : Plant growth promoting rhizobacteria : Vi sinh vật

vill

DANH SÁCH CAC BANG

Trang

Đáng RA Dern trừng: h0 TY STDDTRĨ sueesteugesintsinidelontrlotoiengilikBichES4006090441000)000100039016 0165 20 Bảng 3.2 Dựng đường chuẩn [AA -2-©22222E+222EE12222122271112221122211221112211 22c 22 Bảng 4.1 Kết quả đo pH va EC của từng mẫu đất 22-©222222222z22222zstrrzeee 23

Bảng 4.2 Đặc điểm, hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường Jensen 24

Bảng 4.3 Khả năng đổi màu môi trường của từng chủng vi sinh vật bằng DiOfTGIEHTHGI BING es sccerecosssancssirens tans n0181.1013ocsdeirriosieEgnildeipjBisdgilkniigt8gainu uS32uEagkiouissiobnaaufulaariSossisiE 25 Bảng 4.4 Kha năng đổi mau môi trường của từng chủng bằng thuốc thử Nessler 27

Bảng 4.5 Kết quả khả năng cô định đạm của các chủng vi sinh vật 28

Bảng 4.6 Đặc điểm hình thái và tế bào của ba chủng vi khuẩn có định đạm 30

Bang 4.7 Kết quả phan ứng sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn cố định đạm cao 31

Bang 4.8 Đặc điểm, hình dang khuẩn lạc phân lập trên môi trường Burk’s không 14066 32

Bảng 4.9 Khả năng đồi màu của từng chủng khi tác dụng với thuốc thử Salkowski 33

Bang 4.10 Kết quả hàm lượng IAA của các chủng sinh ra -©zc25cz+¿ 34 Bảng 4.11 Đặc điểm hình thái và tế bào của 3 chủng vi khuẩn sinh IAA cao 35

Bang 4.12 Kết qua thử nghiệm phản ứng sinh hóa của 3 chủng vi khuẩn 36

Bang 4.13 Mật độ các chủng trên môi trường NB có 0,8%, 2%, 4%, 6% NaC] 37

Bảng 4.14 Mật độ các chủng trên môi trường LB có nồng độ 0,5%, 2%, 4%, 6% 38

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 4.1 Khả năng làm đổi màu môi trường của các vi sinh vật 25

Hình 4.2 Kha năng đôi màu môi trường khi tac dụng với thuốc thử Nessler 26

Hình 4.3 Đặc điểm hình thái của các vi sinh vật cố định đạm đã tuyển chọn 30

Hình 4.4 Đặc điểm tế bào của các chủng cố định đạm ở độ phóng đại 100X 30

Hình 4.5 Khả năng đôi màu khi tác dụng với thuốc thử Salkowski 32

Hình 4.6 Đặc điểm hình thái vi sinh vật sinh IAA đã tuyển chọn 35

Hình 4.7 Đặc điểm tế bào của các chủng sinh IAA ở độ phóng đại 100X 36 Hình 4.8 Kết quả khuếch đại mẫu 1L2-30 và 1L4-20B -©222s222sz+css2 39

Hinh 4.9 Cây phát sinh chủng loại chủng 1L2-30 2-5252 5222222>2>z++>eczs+s 41 Hình 4.10 Cây phat sinh chủng loại chủng 1L4-20B -5 2 52<2222+2£2<+e+zsczxss 4]

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, hiện tượng xâm nhập mặn diễn biến vô cùng phức tạp, đặcbiệt tại các tỉnh Cà Mau, Kiêng Giang, Bến Tre, Tiềng Giang, Long An thuộc khu vực đồngbằng sông Cửu Long Vị trí địa lý nơi đây thuộc hạ nguồn sông Mê Kông, giáp với biểnĐông và có độ cao là thấp so với mực nước biển Tại đây, có các con sông bắt đầu từ thượngnguồn sông Mê Kông, dẫn nước trực tiếp ra biển theo 9 nhánh Vào mùa khô từ tháng 3hay tháng 4, nước sông bắt đầu cạn dần do không có mưa Mức độ nhiễm mặn trong thời

kỳ mùa khô tại nơi đây càng có xu hướng gia tăng qua từng năm Hiện tượng thiên tai này

tác động tiêu cực đến đời sống sinh hoạt và nền kinh tế của con người Đồng thời, các côngtác quản lý, trồng trọt, an sinh xã hội của địa phương vô vàn khó khăn

Theo Sở Nông Nghiệp va phát triển Nông thôn vào năm 2020, Long An có diện tíchđất trồng cây hằng năm là 292369,07 ha, tuy nhiên là bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi tìnhtrạng hạn hán và xâm nhập mặn Tháng 4/2020 lượng nước ngọt từ khu vực thượng nguồn

đồ về thấp hơn 5 — 20% so với năm 2016 Nguyên nhân là do các quốc gia thuộc khu vực

thượng nguồn sông Mê Kông day mạnh việc phát triển nông nghiệp, công nghiệp và thuỷ

điện dẫn đến việc thiếu nước ngọt ở vùng hạ nguồn, cùng với việc sử dụng phân bón quá

mức, gió lùa khiến nước biển xâm nhập sâu vào đất liền gây nên hiện trạng đất bị nhiễmmặn Thông thường, khi nước biển xâm nhập vào đất liên, lượng nước ngọt từ những consông từ thượng nguồn chảy về hạ nguồn giúp trung hòa nước mặn đồng thời day ngược rabiển Tuy nhiên trong những tháng mùa khô, thời tiết không có mưa va nước sông bi bốchơi do nắng nóng khiến lượng nước ngọt không đủ đẩy, làm hiện tượng xâm nhập diễn ra

Tháng 4/2020 độ mặn của sông Vam Co Đông đạt 8,1 g/L và sông Vam Cỏ Tây đạt 4 g/L

xâm nhập mặn sâu vào đất liền huyện Thủ Thừa, Bến Lức, Tân Trụ, Thạnh Hoá, Đức Hoà,Đức Huệ Thống kê thiệt hại cho thấy tại huyện Thủ Thừa bị thiệt hại 1700 ha lúa, 1200 hahoa màu và 9100 ha thanh long, đây là huyện chịu thiệt hại nặng nhất ở Long An

Vi sinh vật vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR) là những vi sinh vật cư trútại vùng rễ cây, xung quanh hay trên bề mặt rễ, các vi sinh vật này tác động trực tiếp hoặc

gián tiếp tới sinh trưởng của cây thông qua các cơ chế như: tổng hợp nitơ, tổng hợpphytohormone, giúp cây trồng nhận sắt, điều hoà ethylen làm cho cây trồng ức chế các mầmbệnh Chính vì thế các chủng PGPR có thể giúp giảm nhu cầu sử dụng thuốc trừ sâu vàphân bón hoá học trong sản xuất, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường (Nguyễn Anh

Huy và ctv, 2018)

Xuất phát từ ý tưởng trên đề tài tập trung nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật vùng

rễ có khả năng chịu mặn, có định đạm và chủng có khả năng bồ sung chất kích thích sinhtrưởng giúp cho cây lúa có thể phát triển được khoẻ mạnh ngay trong những khu vực bịnhiễm mặn

1.2 Mục tiêu của đề tài

Tuyển chọn được chủng wi sinh vật chịu mặn có khả năng có định đạm và chủng vịsinh vật chịu mặn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA tốtcho vùngtrồng lúa bị xâm nhập mặn

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Phân lập và tuyển chon vi sinh vật có khả năng cố định đạm

Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh chất kích thích sinh

trưởng IAA.

