Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Kháng Viêm Của Hai Loài Piper Sarmentosum Roxb. Và Piper Longum L. Thuộc Chi Hồ Tiêu Piper.pdf

Các chất kháng viêm hầu hết hoạt động dựa trên cơ chế kìm hãm hoạt động của các enzyme xúc tác cho quá trình tạo các chất gây viêm như cyclooxygenase COX làm giảm tổng hợp PGE2 và F1α là

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN

CẤP ĐẠI HỌC QUỐC GIA

Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của hai

loài Piper sarmentosum Roxb và Piper longum L thuộc chi Hồ tiêu Piper

Mã số đề tài: QG.22.05 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Lê Thị Huyền

Hà Nội, 2024

PHẦN I THÔNG TIN CHUNG 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của hai

loài Piper sarmentosum Roxb và Piper longum L thuộc chi Hồ tiêu Piper

1.2 Mã số: QG.22.05 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

TT Chức danh, học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

2 TS Nguyễn Thị Sơn Khoa Hóa học Thành viên chính 3 TS Trần Thanh Hà Viện dược liệu, Bộ Y tế Thành viên chính 4 ThS Lương Thị Mỹ Hạnh Khoa Hóa học Thành viên 5 HVCH Nguyễn Thị Thu Hậu Khoa Hóa học Thành viên

1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 5 năm 2022 đến tháng 5 năm 2024 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng… năm…

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 5 năm 2022 đến tháng 5 năm 2024

1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): không

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện;

Nguyên nhân; Ý kiến của Cơ quan quản lý)

1.7 Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 280 triệu đồng PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Đặt vấn đề

Viêm là một chuỗi các hiện tượng do nhiều tác nhân như nhiễm trùng, các phản ứng miễn dịch, tổn thương do nhiệt hoặc vật lý gây ra Các dấu hiệu lâm sàng đặc trưng: sưng, nóng, đỏ, đau Phương pháp điều trị hiện nay thường liên quan đến thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) Các chất kháng viêm hầu hết hoạt động dựa trên cơ chế kìm hãm hoạt động của các enzyme xúc tác cho quá trình tạo các chất gây viêm như cyclooxygenase (COX) làm giảm tổng hợp PGE2 và F1α là chất trung gian hóa học của phản ứng gây viêm, hoặc làm bền màng lisosom (thể tiêu bào) ngăn cản giải phóng các enzyme phân giải nên ức chế quá trình viêm, hoặc ức chế vận chuyển bạch cầu Tuy nhiên, mỗi NSAID là một chất hóa học khác nhau, và mỗi người lại có đáp ứng khác nhau với thuốc Có những người bệnh đáp ứng bất cứ một thuốc NSAID nào, nhưng lại có những người có thể không đáp ứng với một thuốc này nhưng lại đáp ứng với một thuốc khác Sự khác nhau giữa các thuốc

NSAID chủ yếu là tỷ lệ và các biểu hiện của tác dụng không mong muốn Các tác dụng phụ của NSAID có thể từ nhẹ như kích ứng dạ dày đến nghiêm trọng bao gồm cả viêm loét, chảy máu và thủng dạ dày và ruột Trái ngược với các thuốc điều trị viêm theo con đường tổng hợp, các dược phẩm có nguồn gốc thiên nhiên dùng trong phác đồ điều trị viêm lại không xuất hiện các tác dụng phụ cho người bệnh

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Piper được

thực hiện trên thế giới, tuy nhiên, số lượng những nghiên cứu về chi này ở Việt Nam còn khá hạn chế Các nghiên cứu trong nước chủ yếu tập trung vào nghiên cứu

thành phần tinh dầu của 3 loài thuộc chi Piper gồm: P nigrum, P betle, P lolot

Tiêu lốt, là lốt không chỉ là những gia vị đáng chú ý trong ẩm thực văn hóa Việt mà còn được biết đến như một vị thuốc có giá trị trong kho tàng y dược học cổ truyền Việt Nam Từ xa xưa, tiêu lốt được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng ôn trung, tán hàn, hạ khí, chỉ thống nhờ tính cay, vị nóng Do vậy, tiêu lốt có hiệu quả trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh về đường hô hấp (như viêm xoang), các bệnh về tiêu hóa (như đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, khó tiêu, đầy bụng, trướng bụng) Ngoài ra, khi sử dụng phối hợp tiêu lốt và các cây thuốc khác đã mang đến các bài thuốc quý khác có tác dụng giảm đau răng, đau thắt vùng ngực, kháng khuẩn, bảo vệ gan, ngăn ngừa ung thư gan, điều hòa kinh nguyệt ở phụ nữ Theo các nghiên cứu khoa học, loài tiêu lốt và lá lốt sở hữu đa dạng các thành phần hóa học như tinh dầu, alkaloid, flavonoid, lignan [1, 2] Bên cạnh đó, khi nghiên cứu các dịch chiết methanol và ethanol của loài tiêu lốt, lá lốt đều cho thấy các hoạt tính sinh học đặc trưng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, chống tiểu đường [2, 3] Sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt và lá lốt chính là một điểm đáng chú ý về mặt thực tiễn của nghiên cứu này

Như vậy, Ở Việt Nam mới chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài

như P betle, P longum, P lolot Trong đó loài P longum mới có các nghiên cứu về

thành phần tinh dầu Cả ba loài trên đều chưa đươc đánh giá và nghiên cứu về hoạt tính sinh học Vì vậy, việc điều tra, nghiên cứu và đánh giá về thành phần hóa học

cũng như hoạt tính kháng viêm của 2 loài Piper sarmentosum Roxb và Piper

longum L sẽ có ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần phát

triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở Việt Nam

- Phân lập được các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong các dịch chiết thu được

- Đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro của các dịch chiết và các hợp chất phân

lập được

3 Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp chiết xuất

Phần trên mặt đất loài tiêu lốt và lá lốt sau khi sấy khô, nghiền thành bột mịn,

sau đó chiết với methanol bằng thiết bị siêu âm Các dịch chiết được gom lại, lọc

qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol Cặn chiết này được hòa tan vào nước cất và tiến hành chiết phân bố lần

lượt với n-hexane, CH2Cl2, EtOAc thu được cặn các cặn n-hexane, CH2Cl2, EtOAc

và lớp nước sau khi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

3.2 Phương pháp phân tách các dịch chiết và phân lập các hợp chất

Sau khi đã điều chế các cặn chiết n-hexane, CH2Cl2, EtOAc và cặn nước Sử

dụng kết hợp nhiều phương pháp sắc ký hiện đại: TLC, CC, HPLC điều chế,… để phân lập các hợp chất có trong các cặn chiết

3.3 Phương pháp xác định cấu trúc các chất

Xác định cấu trúc chất phân lập thông qua việc phân tích các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR và 13C-NMR), và 2 chiều HSQC, HMBC, COSY, phổ lưỡng sắc tròn CD, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, và so sánh với dữ liệu trong các tài liệu tham khảo

3.4 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage

RAW 264.7

Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37oC và 5% CO2 trong 24h Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi là đối chứng âm Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ở các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml Nitrite ion (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA) Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide

trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước Hỗn hợp này được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước song 540 nm Môi trường DMEM không FBS được sử dụng như giếng trắng (blank) Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS) Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế =100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]*100

Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve

2Dv4

3 Tổng kết kết quả nghiên cứu

Với mục tiêu cụ thể là nghiên cứu quy trình chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ hai loài lá lốt và tiêu lốt trồng tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu đã thu được một số kết quả như sau:

- Đã xây dựng quy trình điều chế các cặn chiết methanol, n-hexane, CH2Cl2, EtOAc

có thể áp dụng thực tế tử hai loài tiêu lốt và lá lốt ở Việt Nam - Đã xây dựng quy trình phân lập 14 hợp chất có thể áp dụng thực tế từ hai loài nghiên cứu Khối lượng các chất phân lập được từ 5-75 mg Các hợp chất hóa học phân lập được đạt độ tinh khiết > 90% Trong 14 hợp chất này, 7 hợp chất phân lập

từ loài tiêu lốt bao gồm piperlongoside A (PL1), piperlongoside B (PL2),

piperlongoside C (PL3), (-)-isolariciresinol 2-O-β-D-glucopyranoside (PL4), isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL5), (-)-isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL6), (+)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL7), trong

