DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHUONG 4. KET QUA VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phan lập và định danh nam Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc diém
hình thái
4.1.1. Phần lập Colletotrichum gloeosporioides gầy bệnh trên trái xoài sau thu hoạch
Chọn trái xoài Cát Hòa Lộc có những đốm nâu đen nhỏ hay các đóm đen to, tròn hoặc bất định có quang màu xanh vàng dé tiến hành phân lập. Xoài được đem di xử lý vô trùng, sau đó đem cấy trên môi trường WA, ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó
Hình 4.1. Mau xoài bệnh thu thập được.
4.1.2. Định danh nắm Collletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thai Nắm được cấy thuần trên môi trường PGA, ủ ở nhiệt độ phòng từ 10 — 14 ngày, làm tiêu bản quan sát dưới vật kính 40X dé quan sát hình thái và kích thước bao tử. Kết quả xác định được loài nam Colletotrichum gây bệnh than thư trên xoài là nam Collletotrichum gloeosporioides, nam có bào tử không màu, hình trụ, hai đầu tròn hoặc một đầu tròn một đầu nhọn, giác bám nảy mam sau 24 giờ ủ, giác bám có hình trứng
ngược, hình chùy hay hơi tròn hay hình dạng không xác định, có màu nâu đen. Các đặc
điểm về tản nam, bảo tử và giác bám của nam Collefotrichum được thê hiện qua Hình 4.2 và Bảng 4.1. Các kết quả này đều phù hợp với khóa phân loại của Sutton (1980) và
Swart (1999).
16
Bang 4.1. Mô tả hình thái nam Collletotrichum gloeosporioides
Tan nam Bao tử Giác bám
Mặt trên tản nắm có màu trắng, trắng xám.
Mặt dưới tản nấm mau trắng, hình thành các vòng tròn đồng tâm màu xanh đến xanh đen.
Có dang hình trụ một dau tròn, một đầu nhọn; hình trụ hai đầu tròn, bên trong có các giọt dầu
hình tròn, không màu.
Kích thước trung bình của bào tử là 13,44 x 3,75 jum.
Giác bám có dạng hình trứng ngược, hình trứng, hình
dạng bất định.
Kích thước trung bình là 10,25 x 6,25 um.
\
(C) — (E) Bào tử; (F) — (H) O bào tử; (I) — (M) Giác bám.
Vi
4.2. Phân lập và định danh các dòng nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các
phản ứng sinh hóa
4.2.1. Phân lập các dòng nắm men trên vỏ xoài Cát Hòa Lộc
Đề phân lập nắm men thì 30 mẫu xoài Cát Hòa Lộc đã được thu thập tại nhà vườn thuộc thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp và tiến hành xử lý vô trùng trong phòng thi nghiệm, lắc tăng sinh trên môi trường YPG trong 48 giờ, sau đó hút dich, pha loãng, cấy trang trên môi trường trên môi trường YPGA và cấy ria dé tạo dòng thuần. Kết quả thu được 13 dòng nam men thuần ching.
4.2.2. Định danh các dòng nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng
sinh hóa
4.2.2.1. Định danh các dòng nắm men dựa vào đặc điểm hình thái
18
Bang 4.2. Đặc điểm hình thái của 13 dòng nam men
Hình thái Kích thướctế Hìnhtháitế Hình thức nảy Mẫu : ‘
khuan lac bao (um) bao chôi
C01 Trắng, đẹp 4,71 x 2,17 Hinh elip Nhiéu hướng C02 Trang, lồi 4,86 x 3,13 Hinh elip Một hướng C03 Trắng, dẹp 5,07 x2,90 Hình elip Nhiều hướng C04 Trắng, lồi 5,80 x 5,07 Hình oval Một hướng C05 Trang, tron, 16i 6,25 x 3,13 Hinh elip Một hướng C06 Trắng, lồi 6,16 x 5,80 Hình oval Một hướng C07 Trang, dep 5,33 x 5,00 Hinh oval Một hướng C08 Trắng, lồi 5,90 x 5,21 Hình oval Một hướng C09 Trắng, lồi 4,71 x 3,99 Hinh oval Một hướng C10 Trắng, lồi 6,82 x 6,06 Hình oval Một hướng Cll Trắng, lỗi 6,52 x 5,80 Hình oval Một hướng C12 Trắng, lồi 6,44 x 5,68 Hình oval Một hướng C13 Trắng, lồi 6,00 x 5,33 Hinh oval Một hướng
Kết quả Bang 4.2 cho thấy 13 dòng nam men phân lập được có hình thái khuẩn lạc khi quan sát trên kính soi nỗi có hình tròn, mau trắng hoặc trắng kem, lỗi hoặc đẹp, khuẩn lạc trơn hoặc xù xì. Khi quan sát trên kính hiển vi, tế bào nam men có hình elip hoặc hình oval, nảy chồi một hướng hoặc nhiều hướng. Những đặc điểm này đều giống những đặc điểm mô tả về hình thái nắm men của Fell và cộng sự (1998). Từ các kết quả trên, các đòng nắm men được chia làm 6 nhóm như Bảng 4.3.
