Hiện nay, ở nước ta ngoài những nghiêncứu về ứng dụng vi khuẩn tạo tủa dé cải thiện các vết nứt trên vật liệu bê tông bằngcác chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ nước ngoài thì đã chú trọng h
VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIEM
Thời gian và địa điểm nghiên cứu - 2+ ©2222++22+22+z2++2z+zzxezrrzrxerxez 17 J“ N4 083i ẰẰẳồ'.'IÂo
Thời gian thực hiện: từ tháng 12 năm 2022 đến tháng 6 năm 2023.
2.1.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng vi sinh ứng dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới.
Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị như cân kỹ thuật, lò vi sóng, máy nước cất, máy đo quang phổ và máy lắc đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các thí nghiệm chính xác Ngoài ra, các thiết bị như tủ cấy, tủ ủ, máy đo pH, nồi hấp và thiết bị điện di cũng là những công cụ thiết yếu giúp đảm bảo quá trình nghiên cứu diễn ra hiệu quả Đặc biệt, tủ mát và tủ -20°C được sử dụng để bảo quản mẫu vật và hóa chất, góp phần vào sự thành công của các nghiên cứu khoa học.
Trong phòng thí nghiệm, các dụng cụ và vật liệu như bông thấm nước, bông không thấm nước, búa, bình định mức, cố thủy tinh, đèn cồn, đũa petri, effendoft, erlen, giá đỡ ống nghiệm, găng tay, giấy lọc, hộp nựa, khẩu trang, ống nghiệm, micropipet, que cấy thang, que cấy trang, và seal quấn đĩa đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo môi trường làm việc an toàn và hiệu quả Việc sử dụng đúng các hóa chất và thiết bị này không chỉ giúp nâng cao chất lượng nghiên cứu mà còn bảo vệ sức khỏe của người sử dụng.
Môi trường B4 (4 g/L yeast extract powder; 2,5 g/L Calcium acetate; 5 g/L Glucose, 20 g/L Agar)
Môi trường B4C (4 g/L yeast extract powder; 2,5 g/L Calcium acetate; 5 g/L Glucose; 25 g/L Calcium chloride).
Môi trường NB (1,5 g/L Yeast Extract; 1,5 g/L HM peptone B; 5 g/L Peptone;
Môi trường LB (5 g/L Yeast Extract, 10 g/L Pepton; 10 g/L NaCl).
Môi trường UCB (20 g/L Urea; 2,12 g/L NaHCOs, 10 g/L NHẠC]; 3 g/L
Dung dich A (10 g/L phenol; 50 mg/L sodium nitroprusside ).
Dung dịch B (5 mg/mL NaOH; 0,044% NaClO).
Vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa calcite trong mẫu đá thu được từ khu vực mỏ đá tại tỉnh Nghệ An, Việt Nam.
Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn có khả năng tạo tua calcite.
Tối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn ở quy mô phòng thí nghiệm.
Thử nghiệm khả năng tạo kết tủa calcite các các chủng vi khuẩn tuyên chọn.
Phòng Vi sinh ứng dụng cung cấp các mẫu đá để tiến hành phân lập và định danh Quá trình này nhằm chọn ra những chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite với sản lượng cao Từ đó, khả năng tạo tủa calcite của các chủng vi khuẩn được đánh giá một cách chi tiết.
Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng:
Quy trình nghiên cứu chung
Mau dat đá đã qua xử lý
Phan lap ˆ —————> Lam thuan ———> Giữ chủng, bảo quan
Xác định kha năng tạo tủa với calcite ——— Loai
Thử nghiệm tạo bọt với acid hydrochloric [mm ——— Loại
| Duong tinh Định tính kha năng urease Âmtính ————> Loại
J [ Dương tính Đánh giá khả năng tạo tủa Định danh
Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuân được tuyển chọn
Thử nghiệm khả năng tạo kết tủa của vi khuân được tuyên chọn
Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu chung.
Trong nghiên cứu này, các phương pháp áp dụng là những phương pháp chuẩn mực trong nuôi cấy vi khuẩn, dựa trên các quy chuẩn quốc gia và các công trình quốc tế đã được công bố.
Nội dung 1: Phân lập, tuyến chọn và định danh vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite Phân lập vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite:
Các mẫu thu thập được nghiền nhỏ bằng phương pháp cơ học và nuôi cấy trong môi trường B4 lỏng Sau 24 giờ, mật độ quang học của các dịch nuôi cấy được xác định ở bước sóng 600 nm, với giá trị OD600 đạt trên 0,8.
