Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài dây Đau xương (tinospora sinensis (lour )merr) Ở việt nam

Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài dây Đau xương (tinospora sinensis (lour )merr) Ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Lê Thị Huyền

2 PGS.TS Nguyễn Thị Mai

Hà Nội - 2022

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU………1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 G IỚI THIỆU VỀ CHI T INOSPORA 3

1.1.1 Giới thiệu về họ Tiết dê (Menispermaceae) 3

1.1.2 Chi Tinospora 3

1.2 C ÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHI T INOSPORA 4

1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học 4

1.2.1.1 Các hợp chất terpenoid 4

1.2.1.2 Các hợp chất Alkaloid 9

1.2.1.3 Các hợp chất Steroid 12

1.2.1.4 Các hợp chất C6-C3-C6 14

1.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Tinospora 16

1.2.2.1 Hoạt tính chống viêm 16

1.2.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa 18

1.2.2.3 Các hoạt tính khác 19

1.3 G IỚI THIỆU VỀ LOÀI D ÂY ĐAU XƯƠNG TINOSPORA SINENSIS (L OUR ) M ERR 20

1.3.1 Đặc điểm thực vật 20

1.3.2 Công dụng 21

1.3.3 Tình hình nghiên cứu 22

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 26

2.1 Đ ỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 26

2.3 C ÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH , PHÂN TÁCH VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 26

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng 26

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng 26

2.3.3 Sắc ký cột (CC) 27

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28

2.4 C ÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ 29

2.4.1 Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR 29

2.4.2 Phổ DEPT 30

2.4.3 Phổ HR- ESI- MS 30

2.4.4 Phổ 2D-NMR 30

2.5 P HƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM 31

2.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 31

2.5.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 32

2.5.3 Phép thử sinh học xác định khả năng gây độc tế bào bằng MTT 33

2.6 T HIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 33

2.7 T HỰC NGHIỆM 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 X ÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT 38

3.1.1 Hợp chất FTL-17C3 (Tinosinodane – hợp chất mới) 38

3.1.2 Hợp chất FTL-19C1 (Violanthin) 45

3.1.3 Hợp chất FTL-18E (Isoorientin) 47

3.1.4 Hợp chất FTL-19C2 (Isovitexin) 48

3.1.5 Hợp chất FTL- 11C5 (Excoecarioside) 50

3.1.6 Hợp chất FTL-11B2 (Corchoionoside) 52

3.1.7 Hợp chất FTS-17B (Syringaresinol-4'-O-β-D-glucopyranoside) 54

3.1.8 Hợp chất FTL-12B1 (syringaresinol) 56

3.2 K ẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 57

3.2.1 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các phân đoạn 57

3.2.2 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất 57

KẾT LUẬN………… ………55

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 56

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13C-NMR Cacbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HR-ESI-MS High Resolution Mass

iNOS Inducible nitric oxide synthase Một enzyme tạo ra nitric oxide

từ amino L-arginine acid

κB Human epidemoid carcinoma Ung thư biểu mô người

LPS Lipopolysaccharide Các đại phân tử được cấu tạo

gồm lipid và polysaccharide NOESY Nuclear Overhauser Enhancement

Spectroscopy

Phổ NOESY

PA2 Phospholipase A2

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TNF-α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cây mối tràm 3

Hình 1.2: Cây vàng đắng 3

Hình 1.3: Hình ảnh loài Tinospora cordifolia 4

Hình 1.4 Cấu trúc các Terpenoid phân lập từ chi Tinospora 6

Hình 1.5 Cấu trúc các Alkaloid từ chi Tinospora 9

Hình 1.6 Cấu trúc các Steroid từ chi Tinospora 12

Hình 1.7 Các hợp chất C6-C3-C6 phân lập được từ chi Tinospora 15

Hình 1.8 Dây đau xương (Tinospora sinensis (Lour.) Merr) 19

Hình 2.1 Sơ đồ chiết lá cây loài Tinospora sinensis 32

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Tinospora sinensis 33

Hình 3.1a Cấu trúc hoá học hợp của chất FTL-17C3 35

Hình 3.1b Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất FTL-17C3 37

Hình 3.1c Phổ HR-ESI-MS của hợp chất FTL-17C3 37

Hình 3.1d Phổ 1H-NMR của hợp chất FTL-17C3 38

Hình 3.1e Phổ 13C-NMR của hợp chất FTL-17C3 38

Hình 3.1f Phổ HMBC của hợp chất FTL-17C3 39

Hình 3.1g Phổ HSQC của hợp chất FTL-17C3 39

Hình 3.1h Phổ COSY của hợp chất FTL-17C3 40

Hình 3.1k Phổ NOESY của hợp chất FTL-17C3 40

Hình 3.2a Cấu trúc hóa học của hợp chất FTL-19C1 41

Hình 3.2b Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất FTL-19C1 41

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất FTL-18E 43

Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất FTL-19C2 44

Hình 3.5a Cấu trúc hóa học của hợp chất FTL-11C5 46

Hình 3.5b Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất FTL-11C5 48

Hình 3.6a Cấu trúc hóa học của hợp chất FTL-11B2 48

Hình 3.6b Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất FTL-11B2 49

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất FTS- 17B 50

Hình 3.8 Cấu trúc hoá học của hợp chất FTL-12B1 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các hợp chất Terpenoid từ chi Tinospora 5