19
Bảng 4.3. Phân nhóm các dòng nắm men
Ký
, Hình thái Hình thái Hình thức nay "
Dong nam men : , „ hiệu khuân lạc tê bảo chôi
nhóm
C01, C03 Trắng dẹp Hìnhelpngắn Nhiềuhướng YI C02 Trắng lồ Hìnhelpngắn Mộthướng Y2
Trắng, - ;
C05 hà Hình elip dài Một hướng Y3 trơn, lôi
C07 Trắng, dẹp Hình oval nhỏ Một hướng Y4 C04, C08, C09 Trắng lồ Hìnhovalnhỏ Mộthướng Y5
C06, C10, C11, C12, , ơ
eas Trang, 161 Hình oval lớn Một hướng Y6
Hình 4.4. Hình dia ria khuẩn lạc don của 6 nhóm nam men. (A) Nhóm Y1, (B) Nhóm Y2,
(C) Nhóm Y3, (D) Nhóm Y4, (E) Nhóm Y5, (F) Nhóm Y6.
20
Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc của 6 nhóm nam men. (A) Nhóm Y1, khuẩn lạc mau trắng, đẹp và trơn; (B) Nhóm Y2, khẩn lạc màu trắng, lỗi và xù xi; (C) Nhóm Y3, khuẩn lạc trắng, tròn lỗi và trơn bóng; (D) Nhóm Y4, khuẩn lạc màu trắng, dẹp và xù xì; (E) Nhóm Y5, khuẩn lạc trắng, tròn lôi và trơn bóng; (E)Nhóm Y6, khuẩn lạc trắng, tròn lôi và trơn bóng.
BH
Hình 4.6. Hình thái tế bào của 6 nhóm nắm men. (A) Nhóm YI, tế bào có hình elip ngắn, sinh sản bằng hình thức nảy choi nhiều hướng; (B) Nhóm V2, tế bào có hình elip ngắn, sinh sản bằng hình thức nay choi một hướng; (C) Nhóm Y3, tế bào có hình elip dai, sinh sản bằng hình thức nay choi một hướng; (D) Nhóm Y4. tế bào có hình oval nhỏ, sinh sản bằng hình thức nay choi một hướng; (E) Nhóm Y5, tế bào có hình oval nhỏ, sinh sản bằng hình thức nay choi một hướng; (F)Nhóm Y6, tế bào có hình oval lớn, sinh san bằng hình thức nảy choi một hướng.
21
4.2.2.2. Định danh các dòng nắm men bằng phương pháp sinh hóa
Cùng với việc phân chia các dong nắm men thành 6 nhóm dựa vào các đặc điểm hình thái của chúng thì các phản ứng sinh hóa cũng được thực hiện để tiến hành định
Hình 4.7. Kết quả phan ứng lên men đường Glucose. (DC) ống đối chứng; (1) - (13)
Mẫu nắm men.
nam men.
