Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và định danh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại một số mỏ đất tỉnh Nghệ An

Hồ Chí Minh, xin cam đoan tất cả kết quả đạt được trong đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại một số mỏ đất tỉnh Nghệ An” đều là do chí

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LAP VÀ ĐỊNH DANH CHUNG VI KHUAN CÓ KHẢ NANG TẠO TỦA CALCITE TẠI MỘT SO

MO DAT TINH NGHỆ AN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS NGUYÊN HOÀNG DŨNG DANH THÀNH PHÁT

TP Thủ Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến quýthầy cô trong Khoa Khoa học sinh học, Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tậntình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian emtheo học tại trường.

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo phòng Vi Sinh, Viện Sinh học Nhiệt

đới đã tạo điều kiện dé em được thực hiện đề tài một cách trọn vẹn nhất Cảm ơn TS

Nguyễn Hoàng Dũng, người đã định hướng, đồng hành và hỗ trợ em từ những ngàyđầu nghiên cứu Cảm ơn ThS Lê Quỳnh Loan, ThS Duong Thị Hồng Đào đã luôn

giúp đỡ dé em được lĩnh hội nhiều kinh nghiệm, kiến thức mới và hoàn thành khóa

luận.

Cuôi cùng, con xin gửi lời cảm ơn dén gia đình đã luôn động viên, cảm ơn bạn

bẻ vì tat cả những sự hồ trợ hêt mình Nhờ có ho, em đã có sức mạnh đê vượt quanhững khó khăn và hoàn thành dé tài nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người

TP.HCM, Tháng 8/2023

Sinh viên thực hiện: Danh Thành Phát

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN

Tôi tên Danh Thành Phát, MSSV: 19126275, Lớp: DH19SHD (Số di động:

0559493455, Email: 19126275@st-hcmuaf.edu.vn) thuộc ngành Công nghệ Sinh họcTrường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan tất cả kết quả đạt được

trong đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa

calcite tại một số mỏ đất tỉnh Nghệ An” đều là do chính tôi thực hiện, các số liệu,thông tin trong nghiên cứu nay là hoàn toàn trung thực và khách quan.

Tp Hồ Chí Minh,ngày tháng năm 2023

Người viết cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

il

TÓM TẮT

Kết tủa calcite do vi sinh vật gây ra (MICP) đang là một phương pháp phổ biếntrong việc gia có các vật liệu trong xây dựng như xi măng, bê tông Trong nghiên cứunày, khả năng tạo kết tủa canxi cacbonat của chủng vi khuẩn bản địa bằng cơ chế

thủy phân urease được khảo sát Các chủng vi khuẩn được phân lập từ 35 mẫu dat và

đá vôi thu thập từ mỏ đá vôi tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam Mỗi chủng phân lập đượcxác định bằng các đặc trưng về hình thái và định danh trình tự 16S rDNA Các

chủng phân lập này sau đó được đo hoạt tính tạo kết tủa Kết quả cho thấy tổng số

03 chủng phân lập có kha năng tạo kết tủa canxit, trong đó, một chủng vi khuẩnMICP hiệu quả đã được lựa chon là Bacillus cereus HM4 Ching này có thé kết tủacanxit đạt 12,5g/L Kết quả nghiên cứu đã góp phan hiểu biết đầy đủ hơn tiềm năng

ứng dụng của chủng Bacillus cereus HM4 trong điều kiện môi trường, khí hậu Việt

Nam; làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về những ứng dụng trong việc hàn gắnvết nứt, sản xuất xi măng sinh học thân thiện môi trường

Từ khóa: MICP, kết tủa canxit, đá vôi, Bacillus cereus

ill

Microbial induced calcite precipitation (MICP) is a popular method for reinforcing construction materials such as cement and concrete In this study, the

ability of indigenous bacterial strains to induce calcium carbonate precipitation by urea

hydrolytic mechanism was investigated The bacteria strains were isolated from soil and limestone samples collected in limestone mines and natural caves at Nghe An province, Vietnam Each isolate strain was identified by characterized with respect to morphology and 16S rRNA sequence identity These isolated strains were then measured the calcite precipitation The results showed that total six isolated strains could induce calcite precipitation An efficient MIC bactert'um was selected from among the isolates and identified by morphology characteristics and molecular method

as Bacillus cereus HM4 with the precipitate formed reached 12,5 g/L Initial research results have determined the optimal conditions for the highest calcite precipitation of Bacillus cereus HM4 This 1s the premise for further research on potential applications

in crack healing, self-healing, and bio-cement production in Vietnam's climatic and environmental conditions.

Keywords: MICP, Calcite precipitation, Isolation, limestone, Bacillus cereus.

1V

MỤC LỤC

TrangVẤN GILBISẤNsaesasdenntrnatuodiseternderliengtimitprietsdlosnslsllireiHitt0902199413310080ã9.i6s01nhGiuftnGdfGth iXÁC NHAN VA CAM DOAN u.cesccscsscssessecsssessecsveseesesecsesssssesessssssssessessessessesseeseeseess ii

¡0v — Ơ ,Ơ iiiABS TRAGD sssssrnenasroveess assume ieemunras meneame nausea es an eernan ee eae 1V iMG 1 SM Cee ee eee ee ee V

HÀ NNH, là 1E bi bi TT) 214 ible: gữanondigartgtthtidtiiti6idgit2ogiatodi9tEqHiA4GU10301280gi01061:11800812588003580 viiDANH SACH BANG 3 Viti

8 91282.10:8510117005 ix

ATU) 1 DT BOA onsiesnrcencreanconrcmnsorameceh nen mrs 1

1.1 Đặtvấn (ee |

MÃ 7 TEBmiinfd seueeeesnussaauoeasronoueeHtuiareotoieagiaosaidnGtauogoonedgdso 51.5 TNốtI dung Thực HIẾN scocs:ae~.cxsenranesaryneeeneennmeeseseiatmrmane te rene none ene EER 2Dells Témg quan ve calcite 8 2 3

ĐÀ, Tổng quan về vi khuẩn tạo tủa caÏcite -2-© 2522 5s2S+2z+2E+2E+zEzzxzxzzsez 4

23 Cơ chế tao tủa œaÏCit© - 2-2 Ss+SSE22E9E121221211212121121111121112111111211 210 2e 62.4 Các enzym liên quan tới con đường tao tủa caÏCIfe - 5s c+-c+c+s 82.5 Các yếu tổ tác động đến khả năng tạo tủa calcite -2-©2225z2cszscsce2 92.6 Ứng dụng của vi khuẩn tạo tủa caÏite - 2: 5¿©52222222222222E222222222Ezzxczkv 1]Dal Tinh hinh nghién Cu 11 13CHUNG S VAT LIET VÀ THƯƠNG PHẾ P crasssensmenacnsmsammsmnaceonasnommsancts 16

%1 Thêigianväfiarfdi6mmphinEŨHssseeeseeenbeeedasrvoeeseaoonnaassose 16

32 Vậtliệu và Phương pháp ighiếNmi GỮI eseisseseesavenidssgddasiatitroiE05661408383888603106 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu - - + - +5 cece 2212212212112 2121 9 H2 HH rệt 17