Nội dung 3: Đánh giá và chọn lọc các vị sinh vật có khả năng chịu mặn.

Nội dung 4: Kiểm tra hình thái, các đặc tính của các vi sinh vật đã tuyển chọn và địnhdanh các chủng bằng phương pháp sinh học phân tử

CHUONG 2 TONG QUAN TAI LIEU

2.1 Tình hình nhiễm mặn của nền nông nghiệp Việt Nam

2.1.1 Khái niệm về xâm nhập mặn

Nước ngọt là nguồn tài nguyên khan hiếm Theo Tổ chức Khí tượng Thế giới năm

2017, chỉ có 2,5% tổng lượng nước trên trái đất là nước ngọt, phần còn lại là nước mặn.Nguồn nước ngọt lớn nhất nằm dưới lòng đất và một phần nước mặt nằm rải rác ở nhiềukhu vực trên thế giới Nước ngầm được sử dụng rộng rãi dé bổ sung cho nguồn nước mặtnhằm đáp ứng nhu cầu nước ngày càng tăng Tuy nhiên, một trong những vấn đề đối với

hệ thông nước ngầm ở những vùng ven biển chính là xâm nhập mặn Theo Trung tâm phòngtránh và giảm nhẹ thiên tai, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2017: Xâm nhậpmặn là hiện tượng nước mặn với nồng độ mặn từ 4%o xâm nhập sâu vào nội đồng khi xảy

ra triều Cường, nước biến dâng hoặc cạn kiệt nguồn nước ngọt.

Ngoài ra, xâm nhập mặn là quá trình thay thế nước ngọt trong các tầng chứa nước ởven biển bằng nước mặn do sự dịch chuyên của khối nước mặn vào tầng nước ngọt Ngắngon hon thì sự xâm nhập mặn là sự tích tụ quá nhiều muối hòa tan trong đất (Elsora và ctv,2012) Xâm nhập mặn là vấn đề nghiêm trọng đối với nhiều chính quyền địa phương, vẫn

dé này đã được nỗ lực giải quyết trong bối cảnh đang diễn ra biến đồi khí hậu như nướcbiển dâng, tăng nhiệt độ, khai thác nước ngầm quá mức dé đáp ứng nhu cau nước cho phát

triển, những nguyên nhân này đang làm tăng nguy cơ xâm nhập mặn

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xâm nhập mặn

Theo Tạp chí Tài Nguyên và môi trường năm 2023, biến đổi khí hậu có thé ảnh hưởngsâu sắc đến chu trình thủy văn thông qua thay đổi mô hình lượng mưa, lượng nước bốc hơi

và độ âm của đất Lượng mưa có thé tăng hoặc giảm và phan bó không đồng đều trên toàncầu Hiện tượng này sẽ làm thay đổi lượng nước ngầm được bổ sung, đồng thời thay đổitốc độ xâm nhập mặn vào tầng ngậm nước ven biển

Lượng nước từ thượng nguồn đồ về, lưu lượng càng giảm, nước mặn càng tiến sâu

vào đất liền

Biên độ triêu vùng cửa sông: vào giai đoạn triêu cường, nước mặn càng lân sâu vào.

Địa hình: Địa hình bằng phẳng là yếu tố thuận lợi cho sự xâm nhập mặn.

Các yêu tố khí tượng: Gió từ biển hướng vào đất liền, nhiệt độ cao, mưa it, sẽ là tacnhân làm mặn lấn sâu vào nội địa

Hoạt động kinh tế của con người: Tác động rõ nét nhất của biến đồi khí hậu là làmthay đổi lớn chế độ dòng chảy trên hầu hết các sông, suối dẫn đến sự suy giảm dòng chảy

nghiêm trọng Ngoài ra, còn làm gia tang tình trang 10 lụt, lũ quét, sat lở bờ sông.

Khai thác quá mức nguồn nước ngầm dé phục vụ cho đời sống nhân dân, phát triển

kinh tế xã hội cũng gây ra sự cạn kiệt nguồn nước Hơn nữa, không có sự bé sung cần thiết

để bù lại lượng nước đã bị khai thác càng làm gia tăng nguy cơ xâm nhập mặn

2.1.3 Hậu quả của sự xâm nhập mặn

Theo Tạp chí Tài Nguyên và môi trường năm 2023, việc xâm nhập mặn dẫn đến lượngmuối trong sông hồ tăng cao, khi dùng nước bị nhiễm mặn tưới cho cây trồng làm cho ápsuất thâm thấu của dung dich đất lớn hơn áp suất thấm thấu của tế bào, sự chênh lệch ápsuất này nêu xảy ra thường xuyên làm cho màng tế bao của cây bị phá vỡ dẫn đến cây trồng

bị chết Không có nước ngọt, nông dân không thé tươi tiêu các loại cây ăn quả, cây hoamàu, lương thực, dẫn đến hệ thông sản xuất nông nghiệp bị trì trệ Hơn nữa đất nhiễm mặn,

gây tác động tiêu cực đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng, khả năng hấpcác khoáng của cây bị hạn chế dẫn đến thiếu các khoáng chất và năng lượng Cây không

thích ứng môi trường mặn xảy ra van dé chết hàng loạt Việc nuôi trồng các giống sản phẩm

thủy sản cũng bị thiệt hại nặng nề do hiện tượng xâm nhập mặn Ảnh hưởng nghiêm trọng

đến nền kinh tế của các hộ dân và địa phương

2.1.4 Ảnh hưởng của đất bị nhiễm mặn đối với sự phát triển của cây lúa

Đây là nhóm dat có thành phan cơ giới nặng, có tỉ lệ sét từ 50 - 60%, tính thấm nướcrất kém, khi ướt thì dẻo, khi khô thì co lại, nứt nẻ và ran chắc nên khó dé làm đất canh tác

Vì đất có chứa nhiều muối như NaCl, NazSOx, NaHCOa, MgCla, MgSO¿ nên áp suất thâmthấu của dung dịch đất sẽ lớn, ảnh hưởng đến quá trình hút nước và các chất dinh đưỡngcủa rễ cây lúa khiến lúa không thé phát triển bình thường được Việc làm tăng áp suất thâmthấu của dung dich đất làm ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của rễ cây Cây chỉ có thé

lấy được nước và khoáng chất khi nồng độ muối hoà tan trong đất nhỏ hơn nồng độ dịch

bào của rễ hay áp suất thâm thấu và sức hút nước của rễ cây phải lớn hơn áp suất thâm thấu

và sức hút nước của đất Vì thế việc độ mặn của đất ở mức quá cao sẽ dẫn đến hậu quả làcây không hút được nước từ đất và còn sẽ mất nước vào đất gây nên hiện tượng mất cân

bằng nước, gây hậu quả làm cho cây bị hạn sinh lý và bị héo lâu dài Khả năng hấp thụ các

chất dinh dưỡng cũng sẽ bị hạn chế dẫn đến thiếu các khoáng chất, thiếu phospho nên quátrình phosphoryl hóa bị kiềm hãm Sự dư thừa các ion trong đất làm rối loạn tính thắm củamàng nên làm rò rỉ các ion ra bên ngoài rễ cây làm cho quá trình trao đổi chất đặc biệt làtrao đối Protein bị rối loạn dẫn đến tích lũy các acid amin trong cây (Nguyễn Đức Thanh

và ctv, 2013).

