3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 03/2022 đến tháng 07/2023, tại phòng Vi sinh Ứng dụng
RIBE 212, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi Trường, Trường Đại học Nông
Lâm Thanh phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Thu thập mẫu đất ở tỉnh Bến Tre. Mẫu đất được lấy ở độ sâu tầng đất 0 - 30 cm, 0,5 kg dat/mau, cho vào lọ nhựa sạch, ghi thông tin mẫu thu thập, vị trí lấy mẫu. Mẫu được lưu trữ mát chuyền về phòng thí nghiệm. Mẫu đất được phân tích chỉ tiêu trong đất: EC, pH trong vòng 24 giờ.
Bảng 3.1. Địa điểm thu thập mẫu
Số thứ tự Địa điểm thu mẫu Ký hiệu mẫu 1 Tan Pha, Chau Thanh, Tinh Bén Tre |
Tan Pha, Chau Thanh, Tinh Bén Tre Tân Phú, Châu Thanh, Tinh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre Tân Phú, Châu Thành, Tỉnh Bến Tre
WN â œơỡiatœ:> OMAN DNAHWN
— ©= — ©=
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. từ mẫu đất
Mau đất sau khi thu thập sẽ được tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu như EC, pH. Dé đánh giá độ mặn của đất, ta sẽ dùng đại lượng EC. EC là độ dẫn điện của đất là phép đo tong lượng muối hòa tan trong đất trồng, có đơn vị là dS/m (1dS/m = 0,64%), là cách tốt nhất dé đo các ion đất, điều này giúp theo dõi được các chất dinh dưỡng có san.
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ dẫn điện của đất như: nhiệt độ không khí, nước, đất; loại đất, độ âm; lượng nước tưới; phân bón; độ sâu của đất.
Độ dẫn điện và pH tương tác mật thiết với nhau. Đất có tính axit thì độ dẫn điện càng cao, pH gan trung tính càng ít ảnh hưởng đến độ dẫn điện.
Bảng 3.2. Các loại đất mặn (phân theo nồng độ) và ảnh hưởng đối với cây trồng
Độ mặn Nông độ muôi
Fhanlogidat (isin) — hàng3 Ảnh hưởng đến thực vật
Khôngmặn 0-2 0- 1,28 Mặn ảnh hưởng không đáng kê _
Mặn thấp 2-4 1,28 - 2,56 Năng suât của nhiều loại cây có thê bị giới han
Mặn trung 4-8 2,56 - 5,12 Nang suât của nhiều loại cây trông bị bình giới hạn
Mặn cao 8-16 5,12 - 10,24 Chỉ một sô cây trông chịu đựng được
Mặn rất cao > 16 > 10,24 Chi rat ít cây trồng chịu đựng được.
(Nguon: Utah State University).
Phân lập, làm thuần và giữ giống các chủng vi khuẩn:
Phân lập: tiến hành cân 10 g mẫu dat cho vào bình chứa 90 mL nước cất đã được hap vô trùng và lắc 150 vòng trong 30 phút. Dé lắng khi dich phân thành 2 lớp hút 1 mL dung dịch vào ống nghiệm chứa 9 mL nước cất đã hấp khử trùng thực hiện trong tủ cấy vi sinh vô trùng, thu được dung địch có độ pha loãng 107. Tiếp tục thực hiện các bước trên dé được độ pha loãng tương ứng 103, 10, 10Š. Hút 100 ul dich pha loãng ở nồng độ 103, 10, 10° trải đều trên các đĩa petri chứa môi trường King B (20 g peptone;
MgSO¿.7HaO 1,5 g; KzHPO/¿ 1,5 g; glycerol 10 mL; agar; nước cất vừa đủ 1 lít) có bổ sung 1% NaCl. Dùng que cấy trang đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, trang đều dịch trên bề mặt thạch đến khi bề mặt khô hoàn toàn. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 48 giờ dé vi khuan phát triển.
Làm thuần: sau 48 giờ lựa chọn các khuẩn lạc đơn nam riêng lẻ, phát huỳnh quang dưới đèn UV với bước sóng 366 nm cấy chuyên trên đĩa thạch KB, ủ ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ, quan sát và ghi nhận kết quả. Tiến hành cấy chuyền hai đến ba lần để đảm bảo độ thuần của các chủng vi khuẩn.