22
Hình 4.9. Kết qua phan ứng lên men đường Lactose. (PC) ống đối chứng; (1) - (13) Mẫu
nam men. - „ „ Khả năng lên men các loại đường được xem là chỉ tiêu không thê thiêu khi nhắc
đến phản ứng sinh hóa của nam men, ở đây thí nghiệm thực hiện phan ứng lên men trên ba loại đường Glucose 2%, đường Succrose 2% và đường Lactose 2% trong ống nghiệm và có ống durham. Khi nam men lên men đường sẽ làm đục dung dịch đường trong ống nghiệm và sinh khí trong ống Durham (Kurtzman and Fell, 1998). Kết quả ở Hình 4.7, Hình 4.8 và Hình 4.9 cho thấy tất cả nấm men đều có khả năng chuyển hóa đường Glucose thành nguồn carbon dé sử dung, đa số các dòng phân lập đều chuyên hóa được đường Sucrose trừ mẫu C01, C02, C03 và C05 và các dòng nắm men không có khả năng chuyền hóa đường Lactose.
Theo Kurtzman và cộng sự (2011), một số nắm men có khả năng sử dụng muối
amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH: làm môi trường trở nên kiêm, có màu xanh
23
dương, dựa vào Hình 4.10 ta thay được các dòng nam men khả năng phân giải citrate trừ mẫu C01, C02, C03 và C05.
Theo phương pháp định danh của Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1972), nắm men nếu có enzyme urease sẽ thủy phân ure thành CO› và NH, khi lượng NH; tăng lên sẽ làm pH tăng khiến môi trường chuyển sang màu ánh tim, từ Hình 4.11 thì các dong nắm men thu được đều không có khả năng phân giải ure trừ mẫu C07.
Kết qua phản ứng sinh hóa được mô tả dưới Bảng 4.4.
24
Bảng 4.4. Kết quả phản ứng sinh hóa của các đòng nắm men
. Kha năng lên men đường Phản ứng Phản Mau
Glucose (2%) Sucrose (2%) Lactose (2%) citrate ung ure C01 + - - - -
C02 C03 C04
C05 C06 C07 C08
C09 C10 Cll C12 C13
_ 1 + 1
+ + + + + 1 1 1 1
+ + + + + + + + + + + + _— 11 + + + + + + + + 1
Theo Lương Đức Phẩm (2009) trong cuốn “Nam men công nghiệp” va các nghiên cứu về nắm men của Sasitorn Jindamorakot và cộng sự (2009) đã mô tả về dòng nắm men Hanseniaspora: trên môi trường YPGA thì nấm men có hình elip ngắn hoặc dai, kích thước tế bảo khoảng 3,2 - 9,1 x 2,1 - 7,3 um sinh san bằng hình thức nảy chéi mot hướng hoặc nhiều hướng, có khả năng lên men đường glucose nhưng không lên men sucrose và lactose, dòng nam men Hanseniaspora không có khả năng phân giải ure và
citrate. Những mô tả trên phù hợp với dòng C01, C03 và C05 đã được phân lập.
Kutzman và cộng sự (201 1) đã mô tả dòng nam men Pichia là nam men có hình elip ngắn hoặc dài, kích thước khoảng 2,5 - 10 x 2 - 6 um, sinh sản bằng cách nảy chồi một hướng, khuẩn lạc có màu trắng, bề mặt xù xì, có khả năng lên men đường glucose, nhưng không thể lên men đường sucrose và lactose, tùy vào từng loài thuộc dòng nam men Pichia có khả năng phân giải ure và citarte hoặc không thé. Như vậy có thé kết luận rang, mau C02 đã phân lập thuộc dòng nắm men Pichia.
25
Mẫu C07 có hình oval nhỏ (5,33 — 5,00 tum), sinh sản bằng hình thức nảy chổi một hướng, có kha năng lên men đường glucose và đường sucrose, có thé phân giải ure và citrate, tuy nhiên lại không thé lên men đường lactose. Những mô tả trên phù hợp với mô tả về dòng nam men Meyerozyma của Kutzman và cộng sự (2011) trong cuốn “ Nghiên cứu phân loại nam men”, đã được tái ban lần thứ 5 đó là dòng nam men Meyerozyma có hình oval hay hình đài, kích thước từ 2 - 6 x 1,5 - 5 um, sinh sản bằng hình thức nảy chồi một hướng, khuẩn lac có màu trắng hoặc trang ngà, trơn hoặc xù xì,
có khả năng lên men đường glucose và đường sucrose va có khả năng phân giải ure.