3.4 Phương pháp bão dân chúng vỉ KhUẨH su snccesaesncsasicrnaarserannsanaasnscsnaraneensnanaeia 19

3.5 Phương pháp định danh hình thái-sinh hĩa - ©5555 55<+<++<<+sx<+2 20

3.6 Phương pháp định danh sinh học phân tử - 5-2 cee ++2<+++sc+s+ss+ 23

CHƯƠNG 4 KET QUA VA THẢO LUẬN -©222 522cc+ecveerrrrrrerrrre 26

4] iếguảthumẫuditdi _— 264.2 Kết quả phân lập mẫu đất đá 2 2222222E22E2221221222122122212212212222c-e 26

4.3 Kết quả định tính khả năng sinh urease -2- 2: 2252222z+2z+22zz2zz+zzszxz 29

44 Kết quả sang lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa 3 Í4.5 Kết quả thử nghiệm tao bọt với axit chlohydride 2- 252 2+sz>s+zzzs2 324.6 Kết quả khảo sát khối lượng tủa -2-2225c5ccszscsssrseesersc-s 334.7 Kết quả định danh chủng vi khuẩn có khả năng tao tủa calcite 3 5

CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ 22 ¿2252ccsrtrreerrrrrrrrreee 39

5.1 Kếtluận 2.2 2222222112212 eerre 395⁄2 Kiếnnghi ò 222 222222212122 39TIAL LIEU THAM 3:6 40PHÙ: LÍ TỔ sang cesccnsan hon no 0DLGGS0G48861G18610016330830380G530.SEBHGUGSĐEHIORHISGSGSSHSSGSHEHSRSGSHGSEHERUSEESISRGSGSSSHHd 47

VI

DANH SÁCH CHỮ VIET TAT

BP : Base pair

CTAB : Cetyltrimethylammonium Bromide

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

Dnase : Deoxyribonuclease (enzym thủy phan DNA)

dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Axit

EtBr : Ethidium Bromide

GRAS : Generally Recognized As Safe

LB : Luria Bertani

MICP : Microbially Induced Calcium Carbonate Pricipitation (qua trinh tao tua

calcite do vi khuẩn)

PCR : Polymerase Chain Reaction (phan ứng chuỗi Polymerase)

RPM : Round per minute (vòng trên phút)

SEM : Scan Electrion Microscopy (kính hiển vi điện tử quét)

TAE : Tris-Acetate-EDTA

TBE : Tris-Borate-EDTA

UCB : Urea Calcrum Broth

UCS : Unlimited Compressive Strength

Vii

oc ee 26Hình thai các khuẩn lạc sau phân lập 2-2 222+22++2+£zzzzzzszz2 28Kết qua thử nghiệm turease 2 2 2222222212212 2E22212212231221221221222 30Kết quả định tinh khả năng tạo tủa - 2-22 222222222EE22Eczxzxzzzzszev 31Kết qua thử fiphiệm tao bOt-VO1 ACN sesseessoestsciineibi10L636833401000633931833839936368 32Kết quả các thử nghiệm sinh hóa của chủng vi khuân HM4A 37

Vill

DANH SÁCH HÌNH

TrangHình 2.1 Hình ảnh một số tinh thé caÏcite 2+ 2 +SS2S22S£SE2E2E2£22E2E2E22222222ze 4Hình 2.2 Hình anh vi khuẩn MICP sản xuất turease 2-72 22522522S22E2z222z: =)Hình 2.3 Các nghiên cứu về MICP - c c2 2111122211115 e2 6Hình 2.4 Một số con đường chuyền hĩa tao calcite - 2-2 s2222z22x+2z2zzzcxe2 8Hình 2.5 Sơ đồ hình thành MICP qua trung gian urease va carbonic anhydrase 9Hình 3.1L Quy tinh t6 HIỂTằhueensesoaddidoigtoaCbsbieoskStta400GI2H0N0610300p02400628809y60i30188 18 Hình 3.2 Chu kỳ luân nhiệt của phản ứng PCT 55555 ++**++£+eeezezeeexs 25Hình 4.1 Mau đất đá được nghiền đến kích thước đồng nhất 2- 5+: 27Hình 4.2 Mau đất đá sau 24h tăng sinh trong mơi trường B4 broth 27Hình 4.3 Các khuẩn lạc sau 24h phân lập trên mơi trường B4 agar 27Hình 4.4 Hình ảnh khuẩn lạc thuần sau phân lập 2-22 2222222222222 29Hình 4.5 Kết quả định tính khả năng sinh urease -2- 2 2 22S22S+222zz2zz222 31Hình 4.6 Kết quả định tính khả năng tạo tủa 2-2 ©2222222zz2xc2z+zzxzzxrzzree 32Hình 4.7 Kết quả thử nghiệm tao bọt với HCI] 5-5 +++++++*£++eczeee+eezzess 33Hình 4.8 Kết quả định lượng tủa các chủng đã chon lọc -. ‹ -+ +- 34

Hình 4.9 Các mẫu tủa thu được ta các chủng -22-522222222z2z+zxzzzxcex 34

Hình 4.10 Tổng hợp khối lượng tủa của các chủng -2z52++25z=: 35

Hình 4.11 Hình ảnh chụp SEM mẫu tủa chủng HM4 đượ chụp ở 2 độ phĩng đại khác

000 35Hình 4.12 Kết quả nhuộm Gram (A) và nhuộm bao tử (B) - - - 36Hình 4.13 Kết quả khuếch đại mẫu kích thước 1500bp -2: - 38Hình 4.14 Top 5 kết quả cĩ độ tương đồng cao (> 99%) -2-7¿522+sz252 5522 38

1X

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Hiện nay, vấn đề nứt vỡ bê tông trong các công trình xây dựng đang là một vấn

đề nghiêm trọng và phố biến Những vết nứt nay có thé là hậu quả của những tác động

bên ngoài như thiên tai hoặc đo chất liệu của vật liệu bê tông Với sự gia tăng về kíchthước và độ cao của các công trình xây dựng hiện nay, những vấn đề liên quan đến nứt

vỡ bê tông đang trở thành vấn đề cực kỳ quan trọng Nếu không kiểm soát và khắcphục van dé, nó có thé gây ra những hậu qua rất nghiêm trọng như sự suy giảm chatlượng của công trình, tiềm ấn nguy cơ sự cố trong tương lai, và đặc biệt là mat an toàncho các công nhân và những người sử dụng công trình Vì vậy, nghiên cứu giải pháp

dé khắc phục van đề nứt vỡ bê tông đang trở thành một điều cần thiết trong ngành xây

dựng.

Kha năng kết tua calcite do vi sinh vat (Microbe Inducing Calcite Precipitation

- MICP) là một hiện tượng tự nhiên trong thế ĐIỚI VI khuẩn, đóng vai trò quan trọng

trong quá trình khoáng hóa của các hệ thống tự nhiên trên trái đất như hang động, đất,trầm tích, v.v Những năm trở lại đây, nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc vàtuyển chon các chủng vi khuẩn tạo kết tủa calcite từ nhiều nguồn phân lập như các

hầm mỏ, đất đá vôi Các chủng vi khuẩn như Bacillus spp., Halmonas eurihalina,

Helicobacter pylori, Kocuria flava CR1, L sphaericus CH5, Methylocystis parvum,

Myxococcus xanthus, Proteus mirabilis, Pseudomonas denitrificans, Spoloactobacillus

spp., Sporosarcina ginsengisoli và Sporosarcina pasteurii cho thay có khả nang tạokết tua calcite với sản lượng lớn, làm tiền dé cho tiềm năng ứng dụng trong ngànhcông nghiệp xây dựng.