Bảng 1.2 Các Alkaloid phân lập được từ chi Tinospora .8

Bảng 1.3 Các Steroid phân lập được từ chi Tinospora 11

Bảng 1.4 Các hợp chất C6-C3-C6 phân lập được từ chi Tinospora 13

Bảng 2.1 Hiệu suất các phần chiết từ lá loài Tinospora sinensis L Merr .33

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FTL-17C3 36

Bảng 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FTL-19C1 42

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của hợp chất FTL-18E .44

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất FTL-19C2 .45

Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FTL-11C5 47

Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FTL-11B2 48

Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FTS-17B 50

Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất FLT-12B2 52

Bảng 3.9 Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của các phân đoạn 53

Bảng 3.10 Tác dụng ức chế sự sản sinh NO của các chất được phân lập 54

MỞ ĐẦU

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Theo thống kê, ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất

có nguồn gốc từ thảo mộc Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh Xu hướng đi sâu nghiên cứu

và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc Việc

sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng

Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn

có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng

Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian, Dây đau xương Tinospora sinensis

(Lour.)Merr là vị thuốc thường được dùng dưới hình thức thuốc uống hay thuốc xoa bóp để chữa các bệnh về xương khớp như đau vai gáy, tê bại hay xương khớp đau nhức…Ngoài ra lá cây thường được giã nhỏ vắt lấy nước cốt uống, lấy bã đắp trị rắn cắn, hoặc trộn với rượu để đắp lên chỗ sưng đau Ngoài ra, dây đau xương có giá trị cao trong điều trị chứng béo phì, chứng khó tiêu, viêm phế quản, bệnh về da

và viêm gan Các dịch chiết nước và ethanol có nhiều tiềm năng trong việc chữa trị các bệnh như chống viêm, chống tiểu đường và đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên, hiện

có ít công trình khoa học trong nước công bố cả về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này

Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

loài dây đau xương, chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học

và hoạt tính kháng viêm của loài dây đau xương (Tinospora sinensis (Lour.)Merr)

ở Việt Nam"

Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của

loài dây đau xương Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

Nội dung luận văn bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất từ lá loài dây đau xương (T sinensis) bằng các phương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Tinospora

1.1.1 Giới thiệu về họ Tiết dê (Menispermaceae)

Họ Tiết dê (Menispermaceae) hay còn gọi là họ Biển bức cát nằm trong bộ

Ranuculales chủ yếu là loài thực vật dây leo thân gỗ hoặc đôi khi thân thảo, đôi khi

có củ Lá hình xoắn ốc, đơn giản (hiếm khi có lá kép ba) Cụm hoa ở nách lá hoặc trên cành đã rụng lá, hoa nhỏ, thường có màu xanh lục hoặc vàng hoặc trắng

Theo Đỗ Tất Lợi, các loài thực vật trong họ này được sử dụng rộng rãi trong

việc làm thuốc Loài Cissampelos pareira L (cây mối tràm hay cây mối nám) (Hình 1.1) thường dùng lá tươi giã nát hay vò nát chữa những trường hợp bị sốt, lỵ Tại

Ấn Độ, rễ cây loài này được coi là một vị thuốc có tác dụng hỗ trợ tiêu hóa, chữa

sỏi mật Loài Coscinium usitatum Pierre (cây Vàng đắng) (Hình 1.2) là nguyên liệu

để chiết berberine có thể dùng chữa sốt, sốt rét, lỵ và đau mắt [1]

Hình 1.1: Cây mối tràm Hình 1.2: Cây vàng đắng

Đây là một họ trung bình về số lượng loài và chi với khoảng 68 chi và 440 loài [4], phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi, nhưng có vài chi còn sinh sống tại khu vực có khí hậu ôn đới tại miền đông Bắc Mỹ

1.1.2 Chi Tinospora

Tinospora là một chi trong họ Menispermaceae gồm 34 loài, phân bố ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Úc Thân thảo dạng sợi xoắn hoặc dây leo thân gỗ, đôi khi là cây bụi Các lá có cuống lá phình to và có gân ở gốc Hoa đực có đài gồm 6 lá đài rời xếp thành 2 vòng, cánh hoa có 6 cánh, đôi khi

có 3 cánh, thường rộng hình trứng với các cạnh bên được cuộn vào trong Hoa cái

có lá đài và cánh hoa thường giống hoa đực

Hình 1.3: Hình ảnh loài Tinospora cordifolia

Trong Y học cổ truyền, nhiều loài trong chi này đã được sử dụng trong các bài thuốc trị các bệnh như sốt, sốt rét, chữa triệu chứng của bệnh tê thấp, đau xương, đau người, các bệnh ký sinh trùng, bệnh tiểu đường …[75]