(+)-đó 3 hợp chất PL1, PL2, PL3 là các hợp chất mới Bảy hợp chất phân lập được từ loài lá lốt bao gồm violanthin (PS1), isoorientin (PS2), isovitexin (PS3), vitexin

1.35 µM, tương đương với chất đối chứng dương NG-monomethyl-L-arginine acetate (L-NMMA) với giá trị IC50 32.51 ± 3.70, hợp chất PL2 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 64.56 ± 1.18 µM, trong khi hợp chất PL1 chưa thể hiện hoạt

tính ức chế trong điều kiện thử nghiệm Đối với loài lá lốt hợp chất PS1 thể hiện

hoạt tính kháng viêm tiềm năng với giá trị IC50 là 61,12±5,48, các hợp chất còn lại chưa thể hiện hoạt tính trong điều kiện thử nghiệm

4 Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

Đã xây dựng quy trình điều chế các cặn chiết methanol, n-hexane, CH2Cl2,

EtOAc có thể áp dụng thực tế của 2 loài lá lốt và tiêu lốt Đã xây dựng quy trình phân lập 07 hợp chất loài tiêu lốt và 07 hợp từ loài lá lốt, trong đó có 3 hợp chất mới được phân lập từ loài tiêu lốt Khối lượng các chất phân lập được từ 5-75 mg Các hợp chất hóa học phân lập được đạt độ tinh khiết > 90% Đã đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế sản sinh NO trong đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bới LPS của 14 hợp chất phân lập được Đề tài đã hoàn thành tất cả các nội dung, mục tiêu đặt ra trong thuyết minh của đề tài

6 Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh) Tiếng Việt

Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình chiết xuất điều chế các cặn chiết

methanol, n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, nước từ phần trên mặt đất hai

loài lá lốt và tiêu lốt bằng phương pháp chiết siêu âm Sử dụng các phương pháp sắc ký hiện đại như TLC, CC, HPLC điều chế,…đã phân lập được 7 hợp chất từ loài tiêu lốt và 7 hợp chất từ loài lá lốt Cấu trúc của các hợp chất này được nhận dạng dựa trên phân tích các dữ kiện phổ bao gồm phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều, phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS, phổ lưỡng sắc tròn CD và so sánh với các dữ kiện trong các tài liệu tham khảo 7 hợp chất từ loài tiêu lốt bao

gồm: piperlongoside A (PL1), piperlongoside B (PL2), piperlongoside C (PL3),

(-)-isolariciresinol 2-O-β-D-glucopyranoside (PL4), (+(-)-isolariciresinol glucopyranoside (PL5), (-)-isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL6), (+)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL7), trong đó ba hợp chất piperlongoside

3a-O-β-D-A-C (PL1-3) là các hợp chất mới 7 hợp chất từ loài lá lốt bao gồm: violanthin (PS1), isoorientin (PS2), isovitexin (PS3), vitexin (PS4), corchoionoside (PS5),

syringaresocinol-4-O-β-D-glucopyranoside (PS6), syringaresocinol (PS7) Các hợp

chất phân lập này được đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua sự ức chế sản sinh NO trong đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bởi Lippo polysaccharide, kết

quả cho thấy: đối với loài tiêu lốt bốn hợp chất PL3 - PL7 thể hiện hoạt tính ức chế

NO tốt với các giá trị IC50 thu được lần lượt là 33.46 ± 2.13, 32.09 ± 3.34, 37.81 ±

1.18, 35.32 ± 1.14, 38.16 ± 1.35 µM, tương đương với chất đối chứng dương NGmonomethyl-L-arginine acetate (L-NMMA) với giá trị IC50 32.51 ± 3.70, hợp chất

-PL2 thể hiện hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 64.56 ± 1.18 µM, trong khi hợp chất

PL1 chưa thể hiện hoạt tính ức chế trong điều kiện thử nghiệm Đối với loài lá lốt

hợp chất PS1 thể hiện hoạt tính kháng viêm tiềm năng với giá trị IC50 là

61,12±5,48, các hợp chất còn lại chưa thể hiện hoạt tính trong điều kiện thử nghiệm Các kết quả nghiên cứu đã góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh của lá lốt và tiêu lốt trong y học cổ truyền

Tiếng Anh

In the project, we successfully established an extraction process of ultrasonic

extraction of methanol, n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, and water layer extracts from the stems and leaves of the aerial parts of Piper sarmentosum and

Piper longum species Research also isolated 14 compounds from the methanol

extracts using various modern chromatographic techniques such as TLC, CC, and preparative HPLC… Based on physical and chemical characteristics and analysis of spectra data, including HR-ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC, COSY, NOESY, and CD, and in comparison with those reported in the literature, 14

compounds were elucidated Of these, 07 compounds were determined from Piper

longum as piperlongoside A (PL1), piperlongoside B (PL2), piperlongoside C

(PL3), (-)-isolariciresinol 2-O-β-D-glucopyranoside (PL4), (-)-isolariciresinol

3a-O-β-D -glucopyranoside (PL5), (+)-isolariciresinol 3a-3a-O-β-D -glucopyranoside

(PL6), (+)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside (PL7) Among them, three

compounds, piperlongoside A-C (PL1-3), were new compounds 07 compounds

were determined from Piper sarmentosum as violanthin (PS1), isoorientin (PS2), isovitexin (PS3), vitexin (PS4), corchoionoside (PS5), syringaresocinol-4-O-β-D-

glucopyranoside (PS6), syringaresocinol (PS7) These isolated compounds were

evaluated for their anti-inflammatory activity by inhibiting NO production in the Lippo polysaccharide-activated RAW 264.7 macrophages The results showed that

four compounds PL3 - PL7 exhibited significant anti-inflammatory activity with

the IC50 values of 33.46 ± 2.13, 32.09 ± 3.34, 37.81 ± 1.18, 35.32 ± 1.14, 38.16 ±

1.35 µM, respectively comparing with positive standard NG-monomethyl-L-arginine

acetate (L-NMMA) with an IC50 value of 32.51 ± 3.70 µM, compound PL2 showed moderate inhibition ability with an IC50 value of 64.56 ± 1.18 µM, while PL1 did

not show activity Among compounds isolated from Piper sarmentosum, PS1

exhibited moderate inhibition activity with an IC50 value of 61,12±5,48 µM, whereas the remaining compounds did not show inhibitory activity These findings have contributed to explaining these plants’ therapeutic effects in traditional medicine

PHẦN III SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI 3.1 Kết quả nghiên cứu

đạt độ tinh khiết > 90%

Quy trình phân lập 14 hợp chất có thể áp dụng thực tế Khối lượng các chất phân lập được từ 5-75 mg Các hợp chất hóa học phân lập được đạt độ tinh khiết > 90%

(theo NMR)

2 Dẫn liệu đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất đã phân lập được

Các hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh NO trong điều kiện đại thục bào RAW 264.7 được kích thích

bởi LPS

14 hợp chất phân lập được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh NO trong điều kiện đại thục bào RAW 264.7 được kích thích

Ghi địa chỉ và cảm

ơn sự tài trợ của

Đánh giá chung

(Đạt,

được chấp nhận đơn hợp

lệ/ đã được cấp giấy xác nhận SHTT/ xác nhận sử dụng sản

phẩm)

ĐHQGHN đúng quy

định

không đạt)

1 Công trình công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus

1.1 Le Thi Huyen, Nguyen Thi Thu Hau, Phan

Van Kiem, Piperlongosides A–C, three new

phenolic constituents from Piper longum L

Natural Product Communications, 18(1),

Tên sáng chế: Hợp chất piperlongoside C có tác dụng kháng viêm và phương pháp phân

lập hợp chất này từ loài tiêu lốt Piper

longum L

Đã được chấp nhận đơn hợp lệ

đăng ký

4 Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus 4.1

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.1 6 Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng của đơn

vị sử dụng 7 Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách

hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

Ghi chú:

