DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 3 năm 2023 đến tháng 9 năm 2023.
Địa điểm thực hiện: phòng VI sinh Ứng dụng Ribe 212 - Khoa Khoa học Sinh học
và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm
Thành Phó Hỗ Chí Minh.
3.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuân có khả năng chuyên hóa nitrite được phân lập từ 15 mẫu nước bùn thu được tại các ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở tỉnh Bạc Liêu.
Địa điểm thu mẫu: mẫu được thu ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng tại: ấp Bình Điền, xã Long Điền Tây và ấp Gò Cát, xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu.
Khi thu mẫu ghi nhận đầy đủ các thông tin như: pH, nhiệt độ, độ mặn, màu nước và đồng thời ghi nhận vị trí thu mẫu.
Tại mỗi ao nuôi tôm, mẫu được thu ở 3 vị trí: đầu ao, giữa ao và cuối ao. Sau đó, các mẫu sẽ được trộn lại thành 1 mẫu đại diện.
Ở mỗi vi trí ao thu khoảng 100 g mẫu nước bùn. Mẫu được giữ lạnh tại chỗ bằng đá gel và chuyên về phòng thí nghiệm trong vòng 3-5 giờ, sau đó được bảo quản ở 4 °C và được xử lý trong vòng 2 giờ (Phạm Thị Tuyết Ngân, 2010).
Số mẫu thu được gồm 15 mẫu được kí hiệu lần lượt là: H1, H2, H3, H4, H5, Hó,
H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, HI5.
Bảng 3.1. Địa điểm thu mẫu nước bùn
Mau Dia diém Toa độ
Xã Long Dién Tay, huyện Đông Hải, tinh
HI 9°05'39.7"N 105°2443.6"E Bạc Liêu
H2 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9°05'35.7"N 105°24'40.9"E Bac Liéu
H3 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9905!20.0"N 105°24'27.7"E Bạc Liêu
H4 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hải, tỉnh 9905'20.8"N 105°24'19.1"E Bạc Liêu
H5 Xã Long Điện Tây, huyện Đông Hai, tỉnh 9905'35,7“N 105°24'20.7"E Bạc Liêu
l§
Bảng 3.1. (tt) Địa điểm thu mẫu nước bùn
Tọa độ
Mẫu Địa điểm
Xã Long Điền Tây, huyện Đông Hải, tỉnh
H6 cA Bac Liéu
X4 Long Dién Tay, huyén Dong Hai, tinh H7 fe
Bac Liéu
HS Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tinh Bac Liêu
H9 Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tinh Bạc Liêu
Xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc
HI0 7 Liéu
X4 Dién Hai, huyén Déng Hai, tinh Bac
H11 a, Liéu
Xã Điền Hai, huyện Đông Hải, tỉnh Bac
HI2 “A Liéu
Xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tinh Bạc
HI3 ae Liéu
Xã Điền Hải, huyện Đông Hải, tinh Bac
H14 = Liéu
Xã Điện Hải, huyện Đông Hải, tinh Bac
Hla Liéu
9°05'34.8"N 105°24'06.4"E
9°05'29.2"N 105°24'14.9"E
9°07'08.1"N 105°29'13.4"E
9°06'59.7"N 105°29'07.3"E
9°06'58.2"N 105°29'15.6"E
9°07'02.1"N 105°28'57.9"E
9°07'08.0"N 105°28'51.7"E
9°07'05.1"N 105°28'58.0"E
9°07'16.9"N 105°29'10.9"E
9°06'55.9"N 105°28'44.3"E
t
thu được tại tỉnh Bạc Liêu; (c) (d) Lấy mẫu nước bùn.
Hình 3.1. Thu mau tại tinh Bạc Liêu. (a) Ao nuôi tôm thẻ chân trắng; (b) 15 mẫu
3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1. Phân lập các chủng vi khuẩn chuyén hóa nitrite Phương pháp phân lập vi khuẩn chuyền hóa nitrite:
Mẫu nước bùn sau khi vận chuyền về phòng thí nghiệm, tiến hành đo các chỉ tiêu đầu vào như: độ mặn, nhiệt độ, pH.
Các bước phân lập:
Bước 1: mẫu được lắc đều, hút 10 mL mẫu nước bùn vào các chai thủy tỉnh có chứa 50 mL môi trường khoáng tối thiêu và có bổ sung NaNO> 0,2 g/L đã được khử trùng. Thành phần môi trường gồm: 1,4196 g NasxHPOs; 1,3609 g KH4PO¿; 0,3 g
(NH4)2SOa; 0,0985 g MgSOq.7H20; 5,75 mg CaCl2.2H20; 2,75 mg FeSO4.7H20; 1,7 mg MnSOq.H20; 1,16 mg H:BO;; 1,15 mg ZnSO4.7H20; 0,24 mg CuSQO4; 3,2 mg Naz2.EDTA; 0,235 mg CoCl2.6H20; 0,125 mg (NH4)6Mo24.4H20; 1000 mL H20; pH
= 7 + 0,2 (Breugelmans, 2005). Mẫu được lac trên máy lắc ngang với tốc độ 150 vòng/phút ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm trong một tuần. Sau đó, mẫu được dé lắng 30 phút, hút 5 mL huyền phù phía trên và chuyền sang chai mới có chứa 50 mL môi trường tương tự, tiếp tục lắc mẫu trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong một tuần (giai đoạn này được lặp lại 2 lần) (Nguyễn Thị Phi Oanh và ctv, 2019).
Bước 2: sau 2 lần cay chuyền, mẫu được dé yên trong 30 phút. Hút 100 pL huyền phù phía trên và trải lên môi trường khoáng tối thiêu đặc có bố sung NaNO> 0,2 g/L.