Giữ giống: trong ống thạch nghiêng, nuôi cấy thuần vi khuẩn trên đĩa petri. Sau 48 giờ, chọn khuẩn lạc đơn cấy ria trên ống thạch nghiêng chứa môi trường KB đã được hấp khử trùng, làm nút bông gói lại bằng giấy báo. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Bên cạnh đó, giữ giống trong ông eppendorf (20% glycerol; 1% peptone; nước cat) ở nhiệt độ - 20 °C đến 0 °C.
Xác định các đặc điểm hình thái, sinh hóa:
Hình thái khuẩn lạc: đo kích thước, mô tả hình thái khuẩn lạc, bao gồm các chỉ
tiêu: màu sac, hình thái, độ nôi, dạng bìa khuân lạc.
16
Mô tả một số đặc điểm tế bào:
Nhuộm gram: mục dich phân biệt dòng vi khuẩn gram âm hay gram đương, quan sát hình thái tế bảo.
Các bước thực hiện: nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên giữa lam kính. Dùng que cấy đã khử trùng lấy ít sinh khối vi khuẩn, trải đều lên lam kính, cố định mẫu bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn. Đầu tiên nhỏ 1 đến 2 giọt dung dịch crystal violet (Đức), để khoảng 1 phút sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng. Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vi khuẩn thành mau tim đen. Tiếp theo nhỏ 1 đến 2 giọt dung địch lugol dé có định màu, cũng dé khoảng 1 phút rồi rửa nhanh lại bằng ethanol khoảng 10 giây và nước cất vô trùng. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loài vi khuẩn. Cuối cùng nhỏ 1 đến 2 giọt dung dịch safranin để khoảng 1 phút rồi rửa nước cất vô trùng giúp các vi khuẩn đã bi tay hết màu tim bắt lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bắt màu tim den sẽ không bị ảnh hưởng. Dé ráo nước, quan sát dưới kính hiền vi ở độ phóng đại 100X dưới vật kính soi đầu và ghi nhận kết quả.
Kết quả: mẫu có màu tím là gram dương, mẫu có màu hồng đỏ là gram âm.
Phản ứng Catalase: mục đích phát hiện sự có mặt của các vi sinh vat có hệ enzyme catalase. Catalase giúp vi sinh vật ky khí không bị ngộ độc khi môi trường có oxy không
khí bởi sự hình thành chất HạO¿.
Các bước thực hiện: vi khuẩn kiểm tra sẽ được nuôi trên môi trường thạch. Dùng que cấy đã được khử trùng bằng ngọn lửa đèn côn lấy sinh khối vi khuân từ môi trường nuôi cấy đặt lên lam kính sạch. Sau đó nhỏ thuốc thử HzOa 3% dé kiểm tra hoạt tính
catalase. Quan sát qua 1 - 2 giây. Phản ứng dương tinh sẽ tạo bọt khí, ngược lại phản ứng âm tính sẽ không tạo bọt khí.
Phản ứng Oxidase: mục đích phát hiện sự có mặt của hệ enzyme cytocrom oxydase
của vi khuẩn.
Các bước thực hiện: dùng que cấy đã khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn đặt lên đĩa giấy oxydase có tâm thuốc thử. Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện màu tím đen, ngược
lại phản ứng âm tính.
3.2.2.1. Khảo sát khả năng chịu mặn của vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trên môi trường thạch KB 48 giờ, dùng que cấy lay sinh khối dé tiến hành tăng sinh cấp 1 trong môi trường KB đã hấp khử trùng trong vũng 24 giờ, tốc độ lắc là 150 vũng/phỳt. Do ODứứứam và điều chỉnh sao cho mật
độ quang các bình bằng nhau bằng 0,5. Tiếp giống với tỷ lệ 1% từ bình tăng sinh cấp 1 cho vào bình chứa môi trường KB có bé sung các nồng độ muối khác nhau: 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. Tiếp tục tăng sinh cấp 2 trong vòng 24 giờ tốc độ lắc là 150 vòng/phút.
Hút 100 uL dịch khuẩn đã tăng sinh cấp 2 lên đĩa chứa môi trường KB agar, mỗi nồng độ với 3 lần lặp lại. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Từ đó chọn ra các chủng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nồng độ muối cao dé thực hiện các nội dung tiếp theo.
Chon đĩa có số đếm trong khoảng 25 - 250 sau đó đếm tat cả khuẩn lạc và tính kết quả. Mật độ tông vi khuẩn được tính như sau:
N
"n1xVxfl+--+nixVxfủ
trong đó:
A: số tế bào vi khuẩn trong 1 g hay 1 mL mau (CFU/g hoặc CFU/mL) N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ ¡
V: thể tích địch mẫu (mL) cay vào trong mỗi đĩa
fi: độ pha loãng tương ứng.
