Khóa luận tốt nghiệp Công nghệ sinh học: Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrite trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng

TÓM TẮTNghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập và tuyển chon các dong vi khuẩn chuyên hóa nitrite trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng.. Với tính thực tiễn và ý nghĩa khoa học trên mà đề tài

; BỘ GIAO DỤC VADAOTAO _ ;

TRUONG DAI HOC NONG LAM THANH PHO HO CHi MINH

KHOA KHOA HOC SINH HOC

=

PHAN LAP VA TUYEN CHON CAC DONG VI KHUAN

CHUYEN HOA NITRITE TRONG AO NUOI

TOM THE CHAN TRANG

Nghanh hoc : CONG NGHE SINH HOCSinh vién thuc hién : NGUYEN MINH HIEN

Mã số sinh viên : 19126049

Niên khóa : 2019 - 2023

TP Thủ Đức, 08/2023

; BỘ GIAODUCVADAOTAO

TRUONG DAI HỌC NONG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

PHAN LẬP VÀ TUYẾN CHỌN CÁC DONG VI KHUAN

CHUYEN HÓA NITRITE TRONG AO NUÔI

TOM THE CHAN TRANG

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG NGUYEN MINH HIEN

TP Thủ Đức, 08/2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến Ban GiámHiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy cô

Khoa Khoa học Sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường đã giúp

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài nảy

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cô TS Trương Phước ThiênHoàng, anh ThS Lê Phước Thọ và anh KS Võ Trần Quốc Thắng đã tận tình hướng dẫn,quan tâm, giúp đỡ và luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được hoàn thành khóa luận

Cảm ơn các bạn khóa 19, các em khóa 20 và tất cả các bạn phòng vi sinh đã hỗ trợ

và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn Bà và Mẹ, những người đã sinh thành nuôi dưỡngtôi khôn lớn và tạo điều kiện thuận lợi nhất dé tôi được học tập, luôn ở bên cạnh độngviên tôi, giúp tôi có được động lực phan đấu và cô gắng mới có ngày hôm nay

Xin chân thành cảm ơn!

XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOANTôi tên Nguyễn Minh Hiền, MSSV: 19126049, Lớp: DH19SHB (Số di động:

0939956747, Email: 19126049(@st.hcmuaf.edu.vn thuộc nghành Công nghệ Sinh hoc

Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, xin cam đoan: Đây là Khóa luận tốt nghiệp

do bản thân tôi trực tiếp thực hiện, các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàntrung thực và khách quan Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng về nhữngcam kết này

Tp Ho Chi Minh, ngày 07 tháng 9 năm 2023

Người viet cam đoan

(Ký và ghi rõ họ tên)

li

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm phân lập và tuyển chon các dong vi khuẩn chuyên

hóa nitrite trong ao nuôi tôm thẻ chân trắng Từ 15 mẫu nước bùn thu được tại tỉnh Bạc

Liêu, tiễn hành phân lập trên môi trường khoáng tối thiểu có bố sung 0,2 (g/L) NaNOs,các chủng vi khuan sau khi phân lập được sàng lọc bằng phương pháp định tinh với thuốcthử Griess - Ilosway Khảo sát khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chọnlọc bằng phương pháp trắc quang 4500 - NO» - B (APHA, 2012) trong 10 ngày với hàmlượng NO - N được bồ sung lúc ban dau là 5 (mg/L), tính hiệu suất xử lý Chon ra chủng

vi khuẩn có hiệu suất xử lý cao nhất dé khảo sát độ chịu mặn ảnh hưởng đến kha năngchuyên hóa nitrite ở độ mặn: 25%o, 30%o, 35%o, 40%o và hàm lượng NO: - N được bổsung là 5 (mg/L) Tiến hành, cay trang đếm mật độ và định lượng hàm lượng NO; - N cònlại, tính hiệu suất xử lý Chủng có khả năng chuyền hóa nitrite cao nhất sẽ được định danhsinh học phân tử Kết quả phân lập được 14 chủng vi khuẩn, trên môi trường khoáng tốithiểu, sau khi sàng lọc với thuốc thử Griess - Ilosway thu được 4 chủng: M3, M5, M13,M14 có khả năng chuyên hóa nitrite Ching M3 có hiệu suất xử lý hàm lượng NO - Ntốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy đạt 84,39% cao hơn so với các chủng còn lai (từ 10 - 15%).Hiệu suất xử lý hàm lượng NO: - N của chủng M3 ở độ mặn 25 %o cao nhất đạt 78,35%

và thấp nhất ở độ mặn 40 %o là 3,94% sau 7 ngày nuôi cấy Chung M3 được chọn địnhdanh sinh học phân tử, kết quả xác định chủng M3 thuộc chi Ralstonia sp

Từ khóa: Ralstonia sp., nitrite, Bạc Liêu, thuốc thử Griess - Ilosway

ABSTRACTThe study was conducted to isolate and select nitrite - metabolizing bacteria strains

in white shrimp ponds From 15 samples of sludge collected in Bac Lieu province, isolated

on mineral medium supplemented with at least 0.2 (g/L) NaNOz, the bacterial strains after isolation were screened by qualitative method with Griess - Ilosway reagent Surveying

the nitrite conversion ability of selected bacterial strains by the photometric method 4500

- NO2 - B (APHA, 2012) for 10 days with the initial NO2 - N content added at 5 (mg/L),

processing performance Select the bacterial strain with the highest treatment efficiency

to investigate how salinity affects the ability to convert nitrite at salinities: 25%o, 30%o,

35%o, 40%o and added NO; - N content is 5 (mg/L) Carry out, inoculate the page to count

the density and quantify the remaining NO; - N content, and calculate the treatment

efficiency The strain with the highest nitrite conversion capacity was identified for

molecular biology As a result, 14 strains of bacteria were isolated, on a minimal mineral

medium, and after screening with Griess - Ilosway reagent, 4 strains were obtained: M3,

MS, M13, M14 capable of converting nitrite The M3 strain has the best NO2 - N treatment

efficiency after 10 days of culture, reaching 84,39%, which is higher than the other strains

(from 10 to 15 %) The highest NO; - N treatment efficiency of strain M3 at 25%o salinity reached 78,35% and the lowest at 40%o salinity was 3,94% after 7 days of culture The

M3 strain was selected for molecular biological identification, and the results of

identifying the M3 strain belong to the genus Ralstonia sp

Keywords: Ralstonia sp., nitrite, Bac Lieu, Griess reagent - Ilosway.

iv

122 Mục tiều CL) cá cseekknenieikiiEdagknkig 0011 00813044100158916108180G07018000034:0002300.8 0166 5

L232 Nội đun: HG BIẾT ussseegeesbnotiBndi4A00013655958La880SEL348530308445AI85-SSES-DBHHGSSLERCBOSSGEEEISEEAERSGS0 2

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIỆU 2: 2 2 2SE2SE2E2EE2EE2E2EE2E22E22222222222222-5 32.1 Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng - 2 2 22222++EE2EE+EEEE+£EE+ZE+2EEzzEzzxrsrxee 32.1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam 2- 22©2222++2z++2z+zzz+2 42.2 Vai trò của vi khuẩn nitrite hóa trong nuôi trồng thủy sản -5 525751; K;há1:quát:chfHÍTTH/THUE sec ecstv50 2 S0010104409850GG460553024/00589054Ù8L:GGGQ-ESEEBBIEES57 16088 5

DD (NHI RINH,/ATHDTL Hổ vc cscs esate nha o6 canst 14613616636 Meise 36 nese nth ath SesSegh38ziig32gb3osl3u.0g3520ask34 5

222 5n: QUASI NA EPALE NO AbsesesssesisonsosBenksedadttditoggdEtgiiq4S.0g31330898080314485/80E414G170-35HSBE33.080104010.38gi10 60088 5

2.2.4 Vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hOa c.ccccceseseeseseessseseeseseseeseeeseseeeeeveeeeeeees 72.3 Một số chủng vi khuẩn tham gia vào qua trình nitrate hóa - - 72.3.1 Nhóm vi khuẩn Ni/r70$0I1011445 +25 52 SE+ESEE+ESEEEE+EEEE2EEEE2E221121E11212112EEEtxe 7

332 NhŠm vĩ kìmin AT tHÊNDEftsneanoniotdiaGiGiE00103018:G1310835:G880130038.008g10308g02 0700021808008 82.3.3 Nhóm vi khuẩn ÖacilÏius -2-©22©22-©5222222E22E2EE2EEE2EEEEEEESExerxrrrrerrrrrrerree 92.3.4 Nhóm vi khuẩn PsewdOn0Hđ +25: S2+E+E2ESE+E+E+ESEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrrrsres 102.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới - -z 2+2 10

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong NƯỚC - . - - + + 5+ 2+ *SE*2 SE Hư, 10

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thé giới -2-2- 2¿22222z+2E2EE+£E++EE+zxrzzrzrxeex 12CHƯƠNG 3 VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP 52-55-25222c2cxccrcrreee 153.1 Thời gian va địa điểm nghiên Ctr oe ccccecccccceseesssessesseeesesseessessesseessessessseseessesenees 15

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - -¿- ¿+5 ++++++x£+£zeeeeererrrerrrrrrsre 15

on ls Vat HOU censecemcseen ane menensanee seen aen em eerie ee EER 15 3.2.2 PHUGNS PHA WENCH CU xcs ssn ssmsassesanvesuesinsne asx anesosaaaseneauasaaseansasavnesavauamseawmusanss 173.2.2.1 Phan lập các chủng vi khuẩn chuyên hóa nitrite - -5 5-©2555z 173.2.2.2 Khảo sát khả năng chuyên hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chon lọc bằng

phương pháp trac quang 4500 - NO: - B (APHA, 2012) -< <c<~x 212.2220; Khảo sát ảnh hưởng của độ chịu mặn lên khả năng chuyền hóa nitrite của cácchung vi khuân băng phương pháp trac quang 4500 - NO; - B (APHP, 2012) 22