Ở Ấn Độ, T cordifolia được gọi là Guduchi (cây bảo vệ khỏi bệnh tật, tiếng

Phạn) đã được mô tả trong các sách cổ của Ayurveda có vị đắng, hăng Vị đắng được cho là cải thiện hoạt động trao đổi chất, ngay cả ở cấp độ tế bào Người ta sắc

thuốc từ T cordifolia để điều trị các bệnh đường tiêu hóa bao gồm khó tiêu, đầy

hơi, viêm dạ dày, vàng da, tiêu chảy, lách to và trĩ [6]

1.2 Các nghiên cứu về chi Tinospora

1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Các nghiên cứu về hóa thực vật của các loài thuộc chi Tinospora đã được

nghiên cứu từ lâu Cho đến nay, đã có rất nhiều các hợp chất được phân lập từ các loài trong chi này, trong đó chủ yếu là các hợp chất terpenoid, alkaloid, steroid, flavonoid, lignan và các polysaccharide

1.2.1.1 Các hợp chất terpenoid

Terpenoid là một trong những lớp chất chính của chi Tinospora Cho đến

nay, có khoảng 53 hợp chất terpenoid (1-53) được công bố từ chi Tinospora

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất terpenoid phân lập được từ chi Tinospora

Hình 1.4 Cấu trúc các Terpenoid phân lập được từ chi Tinospora (tiếp)

1.2.1.2 Các hợp chất Alkaloid

Alkaloid là một nhóm các hợp chất hữu cơ có chứa ít nhất một nitrogen và thường là các dị vòng có nguồn gốc từ thiên nhiên Alkaloid được tạo ra bởi nhiều loại sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật Chúng có thể phân lập được từ dịch chiết thô của các sinh vật này bằng cách chiết acid-base hoặc sử dụng sắc ký cột Alkaloid có các tính chất dược lý và sinh lý cao

Bảng 1.2 Các Alkaloid phân lập được từ chi Tinospora

72 N-Formyl nornuciferine T crispa [39]

73 N-Acetyl nornuciferine T crispa [77]

76 N-methyl-2-pyrrolidone T capillipes [40, 41]

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất Alkaloid từ chi Tinospora

1.2.1.3 Các hợp chất Steroid

Steroid là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có cấu trúc từ

17 nguyên tử carbon sắp xếp thành 4 vòng Một số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis, các tiền chất của một số loại vitamine nhất định Steroid rất

đa dạng và phong phú, bao gồm các một số loại vitamine D, digitalis, sterol (ví dụ: cholesterol) và các acid mật

Bảng 1.3 Các hợp chất Steroid phân lập được từ chi Tinospora

[43-Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất Steroid từ chi Tinospora

1.2.1.4 Các hợp chất C 6 -C 3 -C 6

Trong chi Tinospora còn phân lập được nhiều hợp chất thuộc các nhóm như

Lignan, Phenolic hay Flavonoid Các hợp chất này được liệt kê trong Bảng 1.4

Bảng 1.4 Các hợp chất C6-C3-C6 phân lập được từ chi Tinospora

133 Cosmosiin 6''-(E)-ferulate T crispa [54]

134 Cosmosiin 6''-(E)-cinnamate T crispa [54]

Hình 1.7 Các hợp chất C6-C3-C6 phân lập được từ chi Tinospora

1.2.2 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Tinospora

1.2.2.1 Hoạt tính chống viêm

Viêm (trong ngôn ngữ Latin: inflammatio) là một phần trong hệ thống phản ứng sinh học của các mô với những kích thích có hại, như là các mầm bệnh, tế bào

bị tổn thương, hoặc chất gây kích ứng, và là một phản ứng bảo vệ liên quan đến các

tế bào miễn dịch, mạch máu, và các hóa chất trung gian Chức năng của viêm là loại

bỏ nguyên nhân ban đầu làm tế bào tổn thương, dọn sạch các tế bào chết và mô bị tổn thương từ chấn thương ban đầu và trong quá trình viêm, và bắt đầu phục hồi

mô Kháng viêm là đặc tính của một chất hoặc một phương pháp điều trị làm giảm viêm hoặc sưng tấy Năm dấu hiệu lâm sàng của viêm gồm sốt, đau, đỏ, sưng, và rối loạn chức năng

Năm 2004, Rachel Li và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của

dịch chiết ethanol của loài Tinospora smilacina Các thử nghiệm hoạt tính kháng viêm in vitro trên các yếu tố viêm như cyclooxygenase-1 (COX-1),

cyclooxygenase-2 (COX-2), 5-lipoxygenase (5-LO) và phospholipase A2 (PA2) Kết quả cho thấy, dịch chiết ethanol thể hiện khả năng ức chế tốt các enzyme COX-

1, COX-2, 5-LO và PA2 với các giá trị IC50 tương ứng là 63,5, 81,2, 92,1 và 30,5 µg/mL Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài này Kết quả cho thấy các acid béo tự do và các ester của chúng đều thể hiện hoạt tính kháng viêm tốt [61]