Ảnh hưởng của độ mặn thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa.Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng cây lúa chịu được mặn trong quá trình nảy mầm nhưngtrở nên rất nhạy cảm trong thời kỳ mạ non Mặc dù chịu được mặn trong suốt thời gian sinhtrưởng sinh dưỡng và chín, cây lúa lại rất nhạy cảm với độ mặn trong thời gian thụ phấn

(Lauchli và ctv, 2007).

Theo Akita (1986), mặn làm giảm diện tích lá của cây lúa Trong điều kiện thiệt hạinhẹ, khối lượng khô có xu hướng tăng lên trong một thời gian, sau đó giảm nghiêm trọng

vì điện tích lá giảm Nếu ảnh hưởng mặn lớn hơn, khối lượng khô của chồi và rễ sẽ giảm

tương ứng Ở giai đoạn mạ, lá già hơn sẽ bị hại nhiều hơn lá non

Năm 1980,Ponnamperuma và ctv đã chỉ ra những biểu hiện đặc trưng nhất về mặt hìnhthái do tốn thương của mặn là cây lúa sinh trưởng, phát triển kém, lá cuốn lại, khô dau lá,phiến lá xuất hiện nhiều cham 16m đốm màu trắng và lá bên dưới bị khô cháy

Theo Singh (2006), hầu hết các thông số như số nhánh ít, bông lép, số hoa trên bông

ít, khối lượng 1000 hạt thấp và cháy lá đều là biểu hiện của sự ảnh hưởng mặn Các triệuchứng chính về mặt hình thái là lá chuyển màu nâu và chết (trong trường hợp mặn kiềm),

cây thấp, đẻ nhánh kém, tăng số bông bất thụ, chỉ số thu hoạch thấp, giảm số hạt trên bông,

giảm khối lượng 1000 hạt, năng suất thấp và thay đổi thời gian sinh trưởng, lá cuốn lại, lákhô trắng, rễ sinh trưởng kém và ruộng lúa sinh trưởng, phát triển không đồng đều Mặtkhác sự suy giảm hàm lượng diệp lục và các sắc tố quang hợp, đường và Proteintrong các

tế bao của lúa cũng bị giảm bởi ảnh hưởng của đất bị nhiễm mặn (Amirjani và ctv, 2010)

2.1.5 Xâm nhập mặn tại tỉnh Long An

Theo Chi cục Phát triển nông thôn và Thủy lợi tỉnh Long An (2020), do ảnh hưởngtriều cường kết hợp gió chướng nên độ mặn của các tuyến sông trên địa bàn tỉnh này dao

động ở mức 0,8 - 20 g/L Theo đó, độ mặn tại huyện Thủ Thừa ở mức báo động Trên Sông

Vam Cỏ Tây độ mặn 4,0 g/L đã đến cống Bắc Đông, xã Mỹ An, huyện Thủ Thừa Trên

sông Vàm Co Đông độ mặn đo được ngày 10/2/2020 là 8,1 g/L Với độ mặn này thì cây lúa

hoàn toàn không thể hấp thu các chất dinh dưỡng cũng như là nước cho sự sinh trưởng vàphát triển của cây

Đánh giá về tình hình hạn, mặn năm 2020, Giám đốc Sở Nông nghiệp và Phát triểnnông thôn tỉnh Long An Nguyễn Thanh Truyền cho rằng hạn mặn năm 2020 nghiêm trọnghơn so với năm 2016 và cũng gây ảnh hưởng rất nhiều đến sản xuất, đời sống sinh hoạt của

bà con Long An có khoảng trên 14000 ha lúa, hơn 10500 ha rau màu, cây ăn trái bị ảnh

hưởng hạn, xâm nhập mặn tại các huyện Tân Trụ, Thu Thừa, Thanh Hóa, Cần Giuộc, CầnĐước, Châu Thành Theo thống kê sơ bộ vào tháng 4 năm 2020, hạn hán kết hợp với xâmnhập mặn đã làm cho 800 ha lúa ở huyện Thủ Thừa tỉnh Long An gần như mất trắng

2.2 Cơ chế tác động của vi sinh vật kích thích sinh trưởng vùng rễ (PGPR)

PGPR có khả năng tăng cường sinh trưởng của cây trồng thông qua cơ chế trực tiếphoặc gián tiếp Cơ chế trực tiếp gồm hoà tan phosphat, cô định dam, tổng hop chất kíchthích sinh trưởng IAA, HCN, phytohormones (auxin, cytokinin, gibberinin) Các cơ chếgián tiếp gồm hoạt hoá ACC deaminase, tổng hop antibiotics và các enzyme thuỷ phân,tăng cường tính kháng hệ thống (Parewa và ctv, 2018) Đề tài sẽ tập trung nghiên cứu chính

về các nhóm vi sinh vật vùng rễ có khả năng có định đạm và sinh tổng hợp chất kích thích

sinh trưởng IAA.

nhánh và phân cành kém, điệp lục không hình thành, lá chuyển màu vàng, hoạt động quanghợp và tích lũy giảm sút nghiêm trọng, làm suy giảm chất lượng và năng suất cây trồng.

Vi sinh vật cố định đạm là nhóm vi sinh vật có vai trò quan trọng nhất trong việc có

định đạm trong đất và cây trồng Hiện nay người ta đã phát hiện ra 600 loài cây trong đó

có cây lúa có vi sinh vật sống cộng sinh có khả năng đồng hóa nitơ thuộc nhiều họ khác

nhau.

Vi sinh vật có thé có định đạm thông qua cộng sinh hình thành các nét san rễ cây đặc

biệt là cây họ đậu bao gồm các chi phô biến như: Rhizobium, Bradyrhizobium, Burkhodelia

Nhóm vi sinh vật này đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình cố định dam trong đất.Trong đó chi Rhizobium là nhóm chính, có khả năng sinh trưởng nhanh và cố định đạm caonhất (Nehra va ctv, 2011) Ngoài ra có một số nghiên cứu cho thấy chi Bradyrhizobiumthuộc nhóm vi khuẩn sinh trưởng chậm, có khả năng có định đạm trên cây lúa (Karthik và

ctv, 2017).