Hiện nay, ở nước ta những nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tủa calcite bản địavẫn chưa nhiều; các nghiên cứu đã công bố chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu ứngdụng vi khuẩn tạo khoáng để cải thiện các vết nứt trên vật liệu bê tông bằng các chủng

vi sinh vật có nguồn gốc từ nước ngoài Việc tìm kiếm và sàng lọc những chủng vikhuẩn tạo tủa calcite bản địa, có các đặc tính sinh học phù hợp với khí hậu và điềukiện tự nhiên của Việt Nam đang là van đề cần thiết nếu muốn ứng dụng và phát triển

rộng rãi công nghệ vật liệu sử dung vi khuẩn calcite Tinh Nghệ An là một tinh nằm ởvùng Bắc Trung bộ của Việt Nam, nơi đây có nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú

và đa dạng về chủng loại và có quy mô trữ lượng lớn, phân bố rộng trên địa bàn cáchuyện Tuy nhiên, tại khu vực này hiện tại vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩntạo tua calcite Xuất phat từ những lý do trên, dé tài ''Phân lập và định danh ching vikhuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại một số mỏ đất tỉnh Nghệ An `` được thực hiện vớimục tiêu tìm được các chủng vi khuẩn tiềm năng tạo được kết tủa calcite phù hợp với

điều kiện khí hậu tại Việt Nam dé phục vụ cho các công trình xây dựng cũng như cácnghiên cứu về xi măng sinh học phù hợp với nhu cầu thực tiễn hiện nay

1.2 Mục tiêu đề tài

Sang lọc và định danh được chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đất đáthu thập tại một số mỏ đất tỉnh Nghệ An có hoạt tính tạo kết tủa calcite cao, có khả

năng ứng dụng phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, làm nền tang cho việc tạo xi

măng sinh học cũng như bê tông tự liền phục vụ cho các nhu cầu thực tiễn hiện nay.1.3 Nội dung thực hiện

Phân lập các mẫu đất đá thu thập tại tỉnh Nghệ An

Chọn lọc chủng vi khuan có khả năng tạo tua calcite cao

Định danh đến loài dé xác định tên khoa học của chủng vi khuẩn tạo tủa calcite

CHƯƠNG 2 TÔNG QUAN

2.1 Tong quan về calcite

Calcite là dạng phố biến nhất của canxi cacbonat tự nhiên (CaCOa), một loạikhoáng chat được hình thành từ đá, phân bố rộng rãi trên khắp thé giới, là dang đahình tức là cùng công thức hóa học nhưng cau trúc tinh thé khác nhau Calcite là thànhphan cau tạo phổ biến của đá trầm tích, đặc biệt là đá vôi, nó cũng là khoáng chấtchính trong đá cam thạch biến chat Calcite cũng xuất hiện như một loại khoáng chatdạng mạch trong các trầm tích từ suối nước nóng, và cũng xuất hiện trong các hang

động dưới dạng nhũ đá và măng đá Calcite thường là thành phần chính cấu tạo nên vỏ

của các sinh vật biển (ví dụ như sinh vật phù du, động vật chân khớp và các loạinhuyễn thé ) [1, 2, 3]

Về tính chat vat lý, tinh thé calcite có dạng hình hộp thoi 3 phương từ nhọn đến

tù, hình lục giác, hình lăng trụ hoặc nhiều mặt tỉ lệ khác nhau Nó có thể tồn tại ở dangsợi, dạng hạt, dang phiến hay dạng đặc Chúng có độ trong suốt hoặc trong mờ và cóthé phát huỳnh quang Độ cứng được đo trên thang Mohs là 3, trọng lượng riêng 2.7.Calcite là thành phần phô biến trong đá trầm tích như đá vôi, phan lớn chúng đượchình thành từ vỏ của các loài sinh vật biển sau khi chết Đá calcite được phát hiện vàghi nhận ở nhiều dang và nhiều mau sắc khác nhau Với mỗi màu sắc, chúng lại có têngọi riêng và những tính chất riêng biệt Về tính chất hóa hoc, calcite có công thức hóahọc là CaCOa, giống như phần lớn các muối cacbonat, chúng đều sẽ bị hòa tan tronghầu hết các loại axit, sau đó bị sủi bọt và giải phóng khí Cacbon Dioxit [4]

2.2 Tống quan về vi khuẩn tạo tủa calcite

Quá trình tạo tủa calcite do vi khuẩn (Microbially Induced Calcium CarbonatePricipitation) MICP là một quá trình sinh hóa phổ biến trong đất, hang động, nướcngọt, tram tích biển và môi trường sống quá mặn MICP là kết quả của sự tương táctrao đổi chất giữa các quan thé vi sinh vật với các hợp chất hữu cơ và/hoặc vô cơ có

trong môi trường Một số quá trình trao đổi chất chính liên quan đến MICP ở các mức

độ khác nhau là thủy phân ure, khử nitrat, khử sunfat hòa tan và quang hợp Hiện tai,

MICP được điều khiến bởi quá trình thủy phân ure, khử nitrat và khử sunfat hòa tan đãđược ghi nhận là giúp phát triển bê tông sinh học và đã chứng minh được sự cải thiện

về tính chất cơ học và độ bền của bê tông phát thải từ lĩnh vực xây dựng, cũng như vềlợi ích kinh tế bằng cách thúc day quá trình tự phục hồi của kết cấu bê tông Trong sốcác quá trình chuyển hóa nêu trên, quá trình thủy phân ure được áp dụng nhiều nhấttrong cơ chế sửa chữa bê tông MICP đo thủy phân ure được gây ra bởi một loạt cácphan ứng do urease và carbonic anhydrase thúc day Hoạt tính xúc tác của hai enzymnày phụ thuộc vào nhiều thông số khác nhau, hiện đang được nghiên cứu trong điềukiện phòng thí nghiệm dé hiểu rõ hơn về cơ chế sinh hóa liên quan và sự điều hòa củachúng ở vi sinh vật [5, 6]

Việc áp dụng MICP trong việc cải thiện cường độ và độ cứng cho đất đượcnghiên cứu lần đầu tiên vào năm 2002 bởi Ismail và cộng sự [24] Họ đã tìm thấy sựgia tăng cường độ nén không giới hạn (UCS) của đất được xử lý MICP sau 5 giờ xử

lý Một số yếu tố đã được xác định có ảnh hưởng đến UCS bao gồm độ bền của từnghạt, kích thước và hình dang hạt, mật độ và sự hiện diện của các tinh thé canxit có sẵn

Mặc dù đã có những ứng dụng trước đây trong cải tạo đất, nhưng người ta biếtrất ít về hiệu suất của urease do tế bảo vi khuẩn sản xuất trong quá trìnhMICP Whiffin [25] là người đầu tiên phát triển một mô hình gọi là “phương pháp dẫn

điện Whiffin” dé dự đoán những thay đổi trong quá trình thủy phân ure trong quá trình

kết tua CaCO; bằng cách đo độ dẫn điện của dung dịch MICP Độ bền cắt và độ cứngcủa đất được xử lý MICP sau đó được đánh giá bởi Delong và cộng sự [55] bằng cách

sử dụng một loạt các thử nghiệm nén ba trục không thoát nước đẳng hướng (CIUC)hợp nhất Kết quả của họ cho thấy các mẫu đất được xử lý bằng MICP thê hiện đặctính không bị xep/lam mềm với độ cứng chống cat ban đầu cao hơn va khả năng chịucắt cuối cùng so với các mẫu đất rời không được xử lý

