4.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn Pseudomonas
Độ mặn của đất: sau khi thu thập mẫu về phòng thí nghiệm tiến hành đo độ mặn của đất bằng máy đo EC và máy do pH, ta thu được kết qua Bang 4.1.
Bang 4.1. Độ mặn của các mẫu dat Ký hiệu Độ dẫn điện của đất
mẫu (dS/m) Néng độ muối hòa tan (9⁄4) pH
1 5,09 3,26 4,9 2 2,47 1,58 3.2 3 3,08 1,97 4.2 4 2,06 1,32 5,6 5 2,24 1,43 4,3 6 2,11 L235 4,9 7 1,12 0,72 4,2 8 1,68 1,07 4,9 9 1,31 0,84 4,6 10 1,21 0,77 5,6
EC là độ dan điện của đất, đơn vị dS/m (1 dS/m = 0,64%o).
Độ mặn và pH của đất cũng là thông số ảnh hưởng rat lớn đến sinh trưởng va phat triển của vi sinh vật, thông qua tác động tới vận chuyền các chất qua màng tế bao, mỗi chủng vi sinh vật sẽ phát triển tốt tromg đải pH thích hợp. Dựa vào nghiên cứu của Mujahid và ctv (2015) đã chỉ ra rằng pH 5 - 7 rat thích hợp với các chủng vi khuẩn phát huy được khả năng hòa tan phosphat và khả năng này giảm dần khi pH nhỏ hơn 5 hoặc cao hơn 8. Từ kết quả Bảng 4.1 độ mặn ta thấy đất thuộc đất mặn thấp đến trung bình, dựa vào đó lựa chọn được độ mặn thích hợp để khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn đã phân lập. 10 mau đất lấy từ tỉnh Bến Tre ta tiến hành phân lập trên môi trường KB, nuôi cấy trong 48 giờ nhằm chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng phát huỳnh quang dưới đèn UV bước sóng 366 nm. Kết quả thu nhận được 17 chủng phát sáng có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối 1%, sau khi tiến hành làm thuần xác định hình thái khuan lạc thì thu nhận được 10 chủng vi khuẩn nghi ngờ có hình thái và kích thước khác nhau. Bảng 4.2. cho ta thấy đa số các chủng phân lập được có màu xanh lá chiếm 40% gồm T3, T4, Tó, T7 nhưng sau một thời gian sắc tố này sẽ chuyển sang
các màu như nâu, xanh đen ở T6 và T7; 40% có màu vàng sữa, ovan nhưng khác nhau giữa độ bóng, tâm ở các khuân lạc; 10% vàng cam và 10% còn lại là vàng xanh.
24
Bang 4.2. Mô tả đặc điểm khuan lạc của các chủng vi khuẩn trên môi trường KB
Chủng : :
VI Màu sắc tố Đặc điểm hình thái Beng kink
. (mm)
khuan
Tl Vang stra Ovan, trơn, không bóng, không tam 3 T2 Vàng sữa Ovan, trơn, bóng, không tâm Ộ ; 4 T3 Xanh lá Không đều, nhây, bìa rang cưa, tâm lôi, xôp 3 T4 Xanh lá Nhay, tròn, to, bia rang cưa, tâm lôi, trơn 5 TS Vàng xanh nhạt Nhay, tròn, bia rang cưa, có tâm, trơn 7
Xanh lá, già ` — x i ˆ
T6 dhuy ẩn thành Không xác định, nhây, to, bìa răng cưa, tâm 5 See gah khô lôi, tron
mầu nâu
Xanh lá, già F . be. Pe ae :
T17 chuyền thônh Không xác định, nhay, bia rang cua, tam 3 lỗi, x6p
xanh den Ộ
T8 Vàng cam sữa Ovan, không có tâm, không bóng, 161 5 T9 Vàng sữa Ovan, có tâm đen, bóng, lôi 4 T10 Vang sữa Ovan, không tâm, bong, lôi 2
Nhuộm gram và các thử nghiệm sinh hóa: 10 chủng vi khuẩn phân lập có hình thái và kích thước khác nhau được tiễn hành nhuộm gram và các thử nghiệm sinh hóa.