Vi sinh vật không cộng sinh sống tự do trong dat như: Bacillus, Peseudomonas,Azotobacter, Klebsiella, các chủng này có thé tạo ra lượng chất hữu cơ đáng kể Tuy nhiênnhược điểm của nhóm vi sinh vật này đó là sự thiếu hụt nguồn Cacbon và nguồn năng lượng

cho quá trình cố định đạm, vì tiến trình cố định đạm cần nhiều năng lượng Theo Guerinot,(1991) đã nghiên cứu cho thấy một số chủng vi khuẩn ở nhóm này như Bacillus có thé di

chuyển đến gần rễ đề liên kết hoặc sống nội sinh trong rễ cây Sau đây là một số đặc điểmcủa các chi có khả năng có định đạm:

Rhizobium là một chi vi khuẩn gram âm sống trong đất có vai trò cố định đạm.Rhizobium hình thành một nhóm vi sinh vật cộng sinh cố định đạm sống trong rễ của cáccây họ Đậu Vi sinh vật này xâm chiếm tế bào rễ cây tạo thành các nốt san rễ, ở đây các visinh vật này biến đổi nitơ trong khí quyền thành ammonia và sau đó cung cấp các hợp chấtnito hữu cơ như glutamin hoặc ure cho cây Còn cây thì cung cấp các hợp chất hữu cơ cho

vị sinh vật từ quá trình quang hợp.

Bacillus là trực khuẩn gram dương sống rất phô biến trong đất, một số loài có khanăng có đỉnh đạm như B subtilis, B pumilus, B velezensis và là vi sinh vật nội sinh có khảnăng kích thích sinh trưởng của nhiều loại cây trồng như lúa, cao lương, ngô, mía đường

Bradyrhizobium là trực khuan gram âm, hình que sống phổ biến trong đất có thê hìnhthành mối quan hệ cộng sinh với các loài thực vật họ đậu Nhiều loài trong chi này có khảnăng cô định nito trong khí quyền thành các dang có sẵn cho các sinh vật khác sử dụng.

Một số loài đã duoc sử dụng như nguồn phân bón nito thay thế như Ö japonicum và

B elkanii.

Vai trò của vi sinh vật có định dam:

Nhờ khả năng cố định đạm mà vai trò của nhóm vi sinh vật này trong nông nghiệp làrất quan trọng Các vi sinh vật này tiếp nhận nito trong không khí và biến nitơ từ dang cây

trồng không hấp thu được sang dạng hấp thu được, kích thích sinh trưởng ở thực vật bằng

cách tao ra các enzyme như enzyme nitrogenase được sử dụng dé chuyên đổi nitơ thànhamoniac là dạng có thé sử dung cho cây trồng hay tạo ra các hormone thực vật như auxin,cytokinin, gibberinin, đặc biệt các chủng thuộc chi Azotobacter kích thích sự nảy mam củahạt và giúp phát triển hệ rễ của cây trồng Ngoài ra các vi sinh vật có định đạm còn giúpgiảm tác động có hại của mầm bệnh bằng cách cạnh tranh về dinh dưỡng, nơi cư trú haytạo ra các chất kháng sinh, các enzyme thuỷ phân chống lại bệnh sự xâm nhập của các tác

nhân gây bệnh giúp bảo vệ cho cây kí chủ.

2.2.2 Vi sinh vật có khả năng sinh tong hợp chất kích thích sinh trưởng [AA

Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật được xem là những công cu tiềm năng chosản xuất nông nghiệp bền vững và xu hướng phát triển cho tương lai Các nhà khoa họctrên thế giới đã nghiên cứu để tìm hiểu thêm về sự thích nghỉ của vi sinh vật kích thích sinhtrưởng ở vùng rễ, cơ chế của rễ, các hiệu ứng sinh lý, sinh hóa và sự kích thích sinh trưởng

ở những loài này để sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp Các chủng

vi sinh vật kích thích sinh trưởng này có khả năng tổng hợp IAA như chất chuyển hoá thứcấp tham gia vào quá trình hấp thu chất dinh dưỡng cho cây (Datta và Basu, 2000)

IAA là một dang auxin, chat diéu hoa sinh truong cua thuc vat IAA chi phối sự phânchia tế bao, sự co giãn tế bào làm cho tế bao dài ra, phân hóa sinh mô, phát triển trai và hạt

và chi phối giai đoạn đầu sự phát triển của cây trồng kích thích sự nảy mầm của hat và ống

phần Theo Sergeeva va ctv (2002), các nhóm vi sinh vật khác nhau kể cả vị khuẩn đất, vi

khuân biêu sinh, vị sinh vật nội sinh và một sô vị khuân làm đã được phát hiện là có khả

năng sinh tổng hợp IAA, góp phần làm tăng sản lượng cây trồng IAA còn là một trong sốnhững chất kích thích làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ Theo nghiêncứu của Lifshitz (1987), dòng vi khuẩn Bacillus sp giúp gia tăng chiều đài rễ, chiều cao

chéi và tăng hấp thu lân ở cây cải dau IAA từ vi khuẩn làm tăng điện tích bề mặt và chiều

dài rễ giúp thực vật thu nhận được nhiều dinh dưỡng trong đất IAA sinh ra từ vi sinh vậtvùng rễ làm mềm thành tế bào thực vật nên tăng lượng chất tiết ra từ rễ Hợp chất làm thay

đổi nồng độ IAA là tryptophan, đây là tiền chất cần thiết của quá trình tông hợp IAA Có 3

16 trình tiêu biểu nhất cho sự biến đổi của L-tryptophan thành IAA đã được Jinichiro va ctv

(1991),mô tả như sau:

Tryptophan —> indole-3-acetamide — IAA

Carreno va ctv (2000), cũng nhận thấy trong các lộ trình tong hop IAA ở loàiAzospirillum brasilense thì lộ trình indole-3-pyruvic acid là con đường chủ yếu đề tổng hợp

IAA từ tiền chất tryptophan và được xúc tác chú yếu bởi enzym indole pyruvic

Thị Diễm Ái vad ctv (2010), sử dung hai dòng vi sinh vật có định đạm (Azospirillum

lipoferumva Pseudomonas stutzeri) bỗ sung trên lúa ở dang long hoặc dạng viên kết hợp50% phân bón hóa học đã thu năng suất tương đương với nghiệm thức bón 100% phân hóahọc, đồng thời hàm lượng protein trong gạo tăng

Năm 2012 Nabti và ctv đã phát hiện ra rằng vi khuẩn trong đất có khả năng chịu mặntốt giúp cây trồng phát triển tốt hơn mà không gây hại cho con người Những vi khuẩn này

được tìm thấy xung quanh rễ Vi khuẩn Pseudomonas, đặc biệt là Pseudomonasextremorientalis,lavi khuẩn có khả năng kháng mặn và phát triển gan rễ, nơi chúng cạnhtranh với các vi khuân xâm nhập khác Nhóm đã hoàn thành một số thử nghiệm, cả trongnhà kính được bảo vệ và trên cánh đồng, làm việc chặt chẽ với nông dân địa phương Cây

trồng được xử lý bằng phân vi sinh cho năng suất cao hơn 12- 15% so với vi khuẩn thông

thường khi bón cho cà chua và dưa chuột.