3.2.2.4 Định danh bằng sinh học phân tử 22 2¿2222222+2E+22EE+2EE222E2222222zzzzze2 233.3 Xử lí số liệu -2- 5£ SSSE£2E22E21211212112112112112112112112111112111121211111 1211 1rre, 24CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN 2+ 2+2+222E2£E£EE2E2EeEEzEzxrrxrei 254.1 Kết quả phân lập vi khuân chuyền hóa nitrite từ mẫu nước bùn - 254.1.1 Kết quả sàng lọc các chủng vi khuân chuyển hóa nitrite -2- 52552 Li4.1.2 Két qua xac dinh dac diém hinh thai, sinh ly, sinh hóa của các chủng vi khuẩnNOT G acer ace canneries Ốố.ỐỐỐẻỐố.ẻẽốố ốc ốc To nc 28

4.2 Kết quả khảo sát khả năng chuyên hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chon lọc bằng

phương pháp trắc quang 4500 - NO: - B (APHA, 2012) - -s-c+-c+ccseres 304.43 Kết quả khảo sát độ chịu mặn ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa nitrite của chủng

Vi khuất GHOIH.O G:xzssessosstatie4gE9SSSESEBIISESESIGESSSESN.GSESSSRSRSSIGEISREISEEESHHRRISGXENSEGWSSEEIEER,SMBR 33

4.4 Kết quả định danh 2¿©2¿+2S+2EE22EE22E122212221222122122112711221122112211211121122 1 ee 364.5 Thảo lƯẴN:seenessesipnicntoitintectbklDASSSGT45134IXERESGEHSGLSEEDI-SEOXSSGIUHESSE.ANESLEICEGUERCEEIGIEEGLSESESEĐ 37

CRTC SWEET TO VLNH NIETeeeieeseiseisdiiodioio tgkdkggutletoiiilzgdg” 39

Š2 BAI ressccsenescasscescctevas seis thse IAA oH Na 39TAI LIEU THAM KHẢO 2-2 S2+22+E+SE+EE2E9EE2EE2E521221212122121212212121 222212 ce, 40

vi

: Gam per liter

: Microgram per liter

: Miligram per liter

: hecta

: Optical Density

: Ammonia Oxidizing Bacteria (vi khuẩn oxy hóa ammonium): Nitrite Oxidizing Bateria (vi khuẩn oxy hóa nitrite)

: Dissolved Oxygene (oxy hoa tan)

: Total Ammonia Nitrogen (ammonia tổng số)

: Colony Forming Unit

: độ hoạt động của các ion H” trong dung dich

: đối chứng

DANH SÁCH CÁC BANG

TrangBang 3.1 Địa điểm thu mẫu nước bùn - c c c7 111222112221 s2 15Bang 3.2 Cách pha mau dé tiến hành xác định - + +++++++++++++eereres 21Bang 3.3 Các thông số chỉ tiêu đầu vào c c c2 2222211111111 222 see 25Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn AG của Gáo CHUNG vis since c6 66ả2 12 bung cát g5 65608 28Bang 4.2 Kết qua sát định hình thái, sinh lý, sinh hóa ¿+ ¿555 <*<<<52 30Bảng 4.3 Khả năng chuyên hóa hàm lượng NO? - N (ug/mL) 2 + 3]Bảng 4.4 Hiệu suất xử lý hàm lượng NO: - N (ig/mL) -::c:55:55 555: 32Bảng 4.5 Hàm lượng chuyên hóa NO2 - N (ig/mL) - 2-22-2252 << <*<<>>s52 34Bảng 4.6 Hiệu suất xử lý hàm lượng NOz - N (Iuig/mL) 2 2222+++++++s2 34Bang 4.7 Mật độ của chủng vi khuẩn M3 ở môi trường -. -cc55: 35

Vili

DANH SÁCH CÁC HÌNH

- Trang Hình 3.1 Thu mâu tại tỉnh Bạc Liêu 16

Hình 3.2 Phương trình phản ứng diazo hóa -:-c c<<c <<: 19

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc khi phân lặp trên + + ¿+22 cc‡ss2 26Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc khi cấy chuyền ¿c7 7-2 22222 26Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc khi cấy trên - ¿¿¿ ¿c2 22-22 222+££cxsz 27Hình 4.4 Kết quả xác định âm tính của các ¿+ c +22 2222 se 2/7)Hình 4.5 Hình thái các chủng vi khuẩn chọn lọc -ccc << 2+ ss2 28Hình 4.6 Hình thái tế bào 4 chủng vi khuẩn - -¿¿¿cc 222222 ss££cxs2 29Hình 4.7 Kết quả thử nghiệm Catalase của 4 chủng ¿¿ ¿c2 222 ccc‡ss: 29Hình 4.8 Kết quả thử nghiệm Oxidase của 4 chủng - 30Hình 4.9 Kết quả khảo sát khả năng chuyên hóa nitrite ⁄- c2 2-2-2 cc‡<<<52 31Hình 4.10 Biểu đồ khảo sát hiệu suất xử lý hàm lượng NO; - N - 33Hình 4.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ mặn c ¿22-52 34Hình 4.12 Biểu đồ khảo sát hiệu suất xử lý hàm lượng NOz -N - eee 35Hình 4.13 Kết qua cay trang chủng vi khuan M3 trên -. cc c2 cc552 36Hình 4.14 Kết quả so sánh trên ngân hàng 2222 2222222322EEEEEEEEEEeg 36

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Ngành nuôi trồng thủy sản là một ngành kinh tế mũi nhọn, đóng một vai trò quantrọng trong nền kinh tế quốc gia Đối với nuôi tôm biển, nghề nuôi tôm phát triển nhanhchóng cả về diện tích lẫn mức độ thâm canh Theo Tổng cục Thủy sản (2013), tổng điệntích và sản lượng tôm nuôi ở nước ta là 655.156 ha và 487.960 tan Trong đó, Đồng bangsông Cửu Long chiếm trên 90% tông diện tích nuôi và 60% tổng sản lượng tôm nuôi của

cả nước Đặc biệt, nuôi tôm thẻ chân trăng đã tăng lên nhanh chóng về sản lượng trongnhững năm gan đây, chiếm 38,6% tổng sản lượng tôm nuôi từ 6,4% tổng diện tích nuôicủa cả nước Kế hoạch đến năm 2020, tong diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng là 60.000

ha, đạt sản lượng 310.000 tan (Nguyễn Thanh Long và Huỳnh Văn Hiền, 2015)

Do giá trị kinh tế của tôm thẻ chân trắng mang lại khá cao, vì thế sản lượng và diệntích nuôi ngày càng tăng, nhưng lại phát triển theo hướng tự phát, thiếu kiểm soát nên đãdẫn đến tình trang ô nhiễm môi trường do các chat thai trong ao nuôi tôm bao gồm: thức ăn

dư thừa và phân, các sản phâm phụ trong quá trình trao đổi chất, các chat thải trong quátrình lột vỏ tôm, tảo bị chết Ngoài ra, bên cạnh việc gây ô nhiễm môi trường, đồng thờicũng sinh ra lượng khí độc NO> cao trong ao nuôi do: quá trình sên vét, cải tạo ao ban đầu

trước vụ nuôi thực hiện chưa triệt để, lượng bùn cũ trong ao tồn nhiều, nguồn nước nhiều

phù sa, không qua hệ thống lắng lọc, zic - zac, khi vào ao nuôi, lắng tụ từ từ, là nguyên nhânhình thành khí độc NOz Khi hàm lượng khí độc NOz trong nước tăng cao sẽ gây rối loạn

áp suất thâm thấu do cạnh tranh với ion CI, làm hạn chế khả năng hấp thụ khoáng chất củatôm, đặc biệt trong các ao tôm độ mặn thấp, làm cho tôm lột xác không cứng vỏ, gây sưngmang, phù thủng cơ và không nuôi được về kích thước lớn nếu hàm lượng NO» trong nướccao Đây là nguyên nhân khiến tôm nuôi bị bệnh và chết hàng loạt làm ảnh hưởng đến sảnlượng nuôi, dẫn đến mùa vụ thua lỗ, không còn kinh phí đầu tư, nợ nan

Trước thực trạng đó, xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trườngnước, phòng bệnh cho tôm cá và an toàn với người sử dụng là vấn đề cấp thiết Các loài visinh vật được dùng ngày càng nhiều trong xử lý môi trường nước, nuôi trồng thủy sản đãđem lại nhiều lợi ích cho con người và môi trường sống mà các phương pháp khác không

có được như: an toàn với người và động vật, đặc hiệu đối với vật chủ, thích hợp với cácphương pháp phòng trừ khác, thời gian bán phân hủy ngắn nên không tồn đọng lâu và ức

1

chế các vi sinh vật gây bệnh cho tôm cá Các chế phẩm vi sinh vật được sử dụng sẽ loại bỏhàm lượng các chất cacbon, nitơ, photpho dư thừa trong nước theo các quá trình khác nhaunhư tạo sinh khối tế bào vi sinh vật, oxy hóa các chất thành sản phẩm cuối cùng là CO» và

HO, chuyên hóa nito dạng hữu cơ và vô cơ thành dạng khí N› thoát ra ngoài môi trường,tích tụ photpho trong cơ thé tế bảo

Với tính thực tiễn và ý nghĩa khoa học trên mà đề tài “Phân lập và tuyển chọn cácdòng vi khuẩn chuyên hóa nitrite trong ao nuôi tôm thẻ chân trang” đã được thực hiện.1.2 Mục tiêu của đề tài:

Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuân có khả năng chuyền hóa nitrite với hiệusuất cao và đánh giá ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng chuyên hóa nitrite của các chủng

vi khuẩn chọn lọc

1.3 Nội dung thực hiện:

Phân lập và tuyển chọn các dong vi khuẩn chuyền hóa nitrite

Sàng lọc các chủng vi khuẩn chuyên hóa nitrite bằng phương pháp định tính với thuốc thử

Griess - Ilosway.

