Khóa luận tốt nghiệp Bảo vệ thực vật: Đánh giá khả năng đối kháng của một số vi khuẩn đối với nấm Fusarium oxysporum f.sp. cubense gây bệnh héo vàng trên cây chuối già Nam Mỹ

cubense Foc TR4 gây bệnh héo vàng trên cây chuối gia Nam Mỹ Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi dòng vi khuẩn là 1 NT và 1 NT đối chứng

TRUONG ĐẠI HỌC NÔNG LAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH

KHOA NÔNG HỌC

RRR RK

KHOA LUAN TOT NGHIEP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG DOI KHANG CUA MOT SO VI

KHUAN DOI VỚI NAM Fusarium oxysporum f.sp.

cubense GAY BENH HEO VANG TREN

CAY CHUOI GIA NAM MY

SINH VIEN THUC HIEN : NGUYEN THI CAM TIEN

NGANH : BAO VE THUC VATKHOA : 2019 — 2023

Thành phó Hồ Chi Minh, tháng 11/2023

ĐÁNH GIÁ KHẢ NANG DOI KHÁNG CUA MOT SO VI

KHUAN DOI VỚI NAM Fusarium oxysporum f.sp.

cubense GAY BENH HEO VANG TREN

CAY CHUOI GIA NAM MY

Tac giaNGUYEN THI CAM TIEN

Khóa luận được đệ trình dé đáp ứng yêu cầu cấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, dé đạt được kết quảnhư hôm nay ngoài những cố gắng, nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sựgiúp đỡ từ gia đình, thầy cô, bạn bè Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

Ban Giám hiệu Trường Dai học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cùng các quýthầy cô Khoa Nông học đã giảng dạy, hỗ trợ, tạo điều kiện dé tôi học tập, tiếp thu kiếnthức chuyên môn cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Võ Thị Ngọc Hà và ThS Phạm KimHuyền đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và nhiều kinhnghiệm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Hơn hết, tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị, các bạn trong Lab

105, đặc biệt là bạn Võ Nguyễn Thúy Duyên người đã luôn đồng hành, giúp đỡ tôi trongsuốt quá trình làm đề tài cũng như cùng tôi đi qua 4 năm đại học

Cuối cùng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, người đã luôn đồng hành và ủng hộ mọi quyếtđịnh của con, là nguồn động lực giúp con vượt qua được những bề tắc của bản thân, tạomọi điều kiện dé con có thé được đến trường lần nữa và thực hiện được ước mơ của con

như ngày hôm nay.

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Đánh giá khả năng đối kháng của một số vi khuẩn đối với

nam Fusarium oxysporum f.sp cubense gây bệnh héo vàng trên cây chuối già Nam Mỹ”

đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật — Khoa Nông học,

Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 05/2023 đến thang11/2023 Mục tiêu nghiên cứu: Chọn lọc các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng caovới nâm Fusarium oxysporum f.sp cubense (Foc TR4) gây bệnh héo vàng trên cây chuối

gia Nam Mỹ

Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu

nhiên, mỗi dòng vi khuẩn là 1 NT và 1 NT đối chứng, mỗi NT 3 LLL, mỗi LLL của 1

NT là 3 đĩa petri Thí nghiệm đánh giá tác động của vi khuẩn đến sự phát triển của hệSỢI va su nảy mam bào tử được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi dòng vi khuẩn

là 1 NT và 1 NT đối chứng, mỗi NT 3 LLL, mỗi LLL của 1 NT là 3 lam kính lõm Thínghiệm đánh giá khả năng sản sinh enzyme chitinase, enzyme protease được bố tri theokiêu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi dòng vi khuẩn là 1 NT va 1 NT đối chứng, mỗi NT 3LLL, mỗi LLL của 1 NT là | đĩa petri

Từ 16 dòng vi khuẩn đối kháng với nắm Foc TR4 đã tuyên chọn ra được 2 dòng

vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao lần lượt là CC — FN 1.1 (65,17%), ĐHT3 (62,08%)

tại thời điểm 5 ngày sau cấy Kết quả đánh giá tác động của 2 dòng vi khuẩn có hiệu

suất đối kháng cao đến sự phát triển của hệ sợi và sự nảy mam bao tử nam Foc TR4 chothay ca 2 dòng vi khuẩn đều làm biến dạng hình thái sợi nam và ức chế sự nảy mầm bao

tử Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn cho thay cả 2 dòng vi khuẩn

đêu có khả năng sinh enzyme chitinase va protease.

1H

Mitte h@ieccssscueversazecnactesysn Đ18L)4GES:B02SEHGIESSSU2LESSSESSiISSDSS:G-RSVSE-GESIEENLGNGHHG Eee ER RE RETURNER: 1V

Du ce a a 0013001001006 1800021080 08g/0040yn hư vill

AMSA CTC AC WAT Sse estore eeemcosnmtnerenenstiearen Soames towe ttrcae Recast iano 1X

1.2.1 Thiệt hại trên thé giới 2-2 252 2S2SE+EE2E2EE9E1232212112112122121121112112111 21.210 c0 4

12222: Th 6t: hat Ở MIỆUNAHTlissssssssssszesxvo6i651155 8101009900048 003039569969391588958:2u010380046038390200740 6U5000.0u38 5

1.3 Tổng quan về bệnh héo vàng trên chuỐi 2: 2 2 2222++2E+2E£+EE+2E22+zzxz+zzzex 61.3.1 Triệu chứng biểu hiện bên ngoài 2-22 ©2222E+2E22EE£EE2EE2EE2EE2Exerkrrrrees 6

1.3.2 Triệu chứng biểu hiện bên trong 2-2 22 S22S222E2EE2EE£EE£EE£EEEEEEzzxrzxezed 6

1.4 Tổng quan về nam Fusarium oxysporum Ẩ'Sp CUDCNSE -22-©2255225525552: 7

DAT X1 tt a 81 :ssssssiiascccc6ioxczsiz8gsgsi2fsgsoigaSgtEgduilztEodögoSeoisi4gisegeslo-ggaddbidozcodbuipsstbkiasssdik 7

1.4.2 Đặc điểm THHẨN: (Oy: eee ee ee ee ee ee ee 71.4.3 Tính gây bệnh của nam Fusarium oxysporum Esp ewbeHse -: 2 : §

1.4.4 Chu ky 0 9

1.4.5 Con đường lan truyền bem oo cece cece cess eesseesseesssesseeesessseessessessseesseesieesseseses 10

1.5 Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của bénh 2 eee 101.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, 2-2 2 S+SE+SE£EE+EE22EE2EE2EE71712171211212222 22 Xe 101.5.2 Ảnh hưởng của đất - 2-2-2 S2S2£212EE222E92122127127112112111211271211211 22 cre 101.5.3 Ảnh hưởng của các nguyên tố dinh dưỡng - 2 2 2222£EE+2EZ2EE+zzzzzzzzx2 111.6 Phong trừ nam Fusarium oxysporum f.sp cubense gây bệnh héo vàng trên chuối già

1.7 Tông quan về vi sinh vật đôi kháng với nam Fusarium oxysporum f.sp cubense gay

trên bệnh héo vàng chuối 2: 2-22 2SE22EE2EE22E12E1225122122112112211211211211211 21.22 2e 12

1.7.5 Vikhuln PP S6H(ÄÐWHDNHS EỤ -« se HH 21.3123 0000223.020-1,c2 141.7.3 VI khuẩn.Pnioeii tytÏOTNNGTINN s«sscsssec2ns, G2 dang G20 2150010016 00 104814/500414g85E 151.7.4 Vi khuẩn Klebsiella ph€HIOHiđe - 22-52: ©5225s‡222222EE22EE22322E22232232223223222222e2 16

Chương 2 NOI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - 19

2el lỗi QUA HgHIỆN CU csoaseeeeniriientiinoidittoLigi60330050551385616589438555810381550000404810403343840432 19

2.2 Thời gian và dia điểm nghiên cứu 2-22 22 22222E+2E2EE+EE£EE2EEtEEEzExrrxrrrrcrer 19

2.3 (¡820620 19

2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc 2 2+s+SE2S2+E2EE+EE2E22E2EE2E2212212222122222221 2e, 19

2.3.2) V Ab WOU WSN ISH cá s66 5551161811610 há 1152 13 5014 604351364385945463655X5365635G855L881404430045543086588 20 2.4 Phuong phap nghién Cvu mẻ 22

2.4.1 Đánh giá kha năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 222.4.1.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuân đối với nam Foc TR4 bằng

phurong 801g 22

2.4.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 bằngphương pháp khuếch tán giếng thạch - 2© 222¿22222E22E2EE22E2EE22E222222EEEzrrrrev 232.4.2 Đánh giá tác động của dịch nổi vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi và sự nảy

100807 tr wind PO TRA RA .‹‹ ,HpHDHH Ẳ., 352.4.2.1 Đánh giá tác động của dịch nổi vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi nam Foc

Sy ase Sa EAN UR 6884335038138 oN Am AUGER oa aT TGGBRGHSISS1RNGbESSEGXEEESSEASESSGISRE1GI0/8/G8383/0L3843835832 26

2.4.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase, protease của các dong vi khuân 272.4.3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của các dòng vi khuẩn 27

2.4.3.2 Khảo sát khả năng sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn 28

TS FE H tổ TI kereseseneeseieesedbinrseooiottgthgridighfsgrortstt2trcfosogt0tiotesirlrinirgrTrcbudirbirersgtioproggigt 29

Chương 3 KET QUÁ VÀ THẢO LUẬN 2-52255222scsscszzzszsessc - 30

3.1 Kết quả đánh giá kha năng đối khang của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4trong điều kiện phòng thí nghiệm 22 2 222S£+SE22E£2EE2EE22EE2EE22E122122522212222222 2e 303.1.1 Đánh giá kha năng đối kháng của các vi khuẩn đối với nam Foc TR4 bằng phương

TT BE GungeeegeeneurrrrrrorrgrotrraoriroyripintiftgfENEPAnA0A0nneag 30

3.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của 6 dòng vi khuẩn đối với nấm Foc TR4 bang

phương pháp khéch tán giếng thạch - 2-22 22222E2z2E+zEzrxrzszrxerssrsersc-e - 33

3.2 Đánh giá tác động của dịch nổi 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và DHT3 đến sự phát

triển của hệ sợi va sự nảy mầm bao tử nắm Foc TR4 2+s+szcszeerseezeecsccc 3Õ

VỊ

3.2.1 Đánh giá tác động của dich nổi 2 dong vi khuân CC - FN 1.1 và ĐHT3 đến sự

phát triển của hệ sợi nắm FOC TÌR4 - 2-2 52+2S22E22E921921221221121121121121221121221 226 353.2.2 Đánh giá tác động của dich nồi 2 dong vi khuẩn CC — FN 1.1 và DHT3 đến sự nảymầm bảo tử nắm FOC TR4 2-2-2223 SS 2515151515155 55151551515121551511 121151511215 EEEEsee 373.3 Khao sát khả năng sinh enzyme chitinase, protease của 2 dòng vi khuẩn CC — FN

DANH SÁCH CHU VIET TAT

BKTN Bán kính tản nắm

ctv Cong tac vién

DC Đối chứng

DKVPG Duong kinh vong phan giai

FAO Food and Agriculture Organization

(Tổ chức Luong thực và Nông nghiệp của Liên hợp quốc)

Foc Fusarium oxysporum f.sp cubense

Foc TR4 Fusarium oxysporum f.sp cubense Tropical Race 4

GSC Giờ sau cấy

HSDK Hiệu suất đối kháng

DANH SÁCH CÁC BANG

Trang

Bảng 2.1 Nguồn vi khuẩn đối kháng được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Bộ mônBao vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Dai học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 2 lBang 3.1 Bán kính tản nam Foc TR4 và hiệu suất đối kháng (HSDK) của 16 dong vikhuẩn đối với nam Foc TR4 trong điều kiện phòng thí nghiệm - 2-52: 32

Bảng 3.2 Hoạt tính đối kháng của 6 dong vi khuẩn đối với nam Foc TR4 thé hiện qua

kiehitnyrle xông BI HH song niahgouiatiesioobtriasidbjeudBbdsgdptgoedliciptsgascgrsroixcgeeafiuzeoozs STBảng 3.3 Hiệu lực ức chế (%) của 2 dòng vi khuẩn đến sự nảy mam của bào tử namFoo TRA qua: các thời điểm Theo đổi eiiiDiikbinirkibiiisiiabmsdbsdroirscacersoEBang 3.4 Đường kính vòng phân giải enzyme của 2 dòng vi khuẩn sau 72 GSC 40

1X

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Các dang bao tử của nam Fusarium oxyporum Ầ.sp CUDCNSE - §

Hình 1.2 Sơ đồ biểu diễn chu kỳ bệnh héo vàng trên chuối 222255255z552 9

Hình 2.1 Nam Foc TR4 trên môi trường PGA -22-©2++22++22++2x+szxrzrxrsrrre 20Hình 2.2 Bồ trí vi khuẩn đối kháng với nam Foc TR4 trên dia petri - 22Hình 2.3 Bồ trí vi khuẩn đối kháng nam Foc TR4 trên đĩa petri . - 25Hình 3.1 Kha năng đối kháng của 16 dòng vi khuẩn với nam Foc TR4 theo trình ty từ

Hình 3.2 Kha năng đối khang của 6 dong vi khuẩn với nam Foc TR4 theo trình tự từmarth ni2i0 2 08 na 5< 35Hmh,5ã Hgượi năm Fee THỊ Tổ sass cic ssnansns rset hieu ng ghhrtgg2a‡qàgas,gl228/8kseisan TTHinh X4 Hầu từ rầm Pie TRA L2 CHẾ vessesuiesseosiicddosgois0.giusustidLS8204g61000.g0sg06 cse553/5Hình 3.5 Bào tử nam Foc TR4 24 GSC 22- 522 22222222222212212212212211221 2222 cz 38Hình 3.6 Kha năng sinh enzyme chitinase của 2 dòng vi khuẩn 2-5 4lHình 3.7 Khả năng sinh enzyme protease của 2 dòng vi khuẩn - 41

GIỚI THIEU

Đặt vẫn đề

Chuối gia Nam Mỹ (Cavendish banana) là giống chuối chính trên thé giới, được

trồng rộng rãi khắp vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Là nguồn cung cấp các chất đinh

dưỡng quan trọng như carbohydrate, chất xơ, vitamin và khoáng chất quan trọng trong

đời sông hàng ngày Mặc du có hơn 1000 giống chuối nhưng toàn bộ ngành chuối toàncầu chỉ dựa vào giống chuối Cavendish (phân nhóm AAA) với sản lượng 50 triệu tấn

hàng năm (FAO, 2022).

Hiện nay, tình hình sản xuất chuối già Nam Mỹ trên toàn cầu đang gặp phải mộtthách thức lớn do bệnh hại gây ra, đặc biệt là bệnh héo vàng Panama do nam Fusariumoxysporum f.sp cubense (Foc) trong dat gây ra Một khi đã hình thành, nam Foc không

thé được kiêm soát bằng bat kỳ biện pháp hóa học hoặc vật ly nào (Dita va ctv, 2018)

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây bệnh héo vàng trên chuối già Nam Mỹđang lan rộng và phát sinh ở hầu hết các địa phương trồng chuối, người trồng còn ít hiểubiết về bệnh và chưa có các biện pháp phòng trừ hiệu quả

Hiện nay, nhiều biện pháp hóa học được áp dụng dé làm giảm thiểu thiệt hại donam bệnh gây ra Tuy nhiên các biện pháp này không mang lại hiệu qua cao, việc sửdụng nhiều thuốc hóa học có tác động xấu đến môi trường và vi sinh vật, đồng thời làm

rồi loạn hoạt động của hệ sinh thái và giảm tính bền vững của nông nghiệp, tiềm an nguy

cơ về an toàn thực phẩm So với các biện pháp phòng ngừa khác, phương pháp kiểm

soát bệnh héo vàng bằng vi khuân đối kháng là một chiến lược sinh học đã và đang nhậnđược sự quan tâm lớn Phương pháp này sử dung các dòng vi khuẩn có khả năng ký

sinh, cạnh tranh không gian hoặc tiết ra các chất kháng sinh làm giảm triệu chứng bệnh,

từ đó tạo ra sức đề kháng cục bộ đồng thời thúc đây sự tăng trưởng của cây hoặc thayđổi hệ vi sinh trong đất Một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus, Pseudomonas,

Streptomyces đã được đánh giá là phương pháp khả thi dé kiểm soát bệnh héo vàngtrên chuối (Bubici va ctv, 2019)

Chính vì thé đề tài: “Đánh giá khả năng đối kháng của một số vi khuẩn đối với

Lah nam Fusarium oxysporum f.sp cubense gay bệnh héo vàng trên cây chudi gia Nam My

được thực hiện.

Mục tiêu

Chọn lọc được các dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng cao với nắm Fusariumoxysporum f.sp cubense (Foc TR4) gây bệnh héo vàng trên cây chuối già Nam Mỹ.Yêu cầu

Đánh giá khả năng đối kháng của các dong vi khuẩn đối với nam Foc TR4 trongđiều kiện phòng thí nghiệm

Đánh giá khả năng tác động của 2 dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao đến

sự phát triển hệ sợi nam va sự nảy mam bao tử nam Foc TR4

Khao sát kha năng sinh enzyme chitinase, enzyme protease của 2 dong vi khuẩn

có hiệu suât đôi khang cao.

Giới han đề tài

Đề tài được thực hiện trên 16 dong vi khuân đối khang và nam Foc TR4 gây bệnhhéo vàng trên chuối già Nam Mỹ do phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, TrườngĐại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp

Chương 1

TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Tổng quan về cây chuối già Nam Mỹ

1.1.1 Nguồn gốc

Hau hết chuối được trồng là các giống có nguồn gốc từ các con lai cùng loài hoặc

khác loài giữa hai loài hoang dã lưỡng bội, Musa acuminata Colla (bộ gen là AA)

và Musa balbisiana Colla (bộ gen là BB) (Heslop-Harrison và Schwarzacher, 2007).

Chính sự tái t6 hợp trong điều kiện tự nhiên va qua nhiều đời giữa 2 loài này đã hìnhthành rất nhiều nhóm giống chuối Trong đó nhóm Cavendish mang kiểu gen AAA vớirất nhiều giống chuối tiêu thương mại đang được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia vàvùng lãnh thổ Ngày nay, các nghiên cứu về chọn tạo giống kháng và phát triển sản xuấtchuối chủ yếu được thực hiện trên nhóm chuối này

Theo Nelson và ctv (2006), chuối có nguồn gốc phát sinh từ An Độ, các nướcvùng Đông Nam châu Á và khu vực Thái Bình Dương Ngày nay, cây chuối đã đượcphân bồ rộng rãi ở khắp các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thé giới Người ta đã

tìm thấy sự đa dạng về nguồn gen cây chuối không chỉ ở nơi phát sinh nguồn gốc mà

còn ở khu vực Nam Mỹ, Đông Phi và Tây Phi.

1.1.2 Tình hình sản xuất chuối già Nam Mỹ

Chuối là loại cây lương thực có giá trị thứ sáu và được giao dịch nhiều nhất trênthế giới, trong đó Cavendish là giống chuối chính, ước tính chiếm khoảng 40 — 50% sảnlượng toàn cầu Hiện nay, việc sản xuất chuối phổ biến ở hơn 135 quốc gia khác nhauthuộc các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Gomes và ctv, 2020) Hầu như tat cả chuốicung cấp cho thị trường Mỹ và Châu Âu đều là chuối Cavendish, loại chuối này phù hợpvới thương mại quốc tế hơn các giống khác vì chúng có khả năng phục hồi tốt hơn trước

những tác động của dịch hại toàn câu Cavendish cũng là loại chuôi được sản xuât và

tiêu thụ chính ở Trung Quốc, đồng thời chiếm 1/4 sản lượng và tiêu thụ chuối ở An Độ

Lượng chuối xuất khẩu toàn cầu năm 2022 giảm 1,2 triệu tấn so với năm 2021,xuống còn khoảng 19,1 triệu tấn Một trong những nguyên nhân chính ảnh hưởng đếnsản lượng chuối toàn cau là sự lây lan nhanh chóng chủng nam Foc TR4 gây bệnh héovàng trên chuối (FAO, 2023)

Ở Việt Nam, chuối già Nam Mỹ được trồng phô biến khắp cả nước mang lại hiệuqua kinh tế cao, trở thành mặt hàng xuất khẩu lớn thứ ba cả nước do giống chuối này có

sự thích nghi rộng, năng suất và chất lượng vượt trội Theo thống kê của Tổng cục Hải

quan, năm 2022 giá trị xuất khâu chuối tươi đạt gần 311 triệu USD (tăng 34,5% so với

năm 2021).

1.2 Thiệt hại do nắm Fusarium oxysporum f.sp cubense gây bệnh héo vàng trên câychuối

1.2.1 Thiệt hại trên thế giới

Lần đầu tiên trên thế giới bệnh héo vàng ở chuối được mô tả trên giống chuối

Sugar tại nông trường Eagle, Brisbane, Autralia vào năm 1874 (Pegg và ctv, 2019).

Những năm đầu của thế ky XX, chủng 1 và chủng 2 đã gây ra những thiệt hại nặng nềcho ngành công nghiệp xuất khẩu chuối ở Trung Mỹ và Nam Mỹ, phá hủy khoảng40.000 ha chuối (Stover, 1962) Đề khắc phục thiệt hại trên, trong những năm 60 ngànhcông nghiệp của những nước này được phục hồi bằng cách sử dụng các giống chuối tiêuthuộc nhóm Cavendish có khả năng kháng với chủng 1 và 2 Như vậy chuối xuất khâutrên thé giới chủ yếu thuộc nhóm Cavendish Tuy vậy ngành công nghiệp này hiện nay

đang bị đe dọa bởi chủng 4 nghiêm trọng vì chủng này gây hại trên các giống chuối tiêu

thuộc nhóm Cavendish và những nhóm chuối mẫn cảm với cả chủng 1 và chủng 2 Từ

những năm 1990, chủng 4 đã lan rộng khắp các vùng trồng chuối ở Châu Á, TrungĐông, Châu Phi và thậm chí cả Châu Âu, gây thiệt hại nặng nề cho các giống chuối

Cavendish cũng như một số giống kháng chủng 1 quan trọng khác (Zheng và ctv, 2018).Hiện tại, nam Foc TR4 được tìm thay phân bồ ở 19 trong số 135 quốc gia sản xuất chuối

và sự lây lan nhanh chóng của nó đã nhận được sự quan tâm to lớn trên toàn cầu trong

4

việc tìm kiếm các phương pháp quản lý hiệu quả (Zheng và ctv, 2018) Các báo cáo gần

đây đã xác nhận sự hiện diện của bệnh héo vàng 6 Lebanon va Pakistan (Garcia-Bastidas

và ctv, 2014), Việt Nam (Hung va ctv, 2018), Lào (Chittarath và ctv, 2018), Myanmar

(Zheng và ctv, 2018), Israel (Maymon va ctv, 2018), An Độ (Thangavelu va ctv, 2019),

Colombia (Garcia-Bastidas va ctv, 2020) Sự xâm nhập cua Foc TR4 ở Colombia đã

nâng cao nhận thức va nỗ lực phòng ngừa trên khắp Chau Mỹ Latinh va Caribe Trong

hơn 100 năm, loại nắm này đã ảnh hưởng đến sản xuất chuối trên toàn thế giới, gây tácđộng nghiêm trọng đến an ninh lương thực thế giới (Ploetz, 2015) Trong tương lai

gan, Foc TR4 sẽ lan rộng hơn nữa ở chau A, từ đó ảnh hưởng đáng kê đến các nước sanxuất chuối quan trọng như Trung Quốc, Philippines, Pakistan và Việt Nam (Scheerer và

ctv, 2018).

1.2.2 Thiệt hại ở Việt Nam

Những nghiên cứu về bệnh héo vàng trên chuối ở Việt Nam đã được thực hiệnlần đầu tiên năm 1968 ở miền Nam va năm 1995 ở cả miền bắc, miền Trung bởi Vakili.Kết quả điều tra cho thấy, có tới 70% điện tích trồng chuối tây ở miền Nam Việt Nam

bị bệnh héo vàng, trong đó có nhều vùng bị thiệt hại hơn 85% năng suất (Vakili va ctv,1968) Trong nhiéu nghiên cứu giai đoạn trước năm 2013 đều xác định bệnh héo vàngchỉ hại trên chuối tây và do nắm Foc chủng 1 Tuy nhiên trong những năm gan đây bệnhhéo vàng trên chuối do chủng 4 gây ra đang lan rộng trên phạm vi cả nước Mặc dù chưagây thành dịch lớn song bệnh héo vàng vẫn được coi là một trong số bệnh đáng chú ýnhất gây hại chuối ở Việt Nam do bệnh có phạm vi phân bố rộng và khả năng gây hại

lớn.

Theo báo cáo của Hung và ctv (2018), Foc TR4 đã xuất hiện trên chuối Cavendish

ở ba tỉnh miền Bắc Việt Nam cụ thê là Hà Nội (tháng 10 năm 2014), Hưng Yên (tháng

10 năm 2015) và Lào Cai (thang 10 năm 2015) Hiện nay, Foc TR4 gây bệnh héo vàng

trên chuối đã xuất hiện và gây hại nhiều tỉnh trồng chuối, gây hại nặng cục bộ ở HưngYên, Hà Nội, Lao Cai, Lai Châu, Gia Lai, Đồng Nai, Tây Ninh, Long An Sự xuất hiệncủa Foc TR4 ở Việt Nam có tác động đáng kề đến kinh tế và sản xuất nông nghiệp Theo

Scheerer và ctv (2018), những dự đoán về tác động của nam Foc TR4 trong tương lai là

rất lớn, ước tính thiệt hại về điện tích sản xuất chuối của Việt Nam là 8% trong vòng 5

năm tới và lên tới 71% trong vòng 25 năm tới.

1.3 Tổng quan về bệnh héo vàng trên chuối

Bệnh héo vàng gây ra bởi nam Foc có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn sinh trưởngnao của cây Tùy theo mức độ gây hại mà triệu chứng bệnh biểu hiện khác nhau

1.3.1 Triệu chứng biểu hiện bên ngoài

Triệu chứng vàng lá ban đầu thường gặp là xuất hiện một vệt màu vàng nhạt ởcuống lá của lá già nhất, tiếp theo là bệnh vàng lá tiến triển từ lá già bên dưới sau đó landần lên các lá non Triệu chứng vàng phát triển từ bìa lá và lan vào hướng gân lá Lá bị

bệnh thường héo, cuống gãy và lá treo trên thân giả, đôi khi cuống lá cũng bị gãy ở phần

giữa phiến lá, chỉ còn một số lá đọt xanh và mọc thắng, các lá đọt này có màu xanh nhạt hay hơi vàng hoặc bị méo mó, nhăn nheo, cuối cùng cũng bị héo úa (Ploezt, 2015) Cây

bệnh chết nhưng thân không ngã đồ, các bẹ ngoài bị nứt đọc, các chồi con vẫn phát triển

từ thân chính nhưng sau đó cũng bi héo rụi Nếu bị bệnh sớm, cây có thé bị chết hoặc

không cho buồng Nếu cây trưởng thành mới bị bệnh thì cây vẫn cho buồng, nhưng quảnhỏ Hiện tượng vàng lá có thé do nắm sinh ra chất độc axit fusaric Các chất này đi vàomạch dẫn và lên phía trên cây theo mach xylem làm giảm tông hợp chlorophil đọc theogân lá, làm giảm quang hợp, gây rối loạn khả năng thấm của màng tế bao lá và làm matkhả năng trao đôi nước đo đó lá bị héo vàng và chết (Dong và ctv, 2014)

1.3.2 Triệu chứng biểu hiện bên trong

Đặc điểm quan trọng đặc trưng được nhận thấy là xuất hiện mạch màu nâu đỏ ởthân củ, thân giả và cả bẹ lá trong các cây bị bệnh nặng Khi cây bị bệnh, thành tế bảo

mô mềm của lá và các cơ quan khác mất đi tính trương nước Sự có mặt của sợi nam vàcác loại bảo tử trong thân giả, thân củ, rễ cây bị bệnh này cùng với các sản phẩm oxyhóa của cây sinh ra bởi nắm như polysacarit, các chất gel và gôm làm cho hệ mạch củacây bị tắc nghẽn Ngoài ra, sản phẩm của nấm có tác dụng kích thích phân chia quá mứccác tế bào mô mềm quanh bó mạch xylem làm cho thành tế bào mô mềm hơn và yếu đi.Đồng thời, các ống mạch xylem được hình thành ít đi, chuyền sang màu nâu đỏ và cuốicùng bị tắc lại, do đó cản trở việc vận chuyền nước và chất dinh đưỡng (Ploetz, 2015)

Kết quả là nước không được dẫn lên phía trên cây do mạch bị tắc nghẽn, do vậy lá cây

bị héo và gẫy gục.

1.4 Tổng quan về nam Fusarium oxysporum f.sp cubense

1.4.1 Vi tri phan loai

Loài: Fusarium oxysporum f.,sp cubense

(ID: 707; Genome - NCBI)

1.4.2 Dac diém phan loai

Nam Foc gây bệnh héo vàng thuộc ngành nam túi (Ascomycetes), lớp nam battoàn (Deuteromycetes) Hệ sợi nam phân nhánh có nhiều vách ngăn, sợi nam không mau

và chuyên màu nâu khi già và sinh độc tố tiết vào mạch cây gây héo cây chủ Cơ thể

sinh dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, trong tế bào có một hoặc nhiều nhân

Nam Foc TR4 có 3 dạng bao tử vô tính bao gồm: Bào tử lớn (Macroconidia)nhiều nhân, có dạng hình liềm, có 4 — 8 vách ngăn, kích thước 27 — 55 x 3,3 — 5,5m,

thường được hình thành muộn hơn bao tử nhỏ Bao tử nhỏ (Microconidia) đơn nhân,

thường không có vách ngăn, đôi khi có một vách ngăn, có hình oval, một số kéo đài có

kích thước 5 - 16 x 2,4 —3,5um Bao tử hậu (Chlamydospores) có vách dày được tạo ra

trong cây vào giai đoạn muộn của chu kỳ bệnh, có thê phát triển đơn hoặc thành chuỗi,các bào tử hậu hình oval có kích thước 7 - 11um hoặc hình cầu đường kính khoảng 7 —

7,5um (Ploetz, 2006).

Hình 1.1 Các dang bào tử của nam Fusarium oxyporum f.sp cubense (Nguồn: Guo va

ctv, 2014) A) bào tử lớn (Macroconidia), B) bao tử nhỏ (Microconidia), C) bao tử hậu

(Chlamydospores)

1.4.3 Tinh gây bệnh của nắm Fusarium oxysporum Ÿ.sp cubense

Nam Foc tồn tại đưới dạng các chủng gây bệnh khác nhau như chủng 1, 2, 3 va

4 Chúng được phân loại dựa trên cơ sở gây nhiễm với các giống chuối khác nhau

Chung 1 là nguyên nhân gây bệnh ở giống Gross Michel (AAA) và nhóm giống

chuối tây: Si/k (AAB), Pome (AAB), Lady Finger (AAB)

Ching 2 gây bệnh ở giống Bluggoe (ABB) và các giống chuối có quan hệ ho hàng

gần gũi với chúng

Chung 3 gây bệnh ở các loài trong chi Helicolia (có quan hệ gần gũi với chi

Musa) và không còn được công nhận là mâm bệnh trên chuôi.

Chung 4: là chủng độc nhất, gây bệnh ở các giống chuối thuộc nhóm Cavendish(AAA) và các giống man cảm với chủng 1 và 2 (Ploetz, 2015)

Kha năng gây độc của một chủng nam trên các giống ở các vùng khác nhau làkhác nhau Trong số các chủng nam, chủng 1 và chủng 4 là mối quan tâm lớn của thếgiới Hiện nay, các giống chuối Cavendish (Musa spp., AAA) chiếm khoảng 40 — 50 %tổng số chuối được trồng trên toàn thế giới, giống chuối này rất mẫn cảm với chủngnhiệt đới 4 (Foc TR4) va sự bùng phát toàn cầu của nắm bệnh này gây ra mối đe dọanghiêm trọng đối với ngành sản xuất chuối thế giới (Dale và ctv, 2017 )

1.4.4 Chu kỳ bệnh

2021) Các dang bao tử nam Foc (1), bao tử hậu nảy mam (2), bao tử xâm nhập vào rễ(3), bào tử xâm nhập vào mach dẫn (4), cây biéu hiện các triệu chứng bệnh (5), câyhéo hoàn toàn (6), phát tán mam bệnh (7): vật liệu trồng trọt (a), nước tưới (b), nước

chảy tràn (c), con người (d), côn trùng (e), cỏ dại (Ð

Chu kỳ bệnh bắt đầu khi bào tử hậu ở trong đất gặp các điều kiện thuận lợi nảy

mam va đâm xuyên vào rễ cây chủ qua các chỗ tốn thương Sau đó sợi nam sinh trưởng,

lan tới hệ xylem và tiễn dần lên phía trên thân củ rồi thân giả Các bào tử nhỏ được hìnhthành trong xylem và tiếp tục lan rộng trong hệ mạch cây chủ Ở giai đoạn tiếp theo, cácbảo tử nhỏ tiếp tục được hình thành trong mô mềm bao bó mạch và những mô khác củacây chủ Các bảo tử lớn xuất hiện vào giai đoạn muộn trên bề mặt lá, cuống lá và bẹ lá

của cây nhiễm bệnh Cả hai loại bao tử này theo dòng nước trong hệ xylem đi lên phía

trên cây và sinh trưởng ở đó Bào tử hậu có vách dày được tạo ra ngay trên hệ sợi hoặc

bào tử đính ở trong mô cây chủ vào giai đoạn cuôi của chu kỳ bệnh Bào tử hậu rât bên

9

và tồn tại thời gian đài trong đất hoặc trong các nguồn trung gian khác Khi gặp điềukiện thuận lợi, chúng tách ra và mọc các ống mầm xâm nhập vào rễ cây chủ qua các chỗton thương dé bắt đầu một chu kỳ mới (George, 1989).

1.4.5 Con đường lan truyền bệnh

Nam Foc là loại nam cư trú trong đất, chúng có thể tồn tại trong đất hơn 20 nămngay cả khi không có ký chủ thực vật (Ploetz, 2015) Nắm bệnh có thé lan truyền từ khuvực này sang khu vực khác bằng sự di chuyên của thân củ, cây con giống, đất bị nhiễmbệnh dính vào giày, đép, nông cụ canh tác như cuốc, xẻng và các máy móc nông nghiệp

(Ploetz, 2006) Ngoài ra, gió và nước cũng là tác nhân phat tán các loại bao tử đi xa tới

nơi chưa có mầm bệnh Việc sử dụng nguồn nước bị 6 nhiễm dé tưới và nước chảy tràn

từ các khu vực bị nhiễm bệnh sau mưa bão, lũ lụt là tác nhân lan truyền nguồn bệnhnhanh chóng (Pegg và ctv, 2019) Độ âm cao, nhiệt độ vừa phải, khả năng hấp thu các

chất dinh dưỡng trong đất của cây trồng là những điều kiện chính dẫn đến mầm bệnh

phát triển nhanh hơn (Singh, 2015).

1.5 Các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

1.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đây là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh (Ploezt,

2015) Người ta nhận thấy rằng sự phát triển của bệnh đạt tối ưu khi nhiệt độ đạt tối ưu

cho sự sinh trưởng của cây Phé nhiệt độ sinh trưởng của nam Foc rộng, nhiệt độ tối ưucho sự phát triển của nam Foc là 25 — 28°C, bị hạn chế ở nhiệt độ thấp hơn 17°C hoặccao hơn 33°C, ở nhiệt độ 5°C và 40°C nam Foc ngừng tăng trưởng (Nelson va ctv,

1991) Theo Olivares và ctv (2021), trong thời gian mùa đông và ở những vùng có độ

cao trên 700 m như Jamaica người ta nhận thấy bệnh phát triển rất chậm Ngược lại ởnhững vùng nhiệt đới sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho tình trạng thiếu nước ở cây, làm

tăng mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng bệnh cao hơn các vùng khác.

1.5.2 Ảnh hưởng của đất

Kha năng sinh trưởng và sông sót cua nam Foc ở dat cát nhẹ, axit cao hơn so với

vùng đất sét hoặc đất kiềm có hàm lượng Ca cao (Wardlaw, 1961) Một số công trình

10

nghiên cứu đã xác định một số tinh chất hóa học cụ thé của đất bao gồm độ pH và chathữu cơ, hàm lượng kali, phốt pho, nitơ và magie (ở mức độ dư thừa hoặc thiếu hụt) là

những yếu tố chính góp phan làm giảm tính nhạy cảm của cây chuối với nam Foc

(Segura và ctv, 2015) Trong nghiên cứu của Bosman (2016) đã cho thấy mối quan hệgiữa độ đốc trên đồng ruộng với tỷ lệ mắc bệnh héo vàng trong các đồn điền trồng chuối

ở Costa Rica, phát hiện ra rang sự lây lan của nam Foc sẽ dién ra nhanh hơn ở các sườndốc có nhiều xói mòn và đất mất chất dinh dưỡng so với các sườn dốc thoai thoải, nơi

phù sa tích tụ.

1.5.3 Ảnh hưởng của các nguyên tố dinh dưỡng

Theo Wardlaw (1961), ở Canary Islands người ta nhận thấy hàm lượng Zn thấp,

tỉ lệ Ca:Mg và K:Mg cao thì khả năng tan công của bệnh cao hơn Điều đó được giảithích rằng hàm lượng Zn thấp có liên quan đến giảm hình thành tyloza, trong khi tỉ lệCa:Mg và K:Mg có liên quan đến hình thành pectin của thành tế bao cây chủ Như vậy,

các yêu tố dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

1.6 Phòng trừ nắm Fusarium oxysporum f.sp cubense gay bệnh héo vàng trên chuối

già Nam Mỹ

Hiện nay, phương pháp kiểm soát bệnh bằng hóa chất được áp dụng rộng rãinhưng chưa mang lại hiệu quả, chi phí cao cũng như gây ô nhiễm môi trường Việc kiểmsoát bệnh bằng hóa chat trên chuối không thành công do nấm Foc tạo ra bào tử hậu có

thành dày, sống lâu trong đất, có khả năng chống lại việc trừ bệnh bằng hóa chat (Shi

và ctv, 1991) Do đó, một số biện pháp quản lý khác dé kiểm soát bệnh như luân canhcây trồng, kiểm soát sinh học được áp dụng

Luân canh cây trồng là một biện pháp quản lý có hiệu quả cao và thân thiện vớimôi trường để kiểm soát các mầm bệnh truyền qua đất Theo Han và ctv (2015) đãnghiên cứu ảnh hưởng của hệ thống luân canh dứa — chuối và ngô — chuối trong hai năm

đến mật độ của nam Foc trong đất Kết quả cho thấy luân canh đứa — chuối có tác dụng

làm giảm mật độ nam Foc và ngăn chặn tỷ lệ bệnh héo vàng trên chuối Việc quan lýlớp phủ mặt đất xung quanh gốc chuối được cho là một yếu tố quan trọng trong việcgiảm tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh héo vàng trên chuối (Pattison và

11

ctv, 2014) Theo Fortunato va ctv (2012), nghiên cứu đã đánh giá tác dung của Silic

trong việc giảm triệu chứng héo vàng trên cây chuối Kết quả của họ cho thấy rằng việc

cung cap Silic cho cây chuối, đặc biệt là giống man cảm với Foc, có tiềm năng lớn trong

việc giảm cường độ bệnh héo vàng trên chuỗi.

Hiện nay, phương án sử dụng giống kháng bệnh được cho là có hiệu quả và đangđược tiếp tục nghiên cứu Các phương pháp chọn lọc thông qua biến dị Soma hay tạogiống đột biến cũng đang được sử dụng dé tao ra kiểu gen kháng Ngoài ra, việc sử dụngnam có ich dé phòng trừ bệnh hai đã được nghiên cứu va áp dụng nhiều trên thé giới.Nam đối kháng Trichoderma spp là một trong những biện pháp sinh học quan trọngtrong phòng trừ bệnh nam dat (Harman va ctv, 2004) Song song với các biện phápphòng trừ một số yếu tổ liên quan đến sinh trưởng của cây và tác nhân gây bệnh cũng

cần được lưu ý như: tăng cường kiểm soát, hạn chế sự lây lan của bệnh sang những khu

vực chưa bị nắm bệnh ảnh hưởng bằng cách sử dụng nước tưới sạch, đồng thời vệ sinhgiày đép, công cụ canh tác đúng cách, sử dụng cây giống bằng nuôi cay mô tế bao, trồng

chuối trên đất trước đó chưa trồng chuối cũng có thé hạn chế được bệnh trong một thời

polymyxin, tyrotricidin, bacilysin, chlotetaine, mycobacillin, fungistatin và subsporin

có thé kiểm soát các bệnh cây trồng Trong đó, iturin va fengycin là hai lipopeptide phổbiến từ Bacillus sp được biết đến rộng rãi nhờ hoạt tính kháng nắm mạnh đối với một

số loại nam thực vật, có thé ức chế sự phát triển của nắm bằng cách nhắm mục tiêu vàothành tế bao và mảng tế bảo nam Một số nghiên cứu đã được công bố như Yadav và ctv(2021) đã phát hiện ra rang chủng Bacillus licheniformis CSR-D4 có ty lệ ức chế cao

(71,59%) đối với mam bệnh Foc TR4 trong thí nghiệm đối kháng kép, Beibei và ctv

(2016) đã phát hiện ra rằng Bacillus amyloliquefaciens chủng W19 ức chế bệnh

12

héo Fusarium trên chuối trong điều kiện nhà kính và ngoài đồng ruộng Những pháthiện nay chỉ ra tiềm năng to lớn của Bacillus sp trong việc quản lý bệnh héo trên chuối.

Theo Fan và ctv (2021), hai chủng vi khuẩn YN0904 và YN1419 thé hiện tínhđối kháng mạnh với Foc TR4 Bang cách xem xét các đặc điểm hình thái, phân tử, sinh

lý và sinh hóa, YN0904 được xác định là Bacillus amyloliquefaciens, YN1419 được xác

định là Bacillus subtillis Tỷ lệ ức chế TR4 của YN0904 và YN1419 lần lượt là 79,6%

và 81,3% Hiệu quả kiểm soát của YN0904 và YN1419 đối với Foc TR4 trong thínghiệm ngoài đồng ruộng lần lượt là 82,6% và 85,6% Từ kết quả nghiên cứu trên, Fan

va ctv (2021) đã kết luận rằng các chủng đối kháng tự nhiên có nguồn gốc từ các đồn

điền chuối địa phương ở Vân Nam, Trung Quốc có thé cung cấp các nguồn lực kiểm

soát sinh học mới cho bệnh héo vàng trên chuôi.

Theo Yuan va ctv (2012), Bacillus amyloliquefaciens NỊN-6 tạo ra các hợp chat

dé bay hơi ức chế sự phát triển và nay mầm bào tử của nắm Foc Trong tông số 36 hợpchất đễ bay hơi được phát hiện, có 11 hợp chất ức chế hoàn toàn sự phát triển của nắm

và ức chế sự nảy mầm của bào tử Hoạt tính kháng nắm của các hợp chất này mở ra khảnăng kiểm soát sinh học của Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 trong việc ngăn

chan nam Foc.

Bacillus amyloliquefacients được phan lập bởi Zhang va ctv (2014) cho thay hiéu

quả kiểm soát sinh học tốt đối với bệnh héo vàng trên chuối va chủng này có thé tạo ra

IAA và siderophone, thúc đây sự phát triển của cây chuối Trong một nghiên cứu gầnđây, Bacillus amyloliquefaciens được xác định có khả năng tạo ra các chất kháng sinhnhư bacteriocin, surfactin và fengycin, đồng thời được chứng minh là tác nhân kiêm soátsinh học rất mạnh chống lại nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm, cũng như cácchủng nam Fusarium oxysporum, Fusarium avenaceum và Mucor sp (Salazar va ctv,

2017).

Theo Đỗ Thi Tuyên va ctv (2017), hoạt tinh ức ché sinh truong nam Fusariumoxysporum va Rhizoctonia solani của dich nỗi Bacillus subtilis XL62 ty lệ thuận vớinong độ Ở nồng độ cao nhất (50%), khả năng ức chế tăng trưởng lần lượt đạt 90% và

100% đôi với Fusarium oxysporum va Rhizoctonia solani Hơn nữa, dịch nỗi của Ö.

13

subtilis XL62 cũng ức chế sự nảy mầm và phát triển của R solani Sự phát triển củahạch nam gần như bị ức chế hoàn toàn ở nồng độ 20% và khả năng nảy mam bị mat ở

nồng độ 50% Những kết quả này giúp mở ra cơ hội cho B subtilis XL62 trở thành tác

nhân tiềm năng thân thiện với môi trường dé kiểm soát bệnh nắm thực vật

1.7.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp

Pseudomonas là nhóm vi khuẩn cộng sinh hiện diện nhiều ở vùng rễ cây trồng

có kha năng tiết ra nhiều loại kháng sinh ức chế nhiều loại nam, vi khuẩn gây bệnh cónguồn gốc trong đất va là những tác nhân phòng trừ sinh học Vi khuẩn Pseudomonasaeruginosa, Pseudomonas florescens, Pseudomonas putida đều thuộc chi vi khuẩn pháthuỳnh quang (F/uorescent pseudomonas) và là nhóm vi khuan đối kháng với các mầmbệnh quan trọng trong dat (Palleroni, 1984) Chế phẩm từ Pseudomonas fluorescens đãđược công nhận sử dụng phòng trừ các bệnh do nam trên các loại cây trồng (Bộ Nôngnghiệp và Phát triển Nông thôn, 2020)

Theo Li va ctv (2022), nghiên cứu đã cho thay Pseudomonas aeruginosa

Gxun-2 có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của Foc TR4 Ching Gxun-Gxun-2 ức chế mạnh

mẽ sự phát triển sợi nam của Foc TR4 trên các đĩa nuôi cấy kép và tạo ra các nếp nhăn,

đứt gãy và biến dang sợi nắm trên môi trường nuôi cấy in vitro Cây chuối con được xử

lý trong chậu thí nghiệm bằng Gxun-2 trong nhà kính đã giảm được 84,21% bệnh hại.

từ những kết quả trên, nghiên cứu này đóng vai trò là nguồn tài nguyên quý giá liên quan

dén cơ chê kháng mâm bệnh của nam đôi với các tác nhân kiêm soát sinh học.

Theo nghiên cứu của Lê Thị Kim Thỏa (2023), vi khuẩn Pseudomonas sp chủngĐHT3 có khả năng đối kháng đối với Fusarium oxysporum với hiệu suất đối kháng55,42% tại thời điểm 5 NSC trong điều kiện phòng thí nghiệm Theo Huỳnh TrungChính (2023), kết quả nghiên cứu anh hưởng hợp chat bay hơi của 2 dong vi khuân CC

— LD 1.2 và ĐHT3 thuộc chi Pseudomonas sp đối với nam Fusarium oxysporum tạithời điểm 5 NSC cho thay dong ĐHT3 có hiệu suất đối khang cao nhất 72,9% va DHT3

có hiệu suất đối kháng 67% Ca 2 dong vi khuan CC — LD 1.2 va DHT3 đều có khả năng

lam biên dạng, thay đôi cau trúc của bảo tu nam Fusarium oxyporum.

14

Theo Chu Nguyên Thanh va ctv (2018), đã đánh giá kha năng kích thích tang

trưởng thực vật của 2 chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas phân lập từ vùng rễ cây

bắp Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 2 dòng vi khuẩn được khảo sát là những dòng vi

khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng thực vật, cho thấy tiềm năng ứng dụng củaPseudomonas trong thực hành nông nghiệp bền vững

1.7.3 Vi khuẩn Pantoea agglomerans

Pantoea agglomerans sản xuât một sô loại khang sinh như herbicolin, pantocin,

microcin, agglomerin, andrimid, phenazine có thê được sử dụng dé chong lại mâm bệnh

ở thực vật, động vật và con người hoặc đề bảo quản thực phẩm (Jacek và ctv, 2016)

Nhiều chủng Pantoea agglomerans có những đặc điểm thú vị cho việc thăm đòsinh học, bao gồm các lợi ích tiềm năng trong nông nghiệp như một tác nhân kiểm soát

sâu bệnh và mầm bệnh thực vật do có khả năng sản xuất kháng sinh, cơ chế cạnh tranh

hoặc gây ra tính kháng thực vật, là chất kích thích tăng trưởng thực vật, một nguồnenzyme va các protein khác cần thiết cho thực vat (Torres va ctv, 2013) Việc sử dung

nó như một tac nhân kiểm soát sinh hoc cho phép giảm liều lượng thuốc trừ sâu, thânthiện với môi trường Việc sử dụng các chế phẩm vi khuẩn này sẽ bảo vệ hiệu quả cácloại trái cây có múi chống lại sự xâm nhập của nấm mốc Các chủng Pantoeaagglomerans liên quan đến cả vùng rễ và mô thực vật (dưới dạng nội sinh) thúc đây hiệuquả sự phát triển của nhiều loại cây, bao gồm lúa và lúa mì, là lương thực chủ yêu chophần lớn nhân loại Các cơ chế thúc đầy rất đa dạng và bao gồm có định nitơ trong khíquyền, sản xuất phytohormones, cũng như phân hủy khả năng hòa tan phytate vàphotphat giúp tạo ra phốt pho trong đất có sẵn cho cây trồng, do đó Pantoeaagglomerans được coi là ứng cử viên lý tưởng cho chế phẩm sinh học thân thiện vớimôi trường thay thế phân bón hóa học (Jacek va ctv, 2016)

Pantoea agglomerans cũng đã được sử dụng như một sinh vật kiểm soát sinh học

dé quản ly các bệnh thực vật, chang hạn như bệnh thân cây nho do nắm Neofusicoccum

parvum gây ra (Haidar va ctv, 2021).

15

Kiểm soát vi khuẩn Ewinia amylovora gây bệnh thối lê bằng việc sử dụng vikhuẩn không mang gen độc là Pantoea agglomerans đã cho thay khả năng kiểm

soatmam bệnh trong suốt thời gian nở hoa ở điều kiện nhà kính (Stephen va ctv, 2013)

Theo Nunes và ctv (2001), trong tổng số 247 vi sinh vật được thử nghiệm, chỉ có2% vi sinh vật làm giảm hơn 50% tỷ lệ vết thương bị nhiễm trùng và giảm mức độ

nghiêm trọng của ton thương hon 75% Trong đó, Pantoea agglomerans CPA-2 được

công bố là hiệu quả nhất, được chọn dé nghiên cứu sâu hơn và cho thay kha năng bảo

vệ tuyệt vời chống lại các bệnh do 8ofryfis cinerea, Penicillium expansum và Rhizopus

stolonifer gây ra trên quả lê.

1.7.4 Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae

Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae thuộc họ Enterobacteriaceae là vi khuẩn gram

âm, không di động và thuộc loại là vi khuân ky khí không bắt buộc, thường xuất hiện tựnhiên trong đất, nước, gây bệnh cho người, động vật và một số xâm nhập vào cây trồng

và sống nội sinh trong cây (Podschun và ctv, 2001)

Theo nghiên cứu của Iniguez va ctv (2004), tất cả các chỉ tiêu cần thiết cho việcchứng minh khả năng có định đạm ở cây lúa mì (Triticum aestivum L.), cây trồng quantrọng nhất trên thế giới, được thể hiện khi cấy vi khuẩn cố định đạm, Klebsiellapneumoniae 342 (Kp342) Kp342 làm giảm các triệu chứng thiếu nito (N) và tăng nồngđộN vàN tổng số trong cây Quá trình có định đạm được xác nhận bằng cách pha loãngđồng vị 15N trong mô thực vật và trong sản phẩm thực vật, chất điệp lục Tất cả nhữngquan sát này đều trái ngược với cây không được cấy, cây được cay đột biến có định đạmKp342 và cây được cấy tế bào Kp342 đã chết Nitrogenase reductase được sản xuất bởiKp342 trong không gian bào của vỏ rễ Loại hoang dã Kp342 và đột biến nifH đã xâmchiếm phần bên trong của rễ lúa mì với số lượng bằng nhau trên cơ sở trọng lượng tươi

Theo nghiên cứu cua Liu va ctv (2011), Klebsiella pneumoniae NG14 được phân lập từ

bề mặt rễ lúa cho thay NG14 chứa gen nifH có hoạt tinh nitrogenase, hoạt tính có định15N2 và có khả năng cô định trên bề mặt rễ của cây lúa

Trong nghiên cứu của Waghmare và ctv (2014), vi khuân K/eösiella sp chủngPRW-1 có khả năng phân giải cenllulose và hemicellulyl ngoại bảo trên các chất nền

16

khác nhau Enzyme được sản xuất bởi K/ebsiella sp chủng PRW-1 cho thấy độ ôn định

về nhiệt độ và pH, điều này làm tăng khả năng ứng dụng của chủng vi khuan này Những

phát hiện của nghiên cứu này cho thấy tiềm năng hữu ích của Klebsiella sp chủng

PRW-1 dé điều chế nguyên liệu lignocellulose cho việc sản xuất năng lượng sinh học

Theo Kim va ctv (2022) nghiên cứu dé sàng lọc PGPR sản xuất 2,3-butanediol(BDO) dé kiểm soát bệnh héo xanh ca chua do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây

ra Trong tổng số 943 chủng vi khuẩn phân lập được từ đất, chủng Klebsiellapneumoniae JCK-2201 cho ra nồng độ 2,3-butanediol cao nhất, có hiệu quả kiểm soát

vi khuân héo xanh Ralstonia solanacearum lên dén 77%.

1.8 Vai tro của enzyme ngoại bào trong kiêm soát mầm bệnh

Hiện nay, PGPR được biết đến nhiều trong xu hướng phát triển nông nghiệp bền

vững Ngoài các cơ chế thúc day tăng trưởng thực vật một cách trực tiếp như cố định

đạm sinh học, hòa tan phosphate, sản xuất các phytohormone, nhiều PGPR còn có các

cơ chế gián tiếp như kiểm soát sinh học hay đối kháng sinh học thông qua việc sản xuấtcyanide, siderophore, kháng sinh và các enzyme phân giải Việc tiết ra enzyme phângiải bởi vi khuân đã được chứng minh là một trong những cơ chế kiểm soát sinh họcbệnh hại cây trồng Trên thế giới, hiện có nhiều công trình nghiên cứu trên đối tượngcác PGPR sở hữu cùng lúc khả năng đối kháng sinh học và phân giải sinh học Các

PGPR có khả năng sinh enzyme ngoại bào như protease, cellulase, chitinase, lipase đã

được phân lập và xác định đặc tính Nhiều chủng PGPR trong số đó được nhận diện như

là Alcaligenes faecalis, Bacillus sp., Bacillus licheniformis (Gupta va ctv, 2015).

Kha năng sản sinh enzyme chitinase là một trong những yếu tố quan trọng dékhảo sát khả năng kháng nắm của các đòng vi khuẩn bằng việc phân giải thành tế bàonắm Hoạt tính kháng nắm của vi khuẩn còn có thể liên quan đến sự tương tác giữa cácloại enzyme khác nhau Các vi sinh vật đối kháng hiện nay chủ yếu baogồm Bacillus sp va Pseudomonas sp., Streptomyces có khả năng ức ché các mầm bệnhthực vật của nắm chủ yếu thông qua việc tiết lipopeptide, protease và chitinase

Theo nghiên cứu của Chang và ctv (2007) đã chứng minh rằng sự hoạt động cùng

lúc của 2 enzyme chitinase va protease do Bacillus cereus QQ308 tạo ra có khả năng ức

17

chế hiệu quả sự phát triển của các loại nam gây bệnh như Fusarium oxysporum,

Fusarium solani và Pythium ultimum ở mức cao hơn so với từng enzyme riêng lẻ.

Theo Salazar và ctv (2022), nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết hợp cua hai loại vikhuẩn phân giải chitin Paenibacillus sp 300 va Streptomyces sp 385 có hiệu quả chống

lại Fusarium oxysporum gây héo dưa chuột hon so với các chúng riêng lẻ.

Nhiều nghiên cứu cho thấy sự tương quan giữa các enzyme với vách tế bao nam

bệnh như chitinase, cellulase với sự phát triển của nam bệnh, vi dụ như trong nghiên

cứu của Yap (2012) cho thấy bốn chủng Bacillus amyloliquefaciens, Bacillusatrophaeus, Bacillus subtilis và Bacillus vallismortis có khả năng sản xuất các enzyme

như cellulase, protease va ức chê các nam như Colletotrichum capsici, Fusarium solani.

18

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Đánh giá khả năng đối kháng của 16 dòng vi khuẩn với nam Foc TR4

Đánh giá tác động của 2 dòng vi khuân có hiệu suat đôi kháng cao đên sự nảy

mam bào tử nam Foc TR4

Đánh giá khả năng sinh enzyme chitinase, enzyme protease của 2 dong vi khuan

có hiệu suất đối kháng cao

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, KhoaNông học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

2.3 Vật liệu thí nghiệm

2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc

Dụng cụ: dia petri (đường kính 80 mm), bình tam giác, thước đo, ống fancol, ống

eppendoft, lam kính lõm, lame, dung cụ cấy

Các thiết bị máy móc: cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện Sunhouse, tủ cấy khửtrùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), máy hapkhử trùng (MC40L, ALP, Japan), lò vi sóng, máy ly tam HERMLE Z306, máy lắc(SSL1, Stuart, Anh), Máy Nanovue Plus (Anh), Máy lắc Vortex - ZX3 (Velp, ÝY

Hóa chất sử dụng: Đường Glucose, Peptone, Cao nắm men, Agar, NaNOa,

FeSOa.7H2O, MgSOu.7H20, KCl, K2HPO4, Casein, Chitosan, Glycerol.

19

Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar)

Thanh phan môi trường: Khoai tay (200 g), Agar (20 g), Đường Glucose (20 g),Nước cất (1000 ml) Hap khử tring ở 121°C trong 20 phút

Môi trường LB - Luria Broth

Thanh phan môi trường: Peptone (10 g), Cao nấm men 5 g, NaCl (10 g), Agar

(20 g), Nước cat (1000 ml) Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút

Môi trường MT1:

Thành phần môi trường: NaNO: (3,5 g), KzHPO¿ (1,5 g), FeSOx.7H2O (0,01 g),MgSO¡.7H¿O (0,5 g), KCI (0,5 g), Chitosan (10 g), Agar (20 g), Nước cất (1000 ml).Hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút

Môi trường MT2:

Thanh phần môi trường: K2HPOs (1,5 g), FeSO4.7H20 (0,01 g), MgSO4.7H20(0,5 g), KCI (0,5 g), Casein (15 g), Agar (20 g), Nước cat (1000ml) Hap khử tring ở

121°C trong 20 phút.

2.3.2 Vật liệu nghiên cứu

Nam Fusarium oxysporum f£.sp cubense (Foc TR4 chủng LA01) được cung cấp

từ phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ Thực vat, Khoa Nông hoc, Trường Dai hoc

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Hình 2.1 Nắm Foc TR4 trên môi trường PGA Mặt trên (A), mặt dưới (B)

20

Bang 2.1 Nguồn vi khuẩn đối kháng được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Bộ mônBảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.4.1.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nắm Foc TR4

bằng phương pháp cấy kép

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dong

vi khuẩn là 1 nghiệm thức (NT) và 1 NT đối chứng (ĐC), mỗi NT là 3 lần lặp lại (LLL),

mỗi LLL của 1 NT là 3 đĩa petri.

Cách tiến hành

Nắm Foc TR4

Vi khuẩn đối kháng

Hình 2.2 Bố trí vi khuan đối kháng với nam Foc TR4 trên dia petri

Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991): Sử dụngque cấy ria, cấy vi khuẩn thành 2 đường thang song song và cách vị trí đặt thạch nam

2,5 cm vào đĩa petri có sẵn PGA Sau đó, tiến hành cấy thạch nắm (đường kính 5 mm)

đã được nuôi trong 7 ngày vào tâm đĩa petri.

Chỉ tiêu theo doi:

Đo bán kính trung bình theo công thức:

r=(rl +1r2)/2

22

Trong đó:

rl, 12: Bán kính đo từ tâm đến phan tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn

Do bán kính tản nắm va tính hiệu suất đối kháng theo công thức của Moayedi và

ctv (2009).

AE (%) = (C-T)/Cx 100 Trong do:

AE: Hiệu suất đối kháng (%)

C: Bán kính tản nam tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm)

T: Bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng

(mm).

Đánh giá hiệu suất đối khang: theo thang đánh giá của Soytong (1988)

Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng rất cao

Hiệu suất đối kháng từ 61% — 75%: có khả năng đối kháng cao

Hiệu suất đối kháng từ 51% — 60%: có khả năng đối kháng trung bình

Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp

2.4.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn bằng phươngpháp cay kép, các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao và hiệu suất đối kháng trung

bình được chọn dé thực hiện thí nghiệm

Chuan bị huyền phù bao tử nắm

Nam Foc TR4 được nuôi cấy trên môi trường PGA trong 14 ngày ở nhiệt độphòng va dé trong bóng tối dé bào tử nấm hình thành nhanh chóng Sau 14 ngày thu

hoạch bào tử như sau: Lấy 10 mL nước cất đã khử trùng thêm vào đĩa petri, dùng lam

kính gạt nhẹ trên bề mặt nam dé bao tử nắm phân tán vào nước Lọc bằng giấy lọc đãkhử trùng dé loại bỏ sợi nam, thu huyền phù bao tử Xác định mật độ bào tử nam trong

23

huyền phù bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cau và điều chỉnh mật độ bào

tử đến 105 bao tử/mL

Công thức tính mật số bảo tử

D=5xaxnx10

Trong đó:

D: Số lượng bào tử trong 1 ml dung dịch (bào tử / ml)

a: Tổng số bao tử đếm được trong 5 ô lớn trong buồng đếm hồng cau

n: Nông độ pha loãng của dung dịch bào tử

Chuẩn bị dịch vi khuẩn:

Vi khuẩn được nuôi lắc trên môi trường LB lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng.Sau 48 giờ, do mật độ vi khuẩn bằng máy đo mật độ, huyền phù vi khuẩn được điềuchỉnh sao cho mật độ tế bao vi khuẩn đạt 108 CFU/mL

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoản toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng

vi khuẩn là 1 NT và 1 NT DC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL của 1 NT là 3 dia petri

Các bước tiến hành:

Thực hiện theo phương pháp khuếch tán giếng thạch đã được mô tả bởi Sharma

và ctv (2017) với một vài hiệu chỉnh: Dùng micropipet vô trùng hút 100 pL huyền phùbao tử nắm 105/mL cây vào dia petri chứa 20 ml môi trường PGA đã chuẩn bị sẵn Caytrang bang que cấy tam giác cho dich huyền phù bao tử nam trải đều bề mặt thạch Doi

20 - 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 5mmđục 1 lỗ thạch ở giữa tâm đĩa Dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn loại bỏ phần thạchvừa đục, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ đục Dùng micropipet

vô trùng hút 50 L dich vi khuẩn vào lỗ giếng vừa đục Các đĩa petri sau đó được phủkín bằng màng polyetylen và ủ ở nhiệt độ phòng

24

Nắm Foc TR4

Vi khuẩn đối kháng

Hình 2.3 Bồ trí vi khuẩn đối kháng nắm Foc TR4 trên dia petri

Đọc kết quả:

Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn được thể hiện thông qua vòng đối kháng sau

48 GSC được tính theo công thức của Azman và ctv (2017):

Kích thước vòng đối kháng (mm) = D - đ

Trong đó:

D là đường kính tương ứng của vòng đối kháng (mm)

d là đường kính lỗ giếng (mm)

Tính đối kháng được biểu hiện khi vòng đối kháng rộng hơn 2 mm

Đường kính vòng đối kháng < 5 mm: tính kháng yếu

Đường kính vòng đối kháng từ 5 đến 10 mm: tính kháng trung bình

Đường kính vòng đối kháng > 10 mm: tính kháng mạnh

2.4.2 Đánh giá tác động của dịch nỗi vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi và sự

nảy mầm bào tử nắm Foc TR4

Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn bằng phươngpháp khuếch tán đĩa thạch, các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao được chọn dé

thực hiện thí nghiệm.

2

Chuẩn bị dịch vi khuẩn

Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường LB lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độphòng Huyền phù vi khuẩn được điều chỉnh sao cho mật độ tế bao vi khuẩn đạt 10°CFU/mL Thu dich nỗi vi khuẩn bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút, trong 15 phút

Chuẩn bị huyền phù bào tử nắm: thực hiện tương tự như ở thí nghiệm 2.4.1.2

2.4.2.1 Đánh giá tác động của dịch nối vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi nim

Foc TR4

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dong

vi khuẩn là 1 NT và 1 NT ĐC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL là ba lam kính lõm

Cách tiến hành

Đánh giá tác động của dịch nổi các vi khuẩn đến sự phát triển của sợi nam FocTR4 được tiến hành theo phương pháp của Yun và ctv (2021) với một vài hiệu chỉnh

Cho 5 ul huyền phù bào tử nam Foc TR4 nồng độ 10° bao tử/ml lên lam kính lõm

có sẵn môi trường PGA đã tiệt trùng và làm nguội, đậy lame và ủ ở nhiệt độ phòng Sau

48 giờ tiến hành nhỏ dịch nổi của các dòng vi khuẩn lên lam kính lõm chứa sợi nam FocTR4 dang phát triển Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ, tiễn hành quan sát cácmau sợi nam Foc TR4 dưới kính hiển vi điện với độ phóng đại 40x

2.4.2.2 Đánh giá tác động của dịch noi vi khuẩn đến sự nảy mam bào tử nam Foc

TR4

Phương pháp bố tri thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoan toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng

vi khuẩn là 1 NT và 1 NT DC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL là ba lam kính lõm

Cách tiến hành

Đánh giá tác động của các vi khuan dén sự nay mam bao tử nam Foc TR4 được

tiến hành trên lam kính lõm theo phương pháp của Cronin va ctv (1996) có hiệu chỉnh

26