Năm 2010, X Liu và cộng sự đã nghiên cứu về thành phần hóa học của dịch

chiết n-butanol của loài T sagittata Kết quả đã phân lập được các hợp chất:

palmatine, columbamine, và columbinyl glucoside Cả ba hợp chất đều có khả năng

ức chế đối với chứng phù tai do xylene gây ra ở chuột Những kết quả này đã giải thích công dụng của rễ loài này trong y học dân gian Trung Quốc trong việc điều trị các bệnh viêm nhiễm [62]

Năm 2014, B Patgiri và các cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của

dịch chiết nước của loài T cordifolia trên mô hình carrageenan ở chuột Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khả năng kháng viêm của dịch chiết nước của loài T cordifolia còn cao hơn so với loại thuốc Guduchi Ghana có trên thị trường để điệu

trị các bệnh viêm nhiễm [63]

Năm 2019, nhóm nghiên cứu của S Lam và cộng sự đã thử nghiệm hoạt tính

chống viêm in vitro của các hợp chất đã phân lập được từ củ của của loài T dentata

Kết quả đã cho thấy hai hợp chất homomoschatoline và dicentrinone có tác dụng kháng viêm ở mức độ trung bình với giá trị IC50 trong khoảng từ 1-10 µM [35]

Năm 2019, N Ghatpande và nhóm nghiên cứu đã nghiên cứu khả năng

chống viêm in vitro và in vivo của loài T cordifolia (TC) Nhóm chuột được điều trị

bằng TC cho thấy mức độ Hb và số lượng hồng cầu cao hơn đáng kể so với nhóm chuột bị viêm Điều trị bằng TC cho thấy sự giảm biểu hiện của gen HAMP (hepcidin) trong gan chuột Dịch chiết TC cũng ức chế sự biểu hiện gen của các cytokine gây viêm (TNF-α, IL-1β) Nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này bằng phương pháp HPLC đã cho thấy sự có mặt của hợp chất diterpenoid tinoporaside, được xem là hoạt chất đóng góp vào những kết quả trên [73]

Năm 2021, S Philip và các cộng sự nghiên cứu hoạt tính kháng viêm dựa trên sự ức chế Lypopolysaccharide (LPS), một yếu tố tiền viêm của dịch chiết

chloroform của loài T cordifolia (CETC) Tác giả đã nghiên cứu cơ chế tác dụng chống viêm của T cordifolia trên tế bào THP được ủ trước với CETC (30 phút) và

được kích thích bằng LPS (1 μg/ml) trong 20 giờ Mức độ cũng như biểu hiện gen

của các cytokine khác nhau được so sánh với mức độ của các tế bào được ủ riêng với LPS Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu cũng đã cho một nhóm chuột sử dụng

CETC nhằm nghiên cứu về khả năng chống viêm in vivo Trong đó chuột được sử

dụng CETC 48, 24, 12 và 1 giờ trước khi tiêm LPS và sự sống sót của chuột được theo dõi đến 10 ngày Mức độ cytokine được định lượng bằng thử nghiệm chất hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) CETC được phát hiện là hiệu quả trong việc ngăn chặn việc sản xuất các cytokine cảm ứng LPS chính trong đại thực bào THP-1 mà không làm thay đổi quá trình tổng hợp COX-1 Hơn nữa, sự ức chế của TNF-α, iNOS, COX-2, IL-1β và IL-6 của CETC trong sốc nội độc tố, được phản ánh thông qua tỷ lệ sống sót tăng lên của chuột được điều trị với CETC, cho thấy tiềm năng để CETC trở thành một loại thuốc chống viêm hiệu quả và ít độc tính [64]

1.2.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa

Hoạt tính chống oxy hóa là sự hạn chế hoặc ức chế quá trình oxy hóa chất dinh dưỡng (đặc biệt là lipid và protein) bằng cách hạn chế các phản ứng chuỗi oxy hóa

Năm 1998, A Cavin và các cộng sự đã nghiên cứu thành phần hóa học của

dịch chiết dichloromethane của loài T crispa Kết quả cho thấy sự xuất hiện của ba hợp chất n-cis-feruloyltyramine, n-trans-feruloyltyramine, và secoisolariciresinol

thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quét gốc tự do DPPH [30]

Năm 2018, dịch chiết ethanol từ thân của loài T cordifolia (TCME) đã được nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa in vivo trên chuột Chuột uống ion kim loại

cadimi (5mg/kg) và TCME (100mg/kg) trong 28 ngày vào cuối giai đoạn điều trị Huyết thanh và mô gan được phân tích sinh hóa Sử dụng Cadimi dẫn đến giảm hoạt động của các chất chống oxy hóa nội sinh (SOD, CAT, GSH, GPx và GST) Điều trị TCME đã khôi phục những thay đổi về sinh hóa và mô học do nhiễm độc Cadimi về mức gần bình thường Kết quả này là do các thành phần có khả năng chống oxy hóa có trong dịch chiết [65]

Năm 2020, N.A Maya và cộng sự đã nghiên cứu khả năng loại gốc tự do của

dịch chiết ethanol của loài T cordifolia Nhóm tác giả đã tiến hành thử nghiệm trên