Hình 4.1. Kết quả thử nghiệm Oxidase của một số chủng vi
khuân. (a) Chung T3; (b) Ching T6.
Hình 4.2. Kết quả thử nghiệm Catalase của một số chủng vi
khuân. (a) Chung 73; (b) Ching TO.
Bảng 4.3. Kết quả nhuộm gram
Chủng vi khuẩn Gram ati ta Catalase Oxidase
Tl - Que + + T2 - Que + + T3 - Que + + T4 - Que + + TS - Que + + T6 - Que + + T7 - Que + + T8 - Que + + T9 - Que + + T10 - Que + + Duong tính (+); âm tính (-); gram âm (-).
10 chủng phân lập được tiến hành nhuộm gram dé quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi 100X kết qua ghi nhận tat cả 10 chủng đều là trực khuẩn gram âm, hình que phù hợp với nghiên cứu của Lương Đức Phẩm (2002). Các thử nghiệm catalase, oxidase cũng cho kết quả dương tính. Đây là cơ sở bước dau ta có thé xác định được chủng Pseudomonas dé tiên hành các thí nghiệm tiếp theo.
4.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn
Từ 10 chủng vi khuẩn được phân lập tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau trên môi trường KB có bồ sung 3%,
4%, 5%, 6%, 7%.
18 —eT1
16 —e—T2 14 —=''
—=e—11
—e—T5
——T6
——17 6 ——T8
—=—n9
—==TI0 12
Mật độ vi khuẩn (Log10 CFU/ml) 10œ
3% 4% 5% 6% 7%
Nong độ NaCl (%)
Hình 4.3. Biêu đô ảnh hưởng của NaCl đên sinh trưởng của các chủng vi khuân ở các nông độ muôi khác nhau.
26
Bảng 4.4. Mật độ của các chủng vi khuẩn trên môi trường KB có bé sung muối Chủng Mật độ vi khuẩn trên môi trường KB có bô sung NaCl (CFU/mL)
khuẩn 3% NaCl 4% NaCl 5% NaCl 6% NaCl 7% NaCl
TÌ 4,718+0,02 3,282+0,08 3,02"40,05 2,97%+0,13 0,00%+ 0,00 TẢ 5412004 4,43'40,02 3,88840,07 3,55°%+40,10 3,484+ 0,05 T3 163§^2+0/05 12,39°+0,15 10,33°+0,01 7,05*+0,14 6,39*+0,02 T4 120211009 9,954+0,12 7,08°+0,04 5,69%+0,20 5,21°+0,07 TS 15,16°+0,04 14,9874 0,03 8,534+0,11 4,98°+0,17 3,364+ 0,02 T6 15/20°+0/07 14,827+ 0,13 10,01°+0,14 6,39%+0,01 5,73>+ 0,06 T7 1435°+0/02 13,37°+0,04 9,36°+0,04 6,37%+0,05 5,39°+ 0,03 TŠ 781°+017 5,18°+0,03 299h+0]1§ 2,34%+40,06 1,76f+ 0,32 T9 4/19°+0/01 3,032+0,05 2,58: 0,18 1,27"41,11 0,00%+ 0,00 T10 477⁄+0/04 4,75f+0,03 4,728 0,02 4,054+0,06 2,93°+ 0,06
Các giá trị trong cùng một cột có các chữ cái a, b, e, d giống nhau biểu thị khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P = 0,03).