- Cột sản phẩm khoa học công nghệ: Liệt kê các thông tin các sản phẩm KHCN theo thứ tự <tên tác giả, tên công trình, tên tạp chí/nhà xuất bản, số phát hành, năm phát hành, trang đăng công trình, mã công trình đăng tạp chí/sách chuyên khảo (DOI), loại tạp chí ISI/Scopus>

- Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chỉ được chấp nhận nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm ơn tài trợ của ĐHQGHN theo đúng quy định

- Bản phô tô toàn văn các ấn phẩm này phải đưa vào phụ lục các minh chứng của báo cáo Riêng sách chuyên khảo cần có bản phô tô bìa, trang đầu và trang cuối có ghi thông tin mã số xuất bản

3.3 Kết quả đào tạo

Nghiên cứu sinh 1

Học viên cao học 1 Nguyễn

Thị Thu Hậu

02 tháng / 14.900.000 VNĐ

Luận văn: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kháng viêm của loài Tiêu lốt

(Piper longum L.) thuộc họ

- Cột công trình công bố ghi như mục III.1

PHẦN IV TỔNG HỢP KẾT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐỀ TÀI

đăng ký

Số lượng đã hoàn thành

1 Bài báo công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Scopus

5 Số lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa

Thuê khoán chuyên môn

Nguyên, nhiên v-t liÇu, cây con

Thi¿t bË, dång cå

Công tác phí DËch vå thuà ngoài

HÙi nghË, HÙi th£o, kiÃm tra tiÃn Ù, nghiÇm

TÕng sÑ

Minh chéng k¿t qu£ công bÕ

Minh chéng k¿t qu£ nghiên céu

Minh chéng k¿t qu£ ào t¡o

Don vË cho trì Á tài

(Thç tr°ßng ¡n vË k÷ tên, ông d¥u)

TRUÞNG I HÌC

KHOA HÌC

Tð NHIEN

Kinh phí

°ãc duyÇt (riÇu ông) 96,284

Nhóm nghiên céu kiÃn nghË các k¿t qu£ cça Á tài ·c biÇt ph§n nghiên céu vÛi Õi t°ãng

cây lá lÑt c§n °ãc nghiên céu sâu h¡n vÁ ph§n phân l-p và ánh giá ho¡t tính các sinh hÍc

cça các hãp ch¥t à có thà sÛm công bÕ các bài báo và b±ng Ùc quyÁn sáng chÃ

10

PHỤ LỤC 1 MINH CHỨNG KẾT QUẢ CÔNG BỐ

PHỤ LỤC 2 MINH CHỨNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

a Phân lập các hợp chất từ loài tiêu lốt

Để định hướng cho việc phân lập các hợp chất, phần trên mặt đất của loài P

longum được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 40°C, sau đó được xay nhỏ thu được

8.5 kg bột khô Tiến hành ngâm mẫu bột khô của loài P longum trong dung môi

MeOH và chiết siêu âm ở 50°C trong 30 phút, quy trình lặp lại 3 lần, mỗi lần 20 lít dung môi Sau đó, lọc lấy dịch chiết và gộp các dịch lọc MeOH, đem cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không thu được phần chiết MeOH (780 g) Phần chiết này được hòa tan trong 2 lít nước ấm, mang ra chiết phân đoạn

với các dung môi hữu cơ theo độ phân cực tăng dần: n-hexane, dichloromethane

(CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc) cho các dịch chiết hữu cơ tương ứng Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các phần chiết tương ứng:

n-hexane (PLH), CH2Cl2 (PLD), EtOAc (PLE) và còn lại là phần chiết nước

(PLW) Phần chiết MeOH và các phần chiết hữu cơ tương ứng được thử sàng lọc

hoạt tính kháng viêm ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào RAW264.7 được

kích thích bởi LPS Kết quả cho thấy chỉ có phần chiết PLW thể hiện hoạt tính tốt

với phần trăm ức chế là 78.4% ở nồng độ 200 µg/mL Do đó, phần chiết nước PLW

được lựa chọn để tiến hành phân lập các chất

Phần chiết PLW được phân cắt trên cột Diaion HP-20 và rửa giải với hệ

gradient dung môi MeOH/H2O theo tỷ lệ lần lượt 25%, 50%, 75% và 100% (v/v), mỗi hệ dung môi được sử dụng lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 lít Các phần cắt tương ứng được gộp lại với nhau, và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 4 phân đoạn

từ PL4A đến PL4D Hai phân đoạn PL4B (38 g) và PL4C (29 g) được gộp lại với nhau, và phân

tách trên cột sắc ký pha thường, rửa giải với hệ gradient dung môi CH2Cl2/MeOH

(tỷ lệ gradient từ 40/1 – 0/100, v/v) thu được 6 phân đoạn, ký hiệu PL4E1 –

PL4E6

Phân đoạn PL4E4 (20 g) được phân lập trên cột sắc ký pha đảo RP-18 và rửa

giải với hệ dung môi MeOH/H2O (1/1, v/v) thu được 4 phân đoạn, PL4E4A –

PL4E4D

Phân đoạn PL4E4A (1.9 g) được tiếp tục phân lập trên cột silica gel pha

thuận với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (5/1/0.1, v/v/v) thu được 3 phân đoạn từ

PL4E4A1 đến PL4E4A3 Phân đoạn con PL4E4A1 được tinh chế trên cột sắc ký

lỏng hiệu năng cao HPLC và rửa giải với hệ dung môi 16% ACN trong nước thu

được hợp chất PL2 (75.7 mg, tR 31.3 phút) và hợp chất PL3 (14.5 mg, tR 35.9 phút) Phân đoạn PL4E4B (2.2 g) được phân lập trên cột silica gel pha thuận, rửa

giải với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (5/1/0.1, v/v/v) thu được 3 phân đoạn,

PL4E4B1 – PL4E4B3 Phân đoạn con PL4E4B3 (215 mg) được tinh chế trên cột

sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với hệ dung môi 14% ACN trong nước thu được

hợp chất PL4 (16.0 mg, tR 48.0 phút) Phân đoạn PL4E4C (2.0 g) được phân tách trên cột silica gel pha thuận, rửa

giải với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O (1/2.5/0.12, v/v/v) thu được 3 phân đoạn,

PL4E4C1 – PL4E4C3 Phân đoạn PL4E4C1 (467 mg) được tinh chế trên cột sắc

ký lỏng hiệu năng cao HPLC và rửa giải với hệ dung môi 18% ACN trong nước thu

được hợp chất PL7 (58.5 mg, tR 38.6 phút) và hợp chất PL5 (142.7 mg, tR 43.2 phút) Phân đoạn PL4E4C2 (560 mg) được tinh chế trên cột sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với hệ dung môi rửa giải 18% ACN trong nước thu được hợp chất PL6

(12.4 mg, tR 36.7 phút) và hợp chất PL1 (18.2 mg, tR 44.6 phút) Quy trình phân lập các hợp chất được tóm tắt qua sơ đồ sau

16

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài tiêu lốt Piper longum L

b Phân tích và xác định cấu trúc của các hợp chất 1.1 Hợp chất PL1 – Piperlongoside A (hợp chất mới)

OCH3HO

H3CO

O

O

OHO

HO

OHOH3CO

OH

OHOH

12

3456

1¢2¢3¢4¢

5¢6¢1²

2²3²4²

5²6²

7²

HOH3CO

OH

OHOH

1

3

56

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất PL1 thấy xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của 3

proton thơm thuộc một hệ vòng ABX tại [δH 6.62 (dd, J = 8.0, 1.8 Hz, H-5), 7.03 (d, J = 8.0 Hz, H-6), và 7.07 (d, J = 1.8 Hz, H-3)], 2 proton thơm khác của hệ vòng AX khác tại δH 7.36 (2H, s, H-2", H-6"), 1 proton anomer tại δH 4.90 (d, J = 7.2 Hz, H-1') và tín hiệu của 6 proton khác thuộc vùng đường có chuyển dịch hóa học tại [δH 3.56 (dd, J = 9.0, 7.8 Hz, H-2'), 3.54 (t, J = 9.0 Hz, H-3'), 3.46 (t, J = 9.0 Hz, H-4'), 3.79 (m, H-5'), 4.71 (dd, J = 12.0, 2.4 Hz, H-6'), 4.44 (dd, J = 12.0, 7.8 Hz, H-6')] Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của PL1 còn có

sự xuất hiện các tín hiệu proton singlet đặc trưng của ba nhóm methoxy tại [δH 3.87 (3H, s), 3.89 (6H, s)], và tín hiệu của một nhóm trihydroxypropyl tại [δH 4.54 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-