Tiến hành pha loãng dịch tăng sinh đến các nồng độ 10^3, 10^1, 10^5 (Dương Thị Hồng Đào, 2019) Vi khuẩn được phân lập qua phương pháp cấy trải bằng cách hút 200 µl dịch pha loãng và trải đều lên bề mặt môi trường B4 agar trong đĩa petri, sau đó ủ ở 37°C trong 24 giờ Các khuẩn lạc đặc trưng được lựa chọn, sau đó tiến hành cấy truyền để thuần chủng vi khuẩn trên môi trường B4 agar.
Sang lọc nhanh chúng vi khuẩn có khả năng tạo tia calcite
Xác định khả năng tạo kết tủa calcite
Các chủng vi khuẩn đã được thuần chủng trong ống nghiệm với môi trường B4 lỏng và ủ ở 37°C trong 7 ngày để quan sát khả năng hình thành kết tủa khoáng Những chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa sẽ được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Định tính khả năng sinh urease cũng được thực hiện để đánh giá thêm về các chủng vi khuẩn này.
Vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa calcite thường tiết ra enzyme urease, giúp xúc tác quá trình thủy phân urea Quá trình này giải phóng amonia, làm cho môi trường Urea broth trở nên kiềm hơn, dẫn đến sự tăng pH và khiến phenol red chuyển từ màu vàng sang màu tím.
(NH2)2CO + H20-> CO; + H20 +2NH3 pH~6,8 pH~8,l
Để thực hiện, bạn cần dùng que cấy để lấy một khuẩn lạc đã thuần chủng và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường urea broth Tiến hành ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 72 giờ, sau đó kiểm tra kết quả phản ứng.
(+): Môi trường chuyền sang màu tím
(-): Môi trường không đổi màu
Thủ nghiệm tạo bot với acid chlohydric
Thí nghiệm này dựa trên phản ứng của tủa calcite và acid chlohydric bằng cách kiểm tra khả năng tao bọt khí khi tác dụng với acid chlohydric.
Để thực hiện thí nghiệm, nhỏ 1 - 2 giọt acid chlohydric đậm đặc vào các ống nghiệm chứa dung dịch vi khuẩn sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C Sau đó, quan sát hiện tượng phản ứng và ghi nhận kết quả.
(+): Có hiện tượng sti bọt khí do quá trình giải phóng khí carbondioxid.
Phản ứng giữa CaCO3 và HCl tạo ra CaCl2, CO2 và H2O Để định lượng hoạt độ enzyme urease, phương pháp Phenol-hypochloride được sử dụng nhằm xác định lượng ammonia được giải phóng từ urea (Kim và cộng sự, 2016).
Chuẩn bị dich enzyme: Vi khuẩn được tăng sinh trong 50 mL môi trường LB.
Quá trình thu sinh khối tế bào bắt đầu bằng việc ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó rửa sinh khối hai lần bằng dung dịch 50 mM HEPES Tiếp theo, sinh khối được ly tâm một lần nữa ở cùng tốc độ và thời gian để thu thập tế bào Sau đó, sinh khối được đánh siêu âm trong nước đá ba lần, mỗi lần kéo dài 30 giây Cuối cùng, ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi (dịch enzyme), và toàn bộ quá trình được thực hiện ở nhiệt độ 4°C.
Để thực hiện phản ứng enzyme, hút 500 µL dung dịch enzyme hoặc chất chuẩn ammonium chloride, sau đó thêm 500 µL buffer urease và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 20 phút cho enzyme hoạt động Để ngừng phản ứng enzyme, hút 1 mL dịch enzyme cho vào ống nghiệm chứa 1,5 mL dung dịch A, thêm 1,5 mL dung dịch B, trộn đều và ủ ở 37°C trong 30 phút Kết quả được đo bằng mật độ quang học ở bước sóng 620 nm bằng máy đọc đĩa Platereader.
Để xác định hoạt độ enzyme, ta sử dụng đồ thị đường chuẩn ammonium chloride nhằm đo lượng ammonia trong dung dịch enzyme Hoạt độ enzyme được tính dựa trên số lượng ammonia được giải phóng từ urea Đơn vị hoạt độ enzyme (U) được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa 1 micromole (1 mol) cơ chất trong một phút dưới điều kiện tiêu chuẩn.
1U = 1 mol cơ chất (105 mol)/ phút.
Lưu trữ và bảo quản chủng vi khuẩn
Cấy ria chủng vi khuẩn đã được thuần chủng vào ống nghiệm chứa môi trường B4 agar và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Sau khi vi khuẩn phát triển, tiến hành bảo quản ống nghiệm ở nhiệt độ 4°C, thời gian bảo quản có thể lên đến 3 tháng.