Nghiên cứu sàng lọc chất Ức chế yếu tố phiên mã nf Κb có hoạt tính kháng viêm

Nghiên cứu sàng lọc chất ức chế yếu tố phiên mã NF-κB có hoạt tính kháng viêm Nghiên cứu sàng lọc chất ức chế yếu tố phiên mã NF-κB có hoạt tính kháng viêm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đỗ Thị Thanh Huyền

NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC CHẤT ỨC CHẾ YẾU TỐ PHIÊN MÃ NF-κB CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9420101.21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

2 PGS TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – 2024

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là: Đỗ Thị Thanh Huyền xin cam đoan: 1 Đây là công trình do tôi nghiên cứu, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS

Nguyễn Thị Hồng Vân và PGS.TS Nguyễn Quang Huy 2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã công

bố trước đây tại Việt Nam và trên thế giới 3 Kết quả nghiên cứu được công bố trong luận án là trung thực Các tài liệu

sử dụng trong luận án có nguồn gốc, xuất xứ rõ ràng

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2024

NGƯỜI CAM ĐOAN

Đỗ Thị Thanh Huyền

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân và PGS.TS Nguyễn Quang Huy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại đây Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng Đào tạo, Khoa Sinh học đã giúp đỡ em thực hiện các thủ tục cần thiết trong suốt quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thành viên trong Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử tế bào và Phòng nuôi cấy Tế bào động vật, Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống; Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã tạo môi trường học tập tốt và cung cấp các phương tiện để em có thể thực hiện đề tài Em xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Kim Thanh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và PGS TS Vũ Quang Nam, Trường ĐH Lâm nghiệp Việt Nam đã giúp em trong việc thu thập mẫu giổi móc Em xin cảm ơn TS Nguyễn Phi Hùng, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hợp tác hiệu quả trong việc thực hiện phân tích thành phần hóa học một số loài thực vật Việt Nam Em xin cảm đề tài Nafosted 106-NN.02-2016.58 đã tài trợ một phần cho nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường THPT Chuyên Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cũng như tập thể cán bộ Bộ môn Chuyên Sinh học đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện luận án này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày… tháng … năm 2024

Nghiên cứu sinh

Đỗ Thị Thanh Huyền

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 19

1.1 RỐI LOẠN PHẢN ỨNG VIÊM VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN 19

b Kích hoạt các con đường viêm 21

c Giải phóng các chất trung gian của phản ứng viêm 21

d Thu hút các loại tế bào miễn dịch đến vị trí viêm để loại bỏ tác nhân gây viêm 21

1.1.3 Rối loạn phản ứng viêm liên quan tới nhiều căn bệnh khác nhau 21

1.2 CÁC CON ĐƯỜNG TRUYỀN TIN CHÍNH TRONG PHẢN ỨNG VIÊM 25

1.2.1 Con đường axit arachidonic 27

1.2.2 Con đường MAPK 28

1.2.3 Con đường NF-κB 29

a Các yếu tố phiên mã NF-κB 30

b Con đường truyền tin NF-κB 32

1.3 VAI TRÒ CỦA NF-κB TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÁC THUỐC KHÁNG VIÊM 35

1.3.1 Con đường NF-κB và các bệnh liên quan 35

a Mối liên quan giữa NF-κB và các bệnh rối loạn phản ứng viêm 35

b Mối liên quan giữa NF-κB và ung thư 36

1.3.2 Các đích tác dụng thuốc tiềm năng của con đường NF-κB 36

1.4 SÀNG LỌC CÁC CHẤT ỨC CHẾ YẾU TỐ PHIÊN MÃ NF-κB CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM 39

1.4.1 Sàng lọc các chất ức chế con đường NF-κB bằng gen chỉ thị 39

1.4.2 Sàng lọc chất ức chế con đường NF-κB bằng phương pháp in silico 41

1.4.3 Đánh giá khả năng ức chế protein NF-κB p50 và p65 bằng phương pháp EMSA 42

1.4.4 Đánh giá khả năng ức chế con đường NF-κB bằng mô hình tế bào RAW264.7 43

1.4.5 Đánh giá khả năng kháng viêm in vivo sử dụng mô hình động vật 44

1.5 NGUỒN DƯỢC LIỆU KHÁNG VIÊM TIỀM NĂNG TẠI VIỆT NAM 45

1.5.1 Cây xương sông – tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới 46

1.5.2 Cây giổi móc – tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới 46

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 48

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 48

2.2 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG THỂ 49

2.3 SÀNG LỌC IN SILICO BẰNG PHƯƠNG PHÁP DOCKING 49

2.3.1 Sàng lọc in silico thông lượng cao 49

a Chuẩn bị cấu trúc 3D của protein p50 và p65 cho sàng lọc in silico 50

b Chuẩn bị thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên 50

c Sàng lọc ảo 50

2.3.2 Sàng lọc và đánh giá tương tác phân tử sử dụng Autodock Vina 51

a Chuẩn bị cấu trúc 3D của protein đích thuộc con đường NF-κB, MAPK và AA 52

b Chuẩn bị cấu trúc của các hợp chất tự nhiên 52

c Phân tích docking 52

2.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTIEN NF-κB p50 VÀ

p65 VỚI κB DNA 53

2.4.1 Nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch NF-κB p50 và p65 53

a Nhân dòng gen mã hóa protein NF-κB p50 và p65 53

b Chèn đoạn gen vào vectơ biểu hiện 54

c Đọc trình tự gen 54

d Biểu hiện protein NF-κB p50 và p65 tái tổ hợp 54

e Tinh sạch protein NF-κB p50 và p65 tái tổ hợp sử dụng sắc ký ái lực với niken 55

2.4.2 Đánh giá khả năng ức chế tương tác của protein NF-κB với κB DNA bằng phương pháp EMSA 55

2.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM IN VITRO SỬ DỤNG MÔ HÌNH TẾ BÀO RAW264.7 56

2.5.1 Nuôi cấy tế bào RAW264.7 56

2.5.2 Đánh giá độc tính đối với tế bào RAW264.7 56

2.5.3 Đánh giá khả năng ức chế tổng hợp nitric oxide (NO) trong mô hình tế bào RAW264.7 57

2.5.4 Định lượng TNF-α và IL-6 bằng phương pháp ELISA 57

2.5.5 Định lượng protein bằng phương pháp Western blot 58

2.5.6 Phân tích định lượng mRNA của một số gen bằng RT-qPCR 59

2.6 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM IN VIVO SỬ DỤNG MÔ HÌNH CHUỘT SWISS 60

2.6.1 Nuôi động vật thí nghiệm 60

2.6.2 Đánh giá khả năng kháng viêm in vivo trên chuột Swiss 61

2.7 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM HƯỚNG ĐÍCH NF-κB TỪ DỊCH CHIẾT CÂY XƯƠNG SÔNG VÀ CÂY GIỔI MÓC 62

2.7.1 Thu thập mẫu cây xương sông và cây giổi móc 62

2.7.2 Phân tích thành phần dịch chiết bằng GC/MS 63

2.7.3 Đánh giá khả năng kháng viêm hướng đích NF-κB từ dịch chiết cây xương sông và cây giổi móc 64

2.8 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỐNG KÊ SỐ LIỆU NGHIÊN CỨU 64

2.9 ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 64

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 SÀNG LỌC IN SILICO CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEIN NF-κB p50 VÀ p65 TỪ THƯ VIỆN HỢP CHẤT TỰ NHIÊN 65

3.1.1 Sàng lọc in silico chất ức chế protein NF-κB p50 65

3.1.2 Sàng lọc in silico chất ức chế protein NF-κB p65 69

3.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN NF-κB p50, p65 VỚI κB DNA SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP EMSA 73

3.2.1 Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p50, p65 và chèn vào vectơ biểu hiện 73

a Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p50 và chèn vào vectơ biểu hiện pET-M 73

b Nhân đoạn gen mã hóa NF-κB p65 và chèn vào vectơ biểu hiện pET28a 73

3.2.2 Biểu hiện và tinh sạch protein NF-κB p50 và p65 73

a Biểu hiện protein NF-κB p50 tái tổ hợp ở vi khuẩn E coli BL21 (DE3) 73

b Tinh sạch protein NF-κB p50 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột niken 74

c Biểu hiện protein NF-κB p65 tái tổ hợp ở vi khuẩn E coli BL21(DE3) 75

d Tinh sạch protein NF-κB p65 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột niken 76

