2.1 Nội dung nghiên cứu
Đánh giá khả năng đối kháng của 16 dòng vi khuẩn với nam Foc TR4.
Đánh giá tác động của 2 dòng vi khuân có hiệu suat đôi kháng cao đên sự nảy
mam bào tử nam Foc TR4.
Đánh giá khả năng sinh enzyme chitinase, enzyme protease của 2 dong vi khuan có hiệu suất đối kháng cao.
2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 5 năm 2023 đến tháng 11 năm 2023.
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
2.3 Vật liệu thí nghiệm
2.3.1 Dụng cụ, thiết bị máy móc
Dụng cụ: dia petri (đường kính 80 mm), bình tam giác, thước đo, ống fancol, ống eppendoft, lam kính lõm, lame, dung cụ cấy.
Các thiết bị máy móc: cân điện tử (PX224, Ohaus, Mỹ), bếp điện Sunhouse, tủ cấy khử trùng (IIAC2 — 4E8, Esco, Singapore), kính hiển vi (CX23, Olympus, Japan), máy hap khử trùng (MC40L, ALP, Japan), lò vi sóng, máy ly tam HERMLE Z306, máy lắc (SSL1, Stuart, Anh), Máy Nanovue Plus (Anh), Máy lắc Vortex - ZX3 (Velp, ÝY.
Hóa chất sử dụng: Đường Glucose, Peptone, Cao nắm men, Agar, NaNOa,
FeSOa.7H2O, MgSOu.7H20, KCl, K2HPO4, Casein, Chitosan, Glycerol.
19
Môi trường PGA (Potato — Glucose — Agar)
Thanh phan môi trường: Khoai tay (200 g), Agar (20 g), Đường Glucose (20 g), Nước cất (1000 ml). Hap khử tring ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường LB - Luria Broth
Thanh phan môi trường: Peptone (10 g), Cao nấm men 5 g, NaCl (10 g), Agar (20 g), Nước cat (1000 ml). Hap khử trùng ở 121°C trong 20 phút
Môi trường MT1:
Thành phần môi trường: NaNO: (3,5 g), KzHPO¿ (1,5 g), FeSOx.7H2O (0,01 g), MgSO¡.7H¿O (0,5 g), KCI (0,5 g), Chitosan (10 g), Agar (20 g), Nước cất (1000 ml).
Hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút.
Môi trường MT2:
Thanh phần môi trường: K2HPOs (1,5 g), FeSO4.7H20 (0,01 g), MgSO4.7H20 (0,5 g), KCI (0,5 g), Casein (15 g), Agar (20 g), Nước cat (1000ml). Hap khử tring ở
121°C trong 20 phút.
2.3.2 Vật liệu nghiên cứu
Nam Fusarium oxysporum f£.sp. cubense (Foc TR4 chủng LA01) được cung cấp
từ phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ Thực vat, Khoa Nông hoc, Trường Dai hoc
Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Hình 2.1 Nắm Foc TR4 trên môi trường PGA. Mặt trên (A), mặt dưới (B)
20
Bang 2.1 Nguồn vi khuẩn đối kháng được cung cấp từ phòng thí nghiệm của Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
STT Dòng vi khuẩn Chi*
1 CC—-LD1.2 Pseudomonas sp.
2 CC-—LD2.1 Pseudomonas sp.
3 CC-LD2.4 — Bacillus amyloliquefaciens
4 O-BT 1.2 Pantoea agglomerans
5 OBT 3.1 Bacillus sp.
6 DXT6 Bacillus amyloliquefaciens
dị CC-FNI.I Bacius sp.
8 O-DT3 Bacillus sp.
9 KT- ĐDI Bacillus subtilis
10 O-BT 3.2 Pseudomonas sp.
11 ĐXTI Klebsiella pneumoniae
12 SL-DL3 Bacillus sp.
13 DHT7 Pseudomonas sp.
14 O—CC4 Bacillus sp.
15 CC - DT3 Pseudomonas sp.
16 DHT3 Pseudomonas sp.
*: định danh bang đặc điểm sinh hóa
21
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 trong điều kiện phòng thí nghiệm
2.4.1.1 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nắm Foc TR4 bằng phương pháp cấy kép
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dong vi khuẩn là 1 nghiệm thức (NT) và 1 NT đối chứng (ĐC), mỗi NT là 3 lần lặp lại (LLL), mỗi LLL của 1 NT là 3 đĩa petri.
