TỔ NG QUAN
M ộ t vài nét v ề viêm và ung thƣ
1.1.1 Viêm và tiềm năng kháng viêm của các hợp chất từ thực vật
Viêm là một căn bệnh phổ biến tại Việt Nam và trên toàn thế giới, phản ánh một phản ứng phức tạp của cơ thể tại mô liên kết sau khi bị tổn thương tế bào Biểu hiện của viêm bao gồm sưng, nóng, đỏ và đau do mạch máu giãn nở, giúp đưa máu và bạch cầu đến vùng bị tổn thương để loại trừ tác nhân gây viêm Quá trình này thường sản sinh ra các chất như prostaglandin và cytokine nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa tác nhân gây hại Nếu viêm cấp tính không được điều trị kịp thời, nó có thể chuyển sang viêm mãn tính Viêm không chỉ là một phản ứng bảo vệ cơ thể mà còn có thể trở thành phản ứng bệnh lý có hại, dẫn đến tổn thương mô lành, rối loạn chức năng cơ quan, thậm chí gây ung thư.
Trong quá trình viêm, đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong việc khởi động, duy trì và giải quyết tình trạng viêm Dưới tác động của lipopolysaccharide (LPS), đại thực bào tiết ra các cytokine tiền viêm như interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), cùng với các chất trung gian gây viêm như oxit nitric (NO) và prostaglandin E2 (PGE2) NO tác động lên tế bào cơ trơn mạch máu, tăng tính thấm thành mạch và thúc đẩy sự xâm nhập của các chất trung gian gây viêm, đồng thời lôi kéo bạch cầu đơn nhân vào vị trí viêm iNOS tạo ra NO từ L-arginine, đóng vai trò trung gian trong quá trình kích hoạt miễn dịch và viêm Sự kích hoạt COX-2 bởi LPS trên dòng tế bào đại thực bào RAW 264.7 cũng diễn ra thông qua việc tạo NO nội sinh Việc ức chế biểu hiện quá mức của iNOS và COX-2 là cần thiết để ngăn ngừa và điều trị các bệnh viêm.
1.1.1.1 Các giai đoạn của quá trình viêm
Quá trình viêm thường diễn biến qua các giai đoạn sau [10]:
Rối loạn tuần hoàn tại ổ viêm xảy ra khi yếu tố gây viêm tác động lên cơ thể, dẫn đến bốn hiện tượng chính: rối loạn vận mạch, hình thành dịch rỉ viêm, bạch cầu xuyên mạch và bạch cầu thực bào.
Rối loạn chuyển hóa xảy ra khi quá trình oxy hóa tại ổ viêm tăng lên, dẫn đến nhu cầu oxy gia tăng, trong khi sự sung huyết động mạch không đáp ứng kịp thời Hậu quả là pH máu giảm, đặc biệt là khi chuyển sang sung huyết tĩnh mạch, từ đó gây ra hàng loạt rối loạn chuyển hóa liên quan đến glucid, lipid và protein.
Tổn thương mô tại vị trí viêm bao gồm hai loại chính: tổn thương tiên phát, xuất phát từ nguyên nhân gây viêm, và tổn thương thứ phát, phát sinh do các rối loạn xảy ra trong ổ viêm.
Tăng sinh tế bào là một phần quan trọng trong quá trình làm lành vết thương, bắt đầu bằng tổn thương tế bào và kết thúc với sự phát triển tái tạo Trong giai đoạn đầu, quá trình này diễn ra với sự gia tăng số lượng tế bào, bao gồm bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu đơn nhân và lympho bào.
Cuối cùng, sự tăng sinh tế bào vượt mức hoại tử giúp ổ viêm được chữa lành Các tế bào nhu mô tại vị trí viêm có khả năng tái sinh hoàn toàn, phục hồi cấu trúc và chức năng của mô viêm Tuy nhiên, nếu tế bào nhu mô không tái sinh hoàn toàn, mô viêm có thể bị thay thế bằng mô xơ, dẫn đến hình thành sẹo.
1.1.1.2 Các con đường tín hiệu gây viêm
Các con đường gây viêm ảnh hưởng đến cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh mãn tính thông qua các chất trung gian gây viêm Các tác nhân kích thích viêm như vi sinh vật và cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) tương tác với các thụ thể như IL-1R, IL-6R và TNFR, từ đó kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào quan trọng như NF-κB, MAPK, JAK-STAT và TLR4/MyD88, dẫn đến sản xuất các chất trung gian gây viêm.