Trong MICP, quá trình tạo xi măng sinh học (tạo liên kết hạt) và tắc nghẽn sinhhọc (sản xuất vật liệu lấp day lỗ rỗng) đã được nghiên cứu một cách đáng chú ý[26] Trong thập ky qua, kỹ thuật MICP đã được áp dung dé tang cường các đặc tính

kỹ thuật (độ bền và độ cứng) của các loại đất khác nhau [27, 2§], giảm khả năng hóalỏng của cát rời [30], hàn gắn các vết nứt, kiểm soát xói mòn và giảm tính thấm củađất thông qua tắc nghẽn sinh học [31]

Trong những năm gan đây, các nỗ lực nghiên cứu đã tăng lên đáng ké trongviệc nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của quy trình MICP (Hình 2.3a) trình bàytong quan về số lượng sản phẩm bat đầu từ năm 1995 đến nay và cho thấy sự tăngtrưởng theo cấp số nhân về số lượng ấn phẩm phản ánh sự quan tâm ngày càng tăng vàcường độ nghiên cứu trong lĩnh vực này tăng lên Trong khi phần lớn nghiên cứu(khoảng 70%) đã được thực hiện ở Mỹ và Trung Quốc (Hình 2.3b), các nhà nghiên

cứu từ Iran, Úc, Canada, Brazil, An Độ, các nước Trung Đông, Nga, Chau Âu, Đông

Nam A và Châu Phi cũng tham gia đóng góp vào cơ sở tri thức [19]

Hình 2.3 Các nghiên cứu về MICP; (a) Các ấn phẩm trên MICP qua các năm (b) phân

phôi quôc gia của các tác giả đóng góp.

2.3 Cơ chế tạo tủa calcite

2.3.1 Thủy phân bằng urease

Đây là phương pháp phổ biến nhất trong tự nhiên và đã được báo cáo trong một

số nghiên cứu trước đây Các nhóm vi khuẩn mang hoạt tính urease có thể tạo kết tủa

calcium carbonate trong môi trường kiềm thông qua con đường chuyển hóa urea thành

ammonium và carbonate Sự phân hủy urea làm tăng pH và tăng sự lắng đọng của các

tinh thé calcite đóng vai trò là thành phan hàn gắn vết nứt Trong quá trình thủy phân

ure, thành phần chính tham gia là enzym urease, ure (CO(NH2)2) và canxi clorua(CaC1›) Nói chung, CaCO; kết tủa qua quá trình thủy phân ure có thé được chia thành

ba giai đoạn chính: (1) thủy phân ure thành NH¿” và các ion cacbonat (khí COs:7); (2)

sự phân ly của CaCl thành ion canxi (Ca?"); và (3) CaCOa kết tủa Các phản ứng hóahọc liên quan được trình bày trong các phương trình (1) đến (3)

6

CO(NH2)2 + 2H;O _ wwdowss ` 2NH¿* + CO¿2 (1)

CaCl, 1:9 5 Ca + 2Cr (2)Ca?'+ COs? _Prcipitation CaCO; (3)

So với các con đường vi sinh vat khác, CaCO kết tủa thông qua quá trình thủyphân ure mang lại nhiều ưu điểm bao gồm hiệu suất chuyền đổi hóa học cao lên đến90% [21] và dé dàng kiểm soát quy trình [22] Một nhược điểm của quá trình này cóthé là giải phóng các chất không mong muốn NH¿*, đây là nguyên nhân chính gây 6

nhiễm nước [23].

2.3.2 Khử nitrate

Nhiều nghiên cứu đã khảo sát tiềm năng cải tạo đất bằng quá trình khử nitrat.Ngoài việc cải thiện độ bền của đất thông qua kết tủa CaCOs, quá trình khử nitratthường được sử dụng dé khử bão hòa đất (nghĩa là thông qua việc giải phóng N2 khônghòa tan) để giảm thiểu hóa lỏng [48, 49] MICP bằng cách khử nitrat đề cập đến quatrình khử nitrat hòa tan (NO3)_ dé tạo ra khí nitơ (Na), carbon vô cơ (CO›) và độ kiềm(OH) sử dung vi khuẩn khử nitrat (ví dụ: Pseudomonas denitrificans) trong điều kiện

ky khí Việc tao ra CO¿ làm tăng hàm lượng cacbonat của dung dich, trong khi tiêu thụNOz làm tăng độ pH Việc tạo ra độ kiềm tạo điều kiện kết tủa CaCO3 với sự có mặt

của Ca?" Các phản ứng hóa học được trình bày trong phương trình (4) và (5).

NOs +1.25CHO Katunitrate_+ 0 5N; + 1.25CO; + 0.75H2O + OH (4)

Ca2* + COz+2OH- kết >CaCO¿ + HạO (5)

So với quá trình thủy phân ure, quá trình khử nitrat đòi hỏi nồng độ cơ chất thấphơn dé tạo kết tủa CaCOs; tuy nhiên, tốc độ kết tủa CaCO; thấp hơn đáng kế, có thé do

sự tích tụ của các hợp chất trung gian NO3 Nồng độ NO: ban đầu cao có thé ức chế sựphát triển của vi khuẩn bằng cách thay đôi độ pH trên màng tế bào [45, 46, 47]

2.3.3 Khử sunfat

Trong MICP bằng cách khử sunfat (tương tự như khử sắt), vi khuẩn khử sunfat(vi dụ: Desulfovibrio và Desulfotomaculum) oxy hóa sunfat trong điều kiện ky khí détạo ra hydro sunfua (H2S), CO› và tăng độ kiềm pH do độ kiềm tăng tạo thuận lợi chokết tủa CaCO3 Quá trình khử sunfat được trình bay trong phương trình (6)

SO¿2 + 2CH2O —HủsgmÉt_ FS + 2CO¿ + 20H" (6)

Sự giải phóng CO› khi có mặt Ca?* thúc day kết tủa CaCO3 Quá trình oxy hóa

ky khí thông qua quá trình khử sunfat đòi hỏi một lượng cơ chất lớn do độ hòa tanthấp Cơ chế này cũng dẫn đến việc sản xuất H2S, một loại khí có mùi và độc tính caongay cả ở nồng độ thấp Cơ chế này cũng dẫn đến việc sản xuất H2S, một loại khí cómùi và độc tính cao ngay cả ở nồng độ thấp

Các con đường trên đều liên quan đến các phức chất vô định hình và các hạtcalcite, giúp vi khuẩn tạo ra lớp vỏ calcite bao quanh cơ thé của chúng

Ốn+H*~> H,O OH + co, -> HCO, ‘S ( 2

> Ca + HCO, -> CaCO, + Hˆ Ca®TM + HEO, + OH -> Caco, + H,O

Denitrification Ammonification

NO NO N, no; NO;

GHIGSD « 2.6" + 1.6NO, -> 2co,

+4Ø 8N»+ 2.8H,O <@RIROBEISTM co, -> NH, © co, + HO

<

Ca*TM + CO, + 20H -> CaCO, + H,O

v

Ca” + HCO, -> CaCO, +H"