3.2.3 Đánh giá khả ức chế tương tác giữa protein NF-κB với κB DNA sử dụng phương pháp EMSA 77

a Khả năng ức chế protein NF-κB p50 tương tác với κB DNA của các chất p50, 14-p50 và 24-p50 77

11-b Khả năng ức chế protein NF-κB p65 tương tác với κB DNA của các chất p65, 26-p65 và 31-p65 79

22-3.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA CHẤT 11-p50 VÀ CHẤT 14-p50 TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO RAW264.7 80

3.3.1 Đánh giá độc tính của các chất 11-p50 và 14-p50 với tế bào RAW264.7 80

3.3.2 Khả năng ức chế tổng hợp NO của 11-p50 và 14-p50 với tế bào RAW264.7 81

3.3.3 Khả năng ức chế tổng hợp TNF-α và IL-6 của các chất 11-p50 và 14-p50 trong mô hình RAW264.7 82

3.3.4 Thảo luận kết quả sàng lọc in silico và in vitro chất ức chế NF-κB 83

3.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA TINH DẦU CÂY XƯƠNG SÔNG SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN

TÍCH IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO 84

3.4.1 Thành phần hóa học của các loại tinh dầu xương sông (BEO) 84

3.4.2 Đánh giá độc tính của BEO đối với tế bào RAW264.7 87

3.4.3 Khả năng ức chế tổng hợp NO của BEO với tế bào RAW264.7 88

3.4.4 Khả năng ức chế sự biểu hiện mRNA và protein TNF-α và IL-6 của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 89

3.4.5 Khả năng ức chế sự biểu hiện gen iNOS và COX-2 của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 91

3.4.6 Khả năng ức chế con đường NF-κB của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 94

3.4.7 Khả năng kháng viêm của BEO trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan 96

3.4.8 Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 30 chất trong tinh dầu cây xương sông sử dụng phương pháp docking 98

a Đánh giá độ tin cậy của phương pháp docking 98

b Con đường chuyển hóa axit arachidonic 103

c Con đường truyền tin NF-κB 105

d Con đường truyền tin MAPK 106

e Các interleukin viêm (IL-6, IL-23R) 108

3.4.9 Thảo luận tính kháng viêm của tinh dầu cây xương sông 108

3.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA DỊCH CHIẾT METHANOL CÂY XƯƠNG SÔNG SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO 112

3.5.1 Thành phần hóa học của dịch chiết methanol cây xương sông (Met_BL) 112

3.5.2 Đánh giá độc tính của dịch chiết Met_BL đối với tế bào RAW264.7 113

3.5.3 Khả năng ức chế tổng hợp NO của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264.7 114

3.5.4 Khả năng ức chế sự biểu hiện của mRNA, protein TNF-α và IL-6 của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264.7 115

3.5.5 Khả năng ức chế sự biểu hiện gen iNOS và COX-2 của dịch chiết Met_BL

trong mô hình tế bào RAW264.7 116

3.5.6 Khả năng ức chế con đường NF-κB của dịch chiết Met_BL trong mô hình tế bào RAW264.7 118

3.5.7 Khả năng kháng viêm của dịch chiết Met_BL trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan 119

3.5.8 Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 32 chất trong dịch chiết Met_BL sử dụng phương pháp docking 120

a Đánh giá độ tin cậy của phương pháp docking 120

b Con đường chuyển hóa axit arachidonic 124

c Con đường truyền tin NF-κB 124

d Con đường truyền tin MAPK 126

e Các interleukin gây viêm (IL-6, IL-23R) 127

3.5.9 Thảo luận tính kháng viêm của dịch chiết Met_BL 128

3.6 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VIÊM THÔNG QUA ỨC CHẾ CON ĐƯỜNG NF-κB CỦA TINH DẦU CÂY GIỔI MÓC SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO, IN VIVO VÀ IN SILICO 129

3.6.1 Thành phần hóa học của tinh dầu cây giổi móc 129

3.6.2 Đánh giá độc tính của tinh dầu cây giổi móc đối với tế bào RAW264.7 130

3.6.3 Khả năng ức chế tổng hợp NO của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264.7 131

3.6.4 Khả năng ức chế biểu hiện protein iNOS và COX-2 của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264.7 132

3.6.5 Khả năng ức chế con đường NF-κB của tinh dầu giổi móc trong mô hình tế bào RAW264.7 133

3.6.6 Khả năng kháng viêm của tinh dầu giổi móc trên mô hình phù bàn chân chuột bằng carrageenan 134

3.6.7 Đánh giá in silico khả năng kháng viêm của 62 chất trong tinh dầu giổi móc sử dụng phương pháp docking 135

a Con đường chuyển hóa axit arachidonic 142

b Con đường truyền tin NF-κB 142

c Con đường truyền tin MAPK 145

d Các interleukin gây viêm (IL-6, IL-23R) 145

3.6.8 Thảo luận tính kháng viêm của tinh dầu cây giổi móc 147

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 149

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC 1 Kết quả sàng loc ảo in silico thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên với protein p50 1

PHỤ LỤC 2 Kết quả sàng lọc ảo in silico thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên với protein p65 5

PHỤ LỤC 3 Hình ảnh phân tích tương tác giữa p50 với 40 chất phân tích bằng công cụ Autodock Vina 10

PHỤ LỤC 4 Hình ảnh phân tích tương tác giữa p65 với 40 chất phân tích bằng công cụ Autodock Vina 18

PHỤ LỤC 5 Kết quả tạo plasmid tái tổ hợp p50 và p65 26

PHỤ LỤC 6 Dữ liệu của các biểu đồ và hình ảnh thu được trong các kết quả nghiên cứu 29

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ

2D/3D Two-/Three-dimensional 2-/3-chiều

ALOX15 Arachidonate 15-Lipoxygenase Enzyme Arachidonate

15-Lipoxygenase AP-1 Activator Protein-1 Protein hoạt hóa 1

DNA Deoxyribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid BEO Blumea lanceolaria essential oil Tinh dầu cây xương sông

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

cPLA2 Cytosolic phospholipase A2 Enzyme phospholipase A2 tế

bào chất DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium Môi trường DMEM dùng cho

nuôi cấy tế bào DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxynucleoside triphosphate Deoxynucleoside triphosphate

E coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid Axit Ethylene Diamine

Tetra-acetic ELISA Enzyme-linked immunosorbent

EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay Phương pháp phân tích sự thay

ERK1/2 Extracellular signal-regulated

FBS Fetal Bovine Serum Huyết thanh thai bò

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 Phân tử kết dính tế bào 1 IB inhibitory κB, alpha Protein ức chế yếu tố phiên mã

NF-κB

IκB

IL-23R Interleukin 23 receptor Thụ thể interleukin 23

iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase Enzyme cảm ứng xúc tác tạo oxit

nitric

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

IPTG (chất giống với lactose) được sử dụng để cảm ứng biểu hiện gen

JNK Jun N-terminal kinase Enzyme Jun N-terminal kinase

kilô dalton

LB Luria Bertani Môi trường LB sử dụng trong

nuôi cấy vi khuẩn LBEO Leave Blumea lanceolaria essential

NMMA NG-Methyl-L-arginine acetate L-NMMA là chất ức chế iNOS

L-LPS Lipopolysaccharides

Kháng nguyên của vi khuẩn Gram âm được cấu tạo gồm lipid và polysaccharide

MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase phosphoryl hóa protein

kích hoạt phân bào Met_BL Methanol extract of Blumea

lanceolaria

Dịch chiết methanol của cây xương sông

mRNA Messenger Ribonucleic Acid Messenger Ribonucleic Acid

NF-κB Nuclear Factor

Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells

Yếu tố nhân tăng cường biểu hiện chuỗi nhẹ Kappa của tế bào B hoạt hóa

NLR Nod-like receptor Thụ thể giống Nod

OD600 Optical Density at λ= 600 nm Mật độ quang của mẫu ở bước

sóng 600 nm NF-κB

p50 NF-κB subunit p50 Yếu tố phiên mã NF-κB p50 NF-κB

p52 NF-κB subunit p52 Yếu tố phiên mã NF-κB p52 NF-κB

p65 NF-κB subunit p65 Yếu tố phiên mã NF-κB p65

PBS Phosphate buffered saline Đệm photphat PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PGE2 Prostaglandin E2 Prostaglandin E2