3.2.2.3. Khảo sát khả năng phân giải lần
Xác định khả năng phân giải lân dựa theo TCVN 6167:1996 nhằm đánh giá sơ bộ khả năng phân giải lân vô cơ của các chủng vi khuẩn được phân lập bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch chứa môi trường Pikovskaya medium gồm: glucose 10,0 g;
Ca3(PO4)2 5,0 g; (NH¿)¿SO¿ 0,5 g; KCl 0,2 g; MgSOu.7H20 0,1 g; MnSO¿ 0,002 g;
FeSO, 0,002 g; cao nam men 0,5 g; agar 20,0 g và nước cất vừa đủ 1 lít).
Nuôi cay chủng vi khuẩn trên môi trường KB 48 giờ. Dùng que cay lấy sinh khối khuẩn cấy 3 điểm tương ứng với lặp lại 3 lần. Ủ ở nhiệt độ phòng 2 - 5 ngày. Đường
kính vòng phân giải lân khó tan được quan sát dựa trên kích thước vòng phân giải qua
từng ngày nuôi cấy nhằm chọn lọc các chủng có vòng phân giải lớn.
Xác định hàm lượng phân giải phospho: các chủng có vòng phân giải lớn sẽ tiếp thục xác định hàm lượng phân giải phospho bằng phương pháp trắc phố dùng amoni
molipdat theo TCVN 6202:1996 tại Phòng thử nghiệm môi trường, Viện A2, Trường
18
Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, nhằm khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ và chọn lọc được các chủng có hiệu suất phân giải cao.
Nguyên tắc: phan ứng giữa ion octophosphat, dung dịch axit chứa molipdat và ion antimon sẽ tạo ra phức chất antimon phosphomolipdat. Khử phức chất bằng axit ascobic tạo thành phức chất molipden màu xanh đậm. Do độ hấp thu có thé xác định được nồng
độ octophosphat.
Pha dung dich octophosphat chuẩn: sấy khô vai gram kali dihydrogenphosphat tới khối lượng không đổi ở 105 °C. Hòa tan 0,2197 g KH2POs trong 800 mL nước vào bình
định mức 1000 mL. Thêm 10 mL dung dịch H2SOq 4,5 mol/L và định mức đủ 1000 mL.
Dung dịch chuẩn có nồng độ 50 mgP/L.
Pha thuốc thử P: định mức 300 mL nước cất vào cốc đong 1000 mL, thêm từ từ
150 mL HaSOa. Hoa tan 12,5 g amoni heptamolipdat tetrahydrat (NH1)6Mo7024.4H20
trong 100 mL nước cất. Hòa tan 0,35 g antimon kali hemyhydrat K(SbO)C4H4Oo.1/2 HaO trong 100 mL nước cat. Sau khi dung dịch axit nguội bồ sung hai dung dịch trên.
Thuốc thử được bảo quan trong lọ thủy tinh mau nâu.
Pha dung dich lên màu: thuốc thử P pha với dung địch axit ascobic với tỉ lệ 1 g axit/100 mL thuốc thử P. Dung dich lên màu đựng trong lọ thủy tinh và sử dụng trong
ngày.
Cách tiến hành phản ứng:
Đối với mẫu cần xác định phospho tổng:
Phá mau: lắc đều mẫu gốc, dùng pipet hút 5 mL mẫu cho vào bình kendan. Thận trọng thêm 2,5 mL dung dịch H2SO, và lắc đều. Dun nóng nhẹ đến khi xuất hiện khói trắng thêm từ từ 0,5 mL axit nitric từng giọt, vừa thêm vừa lắc nhẹ đến khi dung dịch trong không màu. Nếu dung dịch vẫn còn màu thì tiếp tục đun.
Làm nguội và thêm từ từ 10 mL nước cất, lắc đều.
Lọc mẫu: sau khi đã làm mát, chuyên dung dịch đã phá sang bình định mức, tráng bình kendan bang một nước cat cho vào bình định mức đủ 50 mL bằng nước cat. Tiến hành lọc dung dịch bằng giấy lọc thu dịch trong.
Lên màu: hút 1 mL dung dịch đã lọc cho vào bình định mức (độ pha loãng dung
dịch phụ thuộc vào độ lên màu của mẫu). Cho thêm một ít nước cất. Chính pH bằng 1 giọt phenolphtalein. Tiếp tục lắc và cho từng giọt NaOH 25% cho đến khi dung dịch
chuyên sang màu hồng nhạt. Thêm 4 mL dung dịch lên màu và nước cất định mức đủ, đập nắp, lắc đều và đợi 30 phút. Do bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm.