Con đường NF-κB là một yếu tố quan trọng trong việc điều chỉnh viêm, đáp ứng miễn dịch, sự phát triển tế bào và apoptosis, bao gồm năm yếu tố phiên mã: P50, p52, RelA (p65), RelB và c-Rel Hoạt động của NF-κB được kích hoạt bởi nhiều tác nhân như mầm bệnh, cytokine gây viêm và enzym Trong điều kiện bình thường, protein IκB trong tế bào chất ức chế NF-κB Các thụ thể nhận dạng khuôn mẫu (PRR) kích hoạt IκB kinase (IKK), bao gồm các tiểu đơn vị IKKα, IKKβ và IKKγ, điều chỉnh hoạt động của NF-κB thông qua phosphoryl hóa IκB Quá trình này dẫn đến phân hủy IκB bởi proteasome, giải phóng NF-κB vào nhân để kích hoạt phiên mã Con đường NF-κB điều chỉnh phản ứng tiền viêm, sản sinh các chất trung gian gây viêm như NO và PGE2, cũng như biểu hiện các enzyme như iNOS và COX-2, từ đó gia tăng số lượng tế bào viêm và tăng cường phản ứng viêm.
- Con đường MAPK (Mitogen-activated protein kinase)
MAPK là một họ kinase protein serine/threonine có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh lý tế bào như phiên mã gen, tăng sinh, biệt hóa, và apoptosis Các cytokine gây viêm như IL-1, TNF-α và IL-6 cũng được kích hoạt thông qua các thành phần của MAPK Hệ thống này liên quan đến ba lộ trình chính: lộ trình ERK1/2 kinase, lộ trình p38, và lộ trình c-Jun N-terminal kinase (JNK).
Sự hoạt hóa của các MAPK như Erk1/2 và JNK dẫn đến quá trình phosphoryl hóa và kích hoạt các yếu tố phiên mã p38, khởi đầu phản ứng viêm Họ p38, một nhóm protein kinase kích hoạt mitogen, là mục tiêu quan trọng trong điều trị các bệnh viêm như viêm đường hô hấp mãn tính, viêm khớp dạng thấp, và COVID-19 Bốn đồng dạng của họ MAPK p38 gồm p38α, p38β, p38γ và p38δ, trong đó p38α được kích hoạt bởi nhiều kích thích viêm và đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp các cytokine tiền viêm như IL-1β và TNF-α Sự kích hoạt p38α cũng làm tăng cường biểu hiện của các chất gây viêm như COX-2 và iNOS Do đó, con đường p38α MAPK khi bị kích hoạt có khả năng điều chỉnh tình trạng viêm thông qua giải phóng các cytokine gây viêm, khiến việc ức chế con đường này trở thành một trong những mục tiêu trong điều trị các bệnh lý viêm.
- Con đường JAK-STAT (Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)
Con đường JAK-STAT đóng vai trò quan trọng trong việc kết nối các tyrosine kinase với các yếu tố phiên mã, kiểm soát sự biểu hiện gen thông qua tác động trực tiếp vào các yếu tố này Các yếu tố phiên mã STAT thường tồn tại ở trạng thái bất hoạt trong tế bào Khi các phân tử gắn vào thụ thể, chúng kích hoạt STAT gắn kết với JAK tại vùng SH2, dẫn đến phosphoryl hóa, dimer hóa và di chuyển vào nhân để điều chỉnh quá trình phiên mã gen Phosphoryl hóa tyrosine là cần thiết cho sự đồng phân hóa STAT và liên kết DNA, cho phép tín hiệu JAK/STAT chuyển đổi tín hiệu ngoại bào thành phản ứng phiên mã Ví dụ, sự liên kết của các thành viên họ IL-6 với thụ thể màng sinh chất kích hoạt các protein JAK-STAT, giúp STAT di chuyển vào nhân và liên kết với các vùng khởi động gen mục tiêu để điều chỉnh phiên mã của các gen viêm.