Cách tiến hành
Nắm Foc TR4
Vi khuẩn đối kháng
Hình 2.2 Bố trí vi khuan đối kháng với nam Foc TR4 trên dia petri
Thực hiện thí nghiệm theo phương pháp cấy kép (Ferreira và ctv, 1991): Sử dụng que cấy ria, cấy vi khuẩn thành 2 đường thang song song và cách vị trí đặt thạch nam 2,5 cm vào đĩa petri có sẵn PGA. Sau đó, tiến hành cấy thạch nắm (đường kính 5 mm)
đã được nuôi trong 7 ngày vào tâm đĩa petri.
Chỉ tiêu theo doi:
Đo bán kính trung bình theo công thức:
r=(rl +1r2)/2
22
Trong đó:
rl, 12: Bán kính đo từ tâm đến phan tản nắm phân bồ theo hướng vi khuẩn.
Do bán kính tản nắm va tính hiệu suất đối kháng theo công thức của Moayedi và
ctv (2009).
AE (%) = (C-T)/Cx 100
Trong do:
AE: Hiệu suất đối kháng (%).
C: Bán kính tản nam tương ứng ở nghiệm thức đối chứng (mm).
T: Bán kính tan nắm tương ứng ở nghiệm thức có chủng vi khuẩn đối kháng
(mm).
Đánh giá hiệu suất đối khang: theo thang đánh giá của Soytong (1988).
Hiệu suất đối kháng > 75%: có khả năng đối kháng rất cao.
Hiệu suất đối kháng từ 61% — 75%: có khả năng đối kháng cao.
Hiệu suất đối kháng từ 51% — 60%: có khả năng đối kháng trung bình.
Hiệu suất đối kháng < 50%: có khả năng đối kháng thấp.
2.4.1.2 Đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn đối với nam Foc TR4 bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch
Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp cay kép, các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao và hiệu suất đối kháng trung bình được chọn dé thực hiện thí nghiệm.
Chuan bị huyền phù bao tử nắm
Nam Foc TR4 được nuôi cấy trên môi trường PGA trong 14 ngày ở nhiệt độ phòng va dé trong bóng tối dé bào tử nấm hình thành nhanh chóng. Sau 14 ngày thu hoạch bào tử như sau: Lấy 10 mL nước cất đã khử trùng thêm vào đĩa petri, dùng lam kính gạt nhẹ trên bề mặt nam dé bao tử nắm phân tán vào nước. Lọc bằng giấy lọc đã khử trùng dé loại bỏ sợi nam, thu huyền phù bao tử. Xác định mật độ bào tử nam trong
23
huyền phù bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cau và điều chỉnh mật độ bào tử đến 105 bao tử/mL.
Công thức tính mật số bảo tử
D=5xaxnx10
Trong đó:
D: Số lượng bào tử trong 1 ml dung dịch (bào tử / ml).
a: Tổng số bao tử đếm được trong 5 ô lớn trong buồng đếm hồng cau.
n: Nông độ pha loãng của dung dịch bào tử.
Chuẩn bị dịch vi khuẩn:
Vi khuẩn được nuôi lắc trên môi trường LB lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng.
Sau 48 giờ, do mật độ vi khuẩn bằng máy đo mật độ, huyền phù vi khuẩn được điều chỉnh sao cho mật độ tế bao vi khuẩn đạt 108 CFU/mL.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoản toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng vi khuẩn là 1 NT và 1 NT DC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL của 1 NT là 3 dia petri.
Các bước tiến hành:
Thực hiện theo phương pháp khuếch tán giếng thạch đã được mô tả bởi Sharma và ctv (2017) với một vài hiệu chỉnh: Dùng micropipet vô trùng hút 100 pL huyền phù bao tử nắm 105/mL cây vào dia petri chứa 20 ml môi trường PGA đã chuẩn bị sẵn. Cay trang bang que cấy tam giác cho dich huyền phù bao tử nam trải đều bề mặt thạch. Doi 20 - 30 phút cho bề mặt thạch khô, dùng ống thép vô trùng đường kính khoảng 5mm đục 1 lỗ thạch ở giữa tâm đĩa. Dùng que cấy vô trùng có mũi nhọn loại bỏ phần thạch vừa đục, tránh làm vỡ hoặc chạm vào bề mặt thạch xung quanh lỗ đục. Dùng micropipet vô trùng hút 50 L dich vi khuẩn vào lỗ giếng vừa đục. Các đĩa petri sau đó được phủ kín bằng màng polyetylen và ủ ở nhiệt độ phòng.