Kết quả nhìn chung cho thấy các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn tốt, phần lớn đều phát triển ở có b6 sung 3% - 5%. Khi nồng độ muối tăng dần lên 6% đến 7% thì mật độ các chủng bắt đầu giảm hoặc ngưng phát triển ở các chủng T1; T§; T9 hầu như không phát triển đều nhỏ hơn 2,5.10? CFU/mL. Với các chủng T3; T6; T4; T7 thì mật độ vi khuẩn cao hơn han các chủng còn lại ở 7% mật độ trên 10° CFU/mL; chủng TI, T9 không phát triển ở 7%. So sánh với kết quả phân lập, định danh chủng vi khuẩn chịu mặn, có hoạt tính phân giải lân vô cơ cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long của Nguyễn
Đức Thành và ctv (2019) các chung P. oryzihabitans T2917 va Burkholderia sp. T3602
có kha năng chịu mặn đến 5% NaCl. Trong nghiên cứu của Nguyễn Anh Huy và Nguyễn Hữu Hiệp (2018) đã phân lập được 116 dòng vi khuẩn trên môi trường Burk chịu mặn 10°%o0 có kha năng cố định dam và sinh IAA trên nền đất mặn sản xuất lúa ở Bạc Liêu, Sóc Trăng và Kiên Giang. Và kết quả từ 7 mẫu đất vùng rễ chuối ở Cần Giờ, Giang Cam Tú va ctv (2023) đã phân lập được 24 chủng vi khuẩn chịu mặn ở nồng độ NaCl 4°%oo, trong đó có 10 chủng có khả năng chuyên hóa lân, 14 chủng có khả năng cố định đạm và 5 chủng vừa có hoạt tính cố định đạm vừa có khả năng phân giải lân thì các chủng
phân lập được có khả năng chịu mặn cao hơn lên tới 7%. Vì vậy phạm v1 ứng dụng của
các chủng v1 khuẩn được mở rộng ra các vùng đất nông nghiệp bị nhiễm mặn, cải thiện độ phì nhiêu, an toàn cho môi trường mà vẫn phát huy được hoạt tính.
Từ kết quả trên ta tuyển chọn chủng vi khuẩn có kha năng chịu mặn cao. Nhằm khảo sát thêm khả năng chịu mặn, tiếp tục thực hiện khảo sát ở 8% NaCl đối với 2 chủng vi khuẩn có mật độ cao nhất là T3 và T6 thu được kết qua Bảng 4.5.
Bảng 4.5. Mật độ vi khuẩn trên môi trường KB có bồ sung 8% NaCl
Mật độ vi khuẩn trên môi trường KB có bồ sung 8% NaCl Ching vi khuẩn (CFU/mL)
T3
1,3.10°
T6
1,8.103
4.3. Kết quả khảo sat khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn
4.3.1 Xác định khả năng phân giải lan
Với 10 chủng vi khuan sau khi đã khảo sát khả năng chịu mặn, tiễn hành định tính khả năng phân giải trên môi trường thạch PVK thu được kết quả như Bảng 4.6.
Các chủng vi khuẩn phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải. Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hòa tan hợp chất phospho không tan, dựa vào đó ta có thê đánh giá khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn dựa trên vòng sáng quanh khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy chia thành hai nhóm: nhóm 1 có khả năng phân giải và nhóm 2 không có khả năng phân giải. Từ 10 chủng vi khuẩn, có 8 chủng có kha năng phân tạo vòng phân giải gồm T3, 14, T5, 1ó, T7, T8, T9, T10 còn lại T1 và T2 không xuất hiện, cho
thay 8 chủng có khả năng chuyền hóa lân khó tan thành dạng dé tan. Vòng sáng xung quanh khuẩn lạc sẽ tăng từ ngày 2 đến ngày 5. Dựa vào Hình 4.4 ta thấy được chủng T3 và T6 sau 5 ngày nuôi cấy có vòng phân giải sáng, rõ và lớn hơn so với các chủng còn lại nên được chọn dé tiếp tục thực hiện nội dung tiếp theo.
28
4.3.2. Xác định hiệu suất phân giải phospho
Từ kết quá khảo sát khả năng chịu mặn và định tính vòng phân giải lân trên môi trường PVK, tuyến chọn được hai chủng T3 và T6 tốt nhất để tiến hành định lượng.