PGHS Prostaglandin H synthase Enzyme prostaglandin H

synthase PKC Protein kinase C Enzyme kinaza C protein PLA2 Phospholipase A2 Enzyme phospholipase A2 PLC Phospholipase C Enzyme phospholipase C RBEO Root Blumea lanceolaria essential

RHD Rel Homology Domain Vùng domain tương đồng với

Rel

qPCR

RT-Reverse Transcription- Quantitative - Polymerase Chain Reaction

Phản ứng PCR định lượng kết hợp phiên mã ngược

SBEO Stem Blumea lanceolaria essential

SDS Sodium Dodecyl Sulfate Natri dodecyl sulfat SDS-

poly-TAD Trans-Activating Domain Vùng hoạt hóa Trans TBS Tris-Buffered Saline Đệm TBS

TLR Toll-Like Receptor Thụ thể giống Toll TNF-α Tumor Necrosis Factor Alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Protein-1 Protein kết dính tế bào mạch

máu 1

NF-κB p65 69 Bảng 3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu lá (LBEO), thân (SBEO) và rễ (RBEO)

từ cây xương sông 85 Bảng 3.4 Kết quả docking của 30 hợp chất BEO với các protein đích của con

đường AA, NF-κB và MAPK 100 Bảng 3.5 Thành phần hóa học của dịch chiết methanol cây xương sông 112 Bảng 3.6 Kết quả docking của 32 hợp chất trong dịch chiết methanol cây xương

sông với các protein đích của con đường AA, NF-κB và MAPK 121 Bảng 3.7 Thành phần hóa học của tinh dầu cây giổi móc [35] 130 Bảng 3.8 Kết quả docking của 62 hợp chất trong tinh dầu cây giổi móc với các

protein đích của con đường AA, NF-κB và MAPK 136

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phản ứng viêm ở các bệnh đường hô hấp [7] 23

Hình 1.2 Quá trình viêm mạn tính dẫn đến ung thư [67] 25

Hình 1.3 Các con đường chính trong phản ứng viêm [30] 26

Hình 1.4 Con đường axit arachidonic [163] 28

Hình 1.5 Con đường MAPK [30] 29

Hình 1.6 Cấu trúc domain của các yếu tố phiên mã NF-κB [177] 31

Hình 1.7 Con đường NF-κB [100] 33

Hình 1.8 Các chiến lược ức chế con đường truyền tin NF-κB [136] 37

Hình 1.9 Cấu trúc 3D của phức hệ p50-p65 dị dimer và giả thiết về các vị trí tương tác của các chất ức chế liên kết NF-κB/DNA [60] 39

Hình 1.10 Xác định sự hoạt hóa NF-κB bằng gen chỉ thị [26, 123] 40

Hình 1.11 Phương pháp phân tích EMSA [51, 133] 43

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng thể 49

Hình 2.2 Mô hình sàng lọc ảo 51

Hình 2.3 Hình ảnh mẫu cây xương sông (a) và cây giổi móc (b, c) 62

Hình 3.1 Kết quả phân tích tương tác giữa chất 11-p50, 14-p50 và 24-p50 với protein NF-κB p50 68

Hình 3.2 Kết quả phân tích tương tác giữa chất 22-p65 , 26-p65 và 31-p65 với protein NF-κB p65 72

Hình 3.3 Phân tích biểu hiện protein NF-κB p50 ở tế bào E coli BL21(DE3) 74

Hình 3.4 Kết quả tinh sạch NF-κB p50 75

Hình 3.5 Kết quả biểu hiện NF-κB p65 ở tế bào E coli BL21(DE3) 76

Hình 3.6 Kết quả tinh sạch protein p65 77

Hình 3.7 Đánh giá khả năng ức chế protein NF-κB p50 tương tác với κB DNA của các chất 11-p50, 14-p50, 24-p50 sử dụng phương pháp EMSA 78

Hình 3.8 Phân tích khả năng ức chế p65 tương tác với κB DNA của các chất

thử nghiệm 22-p65, 26-p65, 31-p65 sử dụng phương pháp EMSA 79

Hình 3.9 Đánh giá độc tính của chất 11-p50 và 14-p50 đối với tế bào RAW264.7 80

Hình 3.10 Khả năng ức chế tổng hợp NO của chất 11-p50 và 14-p50 với tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 81

Hình 3.11 Khả năng ức chế tổng hợp TNF-α và IL-6 của các chất 11-p50 và 14-p50 trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 82

Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của các hợp chất dễ bay hơi (1-30) được xác định từ tinh dầu cây xương sông 86

Hình 3.13 Ảnh hưởng của BEO lên khả năng sống của tế bào RAW264.7 87

Hình 3.14 Khả năng ức chế tổng hợp NO của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 88

Hình 3.15 Khả năng ức chế biểu hiện protein TNF-α và IL-6 của BEO với tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 89

Hình 3.16 Khả năng ức chế biểu hiện mRNA TNF-α và IL-6 của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 90

Hình 3.17 Khả năng ức chế sự biểu hiện mRNA và protein iNOS của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 92

Hình 3.18 Khả năng ức chế sự biểu hiện mRNA và protein COX-2 của BEO trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 93

Hình 3.19 Ảnh hưởng của BEO lên mức độ biểu hiện của một số protein thuộc con đường NF-κB 95

Hình 3.20 Khả năng ức chế phù bàn chân chuột của BEO 97

Hình 3.21 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp docking phân tử 102

Hình 3.22 Phân tích docking của hợp chất 16 và 27 với COX-1, COX-2 và ALOX15 104

Hình 3.23 Phân tích docking của chất 20, 23, và 27 với NF-κB p50-p65 106

Hình 3.24 Phân tích docking của chất 16 và 23 với p38MAPK 107

Hình 3.25 Sơ đồ minh họa cơ chế kháng viêm của BEO 109

Hình 3.26 Ảnh hưởng của Met_BL lên khả năng sống của tế bào RAW264.7 113 Hình 3.27 Khả năng ức chế tổng hợp NO của dịch chiết Met_BL với tế bào

RAW264.7 được kích thích bởi LPS 114 Hình 3.28 Khả năng ức chế tổng hợp TNF-α và IL-6 của dịch chiết Met_BL

trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 115 Hình 3.29 Ảnh hưởng của dịch chiết Met_BL lên mức độ biểu hiện protein và

mRNA của iNOS và COX-2 trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 117 Hình 3.30 Ảnh hưởng của Met_BL lên mức độ biểu hiện của các protein

trong con đường NF-κB 118 Hình 3.31 Khả năng ức chế phù bàn chân chuột của dịch chiết Met_BL 119 Hình 3.32 Phân tích docking tương tác của một số chất có trong dịch chiết

Met_BL với protein NF-κB 125 Hình 3.33 Phân tích docking tương tác của một số chất trong dịch chiết

Met_BL với protein p38MAPK 127 Hình 3.34 Ảnh hưởng của tinh dầu giổi móc lên khả năng sống của tế bào

RAW264.7 131 Hình 3.35 Khả năng ức chế tổng hợp NO của tinh dầu giổi móc với tế bào

RAW264.7 được kích thích bởi LPS 132 Hình 3.36 Khả năng ức chế sự biểu hiện protein iNOS và COX-2 của tinh dầu

giổi móc trong mô hình tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS 133 Hình 3.37 Khả năng ức chế con đường NF-κB của tinh dầu giổi móc trong

mô hình tế bào RAW264.7 134 Hình 3.38 Khả năng ức chế phù bàn chân chuột của tinh dầu giổi móc 135 Hình 3.39 Phân tích docking biểu diễn tương tác của một số chất trong

tinh dầu giổi móc với protein NF-κB 144 Hình 3.40 Phân tích docking của một số chất trong tinh dầu giổi móc

với protein p38MAPK 146

MỞ ĐẦU

Viêm là phản ứng quan trọng của hệ miễn dịch giúp chống lại các tổn thương mô hoặc các kích thích ngoại lai như mầm bệnh, chất gây dị ứng, hóa chất độc hại hoặc tia phóng xạ [106] Các phản ứng viêm thường có lợi cho cơ thể, giúp cơ thể loại bỏ tác nhân gây viêm, sửa chữa tổn thương và đưa cơ thể trở về trạng thái cân bằng Tuy nhiên, khi phản ứng viêm bị rối loạn sẽ gây khởi phát và tiến triển nhiều loại bệnh khác nhau như bệnh tim mạch, bệnh đường ruột, bệnh tiểu đường, bệnh hô hấp, bệnh thận, bệnh tự miễn và nhiều loại ung thư [12, 142, 180] Các thuốc kháng viêm được sử dụng rộng rãi hiện nay đều tiềm ẩn nguy cơ gây ra nhiều tác dụng phụ không mong muốn đối với dạ dày, thận, gan [37] Vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm và sàng lọc các loại thuốc mới có tác dụng kháng viêm và ngừa ung thư, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ thực vật, ít tác dụng phụ là nhu cầu cấp thiết