Dòng nam men Candida ban đầu được biết đến là loài nam men gây hại cho con người, tuy nhiên, nhứng năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng một số loài nắm men vẫn đem lại lợi ích cho con người, chủ yếu là những dụng trong việc lên men. Theo Kutzman và công sự (2011) và Lương Đức Phẩm (2009) thì dòng nam men Candida có hình oval nhỏ hoặc lớn, kích thước khoảng 5,8 - 10,8 x 4,3 - 7,2 um, sinh sản bằng hình thức nảy chéi một hướng, có khả năng lên men đường glucose và sucrose nên được ứng dụng nhiều vào lên men rượu, có khả năng sử dung citrate hoặc không, nam Candida không thể lên men đường lactose và phân giải ure, các mô tả trên phù hợp với những đặc điểm hình thái và sinh hóa của các dòng nắm men C04, C06, C08, C09, C10, C11,
C12, C13 đã phân lập.
Như vậy, dựa vào các kết quả sinh hóa thu được cùng với kết quả mô tả hình thái của nắm men, 13 dòng nắm men đã phân lập được chia làm 6 nhóm, trong đó có 2 nhóm là dòng nắm men Hanseniaspora, 1 nhóm thuộc dòng nắm men Meyerozyma, 1 nhóm thuộc dòng nam men Pichia và 2 nhóm thuộc dòng nam men Candida. Kết quả phân nhóm các đòng nắm men được trình bày cụ thé dưới Bảng 4.5.
26
Bảng 4.5. Phân nhóm nam men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng sinh hóa
Đặc điểm hình thái Đặc điêm sinh hóa
ơ Hỡnh Hỡnh Khả năng lờn men đường , Mâunâm Hình Phân Dòng nâm
, dang thire
men dang té , Citrate giải men khuân nay Glucose Sucrose Lactose
bao và ure lac chôi
Elip Trăng, Nhiêu
C01, C03 , 1 + = = - - Hanseniaspora ngan lôi hướng
Elip Trăng Mot
C02 „ + - - - - Pichia ngan dep hướng
Trăng,
Elip Một
C05 j tron, + - - - - Hanseniaspora dai " hướng
161
Oval Trang, Mot
C07 + nh - SẼ ff Meyerozyma nho dep hướng
C04, C08, Oval Trang, Một
: + + - + - Candida C09 nhỏ 161 hướng
C06,C10, ,
Oval Trang, Mot
Cll, C12, " + + ` + Z Candida lớn lôi hướng
C13
4.3. Đánh giá khả năng đối kháng giữa các dòng nắm men và nắm Colletotrichum
gloeosporioides trong phòng thí nghiệm
13 dong nam men được cấy ria hai đường thang đối nhau và cách thành đĩa 1,5 cm, ủ trong 48 giờ dé nam men phát triển, sau đó cấy khoanh nam Colletotrichum
gloeosporioides khoảng 4 mm vào giữa hai đường ria nam men, khi cây trên môi trường
PGA, cả nam men và nam Colletotrichum gloeosporioides đều sử dụng nguồn dinh
dường có trong môi trường làm nguôn năng lượng nuôi sông cơ thê, khi cây nâm men
và nắm bệnh vào cùng nhau thì sẽ dẫn đến sự canh tranh (Rosa và cộng sự, 2010).
Kết quả cho thấy tất cả các dòng nam men đều có khả năng ức chế sự phát triển của nam Colletotrichum gloeosporioides.
27
Bảng 4.6. Tỷ lệ đối kháng của 13 dòng nấm men đối với nấm Colletotrichum
gloeosporioides qua các ngày theo dõi
Mẫu nắm Tỷ lệ đối kháng (%)
men Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 Ngày 10 CÓI 22/40 28,4 12,2 18,4 27,6
C02 18,6 22,7 16,8 28,6 44,7 C03 30,2 25,0 15,0 28,6 242 C04 23:3 2753 18,7 34,7 54,4 C05 25,6 25,0 12,2 25,9 36,8 C06 23,3 30,7 26,2 34,0 53,0 C07 20,9 28,4 18,7 32,0 50,0 C08 20,9 23,9 17,8 34,7 53,5 C09 18,6 29,6 18,7 33,3 50,0 C10 18,6 25,0 15,0 31,3 49,1
Cll 20,9 23,9 15,0 25.9 54,4 C12 21,9 29,6 31,8 40,8 53,5 C13 30,2 28,4 22,4 34,0 54,0
Từ kết qua của Bang 4.6 thu được 6 dòng nam men có tỷ lệ đối kháng cao nhất của 6 nhóm đã phân chia, trong đó thấy mẫu C11 có sự ức chế cao nhất (54.4%) đối với nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh và mẫu C01 có sự ức chế rất yếu (27,6%).