- Con đường TLR4/MyD88 (Toll-like receptor 4/myeloid differentiation primary response 88)
Con đường TLR4/MyD88 đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt các con đường NF-κB và MAKP, với TLR4 là thụ thể đặc hiệu cho LPS Khi được kích hoạt bởi LPS, TLR4 sẽ oligome hóa và thu hút các phân tử tiếp hợp thông qua tương tác với các vùng TIR, bao gồm MyD88 và TRIF MyD88 là yếu tố chính trong việc truyền tín hiệu của con đường TLR, và ngoại trừ TLR3, tất cả các thụ thể TLR đều sử dụng MyD88 để truyền tín hiệu Sự kích hoạt của con đường TLR4/MyD88 sẽ tăng cường hoạt động của NF-κB và MAKP, do đó, việc ngăn chặn sự nhị phân của TLR4 có thể làm giảm sự thu hút của protein MyD88, từ đó ức chế các con đường NF-κB và MAKP, ngăn chặn khởi động phản ứng viêm.
1.1.1.3 Một số hoạt chất nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng kháng viêm
Hiện nay, thị trường thuốc kháng viêm chủ yếu cung cấp các loại thuốc tổng hợp hóa học hoặc thuộc nhóm corticoid, điều này tiềm ẩn nhiều nguy cơ do tác dụng phụ có thể gây hại cho sức khỏe và chi phí sản xuất thường cao.
Thuốc kháng viêm từ nguồn gốc thực vật là giải pháp hiệu quả cho vấn đề viêm Chúng có nhiều ưu điểm nổi bật, bao gồm tính an toàn cao, ít gây phản ứng phụ, hiệu quả lâu dài và giá thành phải chăng Những loại thuốc này đang mở ra hướng đi mới trong điều trị bệnh viêm.
Cơ chế kháng viêm của các hoạt chất chiết xuất từ thực vật:
- Ức chế enzym 15-Lipoxygenase (LOX)
Sơ lƣợ c v ề chi Physalis
1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Physalis
Chi Physalis, thuộc họ Cà (Solanaceae), có khoảng 120 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Nhiều loài trong chi này không chỉ được sử dụng làm thực phẩm mà còn có giá trị trong y học dân gian, giúp chữa trị các bệnh như cảm sốt, ho, tiểu đường và hen suyễn Tại Việt Nam, các loài Physalis thường mọc hoang ở bờ ruộng, bãi cỏ và ven rừng Theo tác giả Võ Văn Hợp (2018), chi Physalis có 5 loài tiêu biểu như Physalis angulata và Physalis alkekengi.
(thù lù kiểng), Physalis peruviana (thù lù lông), Physalis cordata Mill (Tầm bóp lá hình tim) và Physalis minima (thù lù nhỏ) [85]
Các loài thuộc chi Physalis là cây thân thảo cao từ 0,4 m đến 3 m, thường sống ở nơi có ánh sáng đầy đủ và khí hậu ấm áp Mặc dù một số loài nhạy cảm với sương giá, như Physalis alkekengi lại có khả năng chịu lạnh tốt Lá của chúng mọc so le, hình bầu dục, dài 30 – 35 mm và rộng 20 – 40 mm, với cuống lá dài từ 15 – 30 mm Hoa lưỡng tính mọc đơn độc, có cuống dài khoảng 1 cm, đài hoa hình chuông chia thành 5 thuỳ, tràng hoa màu vàng tươi hoặc trắng nhạt, có thể có chấm tím ở gốc Quả mọng tròn, nhẵn, thường nằm trong vỏ mỏng từ đài hoa, khi chín có màu cam với ruột nhiều ngăn rỗng; một số loài cho quả ruột đặc và được gọi là quả anh đào đất (Groundcherry).
1.2.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Physalis
Thành phần hóa học và hoạt tính sinh dược học của các loài thuộc chi
Physalis đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên toàn thế giới, với nhiều công trình công bố về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dược liệu này Các loài thuộc chi Physalis đã được chứng minh có khả năng kháng ung thư, kháng viêm, giảm đau, hạ sốt, chống tiểu đường, kháng khuẩn, kháng lao, kháng ký sinh trùng sốt rét và điều hòa miễn dịch.
Các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp sắc ký và phân tích quang phổ để tách chiết và xác định 216 hợp chất có trong chi Physalis Thành phần hóa học chính của chi này bao gồm các withanolides, labdane diterpene, sucrose ester, flavonoid, ceramide và một số hợp chất khác.