Đích đến của các loại thuốc kháng viêm là các con đường truyền tin chính gây ra phản ứng viêm như NF-κB (Nuclear Factor Kappa-Light-Chain-Enhancer of Activated B Cells), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) và AA (Arachidonic acid) Trong các con đường truyền tin gây ra phản ứng viêm, con đường truyền tin NF-κB đóng vai trò quan trọng nhất Do vậy, việc sàng lọc các chất có khả năng kháng viêm hướng đích NF-κB là hết sức cần thiết và đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu [60]

Để tìm ra các thuốc kháng viêm tiềm năng cần có những mô hình sàng lọc và đánh giá khả năng kháng viêm thích hợp Các hướng sàng lọc thuốc kháng viêm

hiện nay tập trung vào 3 hướng chính: (1) sàng lọc in silico bằng công cụ tin sinh, (2) sàng lọc in vitro trên mô hình tế bào và (3) sàng lọc in vivo trên mô hình động vật Mỗi mô hình sàng lọc có một lợi thế riêng Mô hình sàng lọc in silico (sàng lọc

ảo) dựa vào các công cụ tin sinh có ưu điểm là giá thành rẻ, cho kết quả nhanh, sàng lọc ở quy mô lớn Tuy nhiên, nhược điểm của mô hình này là có sai số giữa tính toán lý thuyết và kết quả thử nghiệm trên mô hình tế bào và mô hình động vật Mô hình tế bào động vật, đặc biệt là mô hình đại thực bào RAW264.7 của chuột, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sàng lọc và đánh giá hiệu quả của các chất

mô hình này có nhược điểm là giá thành cao, khó đánh giá được lượng rất lớn các chất khác nhau trong thời gian ngắn Mô hình động vật là mô hình quan trọng trong việc sàng lọc, phát triển các thuốc kháng viêm tiềm năng mới Trong các mô hình động vật, mô hình động vật gây viêm bằng carrageenan được sử dụng rộng rãi [103] do carrageenan gây viêm cấp tính tại chỗ, không sinh miễn dịch và cho kết quả có độ lặp lại cao [109, 129] Để sàng lọc hiệu quả các chất kháng viêm tiềm năng thì

việc kết hợp được cả ba hướng sàng lọc in silico, in vitro và in vivo là hết sức cần

thiết

Xuất phát từ nhu cầu sàng lọc và tìm kiếm các chất có tiềm năng kháng viêm

và ngừa ung thư hướng đích NF-κB bằng việc kết hợp 3 mô hình sàng lọc in silico,

in vitro và in vivo, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sàng lọc chất ức chế yếu tố phiên mã NF-κB có hoạt tính kháng viêm”

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Sàng lọc được ít nhất hai chất có khả năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên bằng hai phương pháp sàng lọc (1)

sàng lọc in silico và (2) sàng lọc in vitro

2 Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của dịch chiết cây xương sông, cây giổi móc ở Việt Nam sử dụng các phương pháp

phân tích in silico, in vitro và in vivo

Nội dung nghiên cứu:

1 Tạo thư viện cấu trúc 200.000 hợp chất tự nhiên, từ đó sàng lọc in silico

được ít nhất 6 chất có tiềm năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65

2 Đánh giá khả năng ức chế tương tác giữa protein NF-κB (p50 hoặc p65) với κB DNA của 6 chất ức chế tiềm năng (thu được từ sàng lọc ảo) trong điều

kiện in vitro sử dụng phương pháp EMSA và mô hình tế bào RAW264.7 để

tìm ra ít nhất hai chất có khả năng ức chế protein NF-κB p50 hoặc p65

3 Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của tinh dầu và dịch chiết methanol cây xương sông ở Việt Nam sử dụng các phương

pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo

4 Đánh giá khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của

tinh dầu cây giổi móc sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo

Đóng góp mới của luận án:

1 Sàng lọc được 02 chất có tiềm năng ức chế protein NF-κB p50 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên

2 Đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá được khả năng kháng viêm thông qua ức chế con đường NF-κB của tinh dầu, dịch chiết methanol cây xương sông và

tinh dầu cây giổi móc ở Việt Nam sử dụng các phương pháp phân tích in silico, in vitro và in vivo

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Luận án đã sàng lọc được hai chất có tiềm năng kháng viêm thông qua việc ức chế protein NF-κB p50 từ thư viện 200.000 hợp chất tự nhiên Các kết quả này là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc phát triển các loại thuốc kháng viêm mới

Luận án đã đánh giá được khả năng kháng viêm của dịch chiết methanol cây xương sông, tinh dầu cây xương sông, tinh dầu cây giổi móc; đồng thời chỉ ra được đích kháng viêm của các chất có trong các dịch chiết là các protein đích của con đường NF-κB như TNF-α, IL-6, iNOS, COX-2, p-IκBα và p-p65 Các kết quả này cho thấy tiềm năng khai thác và ứng dụng dịch chiết cây xương sông và cây giổi

móc trong việc điều trị các bệnh liên quan đến phản ứng viêm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 RỐI LOẠN PHẢN ỨNG VIÊM VÀ CÁC BỆNH LIÊN QUAN

1.1.1 Phản ứng viêm

Viêm là phản ứng của hệ thống miễn dịch nhằm loại bỏ các kích thích có hại đối với cơ thể [106] Các kích thích gây viêm có hại rất đa dạng bao gồm các tác nhân bên ngoài như vi sinh vật, tác nhân cơ học, vật lý, hóa học, hay các tác nhân bên trong cơ thể như các tổn thương tế bào, mô cơ thể (tắc mạch, xuất huyết), rối loạn thần kinh, phản ứng tự miễn, v.v Phản ứng viêm là một quá trình bệnh lý phức tạp với các dấu hiệu gồm sưng, nóng, đỏ, đau và có thể gây rối loạn chức năng cơ thể [155] Chức năng của phản ứng viêm là nhằm loại bỏ tác nhân gây viêm, sửa chữa các tổn thương và đưa cơ thể trở về trạng thái cân bằng ban đầu Phản ứng viêm có thể được chia làm hai loại là viêm cấp tính và viêm mạn tính

a Viêm cấp tính

Viêm cấp tính diễn ra trong thời gian ngắn từ vài phút đến vài ngày, có đáp ứng tức thời và sớm với tổn thương, có đặc điểm tiết dịch chứa nhiều protein huyết tương và xuất hiện nhiều bạch cầu đa nhân trung tính Khả năng đáp ứng trong viêm cấp tính là huy động bạch cầu tới vị trí tổn thương để giúp làm sạch vi khuẩn và các tác nhân gây viêm khác, đồng thời tiêu hủy các mô hoại tử do viêm gây ra Tuy nhiên, chính bạch cầu lại có thể kéo dài phản ứng viêm và gây tổn thương mô do giải phóng các enzyme, chất trung gian hóa học và các gốc oxi hóa có độc tính Những phản ứng cấp tính này là do sự can thiệp của hai yếu tố: yếu tố thần kinh là sự tê liệt các dây thần kinh co mạch ở các mao mạch và yếu tố thể dịch là sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, bradykinin…[30]

b Viêm mạn tính

Viêm mạn tính là quá trình viêm kéo dài, có thể từ vài tháng tới vài năm Viêm mạn tính có thể xảy ra theo sau viêm cấp do đáp ứng viêm cấp không thành công, không loại bỏ được tín hiệu gây viêm Có những trường hợp viêm mạn tính do sự tiếp xúc liên tục và kéo dài với hóa chất độc hại, khói, bụi Điều này góp phần gây ra viêm mạn tính và khởi phát nhiều bệnh liên quan Viêm mạn tính bao gồm các biểu hiện như tiết dịch nhưng sưng đỏ và nóng không rõ ràng hoặc không có; chức năng mô và cơ quan ít bị ảnh hưởng hoặc chỉ suy giảm chậm chạp; hiện tượng huy động bạch cầu, tăng bạch cầu trung tính vẫn có nhưng không rõ rệt; vẫn có hiện tượng thực bào tại ổ viêm nhưng không mạnh mẽ, chỉ đủ sức khống chế yếu tố gây viêm mà không loại trừ được các yếu tố gây viêm [47]