7), 3.63 (1H, m, H-8), 3.34 và 3.50 (mỗi tín hiệu 1H, m, H-9)]

Dựa trên phổ 13C-NMR và các tương tác trên phổ HSQC, COSY và HMBC của PL1

đã chỉ ra tín hiệu của 25 nguyên tử carbon Trong đó, tín hiệu của carbon tại δC 167.8 gợi ý tín hiệu đặc trưng của một nhóm carbonyl; 12 tín hiệu carbon trong vùng δC 108.6 – 150.5 gợi ý sự xuất hiện của hai vòng thơm ABX và AX; ba nhóm methoxyl tại δC 56.7 và 57.1, một đơn vị đường glucose và một khung trihydroxypropanyl tại δC 64.2 – 102.8 Từ các

phân tích trên, gợi ý cấu trúc hoá học hợp chất PL1 là một phenolic glucoside

Trên phổ HSQC của PL1 cho thấy các tương tác giữa proton và carbon liên kết trực

tiếp với nhau Cụ thể, các tương tác trên phổ HSQC chỉ ra các tín hiệu proton của H-3 (δH 7.07), H-5 (δH 6.62), H-6 (δH 7.03), H-7 (δH 4.54), H-8 (δH 3.63) và H-9 (δH 3.50/3.34) tương tác lần lượt với carbon tại δC 112.4 (C-3), 120.4 (C-5), 117.3 (C-6), 75.0 (C-7), 77.3 (C-8)

và 64.2 (C-9) Trong khi đó, các tín hiệu proton khác của H-1' (δH 4.90), H-2' (δH 3.56), H-3'

(δH 3.54), H-4' (δH 3.46), H-5' (δH 3.79), H-6' (δH 4.71/4.44) tương tác lần lượt với các tín

hiệu carbon có độ chuyển dịch hoá học tại δC 102.8 1'), 74.9 2'), 77.7 3'), 72.0

(H-4'), 75.6 (H-5') và 65.2 (H-6')

Kết hợp với tương tác trên phổ COSY giữa proton và proton của hai carbon liền kề,

cho thấy tín hiệu tương tác giữa H-1' (δH 4.90), H-2' (δH 3.56), H-3' (δH 3.54), H-4' (δH 3.46), H-5' (δH 3.79) và H-6' (δH 4.71/4.44), gợi ý mảnh ghép giữa C-1'/C-2'/C-3'/C-4'/ C-5'/C-6'

của 1 đơn vị đường Tương tự, các tương tác COSY giữa H-5 (δH 6.62) và H-6 (δH 7.03); giữa H-7 (δH 4.54) với H-8 (δH 3.63) và H-9 (δH 3.50/3.34), gợi ý hai mảnh ghép giữa C-5/C-

6 và C-7/C-8/C-9

Phân tích các tương tác trên phổ HMBC giữa H-3 (δH 7.07) và C-2 (δC 150.5)/C-5 (δC 120.4)/C-6 (δC 117.3)/C-7 (δC 75.0); giữa H-5 (δH 6.62) và C-1 (δC 147.2)/C-3 (δC 112.4)/C-7 (δC 75.0) và giữa H-6 (δH 7.03) và C-2 (δC 150.5)/C-1 (δC 147.2) gợi ý mảnh ghép C-5/C-6

thuộc một vòng thơm hệ ABX Bên cạnh đó, khi phân tích tín hiệu tương tác HMBC giữa

H-7 (δH 4.54) và C-3 (δC 112.4)/C-5 (δC 120.4)/C-8 (δC 77.3)/C-9 (64.2); giữa proton của

nhóm methoxy tại (δH 3.87) và C-2 (δC 150.5) gợi ý khung trihydroxylpropyl liên kết trực tiếp với vòng thơm tại vị trí C-4 và một nhóm methoxy tại vị trí C-2 Không những thế,

tương tác giữa H-3' (δH 3.54) và C-2' (δC 74.9)/C-4' (δC 72.0) và tương tác giữa proton

anomer của vùng đường H-1' (δH 4.90) và C-1 (δC 147.2) chỉ ra rằng đường glucose liên kết với vòng thơm hệ AX tại vị trí C-1 bằng một liên kết O-glycoside Ngoài những tương tác trên, các tương tác trên phổ HMBC còn cho thấy các tương tác giữa proton H-2" (δH 7.36) và C-3" (δC 149.0)/C-4" (δC 142.0)/C-6" (δC 108.6)/C-7" (δC 167.8); giữa H-6' (δH 4.44/4.71) và C-7" (δC 167.8) chỉ ra liên kết O-glycoside khác giữa C-6' của vùng đường với một nhóm

3",5"-dimethoxygalloyl

Hơn nữa, khi xét độ chuyển dịch hóa học của carbon trên phổ 13C-NMR của hợp chất

PL1 tại vị trí C-7 (δC 75.0)/C-8 (δC 77.3) với tài liệu tham khảo cho thấy PL1 có sự tương

đồng về độ chuyển dịch hóa học tại 2 vị trí này của hợp chất

(threo)-2-methoxy-4-(1',2',3'-trihydroxyphenol (PL1a) δC 74.9 (C-7) và 77.8 (C-8); và khác biệt với hợp chất

(erythro)-2-methoxy-4-(1',2',3'-trihydroxyphenol) [δC 76.1 (C-7) và 76.5 (C-8)], trong cùng dung môi

đo phổ là CD3OD [4] Đồng thời, hằng số ghép cặp của proton anomeric H-1' lớn (J = 7.2

Hz), gợi ý phần đường có lập thể dạng β Cuối cùng, khi thủy phân trong môi trường acid

hợp chất PL1, rồi xử lý với TMS, sau đó phân tích lại trên HPLC và so sánh với tài liệu

tham khảo giá trị tR của D/L-glucose đã xác định được lập thể của đường là D-glucose [5, 6]

Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập Như vậy, dựa trên sự phân tích dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, COSY và HMBC

đã khẳng định được cấu trúc hóa học của hợp chất PL1 là

(7,8-threo)-1-O-β-D-[6′-O-syringoylglucopyranosyl]-2-methoxy-7,8,9-trihydroxyphenylpropane Đây là một hợp chất phenolic mới và được đặt tên là piperlongoside A

Hình 1.2: Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC chính của hợp chất PL1

Hình 1.3: Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất PL1

Hình 1.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất PL1

Hình 1.5: Phổ 13C-NMR của hợp chất PL1

Hình 1.6: Phổ HSQC của hợp chất PL1

Hình 1.7: Phổ HMBC của hợp chất PL1

Hình 1.8: Phổ 1H-1H COSY của hợp chất PL1

1.2 Hợp chất PL2 – Piperlongoside B (hợp chất mới)

Hình 1.9: Cấu trúc hóa học của hợp chất PL2 và hợp chất tham khảo PL2a Hợp chất PL2 thu được là chất rắn không màu Công thức phân tử được xác định là

C25H32O12 dựa trên phân tích tín hiệu trên phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS cho

peak ion giả phân tử tại m/z 542.2234 [M + NH4]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C25H36NO12]+: 542.2233)

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất PL2 thấy xuất hiện tín hiệu đặc trưng của các proton

thơm thuộc hai hệ vòng ABX tại [δH 7.03 (d, J = 8.4 Hz, 6"), 7.55 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 5", 7.47 (d, J = 1.8 Hz, H-3")] và [δH 7.14 (d, J = 1.8 Hz, H-3), 7.09 (d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.99 (d, J = 8.4, 1.8 Hz, H-5)]; các tín hiệu của proton vùng đường gồm 1 proton anomer tại