2.4 Các nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của các visinh vật chịu mặn có khả năng cố định đạm và sinh IAA

Theo Trần Anh Nguyệt và ctv (2017), đã quan sát khả năng tăng trưởng trên môi trườngYEMA có bổ sung NaCl 0,5 — 4% Sau hai ngày cấy hai chủng vi khuẩn vào môi trườnglỏng nhận thấy rằng có sự khác biệt giữa các nghiệm thức: ở nồng độ mudi đối chứng khôngcấy vi khuẩn thì không có sự phát triển môi trường van trong Ở các nồng độ muối 0,5 -2% 2 chủng phát triển rất tốt làm đục cả môi trường, bat đầu phát triển yếu ở nồng độ 2,5%

Trong khi đó Vũ Văn Dũng (2023), Tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn của 6 chủng

có khả năng sinh IAA cao và cho kết quả hầu như tất cả 6 chủng vi sinh vật đều có khảnăng sinh trưởng ở nồng độ NaCl từ 2 - 5% Tuy nhiên khi tăng nồng độ NaCl càng cao thìmật độ vi sinh vật và khả năng sinh IAA đều bị giảm nghiêm trọng

Theo Upadhyay và ctv (2009),họ đã phát hiện gần như tat cả các chủng Bacillus đều

có khả năng chịu mặn lên đến 8% NaCl

Vào năm 2020 Sangeeta va ctv đã cho thấy rang Pseudomonas sp strain S3 có thé đượcxem như một chat kích thích trưởng thực vật hiệu qua, cai thiện kha năng phục hồi của cây

cà chua trong điều kiện bị nhiễm mặn

Vào năm 2020, Zang và ctv đã phân lập từ rễ lúa 305 chủng vi khuẩn và trong số đó cóđến 162 chủng có khả năng chịu mặn lên đến 15% NaCl

10

Theo Naeima (2018), Khảo sát chủng có kha năng sinh IAA cao nhất mà họ đã phânlập được là Bacillus subtilis ở các nồng độ NaCl 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% Kết quảcho thay mức NaCl mà mà chủng này có khả năng sinh IAA cao nhất là 0,5% và 1% và giữ

được nồng độ IAA ổn định ở các nồng độ muối 1,5% và 2% Trong đó ở mức NaCl 3% thì

khả năng sinh IAA của Bacillus subtilis là thấp nhất

Rodriguez và ctv (2022), Nghiên cứu trên cây cà chua của hai chủng vi khuẩn thuộcchi Enterobacter và Peseudomonas cho thay đây là 2 vi khuân có khả năng kháng mặn và

có khả năng duy trì các hoạt động kích thích tăng trưởng thực vật ngay cả trong điều kiệnnồng độ muối cao, trong đó chủng vi khuẩn thuộc chỉ Peseudomonas đã thê hiện rõ sự kíchthích tăng trưởng và giảm thiểu áp lực do nhiễm mặn đối với cây lúa mạch

11

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 12 năm 2022 đến tháng 07 năm 2023 tại phòng Côngnghệ Biến đổi Sinh học - Viện Sinh học Nhiệt đới, số 9/621 xa lộ Hà Nội, Linh Trung, ThủĐức, Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật có khả năng cố định đạm va sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởngđược phân lập từ mẫu đất trồng lúa nước thu nhận ở huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ: Đĩa petri, pipet, que cấy vòng, que cấy trang, bình tam giác, bình định lượng

500ml, bình định mức 10ml, ống nghiệm, bông gòn, eppendorf, đèn cồn và giá đựng ống

nghiệm.

Thiết bị: Tủ cấy, máy đo pH và EC, máy votex, máy ly tam, máy do OD, cân, nồihấp,

tủ sấy, kính hiển vi và máy lắc

3.2.3 Hoá chất và môi trường

Môi trường Jensen (phân lập vi sinh vật có khả năng có định đạm): Succrose: 20g;

KzHPO¿: 1 g; MgSO4.7H20: 0,5 g; NaCl: 0,5 g; FeSOa: 0,1 g; CaCOs: 2 g; Agar: 20 g; H20: 1000 mL.

Môi trường Burk’s không đạm (phân lập vi sinh vật có khả năng sinh chất kích thích

sinh trưởng IAA): Glucose: 10 g; KHzPO¿a: 0,41 g; KzHPO¿: 0,52 g; Na2SOs: 0,05 g; MgSOx.7H›O: 0,1 g; FeSOa: 0,0025 g; Na:MoÒOa: 0,0025 g, Agar: 15 g; HaO: 1000 mL Môi trường NB: Peptone: 5 g; Beef extract: 3 g; NaCl: 8g; H20: 1000 mL.

Môi trường LB: Peptone: 10 g; Yeast: 5 g; NaCl: 5 g, L-Tryptophan: 1g; H20: 1000 mL.

Thuốc thử: các thuốc thử sinh hóa như Crystal Violet, Safarin, Lugol, Oxy già va cácthuốc thử dùng dé định tính, định lượng như Nessler, Salkowski

12

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phuong pháp thu mẫu

Tiến hành thu mẫu đất trồng lúa ở các ruộng ở huyện Thủ Thừa, tỉnh Long An bằngnhững dụng cụ đã được khử trùng bằng cồn 70°, mẫu sau khi được lay sẽ được bỏ vào túinilon sạch đã được thanh trùng và trữ lạnh trong thùng xốp trước khi được vận chuyên vềphòng thí nghiệm Đất được lay ở 5 mẫu ruộng khác nhau, mỗi mau ruộng sé lấy 5 vị triđất khác nhau và điểm chính xác dé lấy mau là gan các gốc lúa

Cách lấy mau: Mẫu đất được lấy ở độ sâu từ 0 - 30 cm bằng dụng cụ lấy mau đất

chuyên dụng Tại | wi trí lay đất, đất sẽ được chia ra làm 2 phan, 1 phan đất ở độ sâu từ

0— 20 em và | phan đất từ 20 — 30 cm Mẫu sau khi lấy xong sẽ được bao quan ở 4°C.3.3.2 Kiểm tra giá trị pH và độ mặn của đất

Xử lý mẫu: theo Jackson (1973)

Sử dụng 10 g mẫu dat ở tang đất 20 em và 10 g mẫu đất ở tang đất 30 cm trong cùngmột mẫu ruộng Làm khô đất trong không khí trong vòng 24 tiếng

Nghiền nhỏ mẫu và cho vào bình tam giác chứa nước cất vô trùng với tỉ lệ đất nước

là 1:2 Lắc trong vòng 45 phút Sau đó dé yên 15 phút Dùng máy đo pH va EC để kiểm tra

giá trị pH va EC của từng mau Sau khi có kết quả do EC thì tiến hành quy đổi dé có được

độ mặn của đất Độ dan điện EC được quy đổi ra độ mặn của đất là 1 dS/m = 0,64%o độ

mặn (Jan và Amacher, 2020).

3.3.3 Phương pháp phân lập vi sinh vật

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị nước muối sinh lý: sử dụng NaCl 0,9%, chiết ra các ống nghiệm, mỗi ống

nghiệm là 9 mL Sau đó dem hấp khử trùng ở 121°C trong vòng 20 phút

Xử lý mẫu đất: Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 mL nước cất vôtrùng, sau đó lắc 30 phút, lắc ở tốc độ 150 vòng/phút và để yên 15 phút sau khi lắc Hút I

mL địch để pha loãng ở các nồng độ từ 103 - 10°

Đối với phân lập vi sinh vật có khả năng có định dam: Dung pipet vô trùng hút 100

uL mẫu đã pha loãng từ nông độ pha loãng 103 - 10-5 nhỏ giọt vào dia petri có chứa môi

13

trường nuôi cấy Jensen Dùng que cấy trải thủy tinh phân phối dich mẫu trai đều khắp mặtthạch, ủ trong tủ âm ở 35°C trong 48 - 72 giờ.