Sulfate reduction Methane oxidation

Đi TE +2H,O

Ludo, -><COp

Ca* +HCO, -> —— + Hy

N+ OH -> H,0 tr+Hs > HS

ca” + HCO, >:CaCO,+ Hˆ

Hình 2.4 Một số con đường chuyền hóa tạo tủa calcite [11]

2.4 Các enzym liên quan tới con đường tao tủa calcite

Urease: Urease là một loại enzyme được tìm thấy rộng rãi trong vi khuẩn và

động vật Day là enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình thủy phân ure thành NH3 và

CO> Khi urease của vi khuẩn tác động vào ure trong môi trường, nó giải phóng NH;

va COa Quá trình nay làm tăng pH và tạo ra các điều kiện thuận lợi cho tạo tủa calcite

Carbonic anhydrase: Carbonic anhydrase là một loại enzyme giúp tăng tốc độquá trình chuyển đổi CO2 thành HCO; trong môi trường nước Các ion HCO:' sau đó

sẽ tương tác với các ion Ca?” dé tạo thành lớp vỏ calcite Carbonic anhydrase thường

được tim thấy trong các tế bao của vi khuan va động vật, và nó rất quan trọng trong

các quá trình vận chuyên và chuyển đổi CO› trong tự nhiên

Quá trình thủy phan ure, và việc sử dụng các enzyme urease va carbonicanhydrase để tạo tủa calcite, là một con đường rất quan trọng trong các quá trình visinh học, đặc biệt là trong các dự án tạo tủa calcite nhằm bảo vệ môi trường, phục hồidiện tích rừng, và xây dựng các công trình cần độ bên cao [13]

Carbonic Anhydrase

se “TL Nrì2

Passive Inf ats

Calcium ions presence

CaCOs Precipitation

Microenvironment

Hình 2.5 So đồ hình thành MICP qua trung gian urease va carbonic anhydrase [6]

2.5 Các yếu tổ tác động đến khả năng tao tủa calcite

2.5.1 Độ pH

Độ pH có ảnh hưởng đáng ké đến tạo tủa calcite Calcite là một khối lượng kếttủa canxi carbonate tồn tại trong nước có tính kiềm (pH cao hơn 7) Nếu pH quá thấphoặc quá cao, nó sẽ ảnh hưởng đến sự tạo tủa calcite Nếu pH quá thấp (nhỏ hơn 6),thành phần nước sẽ có tính axit, vì vậy mức độ ion OH" trong dung dịch giảm xuống.Dung dịch có pH thấp sẽ làm giảm sự tan của canxi và các ion cacbonat Nếu nồng độcác ion này giảm, tốc độ tạo tủa sẽ chậm còn khi pH quá cao (lớn hơn 10), nồng độ ionOH’ tăng đáng ké và tạo điều kiện dé tao tủa calcite nhanh

Do vậy, pH thích hợp như pH 8 - 9 được coi là lý tưởng dé tao tủa calcite ở mộttốc độ tôi đa Vi khuẩn tao tua calcite thường sống trong môi trường có pH cao, từ 7,5đến 9,5 Khi pH thấp hơn hoặc cao hơn giới hạn, sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe của vi

9

khuẩn, đo đó sẽ ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite của chúng Độ pH đóng vai tròquan trọng trong hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn sinh urease, lắng đọng canxicacbonat và cải thiện các đặc tính địa kỹ thuật Hầu hết các vi khuẩn urease thường

được sử dụng trong quá trình khoáng hóa vi sinh vật đều thích hợp dé phát triển trong

môi trường kiềm Ví dụ, giá trị pH thích hợp của Bacillus là khoảng 9 [51]

Các nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng độ pH tăng dẫn đến tăng nhu cầu carbondioxide của môi trường tăng trưởng [52] Hiện tượng này có thể hữu ích cho côngnghệ MICP đề hấp thụ carbon dioxide và giảm hiệu ứng nhà kính

2.5.2 Nhiệt độ

Nhiệt độ cũng có ảnh hưởng lớn đến tạo tủa calcite Nhiệt độ cao tăng tốc độtạo tủa còn nhiệt độ thấp hơn thì chậm hơn Điều này liên quan đến độ bão hòa của cácchất thành phan trong nước Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng tinh thé calcite ở nhiệt

độ trên 60 - 70°C sẽ dé dang tan chảy và mat di tính kết tủa Do đó, dé tạo tủa calcite

én định và đảm bảo tốc độ tạo tủa tối ưu, nhiệt độ phù hợp cho quá trình tạo tủa là ở

mức trung bình, khoảng từ 20 - 40°C Sự thay đổi nhiệt độ môi trường sẽ ảnh hưởngtrực tiếp đến sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn, do đó làm thay đôitốc độ lắng đọng và sản lượng canxi cacbonat, làm thay đổi chủng loại và hình thai củatinh thé Sự thay đổi nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến kích thước tinh thé và độ gắn kết củacanxi cacbonat giữa các hạt đất, điều này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của quátrình khoáng hóa và gắn kết vi sinh vật Vì vậy, cần nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt

độ đến hoạt động của MICP [43, 44] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính xúc tác

của urease mạnh nhất ở 20 - 37°C [44] Trong phạm vi nhiệt độ nay, ban chất của hầuhết các nghiên cứu MICP, hoạt động của urease tăng theo nhiệt độ

2.5.3 Loại vi khuẩn

Loại vi khuẩn phù hợp với ứng dụng MICP nên có thê xúc tác quá trình thủyphân ure và chúng thường là vi khuẩn đương tính với urease Các vi khuẩn dương tinhvới urease điển hình là các chi Bacillus, Sporosarcina, Spoloactobacilus, Clostridium

và Desulfotomaculum [16] Vi khuan hiểu khí thích hợp hon vi chúng giải phóng CO2

từ quá trình hô hấp tế bao, và sản xuất CO2 song song với việc tăng độ pH do amonisản xuất Loại vi khuẩn ảnh hưởng đến dang tinh thé, hình thái và tốc độ lắng đọng củacanxi cacbonat Năng suât xi măng của vi sinh vật trên vật liệu địa kỹ thuật được xác

10

định bởi các loại tinh thé khác nhau và lượng canxi cacbonat được tạo ra bởi MICP

[42].

Do đó, việc nghiên cứu các đặc tính khoáng hóa của các loại vi khuẩn khácnhau dé tăng cường vi khuẩn và các ứng dụng kỹ thuật có ý nghĩa thực tiễn Các vikhuẩn khác nhau có các đặc điểm khác nhau của tinh thé canxi cacbonat Nam vữngcác đặc tính khoáng hóa của các loại vi khuẩn khác nhau có thể tối đa hóa hiệu quả kếtdính của đá và đất trong các ứng dụng kỹ thuật Các học giả trên toàn thế giới đã điềutra các đặc điểm khoáng hóa của các loại vi khuẩn khác nhau trong những năm gầnđây Nhiều nghiên cứu có giá trị về các loại và kiểm soát các tinh thể canxi cacbonathình thanh do quá trình khoáng hóa, khả năng thích ứng của các vi khuẩn khác nhauvới môi trường và mở rộng MICP từ điều kiện phòng thí nghiệm sang thực địa đãđược thực hiện đề cải thiện quá trình sản xuất urease của vi khuẩn [41]