Nuôi cấy hai chủng vi khuẩn này trên môi trường PVK lỏng trong máy lắc ở 150 vòng/phút. Xác định hàm lượng P hòa tan trong môi trường sau 96 giờ nuôi cấy. Kết qua hàm lượng và hiệu suất phân giải phospho của hai chủng vi khuẩn được xác định dựa trên nồng độ PO4* trong dịch nuôi cấy ghi nhận 6 Bảng 4.6. và Hình 4.5..
Đồ thị đường chuẩn P (mg/L)
0,8 0,7 0,6 0,5 04 03 02 0,1
OD 882nm
0 0,2 0.4 0,6 0,8 1 12
Nồng độ P (mg/L)
Hình 4.5. Đồ thị đường chuẩn P (mg/L).
Đồ thị đường chuẩn có dang y = 0,7626x + 0,0034 (y là giá trị ODss2mm và x là
hàm lượng P theo đơn vị mg/L) với độ chính các R > 99%. Như vậy mức độ liên hệ giữa
x và y rất chặt chẽ, kết quả đo được rất đáng tin cậy.
Bảng 4.6. Hiệu suất phân giải P của hai chủng vi khuan T3 và T6
: : Ậ Hàm lượng phospho sau 96 giờ Hiệu suất phân giải
Chúng vi khuân (hrufT3 (%)
DC 4,29° + 0,32 0,08 T3 76,42? + 5,32 10,19
T6 58,14> + 4,09 7,28 Trong cùng một cột, các giá trị có cùng ki tự không khác biệt ÿ nghĩa về mặt thong ké
(P = 0,05).
Ket quả định lượng PO,* chủng có khả năng phân giải P cao nhất là T3 (76,42
mg/L) tương ứng với hiệu suất 10,19%. So sánh với các kết quả trước đây, theo Nguyễn Văn Giang va ctv (2018) đã phân lap, tuyển chọn được chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa HD3 có khả năng phân giải phosphat khó tan từ đất vùng rễ lúa tỉnh Hải Dương, có hàm lượng phân giải phosphat sau 4 ngày nuôi cấy trong môi trường NBRIP bé sung các nguồn carbon và nito khác nhau dao động lần lượt khoảng 4,64 - 13,56 mg/L và 10,23 - 15,9 mg/L. Năm 2017, từ mẫu đất vùng rễ cây sâm Ngọc linh ở Quảng Nam, Trần Bảo Trâm và ctv đã phân lập được 7 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải phosphat khó tan với hoạt tính dao động từ 57,81 đến 118,40 mg/L PO,* sau 8 ngày nuôi cấy trong môi trường NBRIP lỏng. Và nghiên cứu về vi khuẩn phân giải phosphat khó tan được phân lập từ đất vùng rễ của một số loài rau ăn lá tại Cần Thơ, 11 chủng
được phân lập với hàm lượng phosphat hòa tan cao dao động từ 41,43 - 50,63 mg/L sau
20 ngày ủ (Trần Thị Giang và ctv, 2014). Khi so sánh với các kết quả trên thì hiệu suất hoạt tính phân giải P khó tan của các chủng vi khuẩn phân lập được là cao hơn. Ngoài ra, kết quả định lượng lân hòa tan các chủng vi khuẩn được phân lập từ rễ, lá, trái của cây cà phê ở tỉnh Đắk Lắk của Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và ctv (2019) từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 dao động từ 1,32 - 4,30 mg/mL, trong đó dòng B.R157-2 có khả năng hòa tan lân khó tan cao nhất đạt 4.3 mg P;Os/mL được nhận diện Burkholderia sp.
B.R157-2 là cao hơn so với chủng T3 và T6. Điều này cho thấy thành phan đất ở các vùng canh tác khác nhau sẽ dẫn đến hoạt tính chuyển hóa lân của hệ vi sinh vật cũng khác nhau. Đối với các vùng mà thành phần đất có nhiều phosphat khó tan thì các vi khuẩn tại đó sẽ có hoạt tính cao hơn.