24
Nắm Foc TR4
Vi khuẩn đối kháng
Hình 2.3 Bồ trí vi khuẩn đối kháng nắm Foc TR4 trên dia petri
Đọc kết quả:
Hoạt tính đối kháng của vi khuẩn được thể hiện thông qua vòng đối kháng sau
48 GSC được tính theo công thức của Azman và ctv (2017):
Kích thước vòng đối kháng (mm) = D - đ
Trong đó:
D là đường kính tương ứng của vòng đối kháng (mm).
d là đường kính lỗ giếng (mm).
Tính đối kháng được biểu hiện khi vòng đối kháng rộng hơn 2 mm Đường kính vòng đối kháng < 5 mm: tính kháng yếu.
Đường kính vòng đối kháng từ 5 đến 10 mm: tính kháng trung bình.
Đường kính vòng đối kháng > 10 mm: tính kháng mạnh.
2.4.2 Đánh giá tác động của dịch nỗi vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi và sự nảy mầm bào tử nắm Foc TR4
Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, các dòng vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao được chọn dé
thực hiện thí nghiệm.
2
Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường LB lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng. Huyền phù vi khuẩn được điều chỉnh sao cho mật độ tế bao vi khuẩn đạt 10°
CFU/mL. Thu dich nỗi vi khuẩn bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút, trong 15 phút.
Chuẩn bị huyền phù bào tử nắm: thực hiện tương tự như ở thí nghiệm 2.4.1.2
2.4.2.1 Đánh giá tác động của dịch nối vi khuẩn đến sự phát triển của hệ sợi nim
Foc TR4
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dong vi khuẩn là 1 NT và 1 NT ĐC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL là ba lam kính lõm.
Cách tiến hành
Đánh giá tác động của dịch nổi các vi khuẩn đến sự phát triển của sợi nam Foc TR4 được tiến hành theo phương pháp của Yun và ctv (2021) với một vài hiệu chỉnh.
Cho 5 ul huyền phù bào tử nam Foc TR4 nồng độ 10° bao tử/ml lên lam kính lõm có sẵn môi trường PGA đã tiệt trùng và làm nguội, đậy lame và ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ tiến hành nhỏ dịch nổi của các dòng vi khuẩn lên lam kính lõm chứa sợi nam Foc TR4 dang phát triển. Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ, tiễn hành quan sát các mau sợi nam Foc TR4 dưới kính hiển vi điện với độ phóng đại 40x.
2.4.2.2 Đánh giá tác động của dịch noi vi khuẩn đến sự nảy mam bào tử nam Foc
TR4
Phương pháp bố tri thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoan toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng
vi khuẩn là 1 NT và 1 NT DC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL là ba lam kính lõm.
Cách tiến hành
Đánh giá tác động của các vi khuan dén sự nay mam bao tử nam Foc TR4 được
tiến hành trên lam kính lõm theo phương pháp của Cronin va ctv (1996) có hiệu chỉnh.
26
Dùng 20 pl môi trường PGA sau khi tiệt trùng, làm nguội và phối trộn với dich nổi vi khuân cho vào phan lõm của lam kính. Dé yên 15 phút, tiếp tục cho 5 pl huyền phù bào tử nam Foc TR4 nồng độ 10° bào tử/ml lên lam, đậy lam kính và ủ trong bóng tối. Tiến hành quan sát bao tử dưới kính hiển vi điện với độ phóng đại 40x, xác định số bảo tử nảy mầm sau 12 giờ, 24 giờ. Một bào tử được xem là đã nảy mầm khi chiều dài ống mam xuất hiện dài hơn chính nó.
Chỉ tiêu theo dõi:
Hiệu lực ức chế sự nảy mam của bao tử (PSGI) được tính theo công thức của
Gemeda & ctv (2014)
PSGI = Sc — S/Scx100
Trong đó:
S‹ là số lượng trung bình bào tử nay mam trong nghiệm thức đối chứng.