H-δH 4.81 (d, J = 7.8 Hz) và 6 proton khác tại [δH 3.49 (dd, J = 9.0, 7.8 Hz, H-2'), 3.40 (t, J =

9.0 Hz, H-3'), 3.40 (t, J = 9.0 Hz, H-4'), 3.48 (m, H-5'), 3.87 (dd, J = 12.0, 1.8 Hz, H-6'), 3.70 (dd, J = 12.0, 4.8 Hz, H-6')] Đồng thời, dữ liệu trên phổ 1H-NMR của 2 còn đưa ra tín

hiệu của một khung trioxygenated propanyl tại [δH 4.88 (d, J = 6.6 Hz, H-7), 4.62 (m, H-8), 3.89 (d, J = 7.2 Hz, H-9)] và tín hiệu singlet đặc trưng của 1 nhóm acetyl tại δH 2.54 (3H, s) và 2 nhóm methoxy tại [δH 3.83 (3H, s), 3.84 (3H, s)]

Phân tích các tín hiệu trên phổ 13C-NMR và HSQC của PL2 chỉ ra tín hiệu của 25

carbon bao gồm tín hiệu carbon nhóm acetyl tại [ứng với C-7" (δC 199.5) của nhóm

carbonyl và C-8" (δC 26.3)] Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR còn thấy xuất hiện tín hiệu của 12

carbon thơm nằm trong vùng δC 112.4 – 154.1; 2 nhóm methoxy tại δC 56.5 và 56.7; cùng với các tín hiệu carbon của một đơn vị đường và 3 carbon của đơn vị trioxygenated

propanyl tại δC 62.4 – 103.0 Dựa trên các tín hiệu thu được từ dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR,

HSQC và so sánh với tài liệu tham khảo, gợi ý cấu trúc của PL2 rất giống với cấu trúc

phẳng của lycocernuaside E [7]

Để khẳng định cấu trúc của hợp chất PL2, ta phân tích tín hiệu tương tác giữa proton

và proton, giữa proton và carbon trên các phổ 2D-NMR gồm COSY, HSQC và HMBC

Trên phổ COSY của hợp chất PL2 cho thấy, tương tác giữa H-7 (δH 4.88) với H-8 (δH 4.62)/

H-9 (δH 3.89) gợi ý cho mảnh ghép giữa C-7/C-8/C-9; giữa H-5" (δH 6.62) và H-6" (δH 7.03)

gợi ý mảnh ghép của C-5"/C-6" Tương tự, phổ COSY cũng cho xuất hiện các tương tác

giữa H-1' (δH 4.81)/ H-2' (δH 3.49)/ H-3' (δH 3.40)/ H-4' (δH 3.40)/ H-5' (δH 3.48)/ H-6' (δH 3.70/3.87) của 1 đơn vị đường Thêm vào đó tương tác HMBC giữa H-3" (δH 7.47) và C-1" (δC 154.1)/C-2" (δC 151.1)/C-4" (δC 131.8)/C-5" (δC 124.4)/C-7" (δC 199.5), giữa H-5" (δH 7.55) và C-1" (δC 154.1)/C-3" (δC 112.4)/C-7" (δC 199.5), giữa H-6" (δH 7.03) và C-1" (δC 154.1)/C-2" (δC 151.1)/C-4" (δC 131.8)/C-5" (δC 124.4); giữa H-8" (δH 2.54) và C-7" (δC 199.5); và giữa proton của nhóm methoxy tại (δH 3.83) và C-2" (δC 151.1) đã chỉ ra tín hiệu

của một vòng thơm có thế 1 nhóm acetyl tại C-4" và 1 nhóm methoxy tại C-2" Ngoài ra,

tương tác trên phổ HMBC của PL2 còn cho thấy tín hiệu tương tác của một mảnh ghép

vòng thơm hệ ABX khác Cụ thể, tương tác HMBC giữa và C-2 (δC 150.4)/C-5 (δC 121.2)/C-1 (δC 147.5)/C-4 (δC 137.4); giữa H-6 (δH 7.09) và C-1 (δC 147.5)/C-5 (δC 121.2)/C-2 (δC 150.4)/C-4 (δC 137.4); và giữa H-5 (δH 6.99) và C-3 (δC 112.9)/C-1 (δC 147.5) Thêm vào đó, tương tác giữa proton nhóm methoxy tại δH 3.84 và C-2 (δC 150.4) và proton anomer tại δH 4.81 và C-1 (δC 147.5), gợi ý ra liên kết giữa nhóm methoxy với vòng thơm tại vị trí C-2 và đơn vị đường liên kết tại vị trí C-1 Hơn nữa, mảnh ghép của khung trioxygenated-propanyl được xác định trên phổ COSY và được khẳng định trên phổ HMBC qua tương tác

giữa H-7 (δH 4.88) và C-8 (δC 84.9)/C-9 (δC 62.4), giữa H-8 (δH 4.62) và C-7 (δC 73.8)/C-9

(δC 62.4), và giữa H-9 (δH 3.89) với C-8 (δC 84.9)/C-7 (δC 73.8), tương tác giữa H-8 (δH 4.62) và C-1" (δC 154.1)/C-4 (δC 137.4), từ H-5 (δH 6.99)/H-3 (δH 7.14) đến C-7 (δC 73.8) gợi ý nhóm trioxygenated-propanyl được gắn tại vị trí C-4 và C-1"

Bằng việc phân tích dữ liệu các phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, COSY, HMBC của hợp

chất 2 và so sánh với tài liệu tham khảo cho thấy độ chuyển dịch carbon tại [C-7 (δC 73.8),

C-8 (δC 84.9), C-9 (δC 62.4)] của PL2 khác với cấu hình erythro của lycocernuaside E tại

[C-7 (δC 73.5), C-8 (δC 85.4), C-9 (δC 62.0)] trong tài liệu tham khảo, mặc dù chúng được đo

trong cùng dung môi CD3OD [7] Hơn nữa, trên phổ HSQC, các tín hiệu proton của H-9

xuất hiện riêng rẽ ở hai độ chuyển dịch hóa học tại δH 3.60 và 3.87 trong lycocernuaside E, trong khi chúng lại cho tín hiệu proton doublet tại δH 3.89 (2H, d, 7.2 Hz) ở PL2 Những

bằng chứng trên gợi ý cấu hình của hợp chất PL2 là 7,8 threo Thêm vào đó, hằng số ghép

cặp lớn JH-1'/H-2' (7.8 Hz) của proton anomeric chỉ ra định hướng axial của H-1' và H-2'

Đường D-glucose của PL2 cũng được xác định bằng phương pháp thủy phân tương tự như

đối với hợp chất PL1 [5, 6]

Do đó, dựa trên phân tích dữ liệu các tín hiệu phổ 1D-, 2D-NMR kết hợp so sánh với

tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của PL2 được xác định là

(7,8-threo)-8-O-(2"-

methoxyacetophenone-1"-yl)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-methoxy-7,9-dihydroxyphenylpropane Đây là hợp chất mới và được đặt tên là piperlongoside B

Hình 3.10: Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC của hợp chất PL2

9 62.4 3.89 (d, 7.2) 1' 103.0 4.81 (d, 7.8) 2' 74.9 3.49 (dd, 9.0, 7.8) 3' 78.1 3.40 (t, 9.0) 4' 71.3 3.40 (t, 9.0)

6' 62.5 3.87 (dd, 12.0, 1.8)/3.70 (dd, 12.0, 4.8) 1" 154.1 ―

2" 151.1 ― 3" 112.4 7.47 (d, 1.8) 4" 131.8 ―

5" 124.4 7.55 (dd, 8.4, 1.8) 6" 115.7 7.03 (d, 8.4) 7" 199.5 ―

8" 26.3 2.54 (s) 2-OCH3 56.5 3.84 (s) 2"-OCH3 56.7 3.83 (s)

Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập

Hình 1.11: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PL2

Hình 1.12: Phổ 1H-NMR của hợp chất PL2

Hình 1.13: Phổ 13C-NMR của hợp chất PL2

Hình 1.14: Phổ HSQC của hợp chất PL2

Hình 1.15: Phổ HMBC của hợp chất PL2

Hình 1.16: Phổ 1H-1H COSY của hợp chất PL2

1.3 Hợp chất PL3 – Piperlongoside C (hợp chất mới)

Hình 1.17: Cấu trúc hóa học của hợp chất PL3 Hợp chất PL3 thu được là chất rắn không màu Công thức phân tử được xác định dựa

trên phân tích dữ liệu phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS (peak ion giả phân tử tại

m/z 403.1596 [M + H]+), cho phép xác định công thức phân tử là C18H26O10

Trên phổ 1H-NMR của hợp chất PL3 chỉ ra các tín hiệu proton của hệ vòng ABX tại

[δH 7.23 (d, J = 8.4 Hz, H-6"), 7.67 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-5"), 7.58 (d, J = 1.8 Hz, H-3")]; hai tín hiệu singlet đặc trưng của một nhóm acetyl tại δH 2.58 (3H, s) và một nhóm methoxy tại δH 3.91 (3H, s) Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của PL3 còn cho thấy tín hiệu đặc trưng của

một đơn vị đường và một đơn vị glyceryl có độ chuyển dịch proton dao động trong khoảng

δH 3.21 – 4.69

Kết hợp phân tích dữ liệu phổ 13C-NMR và HSQC của PL3 cho thấy sự hiện diện

của 18 nguyên tử carbon bao gồm một nhóm carbonyl tại δC 199.4 (C-7"), một nhóm methyl tại δC 26.3 (dựa trên tương tác giữa H-8" (δH 2.58)/C-8" (δC 26.3)); tín hiệu carbon của một nhóm methoxy tại δC 56.5 Ngoài ra, còn có 6 tín hiệu chuyển dịch của carbon vòng thơm trong khoảng δC 112.5 – 151.3; 6 tín hiệu carbon của một đơn vị đường trong vùng δC 62.7 – 104.9 và 3 tín hiệu của một nhóm glyceryl tại δC 62.1, 68.9, 80.3

Phân tích dữ liệu tương tác trên phổ COSY, ta thấy tương tác giữa H-5" (δH 7.67) và H-6" (δH 7.23) gợi ý mảnh ghép liên kết giữa C-5"/C-6" Tương tác COSY giữa H-1 (δH 3.90/4.09), H-2 (δH 4.69) và H-3 (δH 3.86/3.90) gợi ý cho mảnh liên kết giữa C-1/C-2/C-3, và tương tác giữa H-1' (δH 4.36), H-2' (δH 3.22), H-3' (δH 3.37), H-4' (δH 3.21), H-5' (δH 3.29) và H-6' (δH 3.67/3.84) gợi ý mảnh ghép C-1'/C-2'/C-3'/C-4'/C-5'/C-6' của một đơn vị đường

Từ kết quả phân tích các dữ liệu trên và các tương tác HMBC giữa H-3" (δH 7.58) và C-1" (δC 153.6)/C-2" (δC 151.3)/C-5" (δC 124.6)/C-7" (δC 199.4), giữa H-5" (δH 7.67) và C-1" (δC 153.6)/C-3" (δC 112.5)/C-7" (δC 199.4), giữa H-6" (δH 7.23) và C-1" (δC 153.6)/C-2" (δC 151.3)/C-4" (δC 132.2)/C-5" (δC 124.5); giữa H-8" (δH 2.58) và C-7" (δC 199.4)/C-4" (δC 132.2) và proton methoxy tại δH 3.91 với C-2" (δC 151.3) gợi ý một khung [2"-methoxy-4"-acetylphenoxyl] Đồng thời tương tác giữa H-1 (δH 4.09) và C-2 (δC 80.3)/C-3 (δC 62.1), giữa H-2 (δH 4.69) và C-1 (δC 68.9)/C-1" (δC 153.6)/C-3 (δC 62.1), và giữa H-3 (δH 3.85) với C-2 (δC 80.3)/C-1 (δC 68.9) gợi ý liên kết giữa nhóm glyceryl tại C-2 và vòng thơm tại C-1" Bên

cạnh đó, cấu trúc của 1 đơn vị đường được xác định dựa trên tương tác HMBC giữa H-1' (δH 4.36) và C-5' (δC 78.0) và tương tác giữa H-1 (δH 4.09) và C-1' (δC 104.9) với tương tác giữa H-1' (δH 4.36) và C-1 (δC 68.9), và mảnh ghép thu được trên phổ COSY gợi ý liên kết O-glycoside với đơn vị glyceryl tại vị trí C-1 Hằng số tương tác của proton anomer J = 7.8 Hz

đặc trưng của đường β Đường D-glucose của PL3 được xác định bằng phương pháp thủy

phân tương tự với PL1 và PL2 [5, 6]

Dựa trên việc phân tích các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HSQC, COSY, HMBC khẳng

định cấu trúc của hợp chất PL3 là

1-O-β-D-glucopyranosyl-2-O-(2"-methoxy-4"-acetylphenyl)-3-hydroxypropane Đây là hợp chất phenolic mới và được đặt tên là piperlongoside C

Hình 1.18: Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC của hợp chất PL3

6' 62.7 3.67 (dd, 12.0, 5.4)/ 3.84* 1" 153.6 ―

2" 151.3 ― 3" 112.5 7.58 (d, 1.8) 4" 132.2 ―

5" 124.6 7.67 (dd, 8.4, 1.8) 6" 115.7 7.23 (d, 8.4) 7" 199.4 ―

8" 26.3 2.58 (s)

Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập

Hình 1.19: Phổ HR-ESI-MS của hợp chất PL3

Hình 1.20: Phổ 1H-NMR của hợp chất PL3

Hình 1.21: Phổ 13C-NMR của hợp chất PL3

Hình 1.22: Phổ HSQC của hợp chất PL3

Hình 1.23: Phổ HMBC của hợp chất PL3

Hình 1.24: Phổ 1H-1H COSY của hợp chất PL3

1.4 Hợp chất PL4 – (-)-isolariciresinol 2-O-β-D-glucopyranoside

Hình 1.25: Cấu trúc hóa học của hợp chất PL4 và hợp chất tham khảo PL4a

Hợp chất 4 thu được là chất rắn màu vàng nhạt Trên phổ 1H-NMR của hợp chất PL4 cho thấy sự xuất hiện của các tín hiệu proton thơm trong đó có ba tín hiệu proton đặc trưng

của một hệ vòng ABX tại [δH 6.72 (d, J = 1.8 Hz, H-2'), 6.65 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, H-5')] và hai tín hiệu proton singlet đặc trưng của một hệ vòng AX tại [δH 6.53 (1H, s, H-1), 6.79 (1H, s, H-4)] Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR của 4 còn chỉ ra các tín

hiệu proton đặc trưng của một đơn vị đường tại [δH 4.42 (d, J = 7.8 Hz, H-1"), 3.44 (1H, m, H-2"), 3.37 (1H, m, H-3"), 3.34 (1H, m, H-4"), 3.20 (1H, m, H-5"), 3.65 (1H, br d, J = 11.4 Hz, H-6"), 3.78 (1H, dd, J = 11.4, 5.4 Hz, H-6")], hai tín hiệu proton singlet đặc trưng của hai nhóm methoxy tại [δH 3.85 (3H, s) và 3.81 (3H, s)], hai nhóm hydroxymethylene tại [δH 3.67 (dd, J = 10.8, 2.4 Hz, H-6a), 3.70 (dd, J = 10.8, 6.4 Hz, H-6a), 3.43 (dd, J = 9.0, 4.2 Hz, H-7a) và 3.44 (dd, J = 9.0, 2.4 Hz, H-7a)], và các tín hiệu proton khác tương ứng của một nhóm methylene tại δH 2.83 (d, J = 7.8 Hz, H-5) và ba nhóm methine tại [2.07 (m, H-6),