Theo nghiên cứu của Hoàng Anh Tuấn (2018) về xác định nhu cầu của một số nguyên tố đa lượng ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây dưa lê, đối với lân ở giai đoạn trồng - ra hoa cần ít lân nhất 5,03 mg/cây/ngày. Giai đoạn hình thành quả nhu cầu lân tăng mạnh dat 14,28 mg/cây/ngày. Đối với chủng T3 sau 96 giờ nuôi cấy với
30
môi trường có chứa Ca3(POx)2 phân giải được 76,42 mg PO¿Ÿ/L tương đương trung bình
sẽ phân giải khoảng 19 mg PO¿Ÿ/ngày. Vì trong dat dang lân khó tan sẽ tồn tại ở dang muối như Cas(PO¿)z, AIPOa,... vậy hàm lượng lân phân giải của chủng T3 đối với Caa(PO¿)a có thé cung cấp khoảng 98% nhu cầu của cây trong một ngày ở các giai đoạn khác nhau. Mặt khác, vì quá trình phân giải diễn ra từ từ cho cây có thé hap thụ nên đáp ứng được nhu cầu của cây, hơn thé quá trình phân giải từ từ tránh được hao phi vì P dé tan sẽ bị cố định thành dang khó tan, hứa hẹn tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất phân bón bền vững. Tuy nhiên cần khảo sát thêm một số điều kiện môi trường ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân như nhiệt độ, pH trong điều kiện phòng thí nghiệm và đồng ruộng. Tuy nhiên cần khảo sát thêm một số điều kiện môi trường ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn như nhiệt độ, pH trong điều kiện phòng thí
nghiệm và đông ruộng.
4.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hop phytase 4.4.1. Xác định khả năng sinh tong hợp phytase
Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân mạnh và chịu mặn cao T3, T6, T7 tiếp tục định tính kha năng sinh tổng hợp phytase.
Quan sát sau 4 ngày nuôi cấy, không ghi nhận vòng sáng xuất hiện ở 3 chủng
trên và cả đôi với các chủng còn lại.
Dựa vào kết quả Hình 4.5. ta có thé nhận thay rằng các chủng vi khuẩn không có
khả năng sinh enzyme phytase thì không phân giải phytate.
Vậy với mục tiêu đánh giá khả năng phân giải phytate thì có thê thấy rằng không
phải các vi sinh vật khả năng phân giải lân vô cơ khó tan thì sẽ có enzyme phytase. Vi vậy nội dung xác định hoạt độ phytase không được thực hiện.
4.5. Kết quả định danh chủng T3
Chủng T3 được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen trên vùng 16S - tRNA với trình tự mỗi 27F - 1492R theo (Piterian và ctv, 2010).
Gửi sản phâm PCR tại Viện Sinh học Phân tử Loci giải trình tự. Kết quả so sánh
trình tự nucleotide 16S - rRNA của chủng T3 với các trình tự trên NCBI va dựng cây
phân loài bằng phần mềm Mega 11.
1500bp
100[ T3
NR 114471.1 Pseudomonas aeruginosa strain ATCC 10145 100
95
NR 117678.1 Pseudomonas aeruginosa strain DSM 50071
91 E— NR 112062.1 Pseudomonas resinovorans strain ATCC 14235
6 NR 114477.1 Pseudomonas mendocina strain ATCC 25411 100
NR 114195.1 Pseudomonas flavescens strain NBRC 103044
‘06 NR 042436.1 Pseudomonas nitroreducens strain IAM 1439
NR 119225.1 Pseudomonas multiresinivorans strain ATCC 700690
LC768706.1 Bacillus subtilis GS3 gene
LC656378.1 Streptomyces coelicolor HEK332A1 gene
Hình 4.9. Cây di truyền của chủng T3 mang gen 16S rRNA.
32
Dựa vào kết quả Hình 4.6 và Hình 4.7 cho thấy mức độ tương đồng của chủng T3 có quan hệ gần nhất với chủng Pseudomonas aeruginosa với mức độ tương đồng 100%, trình tự tham chiếu NR 114471.1.