Đối với phân lập vi sinh vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng IAA: Dùngpipet vô trùng hút 100 HÏ, mẫu đã pha loãng từ nồng độ pha loãng 10°3- 10*nhỏ giọt vàodia petri có chứa môi trường nuôi cay Burk’s không đạm Dùng que cấy trải thủy tinh phânphối dich mau trải đều khắp mặt thạch, ủ trong tủ ấm ở 35°C trong 48 - 72 giờ

Chọn khuẩn lạc: Từ những đĩa petri đã phân lập ở trên, chọn các đĩa có khuân lạcphân bố đều khắp các đĩa với mật độ không quá ít và lựa chọn những khuẩn lạc sinh trưởngnồng độ pha loãng cao Quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc của những khuẩn lạc đó.Lựa chọn những khuẩn lạc có sự khác nhau về hình thái và kích thước tiến hành cấy ria mỗikhuẩn lạc riêng biệt bằng kỹ thuật hộp ria Tiến hành giữ giống các khuẩn lạc đã được làmthuần lên ống thạch nghiên bằng phương pháp cấy ria trên ống thạch nghiêng Giữ giống

trong Eppendorf ở nhiệt độ - 4°C.

3.3.4 Các phương pháp thử nghiệm sinh hoá

Sau khi tiến hành các thí nghiệm định tính, định lượng và chịu mặn chọn ra nhữngchủng có khả năng chịu mặn cao nhất để khảo sát các đặt điểm sinh hóa nhằm tiết kiệmthời gian và hóa chất

Nhuộm Gram

Các phương pháp được dùng dé phân biệt, quan sát các đặc điểm muôi cấy và các

hình thái của vi khuẩn cố định đạm như nhuộm Gram và quan sát gram, hình dạng dướikính hiền vi

Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên lam kính sạch, dùng que cấy lấy một ítsinh khối vi khuẩn (sau khi cấy 24 giờ), đàn đều và để khô tự nhiên Ho nhanh vết bôi trênngọn lửa đèn côn 2 - 3 lần để cố định tế bào Phủ hoàn toàn lên vết bôi với thuốc nhuộmcrystal violet, để yên trong 30 giây sau đó nhẹ nhàng rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước, thấmkhô Nhuộm lại bằng dung dich lugol trong 30 giây, rửa nước, thấm khô

Giữ lam kính ở góc nghiên nhỏ va cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang quavết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo Ngay lập tức rửa vết bôi lại vớinước Vết bôi dày có thể cần phải đuợc khử màu lâu hơn Tuy nhiên thời gian để vết bôi

14

tiếp xúc với cồn không nên lâu quá 5 giây Thời gian khử màu bước này đóng vai trò quantrọng quyết định kết quả của quá trình nhuộm.

Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và dé yên trong 30 giây, rửa lại với nước và dékhô phiến kính Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu100X Vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, cókhả năng giữ phức hợp tím tinh thé -iod (crystal violet) Vi khuẩn gram âm có thành tế bào

peptidoglycan mỏng hơn và thường có thêm lớp mang lipopolysaccharid bên ngoài, không

giữ được màu tím khi rửa qua cồn, nên chỉ màu đỏ tía của thuốc nhuộm kiềm (safarin)

Thử nghiệm Catalase

Catalase thủy phân hydrogen peroxide (HzO2) thành H:O và O2 được ghi nhận qua

hiện tượng sti bọt khí Cách tiến hành: ống nghiệm sau khi thử khả năng di động của vikhuẩn sẽ có sinh khối mọc trên bề mặt thạch Tiến hành nhỏ vài giọt H2O2 3% vào và quansát Nếu thấy sủi bọt khí là catalase đương tính và ngược lại không thấy sủi bọt khí là

catalase âm tính.

Thử nghiệm sử dụng Citrate

Thạch citrate được sử dụng để kiểm tra khả năng sử dung citrate là nguồn nănglượng của vi khuẩn Môi tường có chứa citrate là nguồn carbon duy nhất, muối ammonium

là nguồn nitơ chính Nếu có vi khuẩn phát triển chứng tỏ có sử dụng citrate Khi vi khuẩn

chuyên hóa citrate, muối ammonium sẽ bị giáng hóa thành ammoniac làm kiềm hóa môitrường Chất chỉ thị xanh bromthymol trong môi trường sẽ chuyển từ màu xanh lá cây sangmàu xanh nước biển khi pH trong môi trường trên 7,6

Cách tiến hành:

Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc riêng rẽ (lấy phần phông nhất của khuẩn lạc), sau đó

đốt miệng ống thạch, ria cấy lên bề mặt thạch nghiêng, đậy nắp ống Ủ trong môi trường

hiểu khí 35 - 37°C tối đa trong 4 ngày

Thử nghiệm trên môi trường TSI

Cách tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm chưa môi trường thạch TSI, dùng que cấylay một khuẩn lạc riêng rẽ đâm sâu vào phần thạch cách đáy ống 3 — 5 mm, kéo que cấy

15

lên ria hết phần thạc nghiêng Đặt ống nghiệm thang đứng, ủ ở nhiệt độ phòng và quan sát

trong 1 - 4 ngày.

Nếu chỉ sử dụng Glucose: sau 18 - 24 giờ nuôi cay môi trường bề mặt của ống thạch

nghiêng trở nên có pH và kiềm và phần sâu trong ống có pH acid Trên mặt nghiêng của

môi trường có màu đỏ và phần sâu có màu vàng

Nếu sử dụng ca glucose và Lactose: sau 18 - 24 giờ toàn bộ môi trường đều trở nên

có pH acid và đôi màu môi trường sang màu vàng

Nếu không sử dụng được cả 2 loại đường thì thành phần Peptone có chứa trong môi

trường sẽ được sử dụng dé biến dưỡng năng lượng và vật chất cần thiết cho sự phát triển

của vi sinh vat.

Thử nghiệm kha năng sinh H2S sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng tạo kết tủa màuđen FeS giữa H2S va ion Fe?* của chat chỉ thị frerric amonium citrate hiện điện trong môi

trường.

Kiểm tra khả năng di động

Nguyên tắc: Dựa vào sự quan sát khả năng tăng trưởng và di động của vi sinh vật

trong môi trường thạch

Cách thực hiện: chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường NB ( đối với vi sinh vật cô

định đạm) và môi trường LB( đối với vi sinh vật sinh IAA) chứa 0,5% Agar Dùng que cấy

thẳng thu sinh khối từ khuẩn lạc thuần và đâm thắng que cấy xuyên vào tâm môi trườngtrong ống nghiệm tới độ sâu khoảng 4 - 5 em U ở 37°C trong 24 giờ và quan sát

Nếu vi khuẩn mọc loang theo đường cấy thì có thé kết luận vi khuẩn có khả năng

di động và ngược lại thì không có khả năng di động.