Khảo sát khả năng chuyền hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chọn lọc

Định lượng nitrite bằng phương pháp trắc quang 4500 - NO; - B (APHA, 2012).Khảo sát độ chịu mặn ảnh hưởng đến khả năng chuyền hóa nitrite của các chủng vi khuânchọn lọc.

Định danh chủng vi khuẩn chọn lọc bằng sinh học phân tử

CHƯƠNG 2 TONG QUAN TÀI LIEU

2.1 Giới thiệu về tôm thẻ chân trắng

Tôm thẻ chân trắng hay còn gọi với tên khoa học là Litopenaeus vannamei (Boone,1931), là tôm nhiệt đới, phân bố vùng ven bờ phía Đông Thái Bình Dương, từ biển Pêruđến Nam Mê-hi-cô, vùng biển Ecuador, hiện tôm thẻ chân trắng đã được di giống ở nhiềunước Đông á và Đông Nam á như Trung Quốc, Thái Lan, Philippines, Indonesia, Malaysia

và Việt Nam Ở vùng bién tự nhiên, tôm thẻ chân trắng thích nghi sống nơi đáy là bùn, độsâu khoảng 72 m, có thể sông ở độ man trong phạm vi 5 - 50%, thích hợp ở độ mặn nướcbiển 28 - 34%, pH = 7,7 - 8,3, nhiệt độ thích hợp 25 - 32 °C, tuy nhiên chúng có thể sốngđược ở nhiệt độ 12 - 28 °C Tôm thẻ chân trang là loài ăn tạp giống như những loài tômkhác, chúng không đòi hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú Tôm chân trắng cótốc độ sinh trưởng nhanh, chúng lớn nhanh hơn tôm sú ở tuôi thành niên Trong điều kiện

tự nhiên từ tôm bột đến tôm cỡ 40 g/con mat khoảng thời gian 180 ngày hoặc từ 0,1 g cóthé lớn tới 15 g trong giai đoạn 90 - 120 ngày Là đối tượng nuôi quan trọng sau tôm su

2.1.1 Phân loại khoa học

Tôm thẻ chân trắng được phân loại bao gồm:

Giới (regnum) Animalia

Ngành (phylum) Arthropoda

Lớp (class) Malacostraca

Bộ (ordo) Decapoda

Họ (familia) Penaeidae

Chi (genus) Litopenaeus

Loai (species) L vannamei Hình 2.1 Tôm thẻ chân trắng (Nguồn:

https://tepbac.com).

Tôm thé chân trắng có vỏ mỏng mau trang đục nên có tên là tôm bạc, bình thường cómàu xanh lam, chân bò có màu trắng ngà nên gọi tôm chân trắng Chuỳ là phần kéo dài tiếp

với bụng Dưới chuy có 2 - 4 răng cưa, đôi khi có tới 5 - 6 rang cưa ở phía bụng Những

răng cưa đó kéo dài, đôi khi tới đốt thứ hai Vỏ đầu ngực có những gai gân và gai râu rất rõ,không có gai mắt và gai đuôi (gai telsson), không có rãnh sau mắt, đường gờ sau chuỳ khádài đôi khi từ mép sau vỏ đầu ngực Gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dài tới gai thượng vị Có 6đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất hẹp hoặc không có Gai đuôi (Telsson) không

3

phân nhánh Râu không có gai phụ và chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp Xúcbiện của hàm dưới thứ nhất thon dài và thường có 3 - 4 hàng, phần cuối của xúc biện cóhình roi Gai gốc (basial) và gai (ischial) nằm ở đốt thứ nhất chân ngực.

2.1.2 Tình hình nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam

Sự phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng ở Việt Nam: tôm thẻ chân trắng được đưa vào

Việt Nam năm 2001 và được nuôi thử nghiệm tại 3 công ty: Công ty Duyên Hải (Bạc

Liêu), Công ty Việt Mỹ (Quảng Ninh) và Công ty Asia Hawaii (Phú Yên) (Bộ NN va

PTNT, 2010) Vào thời điểm này nước ta hạn chế phát triển nuôi tôm thẻ chân trắng vì sợlây bệnh cho tôm su Đến năm 2006, ngành thủy sản đã cho phép nuôi bổ sung tôm chântrắng tại các tỉnh từ Quảng Ninh đến Bình Thuận, nhưng vẫn cắm nuôi tại khu vực Đồngbằng sông Cửu Long Đầu năm 2008, nhận thấy thị trường thế giới đang có xu hướng tiêuthụ mạnh mặt hàng tôm chân trang của Thái Lan, Trung Quốc và sản phẩm tôm st nuôicủa Việt Nam bị cạnh tranh mạnh, hiệu quả sản xuất thấp do dịch bệnh Ngày 25/01/2008,

Bộ NN và PTNT ban hành chỉ thị số 228/CT - BNN - NTTS về việc phát triển nuôi tômthẻ chân trắng tại các tỉnh phía Nam Từ đó diện tích và sản lượng tôm thẻ chân trắngkhông ngừng được tăng lên Dự kiến đến năm 2015 sản lượng tôm thẻ chân trắng đạtkhoảng 449.500 tan (Bộ NN và PTNT, 2010)

Tuy nhiên, người nuôi tôm tại Đồng bằng sông Cửu Long đang phải đối mặt với rấtnhiều van dé làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm, trong đó biến đôi khíhậu, dịch bệnh và biến động thị trường là một trong những vấn đề nghiêm trọng nhất

Trong những năm gần đây, vùng Đồng bằng sông Cửu Long đã và đang phải đối

mặt với các tác động khắc nghiệt của biến đổi khí hậu như hạn hán, xâm nhập mặn, mưa

nhiều, nước biển dâng, xảy ra bất thường và rộng khắp các tỉnh, thành phố trong vùng,nghiêm trọng nhất là Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vĩnh, Bến Tre, Tiền Giang, CầnThơ, làm thay đổi môi trường sống của nhiều loài sinh vật biển và ven biển, đặc biệt làtôm thẻ chân trắng Từ đầu năm 2023 tới nay, cả nước có gần 4.024 ha tôm nuôi tại 7 tỉnh

bị thiệt hại, trong đó khoảng 2.239 ha thiệt hại do dịch bệnh (chiếm 55,65%), còn lại 1.785

ha thiệt hại đo môi trường, thời tiết và không rõ nguyên nhân

Do đó, cần kiểm tra phân tích các chỉ tiêu nước, lay mẫu dé xét nghiệm tại vùngtôm thẻ chân trắng bị chết để biết rõ nguyên nhân Đồng thời, đưa ra biện pháp xử lýtình trạng tôm thẻ chân trắng bị chết hàng loạt, giảm thiệt hại

2.2 Vai trò của vi khuẩn nitrite hóa trong nuôi trồng thủy sản

2.2.1 Khái quát chu trình nitơ

Trong nước nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như nitơ phân tử, các hợp chất nitơ

vô cơ và các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong các cơ thé sống (protein, acid amin).Khi cơ thể sinh vật chết đi, các chất hữu cơ chứa nitơ sẽ bị thối rữa và amôn hóa dướitác dụng của các vi sinh vật thành NH; hay NH¿* Dang NH¿? sẽ bị chuyên hóa thànhdang NO; nhờ nhóm vi khuẩn nitrate hóa Các hợp chat nitrate lại được chuyên hóathành dạng nito phân tử do tác dụng của các vi khuẩn phản nitrate hóa Khí nito phân tử

sẽ được có định lại dưới dạng hợp chất hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn có định đạm Cácquá trình trên kết hợp lại với nhau tạo thành vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực Trongtất cả các quá trình này đều có sự tham gia của các nhóm vi khuẩn khác nhau Nếu sựhoạt động của một nhóm vi khuẩn nào đó bị ngừng trệ, toàn bộ tiến trình chuyển hóanito sẽ bị ảnh hưởng gây tích tụ một số hợp chất nitơ có thé gây nên sự biến đổi chấtlượng nước làm ảnh hưởng đến đời sống các thủy sinh vật sống trong thủy vực đó (KiềuHữu Ảnh và Ngô Tự Thành, 1985)

2.2.2 Quá trình amôn hóa

Amôn hóa là quá trình phân hủy và chuyền hóa các hợp chất hữu cơ phức tạp thànhNH3 dưới tác dung cua vi sinh vật Dưới tác dụng của enzyme phân hủy protein (enzymeproteolytic, thường gọi là enzyme protease) làm chất xúc tác sẽ phân hủy protein thànhcác chất đơn giản hơn, các chất này tiếp tục được phân giải thành acid amin nhờ tácdụng của enzyme peptidase ngoại bào Một phần nhỏ acid amin sẽ được vi sinh vật sửdụng dé tổng hợp thành protein của chúng (protein xây dựng cau trúc cơ thé vi sinh vật),phan còn lại được tiếp tục phân giải tạo ra NH3, COa, SO.” (nếu các acid amin có chứalưu huỳnh) và các sản phẩm trung gian khác (Nguyễn Ngọc Thanh Vân, 2010)