4.6. Thảo luận
Từ 10 mẫu đất trồng cây nông nghiệp ở tỉnh Bến Tre, đã phân lập được 17 chủng vi khuẩn có khả năng phát huỳnh quang trên môi trường bổ sung 1% muối. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, màu sắc tổ chọn được 10 chủng nghi ngờ là Pseudomonas. Kết qua nhuộm gram đều là gram 4m, hình que; thử nghiệm catalase và oxidase đương tính.
Khảo sát khả năng chịu mặn của 10 chủng ở nồng độ muối khác nhau ghi nhận ở nồng độ 7%, 2 chủng T1, T9 không phát triển và 4 chủng T3, T4, T6, T7 có khả năng phát triển mạnh với mật độ trên 10° CFU/mL. Đề đánh giá thêm kha năng chịu mặn tiếp tục chọn 2 chủng T3 và T6 khảo sát ở 8% và vẫn ghi nhận kết quả mật độ trên 103 CFU/mL.
Kiểm tra khả năng phân giải lân của 10 chủng này trên môi trường PVK (TCVN 6167:1996) cho thay 8 chủng có khả năng phân giải lân. Hoạt tính phân giải của các chủng là khác nhau và sẽ thay đổi qua các ngày. Dựa vào kết quả quan sát vòng phân giải cho thấy 2 chủng có vòng phân giải lớn nhất lần lượt là T3 và T6. Tiếp tục chọn 2 chủng T3 và Tó6 thực hiện định lượng và hiệu suất phân giải lân theo TCVN 6202:1996.
Kết quả định lượng cho thay T3 đạt khả năng phân giải lân tốt nhất sau 96 giờ nuôi lỏng lắc phân giải 76,42 mg/L tương ứng hiệu suất 10,19%. Mặc dù chủng T3 có khả năng phân giải lân vô cơ khó tan nhưng không có phytase phân giải cơ chất là Na - phytate.
Nhìn chung kết quả nghiên cứu “Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Pseudomonas spp. chịu mặn có khả năng phân giải lân từ đất canh tác nông nghiệp tinh Bến Tre” đã phân lập và tuyển chọn được chủng Pseudomonas aeruginosa có khả năng chịu mặn cao, hiệu suất phân giải lân mạnh. Tuy nhiên cần khảo sát thêm một số môi trường có bồ sung các dang lân khó tan khác và một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân giải lân của chủng này như nhiệt độ, pH, các nguồn C, N. Dang chú ý, khả năng chịu mặn của chủng T3 vẫn được ghi nhận trên công thức môi trường có bổ sung 8%
mudi. Đặc tính nay cho thấy Pseudomonas aeruginosa có khả năng chịu mặn khá tốt, thích hợp với sự thoái hóa và bạc màu đang xảy ra tại những vùng trồng cây lâu năm ở Việt Nam. Kết quả này hứa hẹn Pseudomonas aeruginosa sẽ là đối tượng tiềm năng trong việc nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh tại các vùng canh tác hiện nay. Dựa trên kết quả nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2005) về hiệu quả sử dụng địch lên men chủng
Pseudomonas spp. đối với năng suất và chat lượng hạt đậu nành; Tahir và cộng sự (2013) cho thấy rằng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng cây trồng đóng vai trò quan trọng trong nền nông nghiệp vì kích thích sinh trưởng thực vật. Yazdani và ctv (2009) cũng đã nghiên cứu vi sinh vật phân giải lân và vi sinh vật vùng rễ kích thích tăng trưởng đến năng suất ngô như làm tăng trọng lượng bông, số hàng, số hạt, giảm 50% lượng phân bón phospho mà không làm giảm năng suất nên việc sử dụng những vi sinh vật có ích dé thay thế phan nào phân hóa học giúp bà con nông dan tiết kiệm chi phí, dat trồng màu
mỡ, tăng năng suât vụ mùa và phát triên kinh tê.
34