3.3.5 Xác định khả năng cố định đạm của vi sinh vật

3.3.5.1 Định tính khả năng cố định đạm

Có 2 phương pháp định tính khả năng cố định đạm của vi sinh vật:

Phương pháp 1: Định tính khả năng cố định đạm bằng Bromothymol Blue

Cách tiến hành: theo Vincent (1970) Mục dich: sàng lọc những chủng có kha năng

sinh amom cao và loại bỏ những chủng không có kha năng sinh amoni.

16

Chuẩn bị địch nuôi cấy: Tăng sinh chủng vi sinh vật đã được phân lập trên môi trườngJensen trong 48 giờ, lắc ở 150 vòng/phút

Chuẩn bị dia petri chứa môi trường Jensen có bổ sung 0,05% Bromothymol blue.Dùng que cấy ria ria các dịch đã được tăng sinh lên môi trường Trong đó 1 đĩa sẽ cấy ria

4 chủng ở 4 góc đĩa khác để xem sự khác biệt về kha năng đổi màu môi trường của từngchủng Mỗi chủng được lặp lại quy trình trên 3 lần để đảm bảo độ chính xác

Sau 48 giờ quan sát sự đổi màu của môi trường Các chủng làm đôi màu đổi màu sangmàu vàng đậm là những chủng có khả năng sinh amoni cao, bản chất của amoni có mang

tính acid vì vậy khi tác dụng với môi trường có chứa Bromothymol blue thì các chủng có

khả năng có định dam sẽ bị đổi sang màu vàng, ngược lại những chủng không làm đổi màuxanh dương của môi trường là những chủng không có khả năng sinh amoni Tiến hành lựachọn những chủng vi sinh vật làm đổi màu môi trường sang vàng dé thực hiện nội dungđịnh tính số 2 Ching không làm đổi màu môi trường sẽ loại bỏ

Phương pháp 2: Định tính khả năng cố định đạm bằng phương pháp so màu vớithuốc thử Nessler

Cách tiến hành: theo Cappuccino và ctv (1992)

Chuan bị dịch nuôi cấy : Tăng sinh các chủng vi sinh vật vừa được giữ lại ở phương

pháp 1 150 vòng/phút trên môi trường NB trong 72 giờ,

Hút 5 mL dịch được tăng sinh cho vào ống nghiệm, cho 1 mL thuốc thử Nessler vào

va dé yên trong vòng 5 phút xem khả năng đổi màu của từng chủng Mỗi chủng được lặplại quy trình trên 3 lần để đảm bảo độ chính xác Nguyên lý của thí nghiệm này là đo Nessler

có công thức hóa học KazHgl¿ phản ứng với amoni do các chủng vi sinh vật sinh ra dé tạothành một phức hợp có màu vàng đến nâu tùy vào nồng độ amoni được sinh ra Nhữngchủng làm d6i màu thuốc thử sang vàng nhạt cho thấy chỉ có một lượng nhỏ amoni đượcsinh ra Trong khi đó những chủng đổi màu môi trường sau khi tác dụng thuốc thử từ vàngđậm sang nâu sẽ sinh ra lượng amoni là cao hơn và những chủng không làm đối màu thuốcthử là những chủng không có khả năng sinh amoni Lựa chọn các chủng đổi màu môi trường

từ vàng đậm sang nâu để thực hiện nội dung tiếp theo

17

3.3.5.2 Định lượng khả năng cố định đạm của các chủng vi sinh vật

Cách tiến hành: theo Cappuccino và ctv (1992)

Các chủng vừa được định tính có kha năng cé định đạm sẽ được tăng sinh trên môitrường NB môi lắc 150 vòng/phút, sau 72 giờ ly tâm dịch nuôi 10000 vòng/phút trong 15phút dé thu lay dịch trong Hút 1 mL dich sau khi ly tâm trộn với 1 mL thuốc thử Nessler

và giữ yên trong vòng 5 phút Sau khi dịch trộn đã đổi màu từ màu vàng nhạt đến màu nâu

sẽ được đem đo độ hấp thu màu ở bước sóng 450 nm Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Căn cứ vào đường chuẩn Amoni ( y=axtb) với R? > 0,95 để xác định hàm lượng amonisinh ra của từng chủng Nếu hàm lượng amoni sinh ra vượt quá mức cao nhất thì cần phảitiến hành pha loãng mẫu bằng nước cất sao đó kiểm tra lại ở bước sóng 450 nm Mỗi chủngđược lặp lại quy trình trên 3 lần để đảm bảo độ chính xác Lựa chọn 3 chủng có khả năngsinh amoni cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 3.1 Dựng đường chuẩn amoni

Ông nghiệm | 2 3 4 5 6

Nong độ mol 0 0,5 1,0 II: 2,0 2,5 (NHs)2SO4(M)

Khối lượng 0 0,66 1,32 1,98 2,64 3,30(NH4)2SO4 (g)

Nước cat (mL) 10 10 10 10 10 10

3.3.6 Xác định kha năng sinh chat kích thích sinh trưởng IAA của vi sinh vật

3.3.6.1 Dinh tính kha nang sinh IAA

Phương pháp tiến hành: theo TCVN 10784:2015

Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Các chủng đã phân lập được trên môi trường Burk’s không

đạm được dem tăng sinh trên môi trường LB có b6 sung 0,5 g/L L-tryptophan lắc 150

vòng/phút trong vòng 72 giờ Dịch sau khi được tăng sinh đem ly tâm 10000 vòng/phút

trong 10 phút dé thu lay dịch trong Tiếp theo cho 1 mL dich trong sau ly tâm trộn với 1

mL thuốc thử Salkowski và ủ trong tối trong vòng 30 phút Mỗi chủng được lặp lại quytrình trên 3 lần dé đảm bảo độ chính xác Các mẫu dich có xuất hiện màu hồng cho thay

18

khả năng tổng hợp IAA thấp Trong khi đó các mẫu dịch có xuất hiện màu đỏ cho thấyđược kha năng tông hop IAA cao Các mẫu không thay đổi màu hay thay đổi màu khôngđáng ké là những chủng không có kha năng sinh IAA và sẽ loại bỏ.