Đối với mẫu cần xác định octophosphat:
Lọc mẫu gốc bằng giấy lọc thu dịch trong.
Lên màu: hút 1 mL dung dịch đã lọc cho vào bình định mức (Độ pha loãng dung
dịch phụ thuộc vào độ lên màu của mẫu). Cho thêm một ít nước cất. Chỉnh pH bang 1 giọt phenolphtalein. Tiếp tục lắc và cho từng giọt NaOH 25% cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Cho 4 mL dung dịch lên màu va nước cất định mức đủ,
đập nắp, lắc đều và đợi 30 phút. Do bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm.
Cách tiến hành dựng đường chuẩn:
Bảng 3.3. Pha dung dịch chuẩn P
STT 0 1 2 3 4 5 VddP-PO4
eroded) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 V dd lên màu
(mL) 4 4 4 4 4 4 Nước cat (mL) Dinh mức du 50 mL
C (mg/L) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Dé yên 30 phút, đo bằng máy quang phổ UV - Vis bước sóng 882 nm.
Chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân tốt nhất tăng sinh trong Luria Bertani Broth lỏng (tryptone 10 g; cao nắm men 5 g; NaCl 10 g và nước cất vừa đủ 1 lit) trong 24 giờ, tốc độ lắc là 150 vòng/phút. Do ODeo0nm và điều chỉnh sao cho mật độ quang các bình bằng nhau bằng 0,5. Tiếp giống 1% ở bình tăng sinh cấp 1 vào bình chứa môi trường PVK lỏng đã hấp khử trùng. Tiếp tục nuôi lắc trong vòng 96 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hiệu suất phân giải lân bằng cách đo hàm lượng phospho trong môi trường PVK lỏng trước và sau khi nuôi cấy.
Hàm lượng phospho tan đầu ra — Hàm lượng phospho tan đầu vào
Hiệu suất = x 100 Tổng hàm lượng phospho
3.2.2.4. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp phytase của các chủng vi khuẩn
Xác định khả năng sinh tổng hợp phytase theo Stephen Joseph và Jisha (2008): từ kết quả khảo sát chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn và phân giải lân tốt dé xác định khả năng sinh tông hợp enzyme phytase.
20
Đánh giá khả năng sinh enzyme phytase ngoại bảo qua môi trường Phytase screening medium (glucose 1,5%, natri phytate 0,1%, NH4NO3 0,2%, KCI 0,05%,
MgS0O4.7H20 0,05%, MnSO¿ 0,05%, FeSO¿ 0,03%, agar 2%, pH = 7 va nước cất vừa đủ 1 lit) bằng phương pháp cấy điểm trên đĩa thạch, ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 3 - 5 ngày. Hoạt tính sinh enzyme thể hiện ở hình thành vòng sáng xung quanh khuẩn lạc.
Hoạt tính phân giải phytase được xác định dựa vào công thức:
(D - d)
D x 100 x(%) =
trong do:
x: hoạt tinh phân giải phytate (%) D: đường kính vòng phân giải (mm)
d: đường kính khuẩn lạc (mm)
Xác định hoạt độ phytase theo Shimizu và ctv (1992):
Pha dung dịch thử màu: gồm dung dich A (((NH4)sMo702)4.4H20 1,5% pha trong H;SO¿a 5,5%) và dung dich B (FeSOx.7HaO 2,7% pha trong nước cat) với tỉ lệ (4:1).
Dung dịch thử màu được pha và dùng trong ngảy.
Dung dịch cơ chất: có chứa 3 mM Na - phytate trong đệm Na - acetate 0,1 M pH
= 5,5. Cách pha: Cân 0,198 g muối Na - phytase pha trong 10 mL nước cất ta thu được dung dịch gốc có nồng độ 30 mM (bảo quản 20 °C). Từ dung dịch gốc này pha loãng 10 lần với đệm Na - acetate 0,1 M (pH = 5,5) thu được dung dịch cơ chat có nồng độ 3 mM.
Chủng vi khuẩn sau khi được có hoạt tính sinh enzyme phytase được nuôi trong ống nghiệm chứa 5 mL môi trường PSM lỏng, lắc 200 vòng/phút, ở 37 °C, sau 24 giờ tiếp giống sang bình tam giác (V = 250 mL) chứa 100mL môi trường PSM lỏng sao cho ODứoo trong bỡnh nuụi đạt 0,05, lắc 200 vũng/phỳt, ở 37 °C. Sau 3 ngày nuụi, dịch nuụi vi khuẩn được ly tâm 10000 vòng/phút, 5 phút, ở 40°C thu dich trong.
