DANH SÁCH CÁC HÌNH
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: tháng 7/2022 đến 6/2023
Địa điểm: tại phòng RIBE 208, phòng Vi sinh Ứng dụng - Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nghiên cứu
3.2.1. Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: microwave, tủ cay vô trùng, máy lắc, tủ say, kính hiển vi, kính soi nồi, máy votex, máy ly tâm,...
Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu: đĩa petri, que cấy tam giác, que cấy móc, bình Erlenmeyer, ống nghiệm, micro pipet, pipet thủy tinh, cốc, phéu thủy tinh...
3.2.2. Hóa chất
Hóa chất phân lập nắm men
Yeast Extract.
Petone.
D Glucose.
Agar.
Hóa chất định danh sinh hoa nắm men
Duong D_Glucose.
Đường Sucrose.
Đường Lactose.
Môi trường Christensen.
Môi trường Simmons citrate.
Hoa chat tách chiết DNA nắm men
Lysis buffer (50 mM Tris HCI; 50 mM EDTA; 3% SDS; 1% f3 - mercaptoethanol) pH 8.0.
Hỗn hop Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol PCI (25:24:1).
Hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol CI (24:1).
Isopropanol.
Ethanol 70%.
Dung dich TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 8.0).
11
Hoá chất dùng cho PCR
dNTPs (dATP; dTTP; dGTP; dCTP).
MgCl.
10X PCR buffer.
Taq DNA polymerase.
Hoá chat dùng trong điện di gel agarose
Agarose dạng bột.
Dung dịch TAE 0,5%.
Dung dịch Loading Dye, Gelred.
Thang DNA 1 Kb và thang 100 bp.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phân lập và định danh nắm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm
hình thái
3.3.1.1. Phân lập nắm Colletotrichum gloeosporioides trên trái xoài
Thu các mẫu xoài có các triệu chứng của bệnh than thư như có vết đốm đen nhở hoặc to, có thé bị lõm vào trên vỏ, dem rủa sạch dưới vòi nước, thu vỏ xoài có chứa phan vỏ nguyên lẫn phan bệnh, khử trùng bằng cồn 70 °, rửa lại với nước 2 - 3 lần, sau đó sử dụng dao cắt mẫu dé phân lập, mẫu lay giữa phần mô khỏe và mô bệnh, phơi mẫu từ 20
— 30 phút sau đó cấy trên môi trường WA, theo đõi mẫu cấy đến khi hình thành các sợi nam đồng nhất.
Sử dụng que cấy truyền cắt giữa phần môi trường và đỉnh sinh trưởng của nắm, cấy truyền sang môi trường PGA dé nắm phát triển, ủ ở nhiệt độ phòng, từ 12 — 14 ngày, quan sát hình thái tản nam và xem tiêu ban nam dé xác định hình thái bao tử, đĩa cành, giác bám ở vật kính 40X. Dựa vào các đặc điểm trên dé định danh dòng nam.
3.3.1.2. Định danh nắm Colletotrichum gloeosporioides dựa vào đặc điểm hình thái Mẫu Colletotrichum sp. sau khi phân lập thì làm tiêu ban dé quan sát về hình dạng và kích thước bao tử, đặc điểm hình thái của giác bám, quan sat 6 bào tử có gai hay không gai trên kính hiển vi, quan sát hình thái, màu sắc giọt dầu trên kính soi nổi nếu có, quan sát hình thái tan nam va sợi nam dựa theo khóa định danh của Sutton
(1980), Swart (1999).
12
3.3.2. Phân lập và định danh nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và các phản ứng
sinh hoá
3.3.2.1. Phân lập các dòng nắm men có trên vỏ xoài Cát hòa Lộc
Các mẫu xoài sau khi thu thập được phân lập theo phương pháp tạo khuan lạc đơn ( Nguyễn Văn Minh và Dương Nhật Linh, 2008)
Thu thập và xử lý mẫu xoài Cát Hòa Lộc
ve
Lac tang sinh
NÓ
Cấy trang trên môi trường YPGA
vU
Cay ria
Thu thập và xử ly mẫu: loại bỏ bụi ban và khử trùng bề mặt vỏ xoải.
Tăng sinh: trong môi trường YPG trong 48 giờ đẻ nấm men phát triển.
Cay trang: pha loãng mẫu và cấy trang ở nồng độ 101, 10°, 105 trên môi trường YPGA và ủ mẫu trong 2 ngày.
Cay ria: chọn khuẩn lạc nằm riêng lẻ, cấy ria tạo dòng thuần.
3.3.2.2. Định danh nắm men dựa vào đặc điểm hình thái và thực hiện các phản ứng sinh hóa các dong nắm men
Định danh dựa vào các đặc điểm hình thái: quan sát hình thái khuẩn lạc đơn trên kính soi nồi, cũng như quan sát hình thái, kích thước tế bào, hình thức sinh sản nắm men và tiễn hành định danh dựa theo Kurtzman và cộng sự (2011).