60 con chuột, sử dụng gentamicin (80mg/kg/ngày) trong 7 ngày để gây độc cho thận

của chuột Dịch chiết ethanol của T cordifolia (200mg/kg/ngày) được dùng đồng

thời và tuần tự với gentamicin để quan sát tác dụng phòng và chữa bệnh tương ứng

Sau khi sử dụng dịch chiết, nhóm nghiên cứu nhận thấy các nhóm chuột đều hồi

phục sau ngộ độc thận với gentamicin [66]

1.2.2.3 Các hoạt tính khác

Năm 2014, F Samita và các cộng sự đã phân lập được một hợp chất ceramid

mới là 2,3-dihydroxy-N-[2S,3S,4R]-1,3,4-tryhydroxyicosan-2-yl[tetracosanamide]

từ loài T oblongifolia Hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với

dòng tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 là 3,4 mM [48]

Năm 2015, J Mantaj và cộng sự đã phân lập được một hợp chất clerodane

diterpene mới là Crispene E (78) từ dịch chiết methanol của loài T crispa Nhóm

tác giả đã sử dụng protein STAT3βtc chưa được phosphoryl hóa để phát triển xét

nghiệm liên kết protein-protein sơ cấp phân cực huỳnh quang (FB) để đánh giá hoạt

động ức chế dimer hóa của STAT3 của 78 và đã phát hiện có độc tính đáng kể đối

với dòng tế bào ung thư vú MDA-MB 231 phụ thuộc vào STAT3 Hợp chất này đã

thể hiện sự ức chế đặc hiệu với STAT3 qua giá trị IC50 là 5,35 µM đối với

MDA-MB 231 Có đến 85% tế bào MDA-MDA-MB 231 chết sau khi tiếp xúc với 78 trong 24

giờ cho thấy hợp chất này có tác dụng gây độc hơn là kìm hãm tế bào ung thư vú

MDA-DB 231 [67]

Năm 2016, Q Rong và các cộng sự đã nghiên cứu nghiệm hoạt tính kháng

khuẩn in vitro đối với vi khuẩn Helicobacter pylori (H pylori), một loài vi khuẩn

được phân lập từ lợn, của dịch chiết methanol của loài T sgittata (TSG) và thành

phần chính của nó là palmatine (59) Kết quả cho thấy, nồng độ ức chế tổi thiểu và

nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của TSG chống lại vi khuẩn H pylori chiết xuất từ lợn

và H pylori chuẩn đều là 6250 µg/ml, trong khi các chỉ số này đối với palmatine

khi chống lại H pylori là 6,25 µg/ml và H pylori chuẩn là 3,12 µg/ml Trong thử

nghiệm in vivo, tỉ lệ diệt vi khuẩn trên nhóm chuột sử dụng TSG và Palmatine lần

lượt là 80% và 50% so với 70% ở nhóm chuột sử dụng liệu pháp bộ ba

(omeprazole, clarithromycin và amoxicillin) [68]

Trong nghiên cứu được công bố vào năm 2016, A Banerjee và các cộng sự

đã sử dụng dịch chiết methanol của thân cây loài T sinnensis trong các thử nghiệm

về khả năng làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thụ carbohydrate của dịch chiết

này Dịch chiết methanol thể hiện khả năng ức chế enzyme amylase và

α-glucosidase đáng kể với giá trị IC50 tương ứng là 0,75 µg và 0,80 µg của dịch chiết

khô, tốt hơn so với chất đối chứng dương acarbose Ngoài ra, do sự có mặt của các thành phần chống oxy hóa như rutin hay quercetin, dịch chiết methanol này có triển vọng tốt trong việc kiểm soát tăng đường huyết, hỗ trợ chữa bệnh tiểu đường và các

tình trạng bệnh liên quan Kết quả này cho thấy T sinensis có tiềm năng được sử

dụng như một loại thuốc hoặc một loại thực phẩm bổ sung trong chế độ dinh dưỡng [69]

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của A Balkrishna và các đồng sự đã nghiên cứu về khả năng làm gián đoạn tương tác RBD của virus SARS-CoV-2 và tương tác ACE2 của vật chủ, bằng cách sử dụng Tinocordiside, một hợp chất phân lập được

từ loài Tinospora cordifolia, sử dụng mô hình docking phân tử để tính toán các độ

dài cũng như năng lượng liên kết Kết quả cho thấy, hợp chất này làm giảm đáng kể thành phần tĩnh điện của năng lượng liên kết giữa phức hợp ACE2-RBD (23,5 và 17,10 kcal/mol) Vì hằng số tốc độ của liên kết protein là bậc 5 (105 đến 106 M-1s-1) nên có thể không có thay đổi đáng kể về cấu trúc hoặc tổ chức lại vòng lặp, mà chỉ liên quan đến thay đổi cấu trúc cục bộ, cho thấy sự gián đoạn trong tương tác tĩnh điện giữa RBD và ACE2, và sự gia tăng tính linh hoạt của phức hợp sẽ làm suy yếu hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của SARS-CoV-2 và khả năng lây nhiễm của nó Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất thiên nhiên như Tinocordiside là những lựa chọn tiềm năng giúp kiểm soát sự lây nhiễm SARS-CoV-2 và sự xâm nhập của nó vào tế bào vật chủ [70]

1.3 Giới thiệu về loài Dây đau xương Tinospora sinensis (Lour.) Merr

1.3.1 Đặc điểm thực vật

a) Dây đau xương b) Thân dây đau xương phơi khô

Hình 1.8 Dây đau xương (Tinospora sinensis L Merr.)