1.1.2 Cơ chế phản ứng viêm

Phản ứng viêm kích hoạt các con đường truyền tin và điều tiết các chất trung gian gây viêm trong các tế bào, mô Phản ứng viêm rất đa dạng và phức tạp, phụ thuộc vào bản chất của các yếu tố kích thích ban đầu và vị trí kích thích viêm trong cơ thể Tuy nhiên, tất cả các phản ứng viêm đều bao gồm các bước như sau: 1) Kích hoạt các thụ thể bề mặt tế bào bởi các tác nhân gây viêm; 2) Kính hoạt các con đường viêm bên trong tế bào; 3) Giải phóng các sản phẩm của phản ứng viêm; và 4) Thu hút các tế bào miễn dịch đến vị trí viêm để loại bỏ tác nhân gây viêm, tiêu diệt mầm bệnh và sửa chữa tổn thương [98]

a Kích hoạt các thụ thể bề mặt

Khi xuất hiện các tác nhân gây viêm, phản ứng viêm trong cơ thể được kích hoạt thông qua các thụ thể trên bề mặt của các tế bào miễn dịch và tế bào không miễn dịch Các nhóm thụ thể bề mặt bao gồm thụ thể giống Toll (TLR), thụ thể lectin loại C (CLR), thụ thể RIG và thụ thể giống NOD (NLR) Thụ thể TLR với hơn 10 thành viên đã được phát hiện cho đến nay là nhóm thụ thể bề mặt quan trọng kích hoạt các tín hiệu nội bào gây ra phản ứng viêm [30]

b Kích hoạt các con đường viêm

Các kích thích viêm kích hoạt các con đường truyền tin nội bào bao gồm (1) con đường MAPK, (2) con đường NF-κB, (3) con đường axit arachidonic (AA) và (4) con đường dẫn truyền tin Janus kinase (JAK)

c Giải phóng các chất trung gian của phản ứng viêm

Các tế bào viêm được kích thích bởi các chất gây viêm thông qua các con đường MAPK, NF-κB, con đường AA sẽ sản xuất các chất trung gian gây viêm bao gồm các cytokine gây viêm (IL-1β, IL-6, TNF-α), các protein và enzyme gây viêm inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) Các enzyme iNOS, COX-2 tổng hợp các chất gây viêm như nitric oxit (NO), prostaglandin, leukotrienes để thúc đẩy phản ứng viêm [42]

d Thu hút các loại tế bào miễn dịch đến vị trí viêm để loại bỏ tác nhân gây viêm

Các cytokine gây viêm sẽ thu hút các tế bào miễn dịch (bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, tế bào lympho, tế bào mast) đến vị trí tổn thương Sau khi được thu hút đến vị trí viêm, các tế bào miễn dịch sẽ tiếp tục tiết ra các chất trung gian gây viêm để duy trì và thúc đẩy phản ứng viêm Các tế bào miễn dịch trong đó có đại thực bào sau khi loại bỏ các tác nhân gây viêm sẽ sửa chữa các tổn thương và tiết ra các chất kháng viêm để kết thúc quá trình viêm [30]

1.1.3 Rối loạn phản ứng viêm liên quan tới nhiều căn bệnh khác nhau

Phản ứng viêm là quá trình phức tạp với rất nhiều con đường truyền tin tham gia vào điều hòa một cách nhịp nhàng Bất kỳ một mắt xích nào trong các con đường truyền tin của phản ứng viêm bị rối loạn thì đều có thể dẫn đến rối loạn phản ứng viêm Có nhiều nguyên nhân khác nhau gây ra tình trạng viêm kéo dài và rối loạn phản ứng viêm, chẳng hạn như phản ứng viêm không loại bỏ được tác nhân gây viêm hoặc người bệnh thường xuyên tiếp xúc với tác nhân gây viêm như khói, bụi, các chất độc hại Việc thường xuyên tiếp xúc với tác nhân gây viêm sẽ làm cho phản ứng viêm cấp diễn ra liên tục và kéo dài trở thành viêm mạn tính Viêm mạn

tính và các rối loạn phản ứng viêm kéo dài sẽ dẫn đến tổn thương mô, cơ quan từ đó dẫn đến các nguy cơ phát sinh và phát triển nhiều bệnh ở người như bệnh tim mạch, bệnh đường ruột, bệnh tiểu đường, bệnh hô hấp, bệnh thận, bệnh tự miễn và đặc biệt là nhiều loại bệnh ung thư [12, 142, 180]

a Bệnh tim mạch

Rối loạn phản ứng viêm có liên quan tới bệnh xơ vữa động mạch Sự tăng cường bạch cầu trong máu là dấu hiệu khởi đầu của bệnh này Sự tiến triển của bệnh liên quan đến các chất trung gian gây viêm được tiết ra bởi các tế bào miễn dịch bẩm sinh và thích ứng Mặc dù, hệ thống miễn dịch bẩm sinh là cơ chế bảo vệ chính giúp tim chống lại mầm bệnh và tổn thương mô [179] Tuy nhiên, nhồi máu cơ tim thường do xơ vữa động mạch vành và liên quan đến việc mất khả năng đáp ứng viêm cấp tính của nhiều tế bào cơ tim Đây là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra sự tổn thương tim [71] Các tế bào cơ tim bị tổn thương sẽ xảy ra quá trình viêm nhiễm, giải phóng các cytokine và chemokine của phản ứng viêm Các con đường qua trung gian TLR kích hoạt phản ứng viêm sau nhồi máu bằng cách kích hoạt con đường NF-κB [17, 61]

b Bệnh đường ruột

Rối loạn phản ứng viêm có liên quan đến bệnh viêm ruột bao gồm bệnh Crohn và viêm loét đại tràng Các con đường truyền tin chủ yếu liên quan đến bệnh đường ruột bao gồm MAPK và NF-κB [168] Các vi sinh vật đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong việc bắt đầu và duy trì bệnh Rối loạn các con đường truyền tin bao gồm TLR, NF-κB có thể tác động lên hàng rào bảo vệ của ruột và giải phóng các tế bào T hỗ trợ gây viêm, dẫn đến bệnh Crohn [168]

c Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường loại 2 được coi là một bệnh viêm nhiễm Các biến chứng tiểu đường bao gồm đau tim, đột quỵ, suy thận, bại liệt, mù lòa và tổn thương thần kinh Trong quá trình này, mức độ tuần hoàn của các protein giai đoạn viêm cấp tính tăng cao, bao gồm cytokine, fibrinogen, amyloid A, chất ức chế hoạt hóa

plasminogen, haptoglobin và axit sialic Bệnh tiểu đường loại 2 cũng kích hoạt các con đường NF-κB, MAPK và JAK-STAT, mỗi con đường này đều có thể thúc đẩy quá trình viêm gây tổn thương ở các mô liên quan [40]

d Bệnh viêm đường hô hấp

Hình 1.1 Phản ứng viêm ở các bệnh đường hô hấp [7]

TLR: Toll-like receptors, NF-κB: Yếu tố phiên mã hoạt hóa tế bào B, IL-8: cytokine tiền viêm interleukin 8, TNF-α: yếu tố hoại tử khối u alpha

Viêm đường hô hấp và các bệnh về phổi như hen suyễn hoặc bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính được đặc trưng bởi tình trạng viêm mạn tính Các mầm bệnh, độc tố, chất ô nhiễm, các kích thích và dị ứng đều là các tác nhân kích thích viêm đường hô hấp Hình 1.1 minh họa một cách tổng quát các con đường truyền tin gây viêm liên quan đến các bệnh hô hấp Các mầm bệnh, độc tố, chất ô nhiễm, khói, bụi v.v… kích hoạt các tế bào biểu mô đường hô hấp Trong đó, thụ thể TLR nhận biết sự có mặt của các chất độc hại và kích hoạt các tế bào hoạt hóa con đường NF-κB