Trong nước NH; sẽ được chuyên hóa thành NH¿' theo phan ứng sau:

NH; + H20 > NH¿” + OH: (1)

2.2.3 Qua trinh nitrate hoa

Dưới tac dung của một số vi sinh vật thì NH4* được hình thành từ quá trình amônhóa sẽ tiếp tục chuyên hóa thành NOz (nitrite) và NOx (nitrate) Trước hết NH«* đượcchuyền hóa thành NOz bởi vi khuan Nitrosomonas, sau đó vi khuân Nitrobacter sử dụngmen nitrite oxidase dé chuyền hóa NOx thành NOz- NO; có thé được các thực vật thủysinh sử dụng như một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể bị chuyên hóa tiếp thành khí nitơ

5

(N2) qua hoạt động của các vi khuẩn yếm khi như Pseudomonas Các quá trình chuyểnhóa NH¿* đều cần sự tham gia của oxy, độ kiềm của nước Quá trình nitrate hóa gồm 2giai đoạn được thực hiện bởi 2 nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau Hai giống vi khuẩn này cómối quan hệ mật thiết với nhau Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong môi trườngđất và nước Môi trường thích hợp cho cả hai giai đoạn này phải có pH lớn hơn 6 (tối

Giai đoạn nitrate hóa chuyên NOz thành NO; (3) bởi nhóm vi khuẩn nitrate hóa

NOz + 0,502 > NO: (3)

Sau quá trình nitrite hóa thì các vi khuẩn thuộc nhóm nitrate hóa sẽ thực hiện giaiđoạn tiếp theo, chuyên hóa NO» thành NOz' (là sản phẩm cuối của quá trình nitrate hóa).Nhóm vi khuẩn thực hiện quá trình nitrate hoá này bao gồm 3 giống: Nitrobacter,Nitrospira và Nitrococcus (Watson va ctv, 1989; Bock và ctv, 1992) Vi khuẩn nitratehóa phân bố rat ít trong các thủy vực sạch, nghèo dinh dưỡng, trong các thủy vực giàudinh dưỡng số lượng của chúng có nhiều hơn, nhưng cao nhất cũng chỉ khoảng 10 tếbào/mL nước Số lượng của chúng trong thủy vực dao động theo mùa rõ rệt: các cựctiêu thường thấy vào mùa đông hoặc đầu mùa xuân, còn các cực đại thì trong mùa hè.Quá trình nitrate hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực.Quá trình này có tầm quan trọng trong quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủysản Khi quá trình này xảy ra mạnh chất thải amôn độc hại sẽ được chuyền hoá nhanhsang dạng nitrate không độc đối với sự sống và sinh trưởng của tôm cá (Kiều Hữu Ảnh

và Ngô Tự Thành, 1985; Lê Xuân Phương, 2008) Quá trình nitrate hóa chỉ xảy ra trong

điều kiện nước có đầy đủ oxy, lúc đó thì nồng độ của NOz không vượt quá 0,5 mg/L,

nhưng khi trong nước thiếu oxy thì NO» sẽ tồn tại nhiều và gây độc cho tôm Trong một

số nghiên cứu thì quá trình nitrate hóa trong các ao hồ nuôi thủy sản xảy ra không mạnh

do vi sinh vật phát triển chậm, khả năng nitrate hóa 25 - 50 g/m3/ngay

Tóm lại, trong các hệ thống nuôi thuỷ sản thâm canh và quảng canh, quá trìnhnitrate hoá rất quan trọng giúp tôm cá không bị ngộ độc và giữ môi trường nước luôn ởmức ôn định Nitrosomonas và Nitrobacter là các vi sinh vật giữ nhiệm vụ chủ yếu cho

cả hai bước liên tiếp của quá trình nitrate hoá (Grommen và ctv, 2001)

2.2.4 Vai trò của nhóm vi khuẩn nitrate hóa

Dé làm giảm ham lượng NO» trong ao nuôi tôm, thông thường phải thay một lượnglớn nước mỗi ngày Trong hầu hết các trại nuôi thâm canh ở Negeri (Israel) tỉ lệ thaynước mỗi ngày dao động từ 5% đến 15%, nếu hàm lượng nitrite tăng cao hơn 1 mg/L,

ty lệ thay nước tăng lên tới 70% Việc phải thay lượng nước lớn dẫn đến giá cả đầu tưcao và gây ô nhiễm môi trường xung quanh do lượng nước thải ra không qua xử lý làmtăng hàm lượng NOz trong nguồn nước (Van-Breemen và Van-Dijk, 1988) Việc bồ sungcác nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa vào ao nuôi có thé làm giảm đáng

kể lượng nitrite và do vậy có thé cải thiện chất lượng nước nuôi, ngăn ngừa bệnh phátsinh và giảm tỉ lệ thay nước (Hochheimer va Wheaton, 1991).

Từ những nghiên cứu ban đầu, ngày nay kỹ thuật cấy vi khuẩn vào hệ thống lọctuần hoàn hoặc trực tiếp xuống ao nuôi đã được áp dụng một cách rộng rãi Vào năm

2001, Grommen và ctv đã thực hiện cay hon hop vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas vàNitrobacter) trong một sản phẩm probiotic có tên thương mại là ABIL vào bể lọc tuầnhoàn trong hệ thông nước ngọt và nước lợ Kết quả cho thấy với hàm lượng ABIL 3 - 5mg/L có thé loại bỏ TAN và NO> dưới mức phát hiện trong vòng 4 - 14 ngày vận hànhtrong cả hai hệ thong nói trên Một thí nghiệm khác cua Grommen va ctv, (2005), chothấy loài vi khuân chiếm ưu thé trong bề lọc tuần hoàn cả 2 hệ thống nước lo và nướcngọt có bồ sung ABIL là Nitrosomonas marina

2.3 Một số chủng vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa

2.3.1 Nhóm vi khuẩn Nitrosomonas

Nitrosomonas thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, đều có hình que nhưng các tế bào

vi khuan khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Có 3 hình dạng cơ bản đượcxác định: hình que rất ngắn rộng 0,8 um và dai 1 - 2 wm, hình que rộng 1 - 1,3 pm vàdai 2 - 2,5 um, hình dang thứ ba là những tế bào rộng 1,2 wm và dai 2 - 2,5 um

7

(Meiklejohn, 1950; Engel và Alexander, 1958) Những đặc điểm về hình dạng tế bàonhư mô tả trên giúp phân biệt với giống Nitrosospira là những tế bào dạng sợi xoắn,vòng xoắn hay thé xoắn, trong khi đó Nitrosococcus có hình cầu và các tế bào dính chặtvới nhau (Watson và Mandel, 1971).

Vi khuẩn Nitrosomonas được biết là nhóm vi khuẩn khó phân lập (Heselsoe vàSorenser, 1998) Vì vậy, để xác định mật độ vi khuẩn không thé áp dụng phương phápđếm khuân lạc trên đĩa Một phương pháp được sử dụng phô biến để xác định mật độcủa vi khuẩn Nitrosomonas là kỹ thuật MPN (Most Probable Number) (Morrill vàDawson, 1967; Ehrlich, 1975, Belser va Schmidt, 1981; Macfarlane va Herbert, 1984).Tuy nhiên, hiệu quả của kỹ thuật này tương đối thấp va mức độ chính xác về mặt thong

kê cũng không cao (Herbert, 1999) Gần đây, có một vài nghiên cứu được giới thiệunhằm cải thiện phương pháp định lượng vi khuẩn Nitrosomonas như kỹ thuật kháng thể

huỳnh quang FA (Fluorescent Antibody) (Belser và Schmidt, 1978; Sanden và ctv,

1994) Nổi bật hơn là những kỹ thuật mới về sinh học phân tử như PCR định lượng

(Phillps và ctv, 2000; Hermansson va ctv, 2001), kỹ thuật lai tai chỗ với huỳnh quang

(FISH) (Wagner va ctv, 1995; Schramm và ctv, 1996).

Nitrosomonas sông ở những nơi giàu NH va các muối vô cơ như trong bùn đáy

ao, nước cống, nước ngọt, trên tường của các tòa nhà cũ, các thủy vực bị ô nhiễm chứa

nhiều hợp chất nitơ nhằm tránh ánh sáng Chúng sinh sản bằng cách phân đôi Dưới cácđiều kiện thích hợp có thé tăng lên gấp đôi sau 7 giờ Ở điều kiện bình thường, chúngtăng lên gấp đôi sau 15 - 20 giờ Nitrosomonas không hình thành bao tử, có vách tế baophức tạp được bao quanh bởi lớp màng nhay Không giống với các loài vi khuan didưỡng khác chúng không thê sống trong môi trường khô Trong nước, chúng có thê sốngsót một giai đoạn ngắn ở các điều kiện bất lợi nhờ vào việc dùng các vật chất dự trữ bêntrong tế bào Khi các vật chất này hết chúng sẽ chết (Watson và Mandel, 1971)

2.3.2 Nhóm vi khuẩn Nitrobacter

Giống Nitrobacter gồm hai loài đã được phát hiện: loài Nitrobacter agilis doWinogradsky phân lập từ đất năm 1890 Loài Nitrobacter hamburgensis do Bock và ctv,phát hiện năm 1893 (Watson và ctv, 1958) Theo Aleem và Alexander (1960), sự hìnhthành NO; là giai đoạn quan trọng trong chu trình nitơ, nhưng số lượng các loài thamgia vào quá trình này không nhiều Nitrobacter là nhóm nỗi trội, tuy nhiên vào thời điểm

đó chỉ mới được công nhận Nitrobacter agilis.