St là số lượng trung bình bào tử nảy mam ở nghiệm thức thí nghiệm.
2.4.3 Khao sát kha năng sinh enzyme chitinase, protease của các dòng vi khuan Từ kết quả đánh giá khả năng đối khang của các dòng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, các dong vi khuẩn có hiệu suất đối kháng cao được chọn dé
thực hiện thí nghiệm.
2.4.3.1 Khao sát kha nang sinh enzyme chitinase của các dòng vi khuan Chuan bị dich vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường MTI lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng. Huyền phù vi khuan được điều chỉnh sao cho mật độ tế bào vi khuẩn đạt 108
CFU/mL.
Phương pháp bố tri thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi dòng vi khuẩn là 1 NT và 1 NT DC, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL của 1 NT là 1 đĩa petri.
27
Cách tiến hành
Thực hiện theo phương pháp của Tamrela va ctv (2021) có sửa đôi thành phan môi trường và thuốc thử: Chuan bị đĩa petri có sẵn môi trường MT1, dùng ống thép vô trùng duc 3 lỗ trên đĩa petri, sử dụng micropipet vô trùng hút 50 wL dich vi khuẩn vào 3 lỗ giếng vừa đục. Các đĩa petri được ủ trong 72 giờ. Cho thuốc thử Lugol 1% vào, để 5 phút rồi đo đường kính vòng phân giải trên đĩa.
Chỉ tiêu theo dõi
Đường kính vòng phân giải (DK VPG) của các dòng vi khuẩn được tính theo
công thức Azman và ctv (2017):
ĐKVPG=D-d Trong đó:
D: đường kính vòng phân giải (mm)
d: đường kính lỗ giếng (mm).
Đánh gia hoạt lực enzyme theo Ray va ctv (2010) DKVPG = 13 mm: hoạt tinh enzyme mạnh
DKVPG = 10 mm: hoat tinh enzyme kha manh
DKVPG = 7 mm: hoat tinh enzyme trung binh
PKVPG <7 mm: hoạt tinh enzyme yếu
2.4.3.2 Khảo sát khả nang sinh enzyme protease của các dòng vi khuẩn Chuẩn bị dịch vi khuẩn
Vi khuẩn được nuôi cấy lắc trên môi trường MT2 lỏng trong 48 giờ, ở nhiệt độ phòng. Huyền phù vi khuẩn được điều chỉnh sao cho mật độ tế bao vi khuẩn đạt 108
CFU/mL.
28
Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bồ trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tổ với mỗi dong vi khuẩn là 1 NT, mỗi NT là 3 LLL, mỗi LLL CUA 1 NT là 1 đĩa petri.
Cách tiến hành
Thực hiện theo phương pháp của Tamrela và ctv (2021) có sửa đổi thành phần môi trường và thuốc thử: Chuẩn bị đĩa petri có sẵn môi trường MT2, dùng ống thép vô trùng đục 3 lỗ trên đĩa petri, sử dụng micropipet vô trùng hút 50 wL dich vi khuẩn vào 3 lỗ giếng vừa đục. Các đĩa petri được ủ trong 72 giờ. Cho thuốc thử Lugol 1% vào, để 5 phút rồi đo đường kính vòng phân giải trên đĩa.
Chỉ tiêu theo dõi
Đường kính vòng phân giải (DK VPG) của các dòng vi khuẩn được tính theo
công thức Azman va ctv (2017):
DKVPG = D-d Trong đó:
D: đường kính vòng phân giải (mm)
d: đường kính lỗ giếng (mm)
Đánh giá hoạt lực enzyme theo Ray và ctv (2010)
DKPG = 13 mm: hoạt tính enzyme rat manh
DKPG > 10 mm: hoạt tinh enzyme mạnh
DKPG = 7 mm: hoạt tinh enzyme trung bình
ĐKPG <7 mm: hoạt tinh enzyme yếu 2.5 Xử ly số liệu
Các số liệu được tông hợp, xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Các số liệu của các nghiệm thức được phân tích ANOVA, trắc nghiệm phân hạng Ducan sử dụng phần mềm SAS 9.1.
29
Chương 3