Các yếu tổ trên đều ảnh hưởng đến kha năng tạo tủa calcite của vi khuẩn Do

đó, khi phát triển các ứng dụng của vi khuẩn tao tủa calcite, cần tiến hành điều chỉnh

các yêu tố này dé đảm bảo hiệu suất và chất lượng sản phẩm [14]

2.6 Ung dụng của vi khuẩn tạo tủa calcite

Vi khuẩn tạo tủa calcite đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực khác nhau,bao gồm:

2.6.1 Gạch xây dựng

Gạch là một phần quan trọng của vật liệu xây dựng và được biết đến với độ bền

và tính bền vững của chúng Tuy nhiên, gạch cũng dễ bị xuống cấp theo thời gian doxuất hiện các lỗ rỗng, rỗ khí dẫn đến nứt vỡ MICP đã được chứng minh là một

phương pháp mới dé xử lý các vết nứt này hoặc tăng cường độ bền cho gạch [53] Raut

và cộng sự [40] đã chứng minh MICP trong gạch và nghiên cứu ảnh hưởng củaphương pháp đến cường độ nén và khả năng hấp thụ nước Gạch được xử lý bằngMICP cho thấy cường độ nén được cải thiện 83,9% và khả năng hút nước thấp hơn48,9% sau 28 ngày so với mẫu đối chứng Lambert và Randall [39] đánh giá quy trìnhMICP sản xuất gạch sinh học sử dung ure từ nước tiểu người ổn định Kết quả chothấy cường độ nén cao hơn với sự gia tăng số lần xử lý với cường độ nén cao nhất là2,7 MPa.

II

2.6.2 Xi măng sinh học

Le Metayer-Levrel và cộng sự [7] đề xuất sử dụng khả năng vi khuẩn của MICP

để sản xuất lớp phủ bảo vệ bề mặt cho các tòa nhà, tượng dai và tượng bằng đávôi Một nghiên cứu khác của Webster và May [8] cũng đề xuất xử lý sinh học nhưmột công nghệ bổ sung dé phục hồi bề mặt đá trong các tòa nha

MICP là một quy trình không độc hại và thân thiện với môi trường, có những

ưu điểm so với các phương pháp thường được sử dụng dé liên kết các hạt đất, chang

hạn như vữa hóa học Ivanov và Chu [9] đánh giá chi phí nguyên vật liệu thô cho vitahóa học nằm trong khoảng 2 — 72 đô la /m° đất trong khi đối với vữa vi sinh nằm trongkhoảng 0,5 — 9 đô la/m° đất khi vật liệu phế thai được sử dụng làm nguồn carbon cho

sự phát triển của vi sinh vật

Ramachandran và cộng sự [10] đã kết luận thông qua điều tra bằng kính hiển virằng MICP là một phương pháp hiệu quả để xử lý vết nứt trong bê tông Jonkers vàcộng sự [38] chứng minh rang MICP có hiệu quả như một tác nhân tự phục hồi dé kíchhoạt quá trình tự sửa chữa các vết nứt mới hình thành Achal và cộng sự [37] đã đềxuất như một phương pháp xử lý vết nứt và chất trám khe bê tông chất lượng cao thaythế, cho thấy cường độ nén của vữa xi măng tăng 36% cũng như kha năng hấp thụnước thấp hơn sáu lần trong các mẫu được xử lý Amidi và Wang [36] đã đề xuất mộtphương pháp xử lý bề mặt mới đề xử lý bê tông và các vật liệu hấp thụ tương tự nhằm

tăng cường khả năng đàn hồi và tính chất cơ học của chúng và đạt được mức tăng 36%

cường độ nén nhờ MICP.

2.6.3 Tăng cường va on định dat

Nhiều nghiên cứu đã áp dụng MICP cho các loại đất khác nhau và thử nghiệmchúng trong các điều kiện khác nhau để tăng cường độ bền và độ ổn định củadat DeJong và cộng sự [35] đã áp dụng MICP dé cải thiện các đặc tính kỹ thuật của

cát như độ bền cat và độ cứng Kết qua cho thấy khả năng cắt cuối cùng và độ cứng

chống cắt ban đầu đều cao hơn đối với các mẫu được xử lý so với các mẫu rời không

được xử ly Whiffin và cộng sự [34] đã áp dụng thành công MICP bang cách sử dụng

cột cat dai 5m dé cải tạo mặt đất với tốc độ dong chảy tương đối thấp Nghiên cứu này

cũng đề cập đến việc cân bằng tốc độ thủy phân ure với việc cung cấp các chất phảnứng hỗ trợ cho sự phân bố đồng đều của CaCO

12

2.6.4 Khắc phục các chất gây ô nhiễm môi trường

Sự phát triển công nghiệp nhanh chóng gây ra một mối đe dọa lớn đó là kimloại nặng và các chất gây ô nhiễm khác là sản phẩm phụ của các ngành công nghiệp

tác động đến môi trường của chúng ta Trước đây, các phương pháp xử lý thông

thường được sử dung dé loại bó kim loại nặng khỏi môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên,những phương pháp này không hiệu quả, tốn kém và tiêu tốn nhiều hóa chất và nănglượng [29] Do đó, các phương pháp thay thế như MICP là cần thiết để loại bỏ kimloại nặng một cách hiệu quả mà không ảnh hưởng nhiều đến môi trường Một số nhànghiên cứu [15, 32, 33] đã báo cáo khả nang xử lý kim loại nang trong môi trường của MICP.

Vi khuan tạo tủa calcite có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nhiều lĩnh vực khácnhau do khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt của môi trường va có thể sản xuấtcác vật liệu có độ bền cao và tiên tiến [17]

2.7 Tinh hình nghiên cứu

2.7.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2014, Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và Nguyễn Khánh Sơn tiến hành nuôi cấy

vi khuẩn Bacillus subtilis với mật độ 109 và 1011 CFU/g trong điều kiện thường, tronghỗn hợp xi măng và phân tán trong vữa Kết quả bước đầu cho thấy, các hoạt tính cơhọc như tính chịu uốn của bê tông vi khuẩn cao hơn thông thường và cường độ chịunén của mẫu vữa tăng hơn 30% so với đối chứng ở mật độ vi khuẩn 109 CFU/g, hiệuquả tự làm lành vết nứt sau 14 ngày dưỡng hộ trong nước tại vị trí đứt rộng xấp xỉ0.5mm [1].

Năm 2017, từ các mẫu xi măng Lê Quỳnh Loan và cộng sự đã phân lập được 4chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa calcite, trong đó chủng N1—Bacillusthuringiensis là vi khuẩn gram đương, hình que, có khả năng tạo bào tử và tạo sản

lượng calcite cao [55] Chủng vi khuẩn nay cho thấy có khả năng sống sót trong môi

trường khắc nghiệt và có tiềm năng ứng dụng dé làm liền các vết nứt công trình xâydựng.

Năm 2018 Lê Quỳnh Loan, Nguyễn Hoàng Dũng và cộng sự đã phân lập 22chủng vi khuẩn thuộc 7 loài khác nhau có khả năng tạo tủa calcite từ mẫu đất và đá vôi

thu thập tại tỉnh Kiên Giang, trong đó chủng Oceanobacillus profundus KG 15.3 có

13

hoạt tính tao calcite cao (> 10g/L), có khả năng chống chịu tốt với môi trường va làmliền vết nứt cho thấy tiềm năng ứng dụng của O profiundus KG_15.3 trong gia cô cácvật liệu bê tông.