Mẫu thí nghiệm: hút 0,2 mL dịch ly tâm cho vào 0,2 mL địch cơ chất, ủ ở 55 °C trong 20 phút, sau đó bồ sung 0,4 mL dung dich TCA 15% dé dùng phan ứng, bổ sung tiếp 0,8 mL thuốc thử, dé phản ứng ôn định 5 phút rồi xác định OD700 nm.
Mẫu đối chứng: hút 0,2 mL dịch đã ly tâm cho vào 0,4 mL TCA 15% nhằm bất hoạt enzyme, sau đó bổ sung 0,2 mL dịch cơ chất trong 20 phút, bổ sung tiếp 0,8 mL thuốc thử, dé phản ứng 6n định sau 5 phút rồi xác định OD700 am.
Cách xác định đường chuẩn phospho: dung dịch KH2PO. được dùng để dựng đường chuẩn. Cân chính xác 1,36 g KH:PO¿ hoàn tan vào 100 mL nước cất thu được dung dịch 0,1 M KH2POs (tương đương với 0,1 M Pi = 100 mM). Từ dịch gốc ta pha loãng ra các nồng độ: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mM. Hút 0,4 mL ở các nồng độ trên bổ sung 0,4 mL TCA, bổ sung tiép 0,8 mL thuốc thử mau, để phản ứng ổn định sau 5 phút, xác định OD700 nm. Một don vị hoạt tính phytase được quy định là lượng enzyme cần thiết dé giải phóng 1 umol Pi trong 1 phút ở điều kiện thử trên.
3.2.2.5. Định danh bằng sinh học phân tử
Định danh chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn và hiệu suất phân giải lân vô cơ cao nhất được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen trên vùng 16S - rRNA với trình tự mỗi: 27F: 5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3'
1492R: 5°GGTTACCTTGTTACGACTT3' theo (Piterian va ctv, 2010)
Ly trích DNA: hút 600 ul dich tăng sinh khuẩn cho vào eppendorf, thêm 600 ul
dung dich Lysis Buffer (Tris-HCl 0,1M; EDTA 0,01M; NaCl 0,5M; SDS 1%; pH = 8,0), vortex, thêm dung dich proteinase K va ủ trong 15 giây. Thêm 600 pl phenol -
chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1) vào phan dịch nổi phía trên, vortex nhẹ. Ly tam 12000 vong/10 phút. Hút dich nổi phía trên vào eppendorf mới. Thêm 500 pl Chloroform - isoamyl alcohol (24:1) vào phần dich nổi phía trên, trộn nhẹ hỗn hợp. Ly tâm 12000 vòng/10 phút. Hút dich nổi phía trên vào eppendorf mới. Thêm 400 ul
Isopropanol, trộn kỹ, đảo nhẹ eppendorf va u. Ly tâm 12000 vòng/10 phút, hut bỏ dịch
nôi, lay cặn. Rửa tủa DNA bằng 1 ml dung dich Ethanol 70% lạnh, ly tâm 12000 vòng/10 phút và bỏ dich lay cặn. Say khô, thêm 100 ul dung dịch TE 1X. Bao quan mẫu ở -20°C.
Định lượng DNA: Sử dung 2ul dịch chứa DNA cho mỗi lần đo trên máy BioDrop.
Ghi nhận kết quả đo được và xác định ty lệ A260nm/280nm . Nếu 1,7 < A260nm/280nm < 2,0 thì DNA ly trích được đạt chat lượng dé tiến hành khuếch dai PCR.
DNA tổng số sau khi tách chiết thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng PCR với các thành phần: Master Mix 12,5 wl; Primer 27F 0,5 wl; Primer 1492R 0,5 ul; H20 10,5 ul;
DNA 2 ul. Chu trình nhiệt: tiền biến tinh: 94°C trong 5 phút; quá trình khuếch dai: 94°C
trong 1 phút, 56°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút; 40 chu kì; hậu kéo dai: 72°C trong 10 phút.
Sản phẩm sau khi khuếch đại PCR được điện di trên gel agarose 1,5 % trong dung dịch đệm TBE 0,5X ; 100V trong 30 phút. Sử dụng khoảng Sul sản phẩm PCR cùng với
22