1.2.3 Gi ớ i thi ệ u v ề loài T ầ m bóp (P.angulata)
Loài Tầm bóp (P angulata) là cây thân thảo sống hàng năm, cao gần 50 cm, với thân có góc cạnh, mập, dòn và phân cành nhiều Lá cây có lông, mọc so le, hình trái xoan với gốc hình nêm và đầu thuôn nhọn, mép lá nguyên hoặc đôi khi xẻ thùy nhỏ và gợn sóng Hoa của cây mọc đơn độc ở kẽ lá, có màu vàng tươi hoặc trắng nhạt, với gốc tím và đài hình chuông Quả mọng, hình cầu và nhẵn, có màu đỏ, được bao bọc bởi đài to đồng trưởng Hạt của cây nhiều, dẹt và hình thận, ra hoa kết quả vào tháng 5-7.
Hình 1.3: Thân (A), rễ (B), toàn bộ cây (C), quả và đài hoa (D) và lá (E) của loài P angulata [88]
1.2.3.2 Dạng sống và sinh thái
Loài Tầm bóp (P angulata) phân bố rộng rãi ở nhiều nước nhiệt đới thuộc Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ Tại Việt Nam, loài này chủ yếu xuất hiện ở các tỉnh như Lạng Sơn, Bắc Giang, Ninh Bình, Gia Lai, và thường mọc hoang tại các bờ ruộng, bãi cỏ, đất hoang và ven rừng.
1.2.3.3 Công dụng theo kinh nghiệm dân gian
Loài Tầm bóp (P angulata) có tác dụng hiệu quả trong việc trị cảm sốt, giảm sưng đau yết hầu và ho có đờm Quả của cây có thể ăn được và được sử dụng để chữa ho do đờm nhiệt Ngoài ra, rễ tươi của loài này khi nấu với tim lợn và chu sa cũng được dùng để điều trị bệnh đái tháo đường.
1.2.3.4 Hoạt tính chống ung thư
Các hợp chất phân lập từ chi Physalis, đặc biệt là từ loài P angulata L, cho thấy tiềm năng chống ung thư cao với 16 hợp chất withanolide mới được phát hiện, bao gồm physangulatin A-N và withaphysalin Y-Z Nghiên cứu của Sun và cộng sự (2016) đã chỉ ra rằng các hợp chất này có khả năng ức chế sự tăng sinh của nhiều dòng tế bào ung thư người, bao gồm tế bào ung thư tuyến tiền liệt, thận và u ác tính, với giá trị IC50 từ 0,18 - 7,43 μM Ngoài ra, một số hợp chất cũng cho thấy khả năng ức chế sản sinh NO do lipopolysaccharide (LPS) gây ra trong đại thực bào, với giá trị IC50 từ 1,36 - 11,59 μM.
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học một số hợp chất phân lập từ loài P angulata
Maldonado và cộng sự (2015) đã thực hiện nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tế bào ung thư người, bao gồm u nguyên bào thần kinh (U-251), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư bạch cầu tủy mãn tính (K-562), ung thư biểu mô tuyến (HCT-15), ung thư tuyến vú (MCF-7) và ung thư phổi (SK-LU-1) Nghiên cứu này tập trung vào 3 hợp chất physangulide B, 4-O-acetylphysangulide B và physangulide acetamide được chiết xuất từ loài P angulata Kết quả cho thấy, ở nồng độ 20 µM, physangulide B và 4-O-acetylphysangulide B đã ức chế hoàn toàn sự tăng sinh của tế bào, với giá trị IC50 lần lượt cho dòng tế bào PC-3 là 0,43 ± 0,03 µM và 0,32 ± 0,02 µM, cũng như SK-LU-1 là 0,35 ± 0,01 µM và 0,27 ± 0,01 µM Camptothecin được sử dụng làm chất đối chứng dương với IC50 là 0,12 ± 0,01 µM.
Nghiên cứu cho thấy các hợp chất như dũng PC-3 và SK-LU-1 có hoạt tính mạnh với nồng độ 0,01 àM và 0,15 ± 0,009 àM Đặc biệt, physangulidine A, được chiết xuất từ loài P angulata, có khả năng làm rối loạn chu kỳ tế bào và gây chết tế bào theo cơ chế apoptosis, chủ yếu do các khiếm khuyết trong quá trình phân bào ở dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU145.
Chất (32) có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) ở giai đoạn G2/M, với giá trị GI50 đạt 3,6 μM (1,8 μg/mL) Nó kích hoạt caspase-3 và phân tách PARP-1, dẫn đến sự phân rã DNA trong nhân tế bào ung thư, gây ra quá trình apoptosis.