Năm 2019, Nguyễn Phạm Hương Huyền và cộng sự đã tiễn hành khảo sát việc

sử dụng vi khuẩn tạo tủa calcite gồm Bacillus subtilis va Bacillus megaterium như làchất kết dính cát dé cải thiện độ bền của các vật liệu xây dựng xanh Độ bền kéo đạtcao nhất khi sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus megaterium ở mẫu cát trắng 0.3mm[56].

Nam 2021, Nguyén Pham Huyén và cộng su đã tạo hỗn hop vữa sinh học 0,1

mm cát, các thành phần bé sung và sinh khối theo tỷ lệ 1:1, chứng minh được hiệu quảchống thấm nước khi thi công vào các vết nứt bằng xi măng nhân tạo sau 10 ngày ủ[57].

2.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu đầu tiên về tiềm năng ứng dựng của các chủng vi khuẩn có khảnăng tạo tua calcite được ứng dung làm xi măng sinh học được tiến hành bởiGollapudi và cộng sự (1995) [58] Trong nghiên cứu này, Gollapudi trộn dung dịchcalcium chloride chứa urea và carbonic acid trực tiếp với dat và nén hỗn hợp trên vàomột cột chứa cát Kết quả cho thấy, các lỗ và các vết nứt trong được hàn lại Sau đócác nghiên cứu được tiến hành theo hướng phân lập vi khuẩn có khả năng tạo tủacalcite Trong 10 năm trở lại đây, nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành sảng lọc vàtuyển chọn các chủng vi khuan tạo tủa calcite từ nhiều nguồn như phân lập từ các ham

mỏ, dat đá vôi, và sàng lọc trong các bộ sưu tập chủng, các vi khuẩn ho Bacillus sp., L.spharicus, Sporosarcina pasteurii, K flava, Halomonas sp cho thay có hoạt tínhurease và có khả năng tạo tủa calcite với sản lượng lớn, có tiềm năng ứng dụng cao[59].

Năm 2018, Li va cộng sự đã nghiên cứu về khả năng gia có nền đất của chủng

Bacillus megaterium Nhóm sử dụng tro (FABC) làm chất mang trong việc tạo chế

phẩm sinh học từ chủng Bacillus megaferium Sau đó, trộn chế phẩm vào đất đã được

xử lý với tỉ lệ là 5% Kết quả cho thay, chủng Bacillus megaterium có khả năng làm

tăng độ bền của đất [60] Một nghiên cứu khác của Mondal va Ghosh vào năm 2018

cũng đã kiểm tra nồng độ tối ưu dé tăng cường độ nén với Bacillus subtilis mà khôngcần bổ sung các nguồn calci bên ngoài Calcium oxide tự do có trong bê tông có thé

14

được vi khuẩn sử dụng dé tạo ra lượng kết tủa calcium carbonate đáng ké cả ở bề mặt

và chất nền bên trong của bê tông [61]

Nam 2019, Suha và cộng sự đã phân lập được chủng Bacillus mycoides có khả

năng tao calcium carbonate và đánh giá khả năng tự làm liền vết nứt của các vữa bê

tông Công bố của nhóm tác giả, một phần chứng minh chủng Bacillus mycoides khảnăng hàn gắn vết nứt chỉ sau 21 ngày [62]

Năm 2021, Gehad Mokhtar đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn Bacillus

wiedmannii và Bacillus paramycoides tạo tủa calcitum carbonate và hình thành nội bao

tử, được ứng dụng tăng cường cường độ bê tông đạt 33,7 MPa và 25 MPa sau 28 ngày

[63].

Năm 2022, Kumar Soda dùng vi khuẩn Bacillus megaterium bé sung trực tiếpvào mẫu vữa nhằm cải thiện hiệu suất bê tông đối với cường độ nén, khả năng khuếchtán chlorua và khả năng thấm nước, kết quả cho thay vi khuẩn giúp giảm sự khuếchtán chlorua, cường độ được cải thiện và giảm khả năng thấm nước [64]

15

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian thực hiện

Thực hiện từ tháng 01/2023 đến tháng 06/2023

3.1.2 Địa điểm thực hiện

Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM, 9/621 Xa lộ Hà Nội, khu phố 6, phườngLinh Trung, Thành phố Thủ Đức, TP.HCM

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu đất đá thu thập tại các mỏ đất thuộc tỉnh Nghệ An được cung cấp bởiphòng VI sinh - Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM.

Tổng cộng có 35 mẫu từ 2 mỏ đất đá Hoàng Mai và Nghỉ Sơn Trong đó, mỏHoàng Mai có 18 mẫu được ký hiện từ NA1§ đến NA35, mỏ Nghi Sơn có 17 mẫu

được ký hiệu từ NA1 đến NA17

3.2.2 Thiết bị

Danh sách các thiết bị thí nghiệm sử dụng trong đề tài sẽ được trình bày dướibảng 3.1.

Bảng 3.1 Danh sách các thiết bị dùng trong thí nghiệm

STT Tên thiết bị STT Tên thiết bị

1 Tủ cấy 10 Máy ly tâm

2 Tủủ 11 May ly tam lanh

3 Tu am (-20°C) 12 May votex

4 Tu mat 13 May PCR

5 Tu say 14 May dién di

6 Can ky thuat 15 Hộp đèn UV

7 Nồi hấp 16 Máy nước cất

8 May do pH 17 May nước Mili Q

9 May lac 18 Máy đánh siêu âm3.2.3 Dụng cụ

Danh sách các dụng cụ dùng trong đề tài sẽ được trình bày ở bảng 3.2

16

Bảng 3.2 Danh sách các dụng cụ dùng trong thí nghiệm

STT Dụng cụ STT Dung cu

1 Ong nghiém 10 Nút bông

2 Giá đỡ ống nghiệm 11 Giấy lọc

3 Pipet thủy tinh 12 Gang tay

4 Micro pipet 13 Khau trang

5 Dau tip 14 Silk quan dia

6 Eppendorf 15 Que cay vong

7 Erlen 16 Que cay chan

(5g/l), calcrum acetate (5g/l), agar (25¢/l)

LB Yeast extract (5g/1), Peptone (10g/1),

NaCl (10¢/1) UCB NB (3g/), NaHCOs (2,12g/1), NHaCI

vi khuân có kha năng tao tủa calcite với sản lượng cao.

17

Vi khuan được phan lập dựa trên phương pháp cấy trai bằng cách hút 100uldich pha loãng ở nồng độ 103, 10, 10°, trai đều lên bề mặt đĩa petri B4 agar, ủ 35°Ctrong 24h Lựa chọn các khuẩn lạc đặc trưng, tiến hành cấy chuyển và làm thuầnchủng vi khuẩn trên môi trường B4 agar.

3.3.2 Chon lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tao tủa calcite

Đề tài tiến hành thử nghiệm định tính khả năng sinh urease, thử nghiệm khảnăng tạo kết tủa và thử nghiệm tao bot với HCI dé chọn lọc các chủng vi khuẩn có khảnăng tạo kết tủa calcite

Định tính khả năng sinh urease

Các vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa calcite thường tiết ra enzyme urease xúctác quá trình thủy phân urea Việc thủy phân urea sẽ giải phóng ammonia khiến chomôi trường thạch ure trở nên kiềm hơn, pH tăng lên làm cho phenol red chuyên từ màu

vàng, vang cam sang mau hong.