Nitrobacter rất nhạy cảm với điều kiện không thuận lợi của môi trường, nồng độNaNO> 0,5 g/L bắt đầu kìm hãm sự sinh trưởng của chúng Năng lượng thu được từ quátrình oxy hóa NH,* sẽ được các vi khuẩn sử dụng dé sinh tổng hợp vật chat của tế bào

từ CO3* Do chỉ nhận được rat ít năng lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ phát triểncủa các vi khuân oxy hóa amoni và oxy hóa nitrite tự dưỡng là hết sức chậm chạp Thờigian thé hệ là 0,4 - 2,5 ngày đối với Nitrosomonas và 0,3 - 1,5 ngày đối với Nitrobacter.Sản lượng tế bào (g tế bào khô/g N oxy hóa) là 0,29 đối với Nitrosomonas và 0,08 g đối

với Nitrobacter (Andren và Eaton, 1995).

Nitrobacter là nhóm vi khuẩn phân bố rộng, chúng được phát hiện trong nhiều môitrường khác nhau như đất, nước ngọt, nước biên, nước thải công nghiệp và nông nghiệp(Watson và ctv, 1958) Theo Straat và Nason, (1965), Nitrobacter agilis có tên là

Nitrobacter winogradskyi, sau này với chung Nitrobacter winogradskyi ATCC 14123được gọi là Nitrobacter agilis Nitrobacter agilis là vi khuân gram âm có hình que ngắnhay hình quả lê (0,5 - 0,8 x 2 um) Tế bào hiếm khi chuyển động hoặc không chuyênđộng Nếu có chuyền động, tế bào có một tiêm mao nằm ở gần cuối hoặc ở bên hông.Chúng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, sống tự dưỡng trong môi trường hữu cơ, vô cơ và

cả khoáng Nguồn năng lượng chính lấy từ sự oxy hóa nitrite thành nitrate Tế bào khôngthé nhân đôi hay chuyên hóa NOz trong điều kiện thiếu oxy

2.3.3 Nhóm vi khuẩn Bacillus

Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí, do chúng cókhả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí Phần lớn các chủng thuộc các loài củagiống này đều có khả năng sinh ra nhiều a - amylase và protease kiềm, có một số chủngsinh ra cellulase.

Bacillus là vi khuẩn gram dương, hình que (0,5 - 2,5 x 1,2 - 10 um) Bacillus cóchùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động, là vi khuan dị dưỡng hóa năng, hoạisinh thu năng lượng nhờ oxy hóa các hợp chất hữu cơ Chúng sống hiếu khí hay ky khí

tùy nghi.

Bacillus có khả năng sinh bào tử Thông thường bao tử được tạo ra khi tế bao đãtrải qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng Mỗi tế bàodinh dưỡng sinh ra một bao tử Khi bào tử trưởng thành tế bào đinh dưỡng tự phân giải,bào tử được giải phóng ra khỏi tế bao me Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại,phóng xa và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tổn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều

9

năm Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là mộthình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bắt lợi.

Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH =9 - 10 như Bacillusalcalophillus, hay có loại phù hợp với pH =2 - 6 như Bacillus acidocaldrius Về nhiệt độ

có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (4 - 75 °C), hay ưa lạnh (5 - 25 °C) Nhưng thường gặpBacillus sông ở nhiệt độ (34 - 37 °C) Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và độngvật Một số loại gây độc cho côn trùng Chúng có khả năng sinh enzyme ngoại bào do đóđược ứng dụng nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp và bảo vệ môi trường

Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Bacillus subtilis, Bacillusmegaterium, Bacillus mensentericus, Bacillus cereus, Bacillus pumilus, Bacillus

polymyxa, Bacillus brevis, Bacillus simplex, Bacillus licheniformis.

2.3.4 Nhóm vi khuẩn Pseudomonas

Vi khuẩn Pseudomonas thường là vi khuẩn gram âm, hình que Có tiêm mao ở cựcnên có kha năng di chuyên tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử Pseudomonas

là vi khuẩn sống tự do, chúng hiện diện khắp nơi như trong đất, trong nước, thực vật,

động vật, một số làm hư thực pham chúng có kha năng hô hap hiếu khí hay ky khí trongmôi trường không có oxy Nhiệt độ thuận lợi để chúng phát triển là (30 - 37 °C) (NgôThanh Phong, 2012).

2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2008, Trần Thị Câm Hồng đã khảo sát hiệu quả sử dụng men vi sinh Eco tab trong thực tế sản xuất giống tôm càng xanh Kết quả thí nghiệm cho thấy sử dụngmen vi sinh cho kết quả tốt nhất Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, TAN, NH:,NOz ồn định và tốt hơn ở các nghiệm thức có sử dụng men vi sinh so với nghiệm thứckhông sử dụng Tỷ lệ sống của ấu trùng ở nghiệm thức sử dụng men vi sinh (39,1%,

-39%, 34,6%) cao hơn so với không dùng men vi sinh (15,82%).

Năm 2009, Cù Văn Thanh sử dụng chế phẩm sinh học trong ương nuôi ấu trùngtôm càng xanh cho thấy tỷ lệ sông ở nghiệm thức có sử dụng chế phẩm sinh học cao hơn(52,3%, 65,2% và 75,3%) so với nghiệm thức không sử dụng chế phâm (34,8%) Ngoài

ra việc sử dụng chế phẩm còn làm giảm mật độ vi khuẩn Vibrio trong môi trường bểương và tăng mật độ vi khuẩn

Châu Tài Tảo va ctv (2015) đã thực hiện nghiên cứu ương giống tôm thẻ chân trắng(Litopenaeus vannamei) theo công nghệ bio - floc ở các mức nước khác nhau, nhằm tìm

ra mức nước thích hợp trong bé ương ứng dụng công nghệ bio - floc đến tăng trưởng va

tỷ lệ sông của tôm thẻ chân trắng, nghiên cứu ở 3 nghiệm thức ở các mức nước khác nhaulần lượt là 40 cm, 60 cm, 80 cm Kết quả nghiên cứu cho thay ở mức nước 80 cm thì khanăng hình thành bio - floc, tăng trưởng và ty lệ sống của tôm tốt nhất

Trong nghiên cứu phân lập và sàng lọc vi khuân nitrate hóa đề xử lí trong ao nuôitrồng thủy sản của Nguyễn Văn Minh và ctv (2012) các chủng vi khuẩn nitrate hóa nàyđược phân lập từ 15 mẫu nước ao nuôi tôm thẻ chân trăng và ao nuôi cá tra, kết quả đãphân lập và tuyên chọn được 3 chủng vi khuẩn nitrate hóa (AO¡o, NOa, NOs) có tiềm năngứng dụng xử lí nước trong nuôi trồng thủy sản

Năm 2012, Pham Thị Tuyết Ngân đã nghiên cứu quan thé vi khuân chuyển hóa đạmtrong bùn đáy ao nuôi tôm su (Penaeus monodon) Đã phân lập được 67 chủng vi khuẩn

thuộc nhóm Bacillus, 8 chủng thuộc nhóm Nitrosomonas và 8 chủng thuộc nhóm

Nitrobacter Can cứ vào các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và trình tự gen đã định danh được

vi khuẩn Bacillus Cereus có 4 dòng B8, B9, B37 và B38, vi khuẩn BacillusAmyloiquefaciens B41 va Bacillus Subtilis B67 Trong đó loài Bacillus Cereus chiêm ưuthế Đã định danh được 2 dong S8 và S12 là vi khuan Nitrosomonas nitrosa và 2 dòngN10 và N12 là vi khuân Nitrobacter winogradshyi

Trong khảo sát hệ vi sinh vật kiếm soát NH trong nuôi tôm của Nguyễn Ngọc ThanhVân (2013) đã cho ra kết luận rằng có nhiều loài vi khuẩn có thé tham gia dé kiểm soát

ammonium trong ao nuôi tôm nhưng chi có Nitrosomonas va Nitrobacter được nghiên

cứu và ứng dụng nhiều Trong đó Nitrosomonas hoạt động và tăng trưởng ở nhiệt độ là

30 °C và pH = 8 Tỷ lệ tăng trưởng giảm gần 50% tại 20 °C và 40 °C Tại pH = 4,6 và pH

= 10 tỷ lệ tăng trưởng giảm 50%.

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập và tuyên chọn các dòng vi khuẩn banđịa có khả năng chuyên hóa nitrite hiệu quả Mười sáu đòng vi khuân phát triển trongmôi trường khoáng tối thiểu có bổ sung NaNO> đã được phân lập từ mẫu nước và maubùn thu tại các ao nuôi tôm ở Bạc Liêu Kết quả khảo sát cho thấy ba dòng vi khuẩngồm BLS1.3, BLW2.2 và BLW2.4 có khả năng chuyển hóa nitrite cao hơn so với cácdòng còn lại, đạt trên 56,3% sau bảy ngày nuôi cấy, trong đó dòng vi khuẩn BLW2.2 có

II

hiệu suất chuyên hóa nitrite cao nhất, đạt 97,2% sau ba ngày nuôi cấy (Nguyễn Thị PhiOanh và ctv, 2019).