Định danh dựa vảo các phản ứng sinh hóa
Phan ứng lên men đường Glucose, đường Sucrose và đường Lactose: lắc tăng sinh khối các dòng nắm men trong môi trường YPG ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Hút Iml dung dich tăng sinh nấm men vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml dung dịch đường (Glucose 2%, Sucrose 2% và Lactose 2%) và ống Durham (đã được khử trùng ở 115 °C trong 15 phút) và ủ lên men. Quan sát và đo cột khí trong ống Durham bắt đầu từ sau 2 giờ cho đến thấy cột khí đầy, mỗi thời điểm đo cách nhau 2 giờ.
là
Phản ứng Citrate: lấy khuẩn lạc đơn của các dòng nắm men cấy vào ống nghiệm chứa môi trường Citrate theo đường ziczac rồi quan sát kết qua trong 48 giờ.
Phản ứng ure: Tăng sinh các dòng nam men trong môi trường YPG ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. Hút 0,5 ml dịch tăng sinh nam men vào ống nghiệm có chứa sẵn 4,5 ml môi trường Christensen (đã được khử trùng ở 115 °C trong 15 phút) và ủ ở 30°C trong vòng 1 tuần.
3.3.3. Đánh giá khả năng đối kháng giữa các dòng nắm men và nắm Colletotrichum
gloeosporioides gay bệnh than thư trên trái xoài trong phòng thí nghiệm
Thực hiện đánh giá đối kháng giữa các dòng nấm men và nam Colletotrichum
gloeosporioides phan lập trên môi trường PGA (Potato 200g/L, D - Glucose 20 g/L, agar
20g/L) trong phòng thi nghiệm dé chon dòng nam men mạnh nhất của từng nhóm có khả năng đối kháng với nam Colletotrichum gloeosporioides gây bệnh.
Cách bé trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn nguyên tố, gồm 3 lần lặp lại, trên môi trường PGA, nghiệm thức đối chứng chỉ có nam Colletotrichum gloeosporioides. Các dòng nam men được cấy ria hai đường thang đối xứng nhau và cách thành đĩa 1,5cm và đem ủ trong 48 giờ cho nắm men phát triển, sau đó cay nam Colletotrichum gloeosporioides vào giữa hai đường ria nam men.
Thời gian theo đõi lần lượt là sau 2, 4, 6, 8, 10 ngày sau khi cấy nấm
Colletotrichum gloeosporioides.
Chỉ tiêu theo dõi là bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides từ đó tính tỷ lệ đối kháng của các dòng nắm men theo công thức:
H= ((R1-R2)/R1) x 100
Ri: bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides trên đĩa đối chứng (cm).
Ra: bán kính nắm Colletotrichum gloeosporioides trên đĩa đối kháng với nam men (cm).
Thực hiện phản ứng PCR Ly trích DNA
Bước 1: Lay tơ nam (dùng dau tip) cho vào eppendoft, thêm 200 uL lysis buffer rồi nghiền. Tiếp tục thêm 400 uL và nghiền tiếp.
Bước 2: U ở 65 °C trong 1 giờ, cứ 15 phút đảo nhẹ eppendoft.
Bước 3: Thêm 600 mL dung dich Phenol/chloroform/isoamyl alcohol PCI
(25:24:1), vortex dé trộn đều dung dich.
14
Bước 4: Ly tâm 12000 x g trong 5 phút ở 25 °C.
Bước 5: Chuyển dich nổi vào expendoft mới (500 HL).
Bước 6: Thêm 500 pL chloroform/1soamyl alcohol CI (24:1), lac nhe.
Bước 7: Ly tâm 12000 x g trong 5 phút ở 25 °C.
Bước 8: Hút dich nỗi vào expendoft mới (400 pL).
Bước 9: Thêm 0,03 V (12 nL) Sodium acetate 3M và 1V (400 pL) Isopropanol.
Tron đều bang micropipette (dao nhẹ), ủ ở 20 °C trong 1 giờ.
Bước 10: Ly tâm 13000 x g trong 10 phút.
Bước 11: Loại bỏ dịch nổi, thêm 400 pL Ethanol 70% lạnh. Ly tâm 13000 x g trong 3 phút. Loại bỏ dung dịch. Thực hiện 2 lần.
Bước 12: Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với 50 uL TE 1X, bảo quản -20°C.
Thực hiện phản ứng PCR
Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Cân 0,75 gram agarose cho vào 50 mL dung dịch TAE 0,5X, lắc đều và đun hòa tan trong lò vi sóng, dé nguội đến khoảng 60 °C rồi đồ vào khuôn va gắn lược dé tạo các giếng nap mau. Sau khi bản gel đã đông cứng, đặt ban gel vào buồng điện di, đồ dung dịch đệm TAE 0,5X ngập ban gel khoảng 1 — 2 mm.
Bảng 3.1. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian Số chu kỳ Tiên biến tính 95 5 phút 1
Bién tinh 95 30 giây Bắt cặp
52 1 phút 35 (NL1/NL4)
Kéo dải 72 1 phút
Hậu kéo dai 72 10 phút |
Tiến hành: Hút sản phẩm PCR trộn đều với dung dịch nap mẫu (loading dye) và nạp vào giếng. Đồng thời nạp thang chuân DNA vào giếng để kiểm tra kích thước các đoạn DNA. Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong thời gian 30 phút.
Sản pham PCR sẽ được gửi giải trình tự tại công ty Nam Khoa Biotek.
3.4. Xử lý số liệu
Tổng hợp và xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2019 và phân tích ANOVA 1 yếu tố bằng phần mềm minitab 16.
lŠ