Các tế bào được kích hoạt thông qua thụ thể TLR sẽ tiết ra các yếu tố tăng trưởng, chemokine, các cytokine tiền viêm như IL-8 và TNF-α để thu hút các tế bào miễn dịch đến vị trí viêm Sau đó, các tế bào miễn dịch đến tiêu diệt mầm bệnh, bỏ các tế bào biểu mô bị tổn thương và chữa lành vết thương [7] Tuy nhiên, việc liên tục tiếp xúc với các tín hiệu gây viêm như khói, bụi, ô nhiễm từ môi trường sẽ liên tục kích thích phản ứng viêm của đường hô hấp, làm cho phản ứng viêm kéo dài và gây ra

các tổn thương và các bệnh đường hô hấp [7, 157]

e Bệnh viêm thận

Bệnh tiểu đường, hội chứng Alport, bệnh Berger và xơ hóa cầu thận cục bộ là các bệnh liên quan đến tình trạng viêm thận mạn tính Các tác nhân gây tổn thương thận kích hoạt các con đường NF-κB hoặc MAPK Những tác nhân kích thích này bao gồm các cytokine, các yếu tố tăng trưởng, DAMPs và PAMPs, TLRs, các thụ thể NLR, các chất chuyển hóa và các chất trung gian miễn dịch Việc sản xuất các yếu tố tiền viêm và kháng viêm thông qua con đường NF-κB đóng một vai trò quan trọng trong phản ứng của tế bào cầu thận và ống thận đối với tổn thương thận [152]

f Bệnh ung thư

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng phản ứng viêm đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của khối u [77] Rối loạn phản ứng viêm và viêm mạn tính được chứng minh là có vai trò thúc đẩy sự tiến triển của ung thư ở tất cả các giai đoạn bao gồm (1) bắt đầu, (2) thúc đẩy, (3) chuyển đổi ác tính, (4) xâm lấn và cuối cùng là (5) di căn (Hình 1.2) [67] Theo ước tính, khoảng 20% khối u ác tính ở người có liên quan đến tình trạng viêm mạn tính do nhiễm virus và vi khuẩn [83] Nhiều loại bệnh ung thư có liên quan chặt chẽ đến phản ứng viêm như bệnh ung thư gan, ung thư tụy, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư cổ tử cung… Quá trình viêm không chỉ gây phát sinh và phát triển ung thư, mà còn làm tăng khả năng kháng thuốc điều trị ung thư Do vậy, việc ức chế và kiểm soát được phản ứng viêm có vai

Hình 1.2 Quá trình viêm mạn tính dẫn đến ung thư [67].

Nhìn chung, hầu hết các bệnh rối loạn chức năng của các cơ quan đều có liên quan đến quá trình viêm nhiễm Tất cả tác nhân lây nhiễm và không lây nhiễm gây tổn thương cho cơ thể đều kích hoạt các tế bào gây viêm và kích hoạt các con đường truyền tin gây viêm, phổ biến nhất là các con đường MAPK và NF-κB Các con đường này chính là đích tác dụng tiềm năng của các loại chất kháng viêm Do vậy, việc nghiên cứu và tìm kiếm các chất ức chế các protein quan trọng của các con đường điều hòa phản ứng viêm, đặc biệt là con đường NF-κB là rất cần thiết, góp phần tìm ra các thuốc kháng viêm thế hệ mới có hiệu quả cao và ít tác dụng phụ 1.2 CÁC CON ĐƯỜNG TRUYỀN TIN CHÍNH TRONG PHẢN ỨNG VIÊM

Có nhiều con đường truyền tin tham gia vào phản ứng viêm, trong đó có 3 con đường chính (1) con đường NF-κB, (2) con đường MAPK và (3) con đường

Arachidonic acid (AA) [30] Sơ đồ tổng quát của ba con đường truyền tin này được trình bày ở Hình 1.3

Hình 1.3 Các con đường chính trong phản ứng viêm [30]

Một số con đường truyền tin trong phản ứng viêm gồm: (1) con đường NF-κB, (2) con đường MAPK và (3) con đường Arachidonic acid (AA) IκB: Inhibitor của κB trong tế bào chất, NF-κB nuclear factor-kappa B, p50/p65: NF-κB p50 và p65, AP-1: activator protein-1, COX-2: cyclooxygenase-2, iNOS: inducible nitric oxide synthase, MyD88: myeloid differentiation factor 88; Tlr4: toll-like receptor 4; LPS:

lipopolysaccharide

1.2.1 Con đường axit arachidonic

Con đường axit arachidonic (AA) là một trong những con đường quan trọng giải phóng ra các chất trung gian gây viêm như prostaglandin, thromboxane và leukotrienes [145] AA là một axit béo không bão hòa có nguồn gốc từ axit béo trong lớp màng phospholipid kép của tế bào Khi các tế bào bị kích thích bởi các tác nhân khác nhau đặc biệt là phản ứng viêm, AA được giải phóng khỏi màng phospholipid (Hình 1.4) bởi các enzyme phospholipase A2 (PLA2), phospholipase C (PLC) và được sử dụng để tổng hợp các chất trung gian tiền viêm thông qua ba con đường chuyển hóa (Hình 1.4): (1) con đường cyclooxygenase (COX), (2) con đường lipoxygenase (LOX) và (3) con đường cytochrom P450 (CYP450) Ba con đường COX, LOX và P450 có liên quan mật thiết với nhau Trong đó, con đường COX và LOX có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của các bệnh liên quan đến phản ứng viêm [3]

Trong con đường COX, cả hai enzyme COX-1 và COX-2 đều có chức năng tổng hợp prostaglandin tham gia vào quá trình chuyển hóa AA Tuy nhiên, enzyme COX-1 chịu trách nhiệm tổng hợp prostaglandin ở mức cơ bản để đều hòa các quá trình sinh lý bình thường của mô và cơ thể; còn enzyme COX-2 không được biểu hiện ở điều kiện sinh lý bình thường mà chỉ biểu hiện rõ rệt khi tế bào chịu ảnh hưởng của các kích thích, đặc biệt là trong phản ứng viêm [149] Do vậy, enzyme COX-2 có vai trò đặc biệt quan trọng trong đáp ứng viêm Trung tâm hoạt động của hai enzyme COX-1 và COX-2 có sự tương đồng rất cao Do vậy nhiều thuốc kháng viêm ức chế cả hai enzyme COX-1 và COX-2 có thể gây ra tác dụng phụ do ức chế các hoạt động sinh lý bình thường được điều hòa bởi COX-1

Theo con đường LOX, AA được chuyển hóa thành axit hydroperoxyeicosatetraenoic (HpETE) nhờ sự xúc tác của các enzyme lipoxygenase Cho đến nay, có ít nhất bốn enzyme tham gia chuyển hóa AA theo con đường LOX bao gồm 5-LOX, 8-LOX, 12-LOX và 15-LOX Các enzyme 5-

LOX, 12-LOX và 15-LOX oxi hóa AA (Hình 1.4) ở các vị trí 5-, 12- và 15- để tạo ra các sản phẩm trung gian leukotriene (LT) và lipoxin (LX) tham gia điều hòa phản ứng viêm [165] Leukotriene là chất trung gian gây viêm bằng cách thu hút các tế bào đại thực bào, tế bào bạch cầu và các tế bào tua đến vị trí viêm để tăng cường phản ứng viêm Các chất lipoxin (LX) là các chất ức chế viêm Sau khi các tế bào miễn dịch đến và loại bỏ các tác nhân gây viêm thì các lipoxin (LX) được các tế bào miễn dịch (đại thực bào, bạch cầu trung tính) tạo ra đóng vai trò là các chất kháng viêm giúp làm giảm tổn thương tế bào và mô, đồng thời kết thúc quá trình viêm thông qua việc ức chế các yếu tố phiên mã NF-κB và AP-1 của các con đường truyền tin NF-κB và MAPK [27, 117]

Hình 1.4 Con đường axit arachidonic [163]

1.2.2 Con đường MAPK

MAPK là một họ serine/threonine protein kinase của tế bào tham gia đáp ứng với nhiều loại kích thích, bao gồm tăng áp suất thẩm thấu, sốc nhiệt và các cytokine

gây viêm (như IL-1, TNF-α và IL-6) MAPK điều hòa hàng loạt các quá trình của tế bào như quá trình tăng sinh, biệt hóa, sống sót và chết theo chương trình Con đường MAPK của động vật có vú bao gồm các kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào như ERK1/2, p38 MAP Kinase và c Jun N-terminal kinase (JNK) Khi được kích thích bởi các tín hiệu viêm, các protein MAPK kinase sẽ hoạt hóa ERK, JNK, p38MAPK từ đó kích hoạt các yếu tố phiên mã AP-1 trong tế bào chất Khi yếu tố phiên mã AP-1 được kích hoạt, nó sẽ đi vào nhân tế bào để phiên mã các gen đích và kích hoạt phản ứng viêm (Hình 1.5) [150]