28
Hình 4.12. Kết quả đối kháng giữa các dong nắm men với nam Colletotrichum gloeosporioides
sau 10 ngày. (4) — (N) Cac dong nam men lan lượt từ C01 den C13; (P) Mau doi chứng chi có nam Colletotrichum gloeosporioides.
Qua Hình 4.12 cho thấy, các dong nắm men nếu có khả năng đối kháng càng cao với nam Colletotrichum gloeosporioides thì khi nam Colletotrichum gloeosporioides tiếp xúc càng gần với nắm men sợi nam sé mọc chậm dan, thưa và không bung, ngược lại nếu nam men đối kháng yếu, khi nam Colletotrichum gloeosporioides phát triển gan
thì nâm vân mọc chậm nhưng sẽ phát triên qua nâm men.
Định danh các dòng nắm men bằng kỹ thuật phân tử
6 dòng nắm men thu được có tỷ lệ đối kháng cao được chọn định danh bằng kỹ
thuật PCR.
29
Bảng 4.7. Tý lệ đối kháng của 6 dòng nắm men Mẫu nâm ;
Ty lệ đôi kháng (%)
men
Col 27,6 C02 44,7 C04 54,4 C05 36,8 C07 50,0 Cll 54,4
Theo Kurtzman và Robnett (1998) đã phân tích quan hệ phat sinh gen giữa
các loại nam men Ascomycetous từ sự phân kỳ trình tự DJ/D2 va mức độ khác biệt trong miền 27/22 của DNA ribosome tiểu đơn vị lớn (26S). Bên cạnh đó vào năm 2003, Cadez đã khuếch đại vùng gen 7⁄22 của 26S rDNA bằng cách sử
dụng đoạn primer NLI (57 GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 37) và NL4 (5’
GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3'). Chứng tỏ rằng cặp primer NL1/NL4 sử dụng trong
nghiên cứu này là thích hợp và hiệu quả.
600 bp —*
Hình 4.13. Kết qua PCR của 6 dòng nam men với cặp méi NLI/NL4. L: thang 1 Kbp; (-): đối chứng âm; Từ 1 đến 6 là các mẫu C01, C02, C04, C05, C07, C11.
30
Dựa vào kết quả Hình 4.13 cặp mỗi NL1/NL4 có khả năng bắt cặp với DNA các dòng nam men ở kích thước khoảng 600 bp trùng khớp với nghiên cứu của Kurtzman và Robnett (1998) và được gửi mẫu giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek, so sánh
với dir liệu trên ngân hang gen NCBI.
Kết quả thu được năm mẫu C01, C02, C04, C05 và C11 khuếch đại thành công
vùng gen 7⁄D2 (2§S) với cặp primer NL1/NL4, có các peak tín hiệu huỳnh quang rõ
và có độ tương đồng cao ( lớn hơn 97%), khi Blast với các nguồn nắm men được công bố trên ngân hàng gen NCBI và điều này cũng chứng minh rằng nghiên cứu của Kurtzman và Robnett, 1998 về việc sử dụng cặp primer NL1/NL4 đề khuếch đại vùng gen DJ/D2 (26S) là hoàn toàn chính xác, kết quả so sánh sự tương đồng của các dòng nam men với di liệu trên NCBI được thé hiện rõ ở Bảng 4.8 và Phụ lục 3.
Bang 4.8. Kết quả so sánh độ tương đồng các dong nam men với đữ liệu trên NCBI.
Dòng
, ; ; Max Total Query Percent nam — Accession Description E-value _ ;
score score converage identity
men
Hanseniaspora
C01 MN203645.1 946 946 100% 0,0 99,81%
opuntiae
C02 U75735.1 Pichiabareri 636 636 93% le-177 97,85%
Hanseniaspra
C05 DQ404527.1 941 94I 100% 0,0 100%
thailandica Candida
C04 KY928444.1 979 979 100% 0,0 100%
tropicalis Candida
Cll MK409681.1 976 976 100% 0,0 100%
tropicalis
31