Năm 2020, Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, đã nghiên cứu phân lập và tuyển chọn vi

khuân chuyền hóa đạm từ bùn đáy ao nuôi tôm thẻ chân trắng Kết qua 121 chủng vikhuân đã được phân lập Trong đó, chủng TB7.2 có khả năng oxy hóa amonia tốt nhất đạt39,02% và chủng TV4.2 có hiệu suất oxy hóa nitrite đạt đến 27,8% sau 5 ngày ChủngTB7.2 và TV4.2 có đặc điểm là trực khuân gram âm, có tiềm năng ứng dụng xử lý nướctrong nuôi trồng thủy sản

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong quá trình theo dõi sự biến động hóa học của nước ương ấu trùng tôm càng xanh(Aquacop, 1977) đã cho biết rang: trong ương ấu trùng cần theo dõi sự biến động của đạmnitrite, ammonia và không chế chat lượng nước là van đề quan trọng trong quá trình ương

Việc ứng dụng vi sinh trong nuôi trồng thủy sản đã được công bố vào những nămcuối của thập ki 80 Năm 1980, Yasuda và Taga cho rằng vi khuẩn có lợi tìm thấy khôngchỉ là thức ăn đơn thuần mà còn có tác dụng kiểm soát sinh học trong việc ngăn ngừabệnh ở cá Hầu hết các loài vi khuẩn hữu ích ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản là vikhuan lactic acid (Lactobacillus, Carnobacterium), giông Vibrio (Vibrio alginolyticus),giống Bacillus hoặc giống Pseudomonas Có nhiều nghiên cứu ứng dụng trong các trạigiống nhưng ít có nghiên cứu sâu

Năm 1992, Maeda va ctv sử dụng vi khuẩn phân lập từ đất PM - 4 cho vào môitrường ương tôm Năm 1994, Maeda và ctv đã làm tương tự với chủng vi khuân NS -

110 Một chủng Vibrio alginolyticus đã được cho vào bề ương ấu trùng tôm thẻ chântrắng (Litopenaeus vannamei) hàng ngày (Garriques và ctv, 1995)

Năm 1993, Gariques va ctv cho rang thi nghiệm sử dung probiotic đầu tiên trongnuôi tôm, do các nha ương tôm giống thực hiện, nhằm tim cách cải thiện mức độ Vibrio

có lợi trong bề ương, gọi là “sucrose fermentors” Đề thực hiện mục tiêu này, người tacho đường ăn vào các bê ương tôm giống dé kích thích sự phát triển của Vibrio spp cólợi (chủng lên men đường saccharose) Tiếp theo các chủng vi khuẩn Vibrio có lợi đượcnuôi cấy tương tự như phương pháp nuôi tảo dé cho vào các bê ương tôm giống

Năm 1995, Garrique va ctv đã sử dung chung Vibrio alginolytcus được phân lập

từ nước biển dé thử ấu trùng tôm Litopenaeus vannamei Kết quả là tôm không bị chết

ở lô thí nghiệm có nhiễm vi khuẩn gây bệnh, trong khi tôm đối chứng chết 100% sau 96giờ, do nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus ở mật độ 2.103 tế bào/mL.

Năm 1997, Sherman và ctv cho rằng trong ruột ấu trùng protozoea có nhiều vikhuẩn của môi trường xung quanh, nên có thé gây trở ngại cho các thí nghiệm củaprobiotic Khi nuôi chủng vi khuẩn probiotic trong bể với ấu trùng tôm Litopenaeusvannamei với mật độ 103 tế bào/mL thì đã ngăn cản được sự xâm nhiễm các vi khuẩngây bệnh ngay ở nồng độ 107 tế bao/mL

Năm 1998, Rengpipat và ctv đã kết luận rang, Bacillus S11 là chủng vi khuẩn hữuích có thé giàu hóa Artemia trước khi cho ấu trùng tôm st ăn

Năm 2005, Sazakli và ctv phân lập được 160 chủng Pseudomonas từ nhiều nguồnnước khác nhau (nước biển, nước cất, nước đóng chai ) ở Greece, trong đó Paeruginosa chiém đa số 61 chủng (38%), tiếp theo là 30 chủng Ð stuzeri (19%), còn lại

là P alcaligenes, P putida, P fluorescens, P Mendocina.

Nghiên cứu các dòng vi khuan Bacillus KKU02 va Bacillus KKU03 của(Deeseenthum và ctv, 2007) phân lập từ ruột của tôm càng xanh được trộn vào thức ăn.Kết quả tương đối tốt với sự tăng trưởng chiều dài và trọng lượng ấu trùng của tôm càngxanh ở các bê có cho vi khuẩn vào cao hơn (7,48 em) và (3,32 g) so với bê đối chứng(6,6 cm) và (2,1 g).

Năm 2010, Mujeeb va ctv đã thử nghiệm hai dong vi khuẩn Bacillus NL110 vàVibrio NEI7 được phân lập từ trứng va ấu trùng dé nghiên cứu thực nghiệm trên ấutrùng tôm càng xanh các thử nghiệm qua nước, qua thức ăn và cả hai Kết quả cho thấy

có sự cải thiện đáng kể về trọng lượng và tốc độ tăng trưởng của ấu trùng Tỷ lệ sốngcủa ấu trùng cao hơn so với nghiệm thức không có sử dụng chế phẩm, chất lượng nướcđược cải thiện, làm giảm hàm lượng nitrate và amonia, cải thiện hệ thống miễn dịch của

ấu trùng như tế bào máu và hoạt động của phenoloxidase

Năm 2014, Ma và ctv đã phân lập được một loại vi khuẩn oxy hóa nitrite, ZS - 1,tu

nước của ao nuôi cá Pseudosciaena ven biển, chủng này được xác định là Nitrobacterwinogradskyi dựa trên các phân tích phát sinh gen 16S Trong điều kiện hiếu khí, hoạttính oxy hóa nitrite của ZS - 1 không thay đổi đáng kể trong khoảng pH 7 - 9, nhưng bị

ức chế mạnh bởi các giá trị pH thấp hơn (pH = 6) và cao hơn (pH = 10) Hoạt tính oxy

hóa nitrite của ZS - I bắt dau bi ức chê bởi amoniac va nitrate khi nông độ amoniac và

13

nitrat lần lượt đạt 25 (mg/L) và 100 (mg/L) Tuy nhiên, hoạt tính oxy hóa nitrit của ZS

- 1 không bị ức chế bởi nồng độ nitrite cao (500 mg/L)

Nghiên cứu hiệu quả xử lý nito trong dat mặn của nhóm vi khuẩn nitrate hóa củaChankaew và ctv, (2018) Nhóm vi khuẩn nitrat hóa dị dưỡng chịu mặn bao gồm các

chủng SKNBI, SKNB2, SKNB4, SKNB7 được thu thập và phân lập từ trại nuôi tômthẻ chân trắng Thái Bình Dương Các chủng này có khả năng chuyền hóa hàm lượngamoniac ban đầu (815,86 mg - N/L) trong điều kiện nhiễm mặn Dựa trên khả năng loại

bỏ hầu hết amoni, những vi khuẩn nitrate hóa này có thê là nhóm vi khuẩn oxy hóaamoni (AOB).

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 9 năm 2023

Địa điểm thực hiện: phòng VI sinh Ứng dụng Ribe 212 - Khoa Khoa học Sinh học

và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm

Thành Phó Hỗ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuân có khả năng chuyên hóa nitrite được

phân lập từ 15 mẫu nước bùn thu được tại các ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở tỉnh Bạc Liêu.

Địa điểm thu mẫu: mẫu được thu ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại: ấp BìnhĐiền, xã Long Điền Tây và ấp Gò Cát, xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu

Khi thu mẫu ghi nhận đầy đủ các thông tin như: pH, nhiệt độ, độ mặn, màu nước

và đồng thời ghi nhận vị trí thu mẫu

Tại mỗi ao nuôi tôm, mẫu được thu ở 3 vị trí: đầu ao, giữa ao và cuối ao Sau đó,các mẫu sẽ được trộn lại thành 1 mẫu đại diện

Ở mỗi vi trí ao thu khoảng 100 g mẫu nước bùn Mẫu được giữ lạnh tại chỗ bằng

đá gel và chuyên về phòng thí nghiệm trong vòng 3-5 giờ, sau đó được bảo quản ở 4 °C

và được xử lý trong vòng 2 giờ (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010)

Số mẫu thu được gồm 15 mẫu được kí hiệu lần lượt là: H1, H2, H3, H4, H5, Hó,H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, HI5.