Hình 1.5 Con đường MAPK [30] 1.2.3 Con đường NF-κB

Con đường NF-κB là một trong những con đường truyền tin quan trọng nhất đối với phản ứng viêm Đây cũng là con đường trọng tâm của nghiên cứu này

a Các yếu tố phiên mã NF-κB

NF-κB là yếu tố phiên mã quan trọng được phát hiện bởi Sen và Baltimore năm 1986 [143] Ở người và động vật có vú, có 5 loại NF-κB khác nhau (Hình 1.6a) bao gồm NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), RelA (p65), RelB và c-Rel Các yếu tố phiên mã này được chia thành 2 nhóm chính gồm nhóm NF-κB và nhóm Rel (Hình 1.6a) Nhóm NF-κB gồm hai thành viên là NF-κB1 (p105/p50) và NF-κB2 (p100/p52); nhóm protein Rel có 3 thành viên là RelA (p65), RelB và c-Rel Cả năm protein NF-κB đều có miền tương đồng Rel (RHD) nằm ở vùng đầu N (Hình 1.6a) Miền tương đồng RHD này có tính bảo thủ rất cao từ ruồi giấm cho đến người, có chức năng liên kết với vùng điều hòa của gen đích Vùng đầu C của ba thành viên RelA (p65), RelB và c-Rel chứa vùng hoạt hóa dịch mã (TAD) Vùng này có chức năng liên kết với các protein điều hòa khác để kích hoạt quá trình phiên mã và tổng hợp mRNA của gen đích Hai thành viên nhóm NF-κB gồm p105 (tiền thân của protein p50) và p100 (tiền thân của protein p52) chứa các đoạn lặp Ankyrin (ankyrin repeats) ở đầu C [148] Các đoạn lặp Ankyrin này giống như vùng lặp ankyrin trên các phân tử IκB (Hình 1.6b) Các ankyrin này tương tác với vùng tín hiệu định vị nhân (NLS) ở miền tương đồng Rel (Hình 1.6a) và che khuất tín hiệu định vị nhân NLS Do vậy vùng ankyrin sẽ ngăn cản các protein NF-κB di chuyển từ tế bào chất vào trong nhân để thực hiện chức năng hoạt hóa phiên mã Cấu trúc lặp ankyrin của p105 và p100 cho phép chúng hoạt động như các protein IκB và ức chế NF-κB dimer [148] Khi có tín hiệu hoạt hóa con đường NF-κB, protein p105 hoặc p100 sẽ được cắt bỏ vùng lặp ankyrin để tạo ra các protein trưởng thành là p50 hoặc p52 [90, 119, 148]

Các NF-κB không hoạt động ở dạng đơn phân tử mà thường tương tác với nhau để tạo thành dạng lưỡng phân tử (dimer) gồm dạng đồng dimer (homodimer) giữa hai phân tử NF-κB cùng loại và dạng dị dimer (heterodimer) giữa hai loại NF-κB khác nhau Nhiều dạng dimer hóa đã được phát hiện và nghiên cứu như p65/p65, p65/c-Rel, p65/p52, c-Rel/c-Rel, p52/c-Rel, p50/c-Rel, p50/p50, RelB/p50,

tác với DNA đích Các protein p50 và p52 thiếu vùng hoạt hóa phiên mã (TAD) Do vậy, chúng chỉ có thể hoạt hóa phiên mã khi chúng kết hợp với các yếu tố phiên mã có chứa TAD (p65, RelB, c-Rel) để hình thành dạng dị dimer (heterodimer) Trong số các dimer, dạng dimer phổ biến nhất hoạt động trong các tế bào động vật là dị dimer giữa hai phân tử protein p50 và p65 [54]

Hình 1.6 Cấu trúc domain của các yếu tố phiên mã NF-κB [177]

(a) Cấu trúc domain của 5 yếu tố phiên mã của con đường NF-κB; vùng khóa lơ-xin (LZ), domain tương đồng với Rel (RHD), tín hiệu định vị nhân (NLS), vùng hoạt hóa

phiên mã (TAD), (b) Họ các protein IκB gồm các protein chứa vùng ankyrin lặp lại,

các protein này gồm IκBα, IκBβ, IκBαε và các protein p105, p100, (c) Cấu trúc 3D dị dimer giữa domain RHD của p50 và domain RHD của p65

Miền tương đồng RHD (Hình 1.6c) có ba chức năng quan trọng là hình thành dimer, liên kết với DNA của gen đích và tương tác với protein IκB [148] Do có nhiều vai trò rất quan trọng như vậy, cấu trúc 3D của miền RHD được các nhà khoa học tập trung làm sáng tỏ Miền RHD chứa 2 domain là domain đầu C (aa 226-327) và domain đầu N (aa 38-220) (Hình 1.6c) Hai domain này được nối với nhau bằng một đoạn linker chứa khoảng 6-10 axit amin Domain đầu C có vùng bề mặt kỵ nước có thể tương tác với một domain C khác để hình thành dạng lưỡng phân tử (dimer) Domain C của hai phân tử cùng loại tương tác với nhau sẽ hình thành dạng đồng dimer (homodimer) ví dụ như p50-p50 hoặc p65-p65 Domain C của hai phân tử protein khác loại liên kết với nhau thì hình thành dạng dị dimer (heterodimer) ví dụ như p50-p65 Hình 1.6c minh họa cấu trúc tinh thể của dạng dị dimer giữa domain RHD của p50 và domain RHD của p65 Hai domain C của cùng một loại protein có ái lực tương tác với nhau yếu hơn so với hai domain C của hai loại protein khác nhau Đây cũng là một trong những lý do khiến sự hình thành dạng dị dimer giữa hai protein p50 và p65 là phổ biến nhất Ngược lại với domain đầu C, domain vùng đầu N của mỗi đơn phân quay ra ngoài hình thành cấu trúc chữ X có chứa rãnh liên kết với DNA (Hình 1.6c) Ở domain đầu N có chứa các axit amin có tính bảo thủ cao là R30-R33-R35-C38 của protein p65 và R351-R354-R356-C359 của protein p50 (Hình 1.6c) Motif này có tính bảo thủ rất cao ở tất cả các động vật và đóng vai trò quan trọng trong duy trì cấu trúc và tương tác của RHD với trình tự tăng cường (κB DNA) ở vùng điều hòa phiên mã của các gen đích Đặc biệt, các axit amin C38 (p65) và C359 (p50) là đích tương tác ức chế của nhiều chất ức chế NF-κB [60]

b Con đường truyền tin NF-κB

Có ba con đường truyền tin tham gia vào hoạt hóa NF-κB gồm con đường cổ điển (classical/canonical pathway), con đường phi cổ điển (non-canonical pathway) và con đường không điển hình (atypical pathway) [101, 136, 148]

Hình 1.7 Con đường NF-κB [100]

Con đường cổ điển là con đường truyền tin chính tham gia vào hoạt hóa κB Con đường cổ điển được hoạt hóa bởi nhiều loại kích thích khác nhau như TNF-a, IL-1 hoặc LPS (Hình 1.7) [101] Hoạt hóa NF-κB theo con đường cổ điển được mô tả ở Hình 1.7 [20, 21] Ở tế bào bình thường, khi không có tín hiệu kích thích, các IκBα bám vào phức hệ NF-κB và che khuất vùng trình tự axit amin NLS mang tín hiệu chuyển NF-κB vào nhân tế bào Kết quả là NF-κB bị ức chế và bị giữ lại ở tế bào chất của tế bào Khi có tín hiệu hoạt hóa con đường NF-κB như các tác nhân gây dị ứng, stress, TNF-α, IL-1, LPS, các mầm bệnh, phức hệ enzyme IKK (IκB kinase) sẽ phosphoryl hóa protein IκBα Sau khi bị phosphoryl hóa, IκBα sẽ tiếp tục bị ubiquitin hóa (Hình 1.7) và bị phân hủy bởi phức hệ 26S proteasome Sau khi IκBα bị phân hủy, vùng trình tự axit amin mang tín hiệu NLS cho việc vận chuyển NF-κB vào nhân sẽ được lộ ra và NF-κB sẽ được vận chuyển từ tế bào chất vào trong nhân của tế bào Ở trong nhân tế bào, các NF-κB nhận biết và bám vào trình tự κB ở vùng điều hòa hoạt động của các gen đích Vị trí κB có trình tự là 5’-