3.3.6.2 Định lượng khả năng sinh LAA

Phương pháp tiến hành: Salkowski (Glikmann và Dessaux, 1995)

Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Các chúng đã được định tính có khả năng sinh IAA đượctăng sinh trên môi trường LB có bé sung 1 g/L L-tryptophan lắc 150 vòng/phút trong vòng

72 giờ Sau đó ly tâm dịch nuôi cấy 10000 vòng/phút để thu lấy dịch trong Hút 2 mL địch

trong cho vào ống nghiệm, sau đó cho thêm 8 mL thuốc thử Salkowski và ủ trong tối 30phút Sau khi dịch trộn đã đổi màu từ hồng đến đỏ sẽ tiến hành do OD ở bước sóng 530 nm.Căn cứ vào đường chuẩn IAA ( y=ax+b) với R? > 0,95 để xác định hàm lượng IAA sinh racủa từng chủng Mỗi chủng được lặp lại quy trình trên 3 lần để đảm bảo độ chính xác Lựachọn 3 chủng có hàm lượng IAA sinh ra cao nhất dé tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.Bảng 3.2 Dựng đường chuẩn IAA

STT Nông độ dung dịch chuân làm việc Thể tích dung dịch chuan gốc

3.3.7 Anh hưởng của nồng độ NaCl đến sự phát triển của vi sinh vật

Từ 3 chủng vi sinh vật có khả năng cô định đạm cao nhất và 3 chủng có khả năngsinh IAA cao nhất đã được khảo sát trước tiên hành nuôi cấy trong môi trường bồ sung cácnồng độ muối khác nhau: môi trường muối 0,5% đối với môi trường LB, 0,8% đối với môi

trường NB và 2%, 4%, 6%

Các chủng có định đạm sẽ được tang sinh trên môi trường NB và các chủng sinh IAAđược tăng sinh trên môi trường LB với các nồng độ muối khác nhau trong vòng 72h trên

máy lắc với tốc độ là 150 vòng/ phút Hút 1 mL dich tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9

ml nước muối sinh lý, pha loãng đến nồng độ cao nhất là 109 Hút 1 mL dich pha loãngcấy đồ trên đĩa petri Sau 48 giờ, mật độ của vi sinh vật ở mỗi nồng độ muối sẽ được tínhbằng công thức

CFU ZC) = NixvxD1 + -:.+NixVxDi

Trong đó N: số khuẩn lạc trên 1 g hay 1 mL mẫu

N(

mL

C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên hộp dia petri có số khuan lạc nằm trong

khoảng 25 đến 250

Ni: Số hộp đĩa petri cấy tại độ pha loãng thứ ¡

V: Thể tích dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL)Di: Hệ số pha loãng tương ứng

3.3.8 Phương pháp định danh sinh hoc phân tử

Tách chiết DNA

Phương pháp được đềtài sử dụng là phương pháp CTAB (Nguyễn Thị Phương Trang

và ctv, 2006) dé tách loc DNA từ các tế bào trong mẫu Sau khi các thành phần khác đượcloại bỏ, DNA sẽ được tách lọc ra khỏi dung dịch và được lắng đọng bằng cách sử dụngrượu isopropanol DNA lắng đọng sẽ được rửa sạch bằng ethanol và nước cất, và cuối cùngđược hòa tan trong nước mili Q dé lưu trữ hoặc sử dung tiếp dé phân tích Quy trình táchchiết DNA bằng phương pháp CATB:

Giai đoạn 1: Phá màng tế bào:

Bước 1: Hút 15 mL dich tăng sinh vi khuân vào ống falcon, đem ly tâm 6000 rpm/15phút Rửa bằng nước Mili Q lặp lại 2 lần

20

Bước 2: Sau khi thu tủa bỏ dịch, thêm 800 uL CTAB buffer, votex mạnh, ủ ở 60°C trong 1 - 2 giờ.

Bước 3: Ly tâm lạnh 6000 rpm/15 phút, thu dịch vào eppendorf mới, bỏ tủa.

Giai đoạn 2 :Loại bỏ Protein:

Bước 1: Thêm 600 uL Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (P:C:]) (25:24:1) vào (mix lạnh 2 phút), ly tâm 14000 rpm/10 phut/4°C.

Bước 2: Sau khi ly tâm thì hỗn hợp tách thành 3 lớp, nhẹ nhàng hút phân lớp nước

(lớp trên cùng) cho vào eppendorf mới.

Giai đoạn 3: Tách DNA:

Bước 1: Tua DNA bằng Isopropanol tỷ lệ 1:1 U ở -20°C khoảng 30 phút (hoặc vài

giờ).

Bước 2: Ly tâm 13000 rpm/15 phút/4°C, bỏ dich thu tủa (màu trang đục)

Bước 3: Cho InmL ethanol 70% vào, trộn nhẹ nhàng và ly tam 14000 rpm/15

phút/4°C Loại bỏ địch nồi và làm bay hơi hết ethanol trong eppendorf

Bước 4: Cho 50 HL nước (nuclease free) trộn đều DNA, bảo quản -20°C

Điện di

Sau khi tách chiết DNA sẽ điện di để kiểm tra sự có mặt của DNA Phân tử DNA

được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn (backbone) từ đường

dideoxybose và một nhóm phosphate Theo cấu trúc này, mỗi một nucleotide sẽ đều mangđiện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỉ lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge) Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di chuyển

về phía điện cực đương Quy trình thực hiện như sau:

Bước 1: Chuẩn bị gel Agarose: Gel được sự dụng là agarose 1% Đồ gel vào khuôn

trong khi đồ một chiếc lược sẽ được cắm lên trên miếng gel và gỡ ra khi gel đã đông đặc

dé tạo thành các giếng cho phép nạp mẫu vào

Bước 2: Chạy điện di Miếng gel agarose được đặt trong bồn điện di, chứa dung dichđệm (buffer) dẫn điện và ổn định pH, thường là Tris-acetate-EDTA (TAE) hoặc Tris-borate-EDTA (TBE), đề tài sử dụng TBE dé làm dung dịch đệm Tiến hành điện di ở mức

80 V trong 25 - 30 phút.

21

Bước 3: Quan sát mẫu Nhuộm mẫu để có thể quan sát được DNA, hoá chất được sửdụng là Gelred Sau khi điện di, mẫu gel sẽ được quan sát dưới hộp đèn UV dé có thé quan

sat duoc hinh anh DNA

Phan tng PCR

Thành phan của phản ứng PCR bao gồm: 1 pL DNA template, 12,5 pL My taq mix2x, 10,5 uL Water (Mili Q), 0,5 uL Méi xuôi 27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG, 0,5

uL Môi ngược 1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT (Hongoh va ctv, 2003)

Nguyên tắc hoạt động của PCR:

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94°C, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡkhiến DNA bị biến tính trở thành dang mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65°C, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổsung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72°C, Taq polymerase sẽ sử dung dNTP

dé kéo dai đầu 3' của mồi và tao ra mạch bổ sung

Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳnhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao Số lượng bản saoDNA không 16 này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu có thé nhìn thấy bằng mắt thường

trên gel điện di dưới ánh đèn UV.

Sản phẩm PCR sau đó sẽ được gửi đi giải trình tự Các trình tự nucleotide hoànchỉnh được so sánh với ngân hàng đữ liệu gen NCBI bằng công cụ BLAST

Xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự đa gen của các loài có quan hệ gần gũi được lưu về từ ngân hàng gen NCBI

Cây phat sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép

toán Tamura-Nei trên phần mềm MEGA11 (Trần Thị Nguyệt, 2020)

3.4 Phương pháp phân tích số liệu

Xử lý các số liệu dựa trên phương pháp thống kê Anova 1 nhân tố sử dụng phần mềmMinitab 16 Vẽ cây phát sinh chủng loại dựa trên phần mềm Mega 11 Phương trình đườngchuẩn vẽ trên phần mềm Ecxel với hệ số tương quan R > 0,95

22: