3.1 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nắm Foc TR4 trong điều kiện phòng thí nghiệm
3.1.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các vi khuẩn đối với nam Foc TR4 bằng phương pháp cấy kép
Ở thời điểm 1 NSC, các dòng vi khuẩn đều có khả năng ức chế sự phát triển của nam Foc TR4 ở nhiều mức độ khác nhau. Cụ thé là 2 nghiệm thức O — CC4 với BKTN là 6,08 mm và CC — LD 2.1 với BKTN là 6,2 mm khác biệt rất có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng (9,03 mm).
Ở thời điểm 2 NSC, nghiệm thức có BKTN thấp nhất là CC — FN 1.1 (10,28 mm) khác biết rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại và so với nghiệm thức đối chứng (16,58 mm). Tiếp theo là 5 nghiệm thức DHT3 (11,55 mm), CC — LD 1.2
(11,55 mm), DHT7 (11,65 mm), O — BT 1.2 (12,45 mm) , O - BT 3.2 (12,27 mm) cũng
khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại.
Ở thời điểm 3 NSC, khả năng ức chế của các dòng vi khuẩn thay đổi bat định.
Trong đó, nghiệm thức có bán kính thấp nhất là CC — FN 1.1 (12,05 mm) và nghiệm thức ĐHT3 (12,87 mm) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại và so với nghiệm thức đối chứng (25,33 mm).
Ở thời điểm 4 NSC, 2 nghiệm thức có BKTN thấp nhất là CCFN 1.1 (13,13 mm) và ĐHT3 (14,03 mm) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với nghệm thức các nghiệm thức còn lại và so với nghiệm thức đối chứng (32,02 mm).
Ở thời điểm 5 NSC, đã xác định được 2 dòng vi khuẩn có HSDK cao là CC — FN 1.1 là 65,17% với BKTN thấp nhất là 13,93 mm, HSĐK của dòng DHT3 là 62,08% với
30
BKTN là 15,17 mm khác biệt rất có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại va so với nghiệm thức đối chứng (40 mm). Tiếp theo đó là CC — LD 2.4 (57,29%), O —
CC4 (56,67%), CC — LD 1.2 (52,25%), KT - ĐDI (54,71%).
Như vay, tất cả 16 các dòng vi khuẩn đều có khả năng đối kháng với nam Foc TR4. Trong đó nổi bật 2 dòng có HSĐK cao trên 61% tại thời điểm 5 NSC là: CC — FN 1.1 (65,17%), ĐHT3 (62,08%), 4 dòng có HSĐK trung bình từ 51% đến 60% là CC —
LD 1.2 (52,25%), KT — ĐDI (54,71%), O — CC4 (56.67%), CC — LD 2.4 (57,29%).
Trong nghiên cứu của Lê Thị Kim Thỏa (2023), đã xác định ĐHT3 là dòng vi
khuẩn có hiệu suất đối kháng cao nhất (55,42%) với nắm Fusarium oxysporum trong 16 dòng vi khuẩn được nghiên cứu tại thời điểm 5 ngày sau cấy. Theo nghiên cứu của Nguyễn Anh Toàn (2023), dòng CC — LD 1.2 có hiệu suất đối kháng 53,16 % với nam Fusarium oxysporum trong 12 dong vi khuẩn được nghiên cứu tại thời điểm 6 ngày sau cấy. Từ kết quả thí nghiệm khả năng đối kháng trên có thể thấy được sự tương đồng của 2 dòng DHT3 và CC — LD 1.2 với kết quả nghiên cứu đã được Lê Thi Kim Thỏa và Nguyễn Anh Toàn công bố trước đó.
Theo nghiên cứu của Shen và ctv (2022) cũng đã chỉ ra rằng chủng vi khuan Bacillus siamensis Gxun-6 có khả năng đối kháng cao với nam Foc TR4, cho hiệu suất đối kháng 68,8% trong điều kiện phòng thí nghiệm, kết quả này tương tự với hiệu suất đối kháng của vi khuẩn thuộc chi Bacillus dong CC — FN 1.1 (65,17%).
Trong nghiên cứu của Li va ctv (2022) cho thấy chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Gxun-2 đã ức chế đáng kề sự phát triển của Foc TR4 với hiệu lực ức chế đôi khi đạt tới 75,25%. Kết quả này cho thấy chủng Gxun-2 có khả năng đối kháng cao với Foc TR4, tương tự với kết quả đối kháng của vi khuẩn chi Pseudomonas dòng DHT3
(62,08%).
Theo Yu và ctv (2016), Bacillus subtilis B25 được phân lập từ đất vùng rễ chuối ở Hải Nam, là một ví dụ về vi khuẩn đối kháng hiệu quả khi có khả năng đối kháng mạnh với nam Foc. Kết quả nghiên cứu của Yu va ctv (2016) công bố có sự tương đồng với vi khuẩn Bacillus subtilis dòng KT — ĐDI khi đối kháng với nam Foc TR4 với hiệu suất đối kháng là 54,71%.
31
Bang 3.1 Bán kính tản nam Foc TR4 và hiệu suất đối kháng (HSĐK) của 16 dong vi khuẩn đối với nắm Foc TR4 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
NT BKTN (mm) HSĐK (%) INSC 2NSC 3 NSC 4 NSC 5 NSC 5 NSC CC-ENI11 6,58cd 10,28h 12,05 j 13,13 4 13,931 65,17a
DHT3 8,22 b 11,55 g 12,87] 14,03 ] 15,17 hi 62,08 ab CC-LĐ2.4 547ab 1442bed 164fgh 16,75hi 17,08 gh 57,29 be O-CC4 6,08 d 13,87 de 15,85hi 16,371 17,33 g 56,67 bed KT -DD1 8,1b 14,47 bed 16,65e-h 17,23 ghi 18,12 fg 54,71 cde CC-LĐ1.2 6,92¢ 11,55 g 14,63 1 17,42 ghi 19,lefg 52,25 c-f O-BT 3.1 6,47cd 14,03 d 17,28 d-g 18,68e-h 19,68ef 50,79 def SL - DL3 8,42 ab 15,2 be 17,87 de 18,8efg 19,85ef 50,38 def O-BT 1.2 §35ab 12,45fg 15,77hi 18,05 fi 20,15ef 49,63 ef DHT7 6,78 cd 11,65 g 14,971 18,32 f-1 20,25ef 49,38 ef O-DT3 6,6 cd 14d 17,62 def 19,63 ef 20,87e 47,83 f DXT6 8,72ab 15,42b 19,65 ¢ 20,33 e 21,15 e 47,13 O -BT 3.2 632cd 12,27fg 15,97 ghi 19,93ef 23,75d 40,63 g CC —- ĐT3 622cd 12,97ef 18,08d 22,53 d 26c 35g CC-LĐ2.1 6,2cd 13,8 de 21,2b 23,376 32,82 b 17,96h DXT1 6,7 cd 14,28cd 21,7b 27,6 b 34,77b 13,08 1 DC 9,03 a 16,58 a 25,33 @ 32,02 a 40a
CV (%) 4,04 3,12 3,4 4,06 3,97 3,44 Y nghia 2K 3k 3k 2K 2K 2K
Trong cùng một cội, các giá trị có cùng ki tự theo sau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. NSC:
Ngày sau cây. BKTN: Bán kính tản nam. HSĐK: Hiệu suất doi kháng. DC: Đối chứng. **: Khác biệt
có ý nghĩa thông kê ở mức 0,01. Các giá trị cột HSĐK đã được biên đôi dưới dạng Arsin. Các giá tri trên bảng là giá trị trung bình.
32
3.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của 6 dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Kết quả thể hiện qua Bảng 3.2 cho thấy tại thời điểm 48 giờ sau cấy, có 2 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nam Foc TR4 trong 6 dòng vi khuẩn thí nghiệm. Trong đó, đòng CC — FN 1.1 có kích thước vòng đối kháng trung bình là 10,68 mm và đòng ĐHT3 có kích thước vòng đối kháng trung bình là 10,04 mm, khác biệt rất
33
có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại và nghiệm thức đối chứng. Dòng CC
—LD 2.4 có kích thước vòng đối kháng là 6,53 mm, có khả năng đối kháng trung bình.
Các dong O ~ CC4, KT —DD1, CC — LÐ 1.2 không có khả năng đối kháng với nam Foc TR4, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng.
Từ kết quả nghiên cứu khả năng đối kháng nam Foc TR4 của 2 dòng vi khuẩn CC - FN 1.1 và DHT3 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch cho thấy rang sự ức chế nam Foc TR4 của 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 có thé đo các chất chuyên hóa kháng nắm được sinh ra và khuếch tán trong môi trường thạch. Chính vì vậy, sau khi xác định khả năng đối kháng, 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và DHT3 được tiến hành nghiên cứu sâu hơn tìm hiểu sự ảnh hưởng của địch nổi vi khuẩn sau ly tâm đến sự phát
triên của hệ sợi va sự nảy mâm của bao tử nam Foc TR4.
Bảng 3.2 Hoạt tính đối kháng của 6 dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 thể hiện qua kích thước vòng đối kháng
NT Kích thước vòng đối kháng (mm)
CC - EFN 1.1 10,68 a ĐHT3 10,04b CC - LÐ 2.4 6,53 c
O-CC4 0,0d KT -DD1 0,0 d CC - LÐ 1.2 0,0 d DC 0,0 d
CV 6,39
Y nghia =
Trong cùng một cột, các giá trị có cùng ki tự theo sau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. ĐC:
Doi chứng. **: Khác biệt có ý nghĩa thông kê ở mức 0,01. Các giá trị trên bang là giá trị trung bình.
34
3.2 Đánh giá tac động của dịch nỗi 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 đến sự phát triển của hệ sợi và sự nảy mầm bao tử nam Foc TR4
3.2.1 Đánh giá tác động của dịch nỗi 2 dong vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 đến sự phát triển của hệ sợi nam Foc TR4
Kết quả quan sát Hình 3.3 cho thấy hình thái sợi nam Foc TR4 ở 2 nghiệm thức có bồ sung dịch nổi vi khuẩn là CC — FN 1.1 và ĐHT3 sau 72 giờ đều có sự bat thường.
Cụ thé, sợi nam Foc TR4 ở cả 2 nghiệm thức CC — FN 1.1 va ĐHT3 đều bị biến dạng, sợi nam quan rut, méo mó và teo lại hoặc phan thân sợi nam hình thành các mau lồi bi thắt nút và trương phình ra, sợi nắm xuất hiện nhiều vách ngăn hơn so với mẫu đối chứng có hình thái sợi nắm phát triển bình thường. Từ những quan sát trên có thể chứng minh rằng dịch nổi sau ly tâm của 2 dòng vi khuân CC — FN 1.1 và ĐHT3 có chứa các hoạt chat kháng nam có thé ức chế sự phát triển của sợi nam Foc TR4 và làm biến dang hình thái sợi nam Foc TR4.
kho
Theo nghiên cứu của Yun va ctv (2021), chủng xạ khuan Streptomyces sp. 5-10 có khả năng phá hủy cấu trúc của sợi nam Foc TR4, sợi nắm trở nên nhăn nheo và vỡ ra. Khi tién hành phân tích sâu hơn ảnh hưởng của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. 5- 10 đến sợi nam Foc TR4 có thé thấy được các sợi nam Foc TR4 đều bị phân hủy. Từ kết quả nghiên cứu trên, Yun và ctv (2021) đã kết luận rằng chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. 5-10 có khả năng sản sinh ra các hoạt chat kháng nam có thé ức chế sự phát triển của sợi nắm Foc TR4. Kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trên có sự tương đồng với kết quả nghiên cứu của Yun và ctv (2021) khi thực hiện cùng một phương pháp, sợi nam ở 2 nghiệm thức thí nghiệm CC - FN 1.1 và ĐHT3 có biểu hiện nhăn
nheo và xuât hiện nhiêu vách ngăn hơn so với đôi chứng.
Theo Wang và ctv (2022), hợp chất Cl4-iurn A do vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens NCPSJ7 tiết ra sau khi được tinh sạch có thể làm thành tế bào va màng tế bào nam Fusarium oxysporum f.sp. niveum bị phá hủy ở các mức nồng độ khác nhau. Từ kết quả quan sát SEM sau 6 giờ cho thấy sợi nắm ở mẫu đối chứng dày đặc và hình thái bề mặt sợi nam nhẫn nhụi. Ngược lại ở các mẫu thí nghiệm sợi nắm bị biến dạng ở các mức nồng độ C14-iturin A tinh sạch khác nhau chẳng hạn như bề mặt sợi nam gồ ghé và không đồng đều, hiện tượng sợi nấm méo mó, teo lại hoặc sung to xảy ra cục bộ. Hình thái sợi nắm thay đổi nghiêm trọng hơn sau 24 giờ, sợi nắm mỏng hon
36
và biến dạng co ngót cũng trở nên trầm trọng hơn. Kết quả thí nghiệm trên cho thấy biểu hiện của hệ sợi nam có dịch nổi sau ly tâm của chi Bacillus dòng DHT3 có sự tương đồng với kết quả nghiên cứu đã được công bố của Wang va ctv (2022).
3.2.2 Đánh giá tác động của dịch nỗi 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 đến sự nảy mam bào tử nam Foc TR4
Kết quả đánh giá hiệu lực ức chế nảy mam của bao tử nam Foc TR4 của 2 dòng vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 được trình bảy ở Bang 3.3, nhìn chung 2 nghiệm thức có bồ sung dịch nồi vi khuẩn sau ly tâm đều có hiệu quả ức chế sự nảy mam của bào tử, cho kết quả khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng.
Tại thời điểm 12 GSC các bao tử nam Foc TR4 ở nghiệm thức đối chứng đã nảy mam. Nghiệm thức CC — FN 1.1 đạt hiệu lực ức chế nảy mầm 94,22%. Trong khi đó nghiệm thức ĐHT3 đạt hiệu lực ức chế nay mầm 89,79% khác biết rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng.
Đáng chú ý tại thời điểm 24 GSC, các bào tử ở nghiệm thức đối chứng đã nảy mam hoan toàn thành sợi nắm. Trong khi đó, 2 nghiệm thức CC — FN 1.1 và DHT3 không có thêm bảo tử nảy mầm, hiệu lực ức chế nảy mầm lần lượt là 94,33% và 90%, khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng.
Bảng 3.3 Hiệu lực ức chế (%) của 2 dong vi khuẩn đến sự nảy mam của bào tử nắm Foc TR4 qua các thời điểm theo dõi
NT Hiệu lực ức chế (%)
12 GSC 24 GSC ĐHT3 89,79 a 90a CC —FN 1.1 94,22 a 94,33 a ĐC 0,0b 0,0b CV 4,95 4,73
Y nghia lo MP
Trong cùng một cội, các giá trị có cùng kí tự theo sau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thông kê. GSC:
Giờ sau cây. DC: Đôi chứng. **: Khác biệt có ý nghĩa thông kê ở mic 0,01. Các giá trị trên bang là giá trị trung bình.
37
Hình 3.4 Bào tử nắm Foc TR4 12 GSC. Đối chứng (A), dòng DHT3 (B), dong CC —
FN 1.1(C)
Kết quả Hình 3.4 va Hình 3.5 cho thấy, 2 nghiệm thức bồ sung dich nổi vi khuẩn sau ly tâm cho thay sự thoái hóa trong hình thái bảo tử nam so với nghiệm thức đối chứng, bao tử bị teo mảnh, một số bào tử bị đen hoặc bào tử bị sưng to, phát triển chậm với ống mầm trương phình. Ngược lại, 100% bao tử nảy mam với hình thái bình thường ở nghiệm thức đối chứng.
38
Sự hình thành sợi nắm và nảy mầm của bào tử rất quan trọng đối với sự lây nhiễm nam Foc TR4 trên cây chuối. Từ những quan sát trên cho thay rang dịch nổi vi khuẩn sau ly tâm của 2 dong vi khuẩn CC — FN 1.1 và ĐHT3 có thé chứa hợp chất kháng nam, tác động tích cực đến việc làm giảm khả năng lây nhiễm của nam Foc TR4 trên chuối bằng cách làm biến dạng bào tử và ức chế sự nảy mam bào tử Foc TR4.
Theo nghiên cứu của Đinh Trường Sơn và ctv (2022) cũng cho kết quả tương tự khi các mẫu bao tử của nam Foc TR4 được xử lý bằng địch nuôi của chủng xạ khuẩn Streptomyces diastatochromogenes VNUA27 cho thay một tỉ lệ lớn bào tử không nảy mam, tỉ lệ ức chế nảy mam bao tử là 82,42%.
Theo nghiên cứu của Singh và ctv (2021), vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens S185 tiết ra hoạt chat iturin AS có khả năng đối kháng mạnh với nam Foc. Sau khi tinh sạch, iturin A5 có tác dụng ức chế sự nảy mam bao tử nam Foc, so với ty lệ nảy mam 100% của mẫu đối chứng, tỷ lệ nảy mầm khi có 62,5 pg/mL iturin AS giảm xuống còn 66% va 37% khi có 125 g/mL iturin AS. Hơn nữa các ống mam có hình thái bị biến dạng đáng kế như đầu ống mam trương phinh lên.
3.3 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase, protease của 2 dòng vi khuẩn CC —
FN 1.1 và DHT3
Dựa vào kết quả Bảng 3.4 cho thấy cả 2 dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng
hợp enzyme chitinase. Trong đó, ĐKVPG chitinase ở nghiệm thức CC — FN 1.1 là 14,68
mm được xếp vào nhóm có hoạt tính rất mạnh khác biết rất có ý nghĩa về thống kê so với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức ĐHT3 có ĐKVPG là 10,59 mm được xếp vào nhóm có hoạt tính khá mạnh. So sánh với kết quả của Huỳnh Trung Chính (2023), dòng ĐHT3 có DKVPG enzyme chitinase cao hơn 1,39 mm. Điều này cho thay 2 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng cao với nam Foc TR4 đều tiết enzyme chitinase dé phân giải chitin. Vì chitin là một thành phan quan trọng trong cấu tạo thành tế bào nam Foc TR4. Kha năng sản sinh enzyme chitinase là một trong những yếu tổ quan trọng dé khảo sát khả năng kháng nam của các dòng vi khuẩn bằng việc phân giải thành tế bao nam Foc TR4. Kết quả nghiên cứu trên cho thay khả năng sinh enzyme chitinase của 2 dòng
39
vi khuẩn CC - FN 1.1 và ĐHT3 ở mức cao là tương đồng với kha năng đối kháng của 2 dòng vi khuẩn đã được khảo sát ở thí nghiệm trước đó.
Kết quả khảo sát khả năng sản sinh enzyme protease cho thay ĐKVPG enzyme protease ở nghiệm thức ĐHT3 là 11,83 mm có hoạt tính enzyme mạnh khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức CCFN 1.1 (9,5 mm) và nghiệm thức đối chứng. So sánh với kết quả của Huỳnh Trung Chính (2023), dòng ĐHT3 có ĐKVPG thấp hơn 2,67 mm. Từ kết quả trên cho thấy, 2 dòng vi khuẩn đều có khả năng phân giải protein. Vì vậy enyzme protease được tiết ra từ 2 dong vi khuan đối kháng cũng có khả năng phân giải thành tế bao nam Foc TR4.
Theo Jadhav va ctv (2017), enzyme protease cùng với enzyme có vai trò phân giải chitin như chitinase được xem là các enzyme chịu trách nhiệm chính trong kha năng
đối kháng nam của vi khuẩn. Trên thế giới đã có nhiều công bố về khả năng kháng nam
của chitinase từ các vi sinh vật khác nhau: chitinase từ loài Apergillus terrus có khả năng
kháng 7 loại nắm gây bệnh thực vật với mức độ khác nhau, trong đó hoạt tính thể hiện mạnh nhất đối với Aspergillus niger và yêu nhất đối với Fusarium oxysporum (Aida và ctv, 2014). Theo Liu va ctv (2010), chitinase từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis colmeri có thé ức chế một cách hiệu quả sự phát triển của nhiều mầm bệnh thực vat, bao gồm
Rhizoctonia solani, Botrytis cinerae, Penicillium chrysogenum, Physalospora piricola.
Bang 3.4 Đường kính vòng phân giải enzyme của 2 dòng vi khuẩn sau 72 GSC
NT DKVPG (mm) Chitinase Protease
CCEN 1.1 14,68 a 95b DHT3 10,59 b 11,83 a DC 0,0 c 0,0¢
CV (%) 5,47 9,85
Y nghia = ila
Trong cùng một cội, các giá tri có cùng ki tự theo sau thì sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
ĐKVPG: Đường kinh vong phân giải. ĐC: Đối chứng. **: Khác biệt có ý nghĩa tong kê ở mức 0,01.
Các giá trị trên bang là giá trị trung bình.
40
4I