Mô tả: Dây đau xương (hay còn có một số tên gọi khác Tục cốt đằng, Khoan

cân đằng, Cây đau xương, Khau năng cấp) là một loại dây leo, dài 7-8m, có cánh dài rũ xuống Cành non của cây thường được phủ lông mịn nhưng khi già thì lại nhẵn Lá có lông, nhất là ở mặt dưới làm cho mặt dưới có màu trắng nhạt, phiến lá hình tim, phía cuống tròn và hõm lại, phía đỉnh hẹp lại thành mũi nhọn, dài 10-12cm, rộng 8-10cm, có 5 gân rõ, tỏa hình chân vịt Hoa mọc thành chùm ở kẽ lá hoặc đơn độc, màu trắng nhạt Quả hạch, khi chín có màu đỏ, có dịch nhầy, hạch hình bán cầu, mặt phẳng của bán cầu hõm lại [1]

Loài: Tinospora sinensis (Lour.) Merr

Phân bố: Tinospora sinensis L Merr được phát hiện ở nhiều quốc gia thuộc

Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Srilanka, Bangladesh, Thái Lan và Việt Nam Dây đau xương mọc hoang nhiều tại các địa phương ở nước ta, nhiều nhất ở tỉnh như Lào Cai, Ninh Bình, Hà Nội, Quảng Nam, Đà Nẵng, Phú Thọ, …

1.3.2 Công dụng

Trong các tài liệu nghiên cứu trên thế giới, dây đau xương có giá trị cao trong điều trị chứng béo phì, chứng khó tiêu, viêm phế quản, bệnh da và viêm gan Các dịch chiết nước và ethanol của các cây được báo cáo là có tiềm năng dược lý khác nhau, như chống viêm, chống tiểu đường và thích ứng miễn dịch

Ở Việt Nam, theo kinh nghiệm dân gian, dây đau xương là vị thuốc thường được dùng dưới hình thức thuốc uống hay thuốc xoa bóp để chữa các bệnh về xương khớp như đau vai gáy, tê bại hay xương khớp đau nhức…Ngoài ra lá cây thường được giã nhỏ vắt lấy nước cốt uống, lấy bã đắp trị rắn cắn, hoặc trộn với rượu để đắp lên chỗ sưng đau

1.3.3 Tình hình nghiên cứu

Dây đau xương được nghiên cứu nhiều ở các nước mà nó phân bố như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, … Các bài báo đã công bố chủ yếu tập trung vào nghiên cứu vào thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý của các loài khác nhau tùy theo khu vực

Chi Tinospora là một trong những loại thảo mộc được người Ấn Độ sử dụng

làm thuốc Năm 2016, Sachet Hegde và cộng sự đã tổng hợp những nghiên cứu gần

đây về các đặc tính dược lý và hóa thực vật của cây Tinospora sinensis (Lour.) Merr

cũng như công dụng của các bộ phận khác nhau trong điều trị nhiều bệnh từ sốt, vàng da, tiểu đường, thấp khớp, bệnh lậu cho đến ung thư ác tính ở người Các hợp

chất được phân lập như tinosineside (135), tinocordifolioside (36), malabaroliode (136), tinosporaside (137), 1-deacetyltinosporaside (138), 4-hydroxyl-heptadec-6- enoic acid (139), cordicoside (140), synergin (141), palmatine (91), diosgenin (142),

daucasterol (143), columbin (5), β-setosterol (144), 20β-hydrosone (145) có thể

được sử dụng một cách hữu ích trong tương lai trong phòng và chữa nhiều loại bệnh [71]

Vai trò của cây thuốc trong phòng chống bệnh tật là do đặc tính chống oxy

hóa của nó và do sự có mặt của các chất có hoạt tính sinh học Tinospora sinensis

(Lour.) Merr thuộc họ Menispermaceae, thân cây được dùng làm thuốc Cây mọc hoang ở hầu hết các vùng của Ấn Độ, cả trong rừng và vùng đồng bằng Để khảo sát

các hoạt tính sinh học của thân củ loài T sinensis, các hoạt tính chống oxy hóa và

chống đái tháo đường của dịch chiết methanol của cây đã được nhóm nghiên cứu của Anindita Banerjee và cộng sự tiến hành phân tích vào năm 2017 Kết quả cho

thấy, dịch chiết của loài T sinensis có hoạt tính quét gốc tự do và hoạt tính ức chế chống lại các enzyme α-amylase và α-glucosidase Mặc dù tác dụng của chiết xuất

T sinensis đã được nghiên cứu in vitro, nhưng những kết quả này chỉ ra rằng T sinensis có tiềm năng như một loại thuốc và thực phẩm chức năng [69]