Bảng 3.1 Địa điểm thu mẫu nước bùn

Mau Dia diém Toa độ

Xã Long Dién Tay, huyện Đông Hải, tinh

HI 9°05'39.7"N 105°2443.6"E

Bạc Liêu H2 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9°05'35.7"N 105°24'40.9"E

Bac Liéu H3 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9905!20.0"N 105°24'27.7"E

Bạc Liêu H4 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9905'20.8"N 105°24'19.1"E

Bạc Liêu

H5 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hai, tỉnh 9905'35,7“N 105°24'20.7"E

Bạc Liêu

l§

Bảng 3.1 (tt) Địa điểm thu mẫu nước bùn

Tọa độMẫu Địa điểm

Xã Long Điền Tây, huyện Đông Hải, tỉnh

H6 cA

Bac Liéu X4 Long Dién Tay, huyén Dong Hai, tinh

H7 fe

Bac Liéu

HS Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tinh Bac

Liêu H9 Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tinh Bạc

Liêu

Xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc

HI0 7

LiéuX4 Dién Hai, huyén Déng Hai, tinh Bac

thu được tại tỉnh Bạc Liêu; (c) (d) Lấy mẫu nước bùn

Hình 3.1 Thu mau tại tinh Bạc Liêu (a) Ao nuôi tôm thẻ chân trắng; (b) 15 mẫu

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn chuyén hóa nitrite

Phương pháp phân lập vi khuẩn chuyền hóa nitrite:

Mẫu nước bùn sau khi vận chuyền về phòng thí nghiệm, tiến hành đo các chỉ tiêuđầu vào như: độ mặn, nhiệt độ, pH

Các bước phân lập:

Bước 1: mẫu được lắc đều, hút 10 mL mẫu nước bùn vào các chai thủy tỉnh cóchứa 50 mL môi trường khoáng tối thiêu và có bổ sung NaNO> 0,2 g/L đã được khửtrùng Thành phần môi trường gồm: 1,4196 g NasxHPOs; 1,3609 g KH4PO¿; 0,3 g(NH4)2SOa; 0,0985 g MgSOq.7H20; 5,75 mg CaCl2.2H20; 2,75 mg FeSO4.7H20; 1,7

mg MnSOq.H20; 1,16 mg H:BO;; 1,15 mg ZnSO4.7H20; 0,24 mg CuSQO4; 3,2 mg Naz2.EDTA; 0,235 mg CoCl2.6H20; 0,125 mg (NH4)6Mo24.4H20; 1000 mL H20; pH

= 7 + 0,2 (Breugelmans, 2005) Mẫu được lac trên máy lắc ngang với tốc độ 150vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm trong một tuần Sau đó, mẫu được délắng 30 phút, hút 5 mL huyền phù phía trên và chuyền sang chai mới có chứa 50 mLmôi trường tương tự, tiếp tục lắc mẫu trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong một

tuần (giai đoạn này được lặp lại 2 lần) (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv, 2019).

Bước 2: sau 2 lần cay chuyền, mẫu được dé yên trong 30 phút Hút 100 pL huyềnphù phía trên và trải lên môi trường khoáng tối thiêu đặc có bố sung NaNO> 0,2 g/L.Dùng que thủy tinh trang dịch khuẩn phân bó đều khắp mặt dia Vi khuân được ủ ở 32

°C trong 72 giờ Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc rời rạc cóđặc điểm hình thái khác nhau và cấy ria nhiều lần sang môi trường cùng loại cho đếnkhi chọn được các khuẩn lạc đồng nhất về hình thái và đều nhau trên đường cấy Sau đó,cấy ria khuẩn lạc sang môi trường TSA (30 g/L Tryptone soya broth và 15 g/L agar) và

ủ ở 32 °C trong 48 giờ dé kiểm tra độ thuần của vi khuẩn phân lập

Bước 3: các chủng vi khuẩn phân lập được sàng lọc bằng phương pháp phản ứngmàu với thuốc thử Griess - Ilosway (Yang và ctv, 2011) Cụ thể, tăng sinh các chủng vikhuẩn phân lập trong TSB (30 g/L Tryptone soya broth) và đo mật độ quang OD¢40nm =0,8, sau đó hút 0,5 mL vào chai thủy tinh chứa 50 mL môi trường khoáng tối thiểu có

bồ sung NaNO> 0,2 g/L, đối chứng đương cũng chứa môi trường tương tự có bổ sungNaNO: 0,2 g/L nhưng không bé sung dịch khuẩn Các chai được lắc với tốc độ 150vòng/phút trong một tuần Sau khi lắc xong, tiễn hành nhỏ 1 mL thuốc thử vào ống

17

nghiệm chứa 8 mL huyền phù vi khuẩn oxy hóa nitrite nuôi cấy sau một tuần Đối chứngdương không thêm dịch khuẩn sẽ cho phản ứng dương tính có màu hồng, chọn nhữngống âm tính với thuốc thử cho phản ứng không màu hoặc màu nhạt nhất, chứng tỏ đã có

sự xuất hiện của nhóm chuyền hóa nitrite (Phạm Thi Tuyết Ngân và ctv, 2020).

Phương pháp xác định hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩnphân lập sau khi được sàng lọc với thuốc thử Griess - Ilosway:

Phương pháp nhuộm Gram (Sharmin và Rahman, 2007)

Một giọt nước muối sinh lý đã tiệt trùng được nhỏ lên lame, sau đó nhỏ dung dịchhuyền phù vi khuẩn đã nuôi tăng sinh lên lam, đề khô ở nhiệt độ phòng (25 - 28 °C), rồi

ho lam qua dén cồn có định vi khuẩn Lam được dé nguội, tiễn hành các bước nhuộm:

Đầu tiên nhỏ từ 1 đến 2 giot crystal violet lên lam, sau đó trải đều crystal violetbang que cấy và dé 2 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm cho khô nước

Tiếp tục nhỏ 1 đến 2 giọt lugol lên lam rồi trải đều bằng que cấy và dé 1 phút Rửalại bằng nước cất vô trùng, thắm cho khô nước

Rửa lame bằng dung dịch alcohol/aceton trong khoảng 20 giây cho đến khi vừamat màu tím rồi rửa lại bằng nước cất, thấm cho khô nước

Cuối cùng nhỏ | đến 2 giọt safranin lên lam, trải đều bang que cấy và dé 2 phút.Rửa lại bằng nước cat vô trùng, thấm cho khô nước

Mẫu sau khi nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, vật kính 100X

có giọt dầu Kết quả vi khuẩn gram dương có màu xanh/tím, vi khuẩn gram âm có màuđỏ/hồng Đồng thời xác định hình dang tế bào vi khuan

Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn chuyền hóa nitrite:

Cấy truyền và giữ giống trong ống thạch nghiêng hay glycerol để bảo quản giống

được lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống.

Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn chọn lọc đã làm thuần

sẽ được cấy zic zac trên bề mặt thạch nghiêng của môi trường TSA trong ống nghiệm Sau

24 giờ, kiểm tra ống giống nếu vi khuẩn đã thuần bao quan ở nhiệt độ 3 - 5 °C và được cấytruyền định kỳ hàng tháng

Giữ trong eppendorf chứa dung dich glycerol 20% có bổ sung 1% peptone và giữđông ở nhiệt độ - 20 °C Giữ giống theo cách này sẽ giữ được lâu hơn và khuan cần đượchoạt hóa trước khi nhân giống

Định lượng nitrite bằng phương pháp trắc quang 4500 - NO» - B (APHA, 2012):Nguyên tac: nitrite được xác định bằng phương pháp so màu Xác định NO bằng

cách tạo phản ứng diazo hóa với sulfamlamide va N - (1 - napthyl) - ethylendiamine

dihydrochloride ở môi trường pH = 2 - 2,5 tạo thành hợp chất màu hồng, so màu ở bướcsóng 543 nm, cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng NO; có trong mẫu

SO;H SO;Na) +

/CoH + NaNO, + CH;COOH —>| C,H, \ CH;COO: +2H,O

Hình 3.2 Phương trình phan ứng diazo hóa.

Phương pháp diazo thích hợp khi xác định hàm lượng NO: - N từ 1 - 25 mg/L.

Ảnh hưởng cản trở: chlorine và nitrogen trichloride tồn tại trong mẫu sẽ gây trở ngạiđối với phương pháp này Dé giảm bớt sự ảnh hưởng này nên thêm N - (1 - napthy]) -

ethylendiamine dihydrochloride trước va sau đó là acid sulfanilamide.

Nước đục chứa nhiều chất lơ lửng ảnh hưởng đến kết quả Cần phải lọc nước trướckhi phân tích hoặc phải làm trong bằng phèn nhôm

Các chat Sb, Fe?*, Pb?*, Hg’*, Ag* có mặt ở trong nước sẽ cho kết tủa với thuốc thử.Loại bỏ cản trở bằng cách pha loãng mẫu thử

Bảo quan mẫu: mẫu phải được làm ngay dé tránh trường hợp NOz biến đổi thành

NOs hoặc NH:".

Dụng cụ: bình định mức 100 mL, máy đo quang phổ, bình nón, pipet 1 mL, 5 mL

19

Cách pha hóa chất:

Thuốc thử: lay 800 mL nước cất cho vào bình định mức 1 L, thêm vào 100 mLH;PO¿ 85% và 10 g sulfanilamide Sau khi hòa tan hoàn toàn sulfanilamide, tiếp tục chovào 1 g N - (1 - naphthyl) - ethylenediamine dihydrochloride, lắc đều và định mức Chodung dịch vào chai nâu bảo quản trong tủ lạnh bên 1 tháng

Chú ý: thuốc thử này có thé nhạt màu và trầm hiện sau 1 tuần, ta có thé lọc và vandùng được, nên bảo quản trong tủ lạnh Sử dụng nên cần thận vì thuốc thử này có độctính, do đó tránh hút bằng miệng và tránh dính vào da

Dung dịch chuẩn:

Dung dịch lưu trữ NO; - N (1 mL = 0,5 mg; 500 up NO2 - N): NaNO; 0,05 N: hoa

tan 1,232 g NaNO> trong nước cất va định mức thành 500 mL

KMnO¿ 0,05 N: can 1,6 g KMnO, thêm nước cất định mức thành 1 L

FAS 0,05 N: cân 19,607 g Fe(NH4)2(SO4)2.6H20 thêm vào 20 mL H2SO, đậm đặc,

Tính nồng độ dung dịch lưu trữ NO - N bằng công thức:

BxC) - (DxE)] x7

a=" — 2Ì” mgiLNO; -N)

trong do:

B: là mL dung dịch KMnÒ¿ đã dùng.

C: là nguyên chuẩn độ của dung dịch KMnO¿ (0,05 N)

D: là mL FAS hoặc (NazCr2O4) đã dùng.