1.81 (m, H-7) và 4.83 (br s, H-8)]

Trên phổ 13C-NMR của hợp chất PL4 gợi ý sự hiện diện của 26 carbon Cụ thể, có 6

tín hiệu carbon tại δC 103.4, 74.6, 77.8, 70.8, 77.9 và 62.0 đặc trưng cho một nhóm glucopyranosyl; hai tín hiệu carbon đặc trưng cho hai nhóm methoxy tại δC 56.4 và 57.0; 12 tín hiệu đặc trưng cho hai vòng thơm tại δC 113.3 – 149.0 Còn lại, 6 tín hiệu carbon khác

đại diện cho hai nhóm hydroxymethylene tại δC 65.9 và 62.3; một nhóm methylene tại δC 33.4 và ba nhóm methine tại [δC 39.9, 47.5 và 48.2] Từ các tín hiệu 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PL4, gợi ý PL4 là một lignan glucoside chứa hai nhóm hydroxymethylene tại C-6a và C-7a

Phân tích các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất PL4, giữa H-1 (δH 6.53) và C-2

(δC 146.3)/C-8 (δC 48.2)/C-9 (δC 132.3)/C-10 (δC 134.7), giữa H-4 (δH 6.76) và C-2 (δC 146.3)/C-3 (δC 148.6)/C-5(δC 33.4)/C-10 (δC 134.7), giữa proton anomer H-1" (δH 4.42) và

C-2 (δC 146.3), và giữa proton của một nhóm methoxy tại δH 3.85 đến C-3 (δC 148.6) gợi ý

liên kết của nhóm methoxy tại vị trí C-3 và một đơn vị đường liên kết tại C-2 của một vòng

thơm Hơn thế nữa, tương tác HMBC giữa H-5' (δH 6.77) và C-1' (δC 138.2)/C-3' (δC

149.0)/C-4' (δC 146.1)/C-6' (δC 123.2), giữa H-2' (δH 6.72) và C-1' (δC 138.2)/C-3' (δC 149.0)/C-4' (δC 146.1)/C-6' (δC 123.2)/C-8 (δC 48.2), giữa H-6' (δH 6.65) và C-1' (δC 138.2)/C-2' (δC 113.9)/C-4' (δC 146.1)/C-5' (δC 116.1)/C-8 (δC 48.2) và giữa proton của một nhóm methoxy tại δH 3.81 đến C-3' (δC 149.0) gợi ý mảnh ghép của một nhóm [4'-hydroxy-

3'-methoxyphenyl] liên kết tại vị trí C-8 Đồng thời, trên phổ HMBC còn gợi ý một loạt các tương tác khác giữa proton và carbon để khẳng định cấu trúc khung aglycone của hợp chất

PL4 là một lignan đã biết là isolariciresinol Đơn vị đường có lập thể β- được xác định dựa

trên hằng số tương tác của proton anomer Jlớn = 7.8 Hz Dựa trên các phân tích từ phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC, cấu trúc hoá học của hợp chất PL4 được gợi ý là isolariciresinol 2-O-

β-D-glucopyranoside

Bảng 1.4: Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PL4 và TLTK C *δC #δC δCa,b δHa,c (độ bội, J = Hz)

1 118.8 118.9 119.0 6.53 (s)

4 113.4 113.5 113.3 6.79 (s) 5 33.1 33.8 33.4 2.83 (d, 7.8)

3'-OCH3 56.4 57.0 56.8 3.82 (s) Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập, *δC của balanophoroside B

[6], #δC của sargentodoside C [8]

Kết hợp so sánh các dữ kiện phổ 13C-NMR của PL4 với chất tham khảo

sargentodoside C, cho thấy sự khác biệt về độ chuyển dịch carbon tại C-3 (δC 148.6) và C-4' (δC 146.1) của PL4 với hợp chất tham khảo sargentodoside C tại vị trí tương ứng là δC 146.0 và 148.8 [8] Gợi ý trong cấu trúc hoá học của PL4 có sự hoán đổi vị trí của nhóm methoxy

và hydroxyl tại vị trí C-3 và C-4' khi so sánh với hợp chất sargentodoside C Cụ thể ở PL4

nhóm methoxy được gắn vào vị trí C-3 và nhóm hydroxyl được gắn vào vị trí C-4'

Ngoài ra, lập thể của hợp chất PL4 được xác định như sau: khi phân tích các hiệu ứng trên phổ lưỡng sắc tròn CD của hợp chất PL4 thấy có xuất hiện ba đỉnh hiệu ứng Cotton đặc

trưng tại Δε: +2.52 (239 nm), +2.01 (274 nm), -2.63 (291 nm) Khi so sánh phổ CD của hợp

chất PL4 với tài liệu tham khảo, tại vị trí C-8, chỉ ra rằng hiệu ứng Cotton âm tại 291 nm

đặc trưng cho cấu hình tuyệt đối 8S và ngược lại, hiệu ứng Cotton dương tại 291 nm đặc trưng cho cấu hình tuyệt đối R [6, 8-10] Trong khi đó, đối với hai vị trí C-6 và C-7, nếu có

sự xuất hiện của hai hiệu ứng Cotton dương tại 239 nm và 274 nm trên phổ CD, chỉ ra cấu

hình tuyệt đối là (6R,7S) [6, 8] Do đó, dựa trên các hiệu ứng Cotton thu được trên phổ CD

của 4 thấy xuất hiện một hiệu ứng Cotton âm tại 291 nm và hai hiệu ứng Cotton dương tại

237 nm và 274 nm Từ đó, cấu hình tuyệt đối của PL4 tại các vị trí C-6, C-7 và C-8 được

khẳng định là (6R,7S,8S) [8]

Như vậy, dựa trên toàn bộ các phân tích dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR, HMBC, CD và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc hoá học của PL4 được xác định là (6R,7S,8S)-

hydroxy-3'-methoxyphenyl)-naphthalene hay (-)-isolariciresinol 2-O-β-D-glucopyranoside

5,6,7,8-tetrahydro-2-O-β-D-glucopyranoside-3-methoxy-6,7-bis(hydroxymethyl)-8-(4'-Hình 1.26: Các tương tác HMBC chính của hợp chất PL4

(1H, s, H-5) và 6.67 (1H, s, H-8)], tín hiệu của các proton vùng đường gồm tín hiệu proton

anomer tại δH 4.14 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1") và các proton khác chuyển dịch hoá học tại [δH 3.23 (1H, m, H-2"), 3.37 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-3"), 3.30 (1H, t, J = 9.6 Hz, H-4"), 3.23 (1H, m, H-5"), 3.67 (1H, dd, J = 12.0, 6.0 Hz, H-2") và 3.85 (1H, dd, J = 12.0, 2.4 Hz, H-2")]

Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR còn thấy xuất hiện tín hiệu proton singlet đặc trưng của hai

nhóm methoxy tại δH 3.82 (6H, s) và tín hiệu proton của một nhóm hydroxymethylene tại δH 3.78 (2H, dd, J = 10.8, 3.6 Hz, H-2a) và 1 nhóm oxygenated methylene tại [δH 3.78 (1H, dd,

J = 10.2, 3.6 Hz, H-3a), 4.08* (1H, H-3a)], cùng với một loạt các tín hiệu proton khác của

một nhóm methylene và ba nhóm methine chuyển dịch lần lượt tại [δH 2.84 (2H, t, J = 9.6

Hz, H-1), 2.11 (1H, m, H-2), 1.89 (1H, m, H-3) và 4.08* (1H, H-4)]

Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR và HSQC của PL5 cũng chỉ ra tín hiệu của 26 carbon

bao gồm: 12 tín hiệu carbon của hai vòng thơm dao động trong khoảng δC 112.5 – 148.9; 6 tín hiệu carbon của đơn vị đường với đặc trưng của một carbon anomer tại δC 105.2 (C-1") và 5 tín hiệu carbon khác tại δC 75.2 (C-2"), 78.1 (C-3"), 71.7 (C-4"), 77.9 (C-5") và 62.8 (C-6"); hai tín hiệu carbon của một nhóm hydroxymethylene tại δC 65.2 (C-2a) và một nhóm oxygenated-methylene tại δC 69.6 (C-3a) Hơn nữa, trên phổ 13C-NMR của PL5 còn xuất hiện

tín hiệu carbon đặc trưng của 2 nhóm methoxy tại δC 56.4 và 56.5; và các tín hiệu carbon khác của nhóm methylene và methine tại δC 33.9 (C-1), 39.6 (C-2), 45.9 (C-3) và 47.9 (C-4)

Dựa trên phân tích các dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HSQC, gợi ý hợp chất PL5 là

một isolariciresinol kiểu lignan glycoside Trong đó, tín hiệu dạng đường glucopyranoside được xác định và khẳng định dựa trên hằng số tương tác (J = 7.8 Hz) của proton anomer tại δH 4.14 Thêm vào đó, tương tự với PL4, lập thể của hợp chất PL5 được

β-D-xác định dựa trên phổ lưỡng sắc tròn CD tại các vị trí C-2, C-3 và C-4 Cụ thể, trên phổ CD

của 5 thấy xuất hiện ba hiệu ứng Cotton đặc trưng tại Δε: -12.83 (239 nm), -5.12 (274 nm),

+7.50 (291 nm) Khi so sánh PL5 với PL4 tại các vị trí tương tự, hiệu ứng Cotton dương tại

291 nm khẳng định cấu hình tuyệt đối của PL5 là R tại vị trí C-4 Đồng thời, hai hiệu ứng

Cotton âm tại 238 nm và 274 nm, xác định cấu hình tuyệt đối S, R tại vị trí C-2, C-3 của hợp

chất PL5 Các hiệu ứng trên phổ CD của PL5 chỉ ra rằng cấu hình tuyệt đối của PL5 ngược cấu hình tuyệt đối của PL4 nhưng lại tương đồng với cấu hình của chất tham khảo sargentodoside B Do đó, cấu hình tuyệt đối của PL5 tại các vị trí C-2, C-3 và C-4 được

3'-OCH3 56.6 56.5 3.82 (s)

Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập Do đó, dựa trên phân tích các các dữ kiện phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, CD của 5

và so sánh tài liệu tham khảo cho thấy 5 có sự trùng khớp với (+)-isolariciresinol

3a-O-β-D-glucopyranoside [50] Do đó, cấu trúc của hợp chất đã được xác định

J = 7.8 Hz, H-5')] và 2 tín hiệu singlet đặc trưng của vòng thơm hệ AX tại [δH 6.21 (1H, s,

H-5), 6.66 (1H, s, H-8)] Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR của 6 còn cho thấy tín hiệu singlet

đặc trưng của hai nhóm methoxy tại [δH 3.80 (3H, s) và 3.79 (3H, s)], một nhóm

hydroxymethylene tại δH 3.32 (dd, J = 11.4, 2.4 Hz, H-2a), một nhóm methylene tại δH 3.83 (dd, J = 11.4, 4.8 Hz, H-2') và các tín hiệu proton vùng đường gồm [một proton anomeric tại δH 4.06 (d, J = 7.8 Hz, H-1") và một loạt các tín hiệu proton chuyển dịch tại δH 3.07 – 3.70] Ngoài ra, các tín hiệu proton của một nhóm methylene khác tại [δH 2.89 (dd, J = 15.6, 10.8 Hz, H-1), 2.74 (dd, J = 16.2, 4.2 Hz, H-1)] và 3 nhóm methine tại [δH 1.96 (2H, m, H-2, H-3) và 3.77 (d, J = 3.0 Hz, H-4)] cũng xuất hiện trên phổ

oxygenated-1H-NMR

Trên phổ 13C-NMR của PL6 thấy xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử carbon Trong

đó, có 12 tín hiệu carbon olefinic của hai vòng thơm trong vùng δC 112.3 – 148.9; hai tín

hiệu carbon đặc trưng của hai nhóm methoxy tại δC 56.5 và 56.4; cùng sự xuất hiện của các

tín hiệu của 6 carbon thuộc vùng đường và tín hiệu carbon của nhóm methylene liên kết trực

tiếp với nguyên tử oxygen tại δC 62.4 – 103.6 Hơn nữa, trên phổ 13C-NMR của PL6 còn gợi

ý các tín hiệu carbon của một nhóm methylene tại δC 33.6 (C-1) và ba nhóm methine lần lượt tại

δC 41.1 (C-2), 45.2 (C-3) và 48.5 (C-4)

Dựa trên phân tích một loạt các tín hiệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR, gợi ý hợp chất

PL6 là một isolariciresinol kiểu lignan glycoside Khi so sánh dữ liệu phổ của PL6 và PL5

cho thấy PL6 có cấu trúc tương đồng với cấu trúc phẳng của PL6, gợi ý cấu trúc hoá học

của PL6 là isolariciresinol 3a-O-β-D-glucopyranoside

Bảng 1.6: Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất PL5, PL6 và TLTK

δCa,b δC[12] δCa,b δHa,c (mult., J = Hz)

1 33.9 33.6 33.6 2.89 (dd, 16.2, 10.8)/ 2.74 (dd, 16.2, 4.2) 2 39.6 41.1 41.1 1.96 (m)

2a 65.2 65.5 65.5 3.73 (m)/ 3.82 (d, 4.8) 3 45.9 45.3 45.2 1.96 (m)

3a 69.6 70.7 70.7 3.33 (m)/ 3.47 (m) 4 47.9 48.3 48.5 4.06 (d, 7.8) 5 117.4 117.4 117.4 6.21 (s) 6 145.8 145.9 145.9 ― 7 147.1 147.3 147.2 ― 8 112.5 112.3 112.3 6.76 (s) 9 129.2 138.8 138.7 ― 10 134.4 129.3 129.3 ― 1' 138.7 133.7 133.6 ― 2' 114.4 113.9 114.0 6.70 (d, 1.8) 3' 148.9 149.0 148.9 ―

4' 145.2 145.2 145.1 ― 5' 116.1 116.0 116.0 6.77 (d, 7.8) 6' 123.1 123.5 123.4 6.65 (dd, 7.8, 1.8) 1" 105.2 103.8 103.6 4.06 (d, 7.8) 2" 75.2 75.0 74.9 3.36 (m) 3" 78.1 78.2 78.1 3.30 (m) 4" 71.7 71.4 71.3 3.20 (t, 8.4) 5" 77.9 77.8 77.7 3.07 (m) 6" 62.8 62.4 62.4 3.65 (dd, 12.0, 6.0)/ 3.77 (dd, 12.0, 3.0) 7-OCH3 56.4 56.5 56.5 3.80 (s)

3'-OCH3 56.5 56.4 56.4 3.79 (s)

Đo trong a) CD3OD, b) 150 MHz, c) 600 MHz, *tín hiệu bị chập

Tuy nhiên, khi phân tích dữ liệu phổ 13C-NMR của PL5 và PL6 cho thấy tín hiệu

carbon thu được trên phổ 13C-NMR của PL6 tại các vị trí C-2 (δC 41.1), C-3 (δC 45.2), C-4

(δC 48.5) cho thấy sự khác biệt so với các tín hiệu carbon tại vị trí tương đương của hợp chất

5 tại [δC 39.6 (C-2), 46.0 (C-3) và 47.9 (C-4)] Không những thế, khi phân tích phổ lưỡng

sắc tròn CD của PL6 thấy xuất hiện một hiệu ứng Cotton âm tại 291 nm và hai hiệu ứng Cotton dương tại 238 nm và 274 nm, các hiệu ứng này ngược lại so với PL5 Điều đó đã chỉ ra rằng PL6 là một đồng phân lập thể đối quang của PL5, và cấu hình tuyệt đối của PL6

được khẳng định là (2R,3S,4S) Kết hợp phân tích các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và so

sánh với tài liệu tham khảo, khẳng định cấu trúc hoá học của PL6 là (-)-isolariciresinol

3a-O-β-D-glucopyranoside [12]