Ở Trung Quốc, năm 2017 Huan Jiang và cộng sự đã phân lập được mười

chất diterpenoid glucoside mới là tinosinenoside A (40), B (41), C (42), D (146),

Vào năm 2021, Zhang Jun-Sheng và cộng sự đã phân lập được hai lignan

glucoside mới là tinsinlignans A (156) và B (157), hai oxyneolignans mới là

tinsinlignans C (158) và D (159) cùng với một chất tương tự đã biết guaiacylglycerol-β-O-4′- sinapyl ether (160), từ thân cây Tinospora sinensis [72]

threo-Ở Việt Nam, tính đến nay chỉ có hai công trình nghiên cứu của PGS Vũ

Đức Lợi và cộng sự vào năm 2017 đã thông báo phân lập được ra năm hợp chất

Trong đó, hai hợp chất alkaloid là decarin (161), và iwamid (162) [3] và ba chất

flavonoid là 5,3′,4′,5′-tetramethoxy-6,7-methylenedioxyisoflavone (163), asiatic

acid (164), acetovanillone (165) [2]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tên khoa học: Tinospora sinensis (Lour.) Merr

Nơi thu mẫu: Trung tâm nghiên cứu đa dạng sinh học, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

Ngày thu mẫu: 5/2020

Người giám định: TS Nguyễn Thế Cường, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mẫu tiêu bản: NCCT-TSL93 tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp chiết nguyên liệu thực vật

Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ, ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ phòng Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH Phần chiết MeOH được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần:

n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate cho các phần chiết tương ứng

2.3 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng

Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ) Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng trên silica gel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ Vì sự phân tích TLC trên silica gel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột Để định tính các hợp chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel

là 0,2 mm

Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng: Hòa tan mẫu thử trong dung môi thích

hợp (1 mg/mL), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 μL)

Dung môi triển khai: Các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và

chưng cất lại trước khi sử dụng Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều nhau rồi cho vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0,5cm Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng: Bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến

xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để yên và quan sát Khi quan sát thấy dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng

Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: Bản mỏng được phun H2SO4 1%, sau đó được hơ nóng ở 120°C, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu

sắc của các vệt chất

2.3.3 Sắc ký cột

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách Chất hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với các cỡ hạt 63-200 µm và 40-63 μm

Dung môi hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng

Nhồi cột sắc ký: Phương pháp nhồi cột ướt: Một lượng silica gel ứng với cột

sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là 100 cm được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ dung môi Bột nhão này được nhồi vào cột sắc ký và được đuổi hết bọt khí Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định

Đưa mẫu lên cột sắc ký: Phương pháp tẩm mẫu trên silica gel: Mẫu được hòa

tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp Trộn dung dịch thu được với silica gel (cỡ hạt 40-63 μm) với tỷ lệ chất/ silica gel là 1: 1,2 – 1,5 Hỗn hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thu được bột mịn của mẫu chất hấp phụ trên silica gel Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel

Triển khai sắc ký cột: Mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi

cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho từ từ mẫu tẩm trên silica gel lên cột Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang Rắc một lớp cát lên phía trên để tránh các chất bột bị hòa tan ngược

Tiến hành rửa giải: Rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các

khảo sát thăm dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/phút, thu các phân đoạn theo thể tích

150 mL, 50 mL và 20 mL (CC, FC)

Khảo sát sắc ký các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được

bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khì mà chúng chảy ra khỏi cột

chromatography-Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymer, có kích thước trong khoảng 2-50 μm Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương tác khác nhau với các hạt hấp phụ Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung

môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là "pha động" Thành phần

và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên nhưng tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột Đây là những tương tác vật lý như kị nước, lưỡng cực-lưỡng cực và ion, thông thường nhất là sự kết hợp của các tương tác này

HPLC được phân biệt với sắc ký lỏng truyền thống áp suất thấp bởi vì áp suất hoạt động của nó cao hơn nhiều (50-350 bar), trong khi sắc ký lỏng thông thường chỉ dựa trên lực hút trái đất để pha động đi qua cột Do chỉ có một lượng nhỏ mẫu được tách bằng phân tích HPLC, cột có kích thước 2,1-4,6 mm cho đường kính và 30–250 mm cho chiều dài Cột HPLC cũng đổ với kích thước hạt hấp phụ nhỏ hơn (trung bình kích thước hạt 2-50 μm) Điều này mang lại HPLC hiệu quả phân giải cao (khả năng tách biệt từng chất) khi mà tách hỗn hợp, làm cho nó trở thành phương pháp sắc ký phổ biến