E: là nguyên chuẩn độ của dung dịch khử (0,05 N)

F: là mL dung dịch NaNO: dùng định phân.

Cứ 1 mL dd KMnO¿ sé phản ứng với 1,175 mg NO; - N.

Dung dich NO; - N chuẩn (1 mL = 0.0005 mg = 0,5 ug NO: - N): Lay 0,5 mL

dung dịch lưu trữ thêm nước cất vào định mức thành 500 mL.

Chú ý: Hai dung dich NO> - N lưu trữ và NO> - N chuẩn làm việc phải được phakhi sử dụng dé tránh bị oxi hóa

Bảng 3.2 Cách pha mẫu đề tiến hành xác định hàm lượng NO; - N (ug/mL)

Số ống nghiệm 0 1 2 3 4 5Dung dich chudn NO: - N 0 5 10 15 20 1Nước cat thêm vào 25 20 15 10 5 0Thuốc thử Griess - Ilosway 1 1 1 | 1 1Nong độ NO: - N (ug /mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Đợi 10 phút, so màu ở bước sóng 543 nm.

Dựng đường chuẩn, lập phương trình y = ax + b Từ trị số độ hấp thụ màu ta tínhnồng độ NO2 -N Nếu trị số hấp thụ của mẫu vượt quá trị s6 của dung dịch chuẩn thìphải pha loãng mẫu đến nông độ thích hợp

3.2.2.2 Khảo sát khả năng chuyển hóa nitrite của các chủng vi khuẩn chọn loc bằngphương pháp trắc quang 4500 - NO; - B (APHA, 2012)

Các chủng vi khuẩn sau khi tuyển chọn được nuôi cấy tăng sinh trong môi trườngTSB (30 g/L Tryptone soya broth) đến khi đạt mật độ OD¢4onm = 0,8 thì tiền hành các thínghiệm đánh giá khả năng xử lý nitrite với 3 lần lặp lại

Hút 0,5 mL dịch khuẩn cho vào các chai thủy tinh chứa 50 mL môi trường khoángtối thiểu có bố sung 5 mg/L NO2- N, đối chứng dương không bồ sung dịch khuẩn, cácchủng vi khuan được nuôi cấy mẻ qua đêm ở 32 °C, lắc 150 vòng/phút trong 10 ngày.Mau được thu tai thời điểm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ngày dé xác định nồng độ NO: -

a: là hàm lượng chất ban dau (mg/L)

b: là hàm lượng chất sau thời gian ngày thứ ¡ (mg/L)

21

3.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ chịu mặn lên khả năng chuyển hóa nitrite củacác chúng vi khuẩn bằng phương pháp trắc quang 4500 - NO; - B (APHP, 2012)

Khi nuôi cấy một loại vi khuan trong cùng một loại môi trường ở các điều kiệnnuôi cấy giống nhau nhưng độ mặn khác nhau thì khả năng chuyền hóa nitrite của vikhuan cũng khác nhau

Chọn ra chủng vi khuẩn có khả năng chuyền hóa nitrite cao nhất từ nội dung trên bổsung vào chai thủy tinh chứa 50 mL môi trường TSB lỏng đã được hấp tiệt trùng (121 °C),lắc 150 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng đến khi đạt mật độ OD640nm = 0,8 Sau

đó, hút 500 wL dịch tăng sinh với mật độ ODøxonm = 0,8 vào môi trường khoáng tối thiểu,

bổ sung 5 mg/L NO> - N và thêm NaCl với các nồng độ: 25%o, 30%o, 35%o, 40%o, mỗinghiệm thức được lặp lại 3 lần Được nuôi cây và lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng

Tiến hành định lượng hàm lượng NO> - N còn lại và tính hiệu suất xử lý, đồng thờixác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc của chủng vi khuẩn chọnlọc ở các nồng độ muối khác nhau

Các kết quả định lượng sẽ được đưa về hiệu suất xử lý theo công thức:

a-b

H= x 100 (%)

trong đó:

H: hiệu suất xử lý (%)

a: hàm lượng chất ban đầu (mg/L)

b: hàm lượng chất sau thời gian ¡ (mg/L)

Đồng thời, cấy trải, đếm và tính mật độ vi khuẩn, từ đó chọn độ mặn thích hợp.Mật độ vi sinh vật sau khi cấy trang sẽ được tính bằng công thức:

N

a CFU/g hay CFU/mL ny V.f; + + ni V-fj ( g hay mL)

trong đó:

A: là số tế bao vi khuẩn trong 1 g hay 1 mL mẫu

N: là tong số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: là số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: là thé tích dich mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa

fj: là độ pha loãng tương ứng.

3.2.2.4 Định danh bằng sinh học phân tử

Chọn ra chủng vi khuẩn có khả năng chuyên hóa nitrite với hiệu suất cao nhất, tiếnhành cấy thuần và nuôi cấy tăng sinh Hút dịch tăng sinh của chủng vào ống eppendorf,

ly tâm 10000 rpm trong 15 phút Đồ bỏ dịch nổi, tiếp tục thêm dịch tăng sinh còn lại vàoống cũ và ly tâm cho đến khi hết 10 mL dịch tăng sinh

Sau khi lượng tế bao đạt yêu cầu thì cho vào ống eppendorf 1000 uL dung dịchCTAB - hóa chất có tác dụng phá vỡ màng tế bào, votex dé hòa tan tế bà U ống trong

bể điều nhiệt 60 °C trong 1 giờ Ly tâm 13000 rpm trong 15 phút Nhẹ nhàng hút 800

uL địch nồi sang ống eppdorf mới

Thêm phenol chloroform: isoamylalcolhol (25:24 :1) vào ống mới chứa dịch nỗi,vortex và dé ôn định trong ngăn lạnh đông của tủ lạnh 2 phút Sau ly tâm, hỗn hợp táchthành 3 lớp, hút dịch nổi trên cùng cho vào eppendorf mới

Thêm isopropanol với ty lệ 1:1 v/v U mẫu ở 80 °C trong 30 phút Ly tâm lạnh

14000 rpm trong 15 phút, bỏ dich thu tủa trang đục Rửa tủa bằng 1000 pL ethanol 70%,

ly tam Làm khô cặn DNA bang cách mở nắp ông, dé ở nhiệt độ phòng trong 30 phút ởtrong buồng cấy DNA tổng số được hòa trong 50 uL đệm TE và bảo quản mau ở 4 °Ccho các thí nghiệm tiếp theo Kết quả tách chiết DNA bộ gen trên gel được phát hiệnbằng hộp đèn UV Thực hiện phản ứng PCR với các thành phan: 2,5 pL đệm PCR; 0,5

uL DNA tổng số; 0,5 uL dNTPs; 1 pL mỗi loại môi và 0,2 wL Taq polymerase Sử dụngcặp mồi tông 27F và 1492R có trình tự:

27F: 5° AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’;

1492R: 5‘ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ (Lane D.J., 1991).

Chu trình nhiệt cho phan ứng PCR với 27F/1492R

Tiền biến tính : 90 °C trong 5 phút

Quá trình khuếch đại : 94 °C trong 1 phút

56 °C trong 30 giây

72 °C trong 1 phút

Số chu kỳ : 4

Hậu kéo dài : 72 °C trong 10 phút

Sau đó sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự gen 16S rRNA tại Viện Sinh họcPhân tử Loci So sánh tương quan di truyền với các dòng vi khuẩn trên cơ sở dit liệuNCBI bằng chương trình BLASTN

23

3.3 Xử lí số liệu

Số liệu thống kê được phân tích ANOVA 1 yếu tố bang phần mềm Minitab 16 vàbiểu đồ được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2022 Vẽ cây phát sinh chủng loại từtrình tự gen bang phần mềm Mega 11

CHƯƠNG 4 KET QUA VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrite từ mẫu nước bùn

Mẫu nước bùn được thu từ các ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại ấp Bình Điền, xãLong Điền Tây và ấp Gò Cát, xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu

Bảng 3.3 Các thông số chỉ tiêu đầu vào

H2 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, 16 Xanh 273°C 20%

tinh Bac Liéu nhat

H3 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, 17 Vang 27°C 22%

tinh Bac Liéu nau

H4 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, 79 Vàng 272%C_ 20.3%

tỉnh Bạc Liêu nâu

H5 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, 8.0 Vang 273°C 21,6%

tinh Bac Liéu nau

H6 Xã Long Dien Tay, huyện Đông Hải, 8.4 Vang 27.3 °C 15%

tỉnh Bạc Liêu nâu

H7 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, 73 Vàng 27,3°C 18,5%

tỉnh Bạc Liêu nâu H8 Xã Điện Hải, huyện Đông Hai, tinh Bạc 75 Vang 278°C 22,4%

Liéu nau H13 Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc 8.5 Vang 27,4°C 24,6%

Liéu nau H14 Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc 78 Vàng 29 °C 259%

Liêu nâu HIS Xã Dién Hai, huyện Dong Hai, tinh Bac 8.3 Vang 283%C 23.6%

Liêu nauMau được nuôi cấy trên môi trường khoáng tối thiêu có bô sung 0,2 g/L NaNO2 valắc trong 21 ngày Tiếp tục tiền hành phân lập trên môi trường thạch khoáng tối thiểu có

bổ sung 0,2 g/L NaNO¿ Vi khuẩn được ủ ở 32 °C trong 72 giờ Sau 72 giờ, chọn cáckhuẩn lạc rời rac có đặc điểm hình thái khác nhau và cấy chuyền nhiều lần sang môi

25