NF-GGGPuNPyPyPyCC-3’, trong đó Pu là purine, N là bất kỳ loại nucleotit nào và Py là pyrimidine Các NF-κB bám vào các trình tự κB trên các promoter và thúc đẩy

quá trình phiên mã của gen đích gây viêm như iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1 [101,

136, 148] Con đường cổ điển là con đường truyền tin chính tham gia vào hoạt hóa NF-κB

Khác với con đường cổ điển, con đường NF-κB phi cổ điển không phụ thuộc vào protein ức chế IκBα [153] Con đường này chỉ hoạt hóa p100 chứ không hoạt hóa các protein NF-κB khác Khi được hoạt hóa bởi một nhóm các thụ thể CD40, beta lymphotoxin (LTβ), yếu tố hoạt hóa tế bào B (BAF), con đường phi cổ điển kích hoạt sự phân hủy vùng ankyrin lặp lại (có vai trò giống với IκBα) của protein p100 và hoạt hóa phức hệ p100/RelB protein (Hình 1.7) [100] Trong điều kiện bình thường không có kích thích, các protein kinase hoạt hóa NF-κB (viết tắt là NIK) sẽ bị ubiquitin hóa và bị phân hủy Khi có các tín hiệu kích thích, NIK sẽ được phosphoryl hóa và hoạt hóa IKKα IKKα ở dạng phosphoryl hóa sẽ tiếp tục phosphoryl hóa tiểu đơn vị p100 (NF-κB2) và dẫn đến sự phân hủy vùng ankyrin lặp lại của p100, giúp protein thành dạng trưởng thành (p52) Protein p52 hình thành dị dimer với RelB sẽ được vận chuyển vào nhân tế và hoạt hóa các gen đích tương ứng (Hình 1.7) Con đường phi cổ điển chỉ kích hoạt protein p100/RelB và chủ yếu tham gia vào sự hình thành tế bào lympho và tế bào B, hoạt hóa tế bào tua và chuyển hóa xương [153]

Con đường NF-κB không điển hình (atypical pathway) là con đường hiếm gặp không phụ thuộc vào IKK [100] Nó chỉ được kích hoạt trong một vài trường hợp ví dụ như khi có tia UV có bước sóng ngắn (Hình 1.7) Tia UV sẽ gây ra tổn thương DNA và kích hoạt protein p38 và enzyme casein kinase 2 (CK2) CK2 sẽ phosphoryl hóa IκBα và phân hủy IκBα nhờ phức hệ 26S proteosome Khi IκBα bị phân hủy, p50/p65 sẽ được chuyển vào nhân và thực hiện chức năng phiên mã gen đích Con đường không phổ biến là con đường ít khi xảy ra nhất Nó chỉ được kích hoạt khi có tổn thương DNA do gốc tự do hoặc tia UV bước sóng ngắn gây ra [100]

Trong ba con đường truyền tin NF-κB, con đường cổ điển là con đường truyền tin quan trọng nhất tham gia vào hoạt hóa NF-κB [153] Con đường này có nhiều yếu tố phiên mã với nhiều thành phần NF-κB khác nhau tham gia và đáp ứng với nhiều tín hiệu khác nhau từ môi trường ngoại bào Trong các dạng NF-κB của con đường này, dạng dị dimer p50/p65 là phổ biến nhất và có mặt ở hầu hết các loại tế bào động vật khác nhau [122] Do đóng vai trò quan trọng và phổ biến nhất trong ở các loài động vật, con đường truyền tin cổ điển được các các nhà khoa học tập trung nghiên cứu [100, 118, 122, 136]

1.3 VAI TRÒ CỦA NF-κB TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÁC

THUỐC KHÁNG VIÊM

1.3.1 Con đường NF-κB và các bệnh liên quan

a Mối liên quan giữa NF-κB và các bệnh rối loạn phản ứng viêm

Ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự hoạt hóa NF-κB đóng một vai trò quan trọng trong việc phát sinh và phát triển các bệnh liên quan tới rối loạn phản ứng viêm [16, 113, 174] NF-κB có thể làm cho tình trạng viêm tiến triển nặng hơn do có khả năng tạo ra nhiều cytokine, chemokine, các loại enzyme và các phân tử kết dính có liên quan đến phản ứng viêm [16, 156] Các phân tử này tham gia vào quá trình viêm bằng cách thu hút các tế bào bạch cầu di chuyển đến vị trí viêm [11] Sự tăng biểu hiện của enzyme iNOS do sự hoạt hóa của NF-κB có liên quan trực tiếp tới viêm loét đại tràng [172], hen suyễn và viêm khớp [41, 62] Sự tăng biểu hiện của enzyme COX-2 được điều hòa bởi NF-κB cũng liên quan trực tiếp tới bệnh viêm khớp dạng thấp [15] Sự hoạt hóa liên tục của NF-κB dẫn đến việc gia tăng phiên mã các protein gây viêm trong phế quản và tạo đờm ở bệnh nhân hen suyễn [24, 25, 147] Nhiều gen liên quan đến phản ứng viêm (ví dụ như các gen mã hóa cho protein IL-9, IL-13, eotaxin, TSLP, ICAM-1, VCAM-1, E-selectin) được điều hòa bởi NF-κB vì chúng chứa các trình tự κB DNA ở vùng promoter [8]

b Mối liên quan giữa NF-κB và ung thư

NF-κB tham gia điều khiển hoạt động của nhiều nhóm gen liên quan tới ung thư Các nhóm gen này mã hóa cho các protein liên quan đến khả năng sống sót của tế bào (bcl-xl, cIAP, XIAP, c-FLIP); khả năng tăng sinh tế bào (Cycline D1, cMyc, TNF-α, IL-1, IL-6); khả năng tăng sinh mạch máu (VEGF, TNF-α, IL-1, IL8); phát triển khối u (COX2, iNOS, MMP-9, uPA); và khả năng xâm lấn và di căn (ICAM-1, VCAM-1, ELAM-1) [59] Sự hoạt hóa quá mức NF-κB khiến cho tế bào không những không bị chết theo chương trình mà còn sinh sản nhanh hơn, dẫn đến sự hình thành và phát triển của các tế bào ung thư [19, 59, 69, 94, 100] Như vậy, sự hoạt hóa quá mức NF-κB chính là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh và tiến triển nặng của hàng loạt bệnh ung thư khác nhau như ung thư phổi, ung thư gan, ung thư thận, ung thư đại tràng, ung thư cổ tử cung, ung thư vòm họng, ung thư tuyến tiền liệt [6, 91, 95, 100, 104, 137, 175]

1.3.2 Các đích tác dụng thuốc tiềm năng của con đường NF-κB

NF-κB điều khiển trên 500 gen liên quan đến nhiều bệnh rối loạn phản ưng viêm khác nhau [56] Do vậy, việc tìm kiếm các chất ức chế con đường NF-κB đã và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới Cho đến nay, đã có nhiều chất ức chế con đường NF-κB được phát hiện [60, 126, 144] Những chất ức chế này tác dụng tới các giai đoạn khác nhau (Hình 1.8) của con đường NF-κB,

bao gồm (1) giai đoạn kích thích, (2) giai đoạn phosphoryl hóa IκBα, (3) giai đoạn phân hủy IκBα và (4) giai đoạn protein NF-κB bám vào trình tự κB DNA của gen đích và hoạt hóa gen đích (giai đoạn này được gọi là giai đoạn ức chế NF-κB)

Các chất ức chế giai đoạn kích thích thường là các chất có khả năng chống

oxi hóa (anti-oxidant) như glutathione, axit α-lipoic, pyrrolidine dithiocarbamate v.v… Những chất chống ôxi hóa này ức chế con đường NF-κB bằng cách bắt giữ các gốc tự do sinh ra do stress, tia UV, tia tử ngoại, quá trình trao đổi chất của tế bào v.v Tuy nhiên, chất chống ôxi hóa có tính đặc hiệu không cao đối với con đường NF-κB do chúng còn tương tác với nhiều protein khác [126]