Sơ đồ của một thiết bị HPLC đặc thù gồm có cổng lấy mẫu, bơm, và một đầu

dò Cổng lấy mẫu đưa hỗn hợp mẫu và dòng pha động để đi qua cột Hệ thống bơm đảm bảo tốc độ dòng mong muốn và thành phần của pha động qua cột Đầu dò tạo

ra tín hiệu tỷ lệ với lượng mẫu thành phần đi ra từ cột, do đó cho phép phân tích định lượng của những thành phần trong mẫu Một bộ vi xử lý số và phần mềm điều khiển thiết bị HPLC và cung cấp dữ liệu phân tích Một vài mẫu bơm cơ trong thiết

bị HPLC có thể trộn nhiều dung môi với nhau trong những tỉ mà thay đổi theo thời gian, tạo ra thành phần gradient trong pha động Các đầu dò như UV/Vis, PDA hay khối phổ được sử dụng phổ biến Phần lớn các thiết bị HPLC có lò cột để điều chỉnh nhiệt độ phân tách

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Hiện nay các phương pháp phổ là các phương pháp hiện đại thường dùng để xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

2.4.1 Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR

Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp phổ dựa trên sự chuyển mức năng lượng của các spin hạt nhân có tính từ trong các nguyên tử định hướng theo một từ trường của một nam châm vĩnh cửu Do tương tác của các spin này với một điện từ trường bổ sung, các hạt nhân chuyển lên một mức năng lượng cao hơn Tín hiệu sinh ra do sự thay đổi vị trí từ trạng thái có mức

năng lượng cao xuống trạng thái có mức năng lượng thấp hơn được ghi lại và cường độ của tín hiệu tỷ lệ với mức chênh lệch năng lượng giữa các trạng thái

Các phổ NMR phổ biến nhất trong xác định cấu trúc các chất hữu cơ, là phổ cộng từ hạt nhân proton (1H-NMR, 500 MHz) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR, 125 MHz) Trong phổ 1H-NMR, các thông số quan trọng là

độ lệch chuyển hóa học (δ), cường độ tín hiệu và hằng số tương tác (J) Phổ 13NMR cho biết thông tin về số lượng nguyên tử carbon có trong chất hữu cơ Ngoài

C-ra còn phổ DEPT cho biết các tín hiệu là CH3, CH2, CH hay C, từ đó cho phép dự đoán cấu trúc của hợp chất nghiên cứu

Khi đo phổ NMR, để có tín hiệu tốt thì mẫu cần được pha loãng trong dung môi ít ảnh hưởng đến tín hiệu của chất Khi đó để đo phổ 1H-NMR thì cần dung dung môi không chứa hydro như CCl4, CS2 hoặc dùng dung môi đã được deuteri

hoá Độ dịch chuyển (δ) được biểu thị theo ppm Tetramethylsilane (TMS) là chất

nội chuẩn cho phổ 1H-NMR

2.4.2 Phổ DEPT

Phổ này cho ta các tín hiệu cộng hưởng dùng để phân loại các loại carbon có hay không có hydro Trên phổ DEPT, tín hiệu của các carbon không liên kết trực tiếp với hydro Tín hiệu của CH và CH3 nằm về phía trên và của CH2 về phía dưới trên phổ DEPT-135 Trên phổ DEPT-90 chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của CH

2.4.3 Phổ HR- ESI- MS

Phổ khối phân giải cao cho phép xác định các chất phân tích đến 0,001 đơn

vị khối lượng nguyên tử gần nhất

2.4.4 Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật chủ yếu thường được sử dụng như sau:

- Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence): Các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này Trên phổ, một trục là phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ

- Phổ 1H-1H COSY (1H-1H Correlation Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton đính với cacbon liền kề nhau Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn tương tác xa của H và C trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc

- Phổ NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa trong không gian của các proton không kể đến các liên kết mà chỉ tính đến khoảng cách nhất định trong không gian Dựa vào kết quả phổ này có thể xác định cấu trúc không gian của phân tử

Người ta còn sử dụng hiệu ứng NOE bằng kỹ thuật phổ NOE sai phân để xác định cấu trúc không gian của phân tử Bằng việc đưa vào một xung đúng bằng từ trường cộng hưởng của một proton xác định thì các proton có cùng phía về không gian cũng như gần nhau về không gian sẽ cộng hưởng mạnh hơn và cho tín hiệu phổ với cường độ mạnh hơn Ngoài ra, người ta còn sử dụng phổ tia X (nhiễu xạ Rơnghen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử của hợp chất kết tinh ở dạng đơn tinh thể Nhưng phạm vi sử dụng của phổ này hạn chế vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có đơn tinh thể Đây là một điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ

Như trên đã đề cập, ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp chuyển hoá hoá học cũng như các phương pháp phân tích,

so sánh, kết hợp khác Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại đường cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến

2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng viêm

2.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

- Dòng tế bào RAW264.7, do GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia

và GS.TS Chi-Huang, Đại học quốc gia Yang-Ming, Đài Loan cung cấp, được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-

glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO)

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2

2.5.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7

- Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tế bào/giếng

và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h

- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h

- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (10 μg/mL) trong 24h

- Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là

đối chứng âm Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NGarginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/mL

-Methyl-L Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào

100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v)

phosphoric acid và 50 μL 0,1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine

dihydrochloride pha trong nước

- Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy Microplate Reader ở bước sóng 540 nm Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank)

- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS)

- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lượng NO sample /hàm lượng NO LPS ]*100

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính

TableCurve 2Dv4