Dùng que thủy tinh trang dịch khuẩn phân bó đều khắp mặt dia. Vi khuân được ủ ở 32
°C trong 72 giờ. Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc rời rạc có đặc điểm hình thái khác nhau và cấy ria nhiều lần sang môi trường cùng loại cho đến khi chọn được các khuẩn lạc đồng nhất về hình thái và đều nhau trên đường cấy. Sau đó, cấy ria khuẩn lạc sang môi trường TSA (30 g/L Tryptone soya broth và 15 g/L agar) và ủ ở 32 °C trong 48 giờ dé kiểm tra độ thuần của vi khuẩn phân lập.
Bước 3: các chủng vi khuẩn phân lập được sàng lọc bằng phương pháp phản ứng màu với thuốc thử Griess - Ilosway (Yang và ctv, 2011). Cụ thể, tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong TSB (30 g/L Tryptone soya broth) và đo mật độ quang OD¢40nm = 0,8, sau đó hút 0,5 mL vào chai thủy tinh chứa 50 mL môi trường khoáng tối thiểu có bồ sung NaNO> 0,2 g/L, đối chứng đương cũng chứa môi trường tương tự có bổ sung NaNO: 0,2 g/L nhưng không bé sung dịch khuẩn. Các chai được lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong một tuần. Sau khi lắc xong, tiễn hành nhỏ 1 mL thuốc thử vào ống
17
nghiệm chứa 8 mL huyền phù vi khuẩn oxy hóa nitrite nuôi cấy sau một tuần. Đối chứng dương không thêm dịch khuẩn sẽ cho phản ứng dương tính có màu hồng, chọn những ống âm tính với thuốc thử cho phản ứng không màu hoặc màu nhạt nhất, chứng tỏ đã có
sự xuất hiện của nhóm chuyền hóa nitrite (Phạm Thi Tuyết Ngân và ctv, 2020).
Phương pháp xác định hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập sau khi được sàng lọc với thuốc thử Griess - Ilosway:
Phương pháp nhuộm Gram (Sharmin và Rahman, 2007)
Một giọt nước muối sinh lý đã tiệt trùng được nhỏ lên lame, sau đó nhỏ dung dịch huyền phù vi khuẩn đã nuôi tăng sinh lên lam, đề khô ở nhiệt độ phòng (25 - 28 °C), rồi ho lam qua dén cồn có định vi khuẩn. Lam được dé nguội, tiễn hành các bước nhuộm:
Đầu tiên nhỏ từ 1 đến 2 giot crystal violet lên lam, sau đó trải đều crystal violet bang que cấy và dé 2 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm cho khô nước.
Tiếp tục nhỏ 1 đến 2 giọt lugol lên lam rồi trải đều bằng que cấy và dé 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thắm cho khô nước.
Rửa lame bằng dung dịch alcohol/aceton trong khoảng 20 giây cho đến khi vừa mat màu tím rồi rửa lại bằng nước cất, thấm cho khô nước.
Cuối cùng nhỏ | đến 2 giọt safranin lên lam, trải đều bang que cấy và dé 2 phút.
Rửa lại bằng nước cat vô trùng, thấm cho khô nước.
Mẫu sau khi nhuộm được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, vật kính 100X có giọt dầu. Kết quả vi khuẩn gram dương có màu xanh/tím, vi khuẩn gram âm có màu đỏ/hồng. Đồng thời xác định hình dang tế bào vi khuan.
Thử nghiệm Catalase
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít khuẩn lạc phết lên lam kính, sau đó nhỏ 1 giọt dung dịch H2Oằ (3%) lờn lam. Vi khuẩn cho phan ứng dương tinh với catalase sẽ cú hiện tượng sui bọt khí và ngược lại (Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2020).
Thử nghiệm Oxidase
Phết một ít vi khuẩn lên đĩa giấy đã tâm dung dịch tetramethyl - p - phenylenediamine dihydrochloride (1%) bằng que cấy vô trùng. Vi khuẩn cho phản ứng dương tính sẽ làm giấy chuyển sang mau tím den và ngược lại (Pham Thị Tuyết Ngân và ctv, 2020).
Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn chuyền hóa nitrite:
Cấy truyền và giữ giống trong ống thạch nghiêng hay glycerol để bảo quản giống được lâu hơn, tránh hiện tượng thoái hóa giống.
Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: các chủng vi khuẩn chọn lọc đã làm thuần sẽ được cấy zic zac trên bề mặt thạch nghiêng của môi trường TSA trong ống nghiệm. Sau 24 giờ, kiểm tra ống giống nếu vi khuẩn đã thuần bao quan ở nhiệt độ 3 - 5 °C và được cấy truyền định kỳ hàng tháng.
Giữ trong eppendorf chứa dung dich glycerol 20% có bổ sung 1% peptone và giữ đông ở nhiệt độ - 20 °C. Giữ giống theo cách này sẽ giữ được lâu hơn và khuan cần được hoạt hóa trước khi nhân giống.
Định lượng nitrite bằng phương phỏp trắc quang 4500 - NOằ - B (APHA, 2012):
Nguyên tac: nitrite được xác định bằng phương pháp so màu. Xác định NO bằng
cách tạo phản ứng diazo hóa với sulfamlamide va N - (1 - napthyl) - ethylendiamine
dihydrochloride ở môi trường pH = 2 - 2,5 tạo thành hợp chất màu hồng, so màu ở bước sóng 543 nm, cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng NO; có trong mẫu.
SO;H SO;Na) +