(NH2)2CO + 2H›O ——> CO.+H20+2NH;3

pH ~ 6,8 pH~ 8.1

18

Cách thực hiện: Cay một khuẩn lạc tạo tủa đã thuần chủng vào đĩa thạch ure, dé

ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Sau đó kiểm tra kết quả phản ứng:

(+): Môi trường chuyền sang mau hồng cánh sen.

(-): Môi trường không đối màu

Xác định khả năng tạo kết tủa calcite

Cay chuyền các mẫu vi khuẩn đã thuần chủng vào ống nghiệm chứa môi trườngUCB, ủ ở 35°C trong 14 ngày và quan sát khả năng tạo kết tủa Các chủng tạo kết tủa

sẽ được chọn lọc để tiến hành thử nghiệm tạo bọt với HCI

Thử nghiệm tao bọt với HCl

Thí nghiệm này dựa trên phản ứng của tủa calcite với acid hydrochloric bằngcách kiểm tra khả năng tạo bọt khí khi tác dụng với acid hydrochloric

Nhỏ vài giọt HCI vào các ống nghiệm tạo tủa đã được chọn lọc, quan sát phản

ứng và đọc kết quả:

(+): Có hiện tượng sui bọt khí do quá trình giải phóng khí carbon dioxide.

(-): Không có hiện tượng

3.3.3 Xác định khối lượng CaCO: tạo thành

Mau vi khuẩn tăng sinh trong môi trường LB broth được cấy vào bình chứa100ml môi trường lỏng UCB, ủ ở nhiệt độ 35°C trong 14 ngày Sau đó, các mang tủaxuất hiện trong bình sẽ được thu và lọc qua giấy lọc whatman Grade 2 WHA1002150

và say khô ở 70°C đến trọng lượng không đổi Khối lượng kết tủa được cân và ghinhận ước lượng hàm lượng calcite được tạo bởi vi sinh vật Lượng tủa thu nhận được

từ các chủng vi sinh vật sẽ được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét SEM, dékiểm tra thành phần nguyên tố và dạng tinh thé calcite có trong mau tủa

3.4 Phương pháp bảo quản chủng vi khuẩn

Giống thạch nghiêng: Cay ria chủng vi khuẩn đã được thuần chủng vào ốngnghiệm chứa môi trường B4 agar, ủ ở nhiệt độ 35°C trong 24 giờ Tiến hành bảo quản

ở nhiệt độ 4°C khi vi khuẩn đã phát triển trong ống nghiệm thời gian bao quản khoảng

03 tháng.

Giống lạnh đông: Hút 500ul chủng vi khuẩn đã tăng sinh ở 35°C trong 48 giờvào eppendorf 1,5ml Bồ sung 500ul glycerol 40%, trộn đều và bảo quản ở nhiệt độ -80°C, thời gian bảo quản khoảng 05 đến 10 năm

19

3.5 Phuong pháp định danh hình thai-sinh hóa

Mục đích: Dựa vào các đặc điểm hình thái và sinh hóa dé phân loại và xếp

nhóm cho các chủng vi sinh vật đã phân lập Vi sinh vật được phân loại bước đầu dựa

vào các đặc điểm hình thái: quan sát đại thể (khuẩn lạc), quan sát tế bào (nhuộm

Gram) và khả năng hình thành bào tử Các thử nghiệm sinh hóa: được tiễn hành trên

các môi trường đặc hiệu, phản ứng dương tính (+) hoặc âm tính (-) được ghi nhận dựa

trên phản ứng của môi trường.

3.5.1 Phương pháp nhuộm Gram

Phương pháp nhuộm Gram trong đề tài sẽ được sử dụng đề phân biệt các loại vi

khuẩn có trong mẫu Phương pháp nhuộm Gram dựa trên khả năng hấp thu và phânphối các kháng sinh, giúp phân biệt giữa các loại vi khuẩn Gram âm và Gram dương.3.5.2 Phương pháp nhuộm bào tử

Nội bào tử vi khuẩn là các cấu trúc không hoạt động chuyên hóa và rất trơ đượctạo ra bởi một số vi khuẩn như một chiến lược phòng thủ chống lại điều kiện môitrường không thuận lợi Vi khuẩn có thé van trong trang thái này cho tới khi các điềukiện trở nên thuận lợi và chúng có thé nảy mam và trở lại trạng thái hoạt động

3.5.3 Các thí nghiệm sinh hóa

3.5.3.1 Thử nghiệm kha năng lên men

Nguyên tắc

Lên men carbohydrate là quá trình vi sinh vật sử dụng đường dé sản xuất nănglượng Hầu hết các vi sinh vật chuyển đổi glucose thành pyruvate trong quá trình

đường phân Môi trường lên men bao gồm một số loại carbohydrate (glucose, maltose,

lactoza, sucrose, manmtol, ) dé lên men Khi sử dụng các nguồn carbon dé lên men,tuỳ phương thức lên men, các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau bao gồm ethanol, cácacid hữu co, carbon dioxide, và đều làm giảm pH môi trường Do đó kha năng lên

men được đánh giá nhờ vào phản ứng của chất chỉ thị pH môi trường

3.5.3.2 Thwr nghiệm Indol

Nguyên tắc

Trytophan là một axit amin có thé trai qua quá trình khử amin và thủy phân bởi

vi khuẩn có hệ enzym trytophanase Indol được tạo ra bằng cách khử amin từ

trytophan thong qua phân tử trung gian axit indolepyruvic Tryptophanase xúc tác

20

phan ứng khử amin, trong đó nhóm amin (-NH;) của phân tử tryptophan bị loại

bỏ Sản phẩm cuối cùng của phản ứng 1a indol, axit pyruvic, amoni (NH¿”) va nănglượng Pyridoxal phosphate là cần thiết như một coenzym

Khi mdol được kết hợp với thuốc thử Kovac’s (co chứa axit clohydric và dimethylaminobenzaldehyde), dung dịch chuyên từ màu vàng sang màu đỏ hồng Bởi vì

p-rượu amyl không hòa tan trong nước nên mau đỏ sẽ tạo thành một lớp dau ở trên cùng

3.5.3.3 Thử nghiệm Methyl red (MR)

Trong thử nghiệm methyl red (thử nghiệm MR), vi khuẩn thử nghiệm đượcnuôi cấy trong môi trường canh thang có chứa glucose (MR-VP broth) Nếu vi khuẩn

có khả năng sử dung glucose với việc tạo ra một loại axit én định, thi màu của môitrường sẽ chuyền từ vàng sang đỏ sau khi bổ sung thuốc thử

3.5.3.4 Thử nghiệm Voges-Proskauer

Nguyên tắc

Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) được sử dụng dé xác định xem một sinh vật

có tạo ra acetylmethyl carbinoltừ quá trình lên men glucose hay không Nếu

có, acetylmetyl carbinol sẽ được chuyển thành diaxetyl với sự có mặt của naphthol , kiềm mạnh ( 40% KOH ) và khí oxy

alpha-2 pyruvate = acetoin + alpha-2CO;

acetoin + NADH + H* = 2,3-butanediol + NAD*

3.5.3.5 Thử nghiệm Citrate (iC)

Nguyén tac

Thạch Simmons Citrate được su dụng dé kiém tra kha năng sử dung citrate lamnguồn năng lượng của sinh vật Nếu có thé sử dung citrate, vi khuẩn sẽ tích lũy các sản

21