Hợp chất physangulide B, 4-O-acetylphysangulide B, physangulide acetamide và Physangulidine A được phân lập từ loài P angulata Nghiên cứu của Hsieh và cộng sự (2006) cho thấy dịch chiết từ P angulata có khả năng gây ra sự bắt giữ pha G2/M trong các dòng tế bào ung thư vú ở người.
Nghiên cứu của Hsu và cộng sự (1992) cho thấy physalin B, một hoạt chất chính được chiết xuất từ loài P angulata, có khả năng gây ra apoptosis trong các dòng tế bào ung thư như HepG2, A375 và A2058 với IC50 thấp hơn 4,6 µg/mL Cơ chế tác động của physalin B liên quan đến các con đường NOXA, caspase-3, Bax và ti thể, mà không gây hại cho các nguyên bào sợi da hay tế bào cơ tim Thêm vào đó, physalin B cho thấy ít độc tính đối với các tế bào CCD-966SK, T/G HA-VSMC và H9c2, điều này mở ra triển vọng phát triển nó thành một liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả cho các khối u ác tính.
Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất Physalin B (33) và Physalin F (34) phân lập từ loài P angulata
Nghiên cứu của Chiang và cộng sự (1992) chỉ ra rằng Physalin B và Physalin F, được chiết xuất từ loài P angulata, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào bạch cầu như K562, APM1840, HL-60, KG-1 và CTV-1 Đặc biệt, Physalin F cho thấy độc tính tế bào đối với các dòng tế bào ung thư thận qua quá trình apoptosis phụ thuộc vào ROS và NF-κB Physalin F kích hoạt các protein Bcl-2, hình thành các oligomer trên màng ti thể, giúp phóng thích cytochrome c và các protein khác vào tế bào chất, từ đó kích thích caspase và điều hòa apoptosis Nghiên cứu cũng cho thấy Physalin F kích hoạt gen p53, giảm biểu hiện và phosphoryl hóa IκBa, ức chế hoạt động của NF-κB, thúc đẩy apoptosis tế bào ung thư theo thời gian Thêm vào đó, Physalin F gây apoptosis qua con đường ti thể bằng cách phá hủy điện thế màng ti thể, giải phóng cytochrome c, kích hoạt Apaf-1 và hình thành apoptosome, dẫn đến sự hoạt hóa của pro-caspase-9 và cuối cùng là apoptosis của tế bào A549.
Theo nghiên cứu của Hsieh và cộng sự (2006), dịch chiết methanol của loài
P.angulata ức chế sự tăng sinh tế bào và bắt giữ tế bào ung thư vú di căn (MDA- MB-231) ở pha G2/M, ức chế tổng hợp của mRNA và làm tăng nồng độ cyclin A, giảm hoạt động Cdc2, tăng phosphoryl Cdc2, giảm Cdc25C và tăng cường biểu hiện của chất ức chế chu kỳ tế bào gồm các gen p21, p27 bằng cách gắn và bất hoạt phức hợp cyclin-CDK thông qua con đường ức chế kinase phụ thuộc cyclin p21 waf1/cip1 và P27 kip1 Ngoài ra, chiết xuất methanol của P angulata còn được chứng minh là có khả năng gây ra apoptosis trong các dòng tế bào ung thư vú MDA-MB 231 và MCF-7 ở người theo cơ chế kích hoạt caspase-3 gây ra sự phân cắt PARP, phá vỡ chuỗi DNA và nhiễm sắc thể [92]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tƣợ ng và v ậ t li ệ u nghiên c ứ u
2.1.1 Mẫu loài Tầm bóp ( P angulata )
Loài Tầm bóp (P angulata) được thu hái tại huyện Tiền Hải và Đông Hưng, tỉnh Thái Bình vào tháng 8 năm 2015, sau khi được loại bỏ tạp chất, rửa sạch, phơi ở nhiệt độ phòng, và sấy khô ở 50-60 độ C, đã được xay thành bột khô với khối lượng 2.0 kg Mẫu nguyên liệu thực vật này đã được Tiến sĩ Trần Thị Phương Anh tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định Hiện nay, mẫu tiêu bản (TB 14.2015) được lưu giữ tại Viện nghiên cứu khoa học Miền Trung thuộc Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2 Mẫu loài Thù lù nhỏ (P minima)
Loài Thù lù nhỏ (P.minima) được thu hái tại xã Hương Hòa, huyện Nam Đông, tỉnh Thừa Thiên Huế, Việt Nam vào tháng 9 năm 2018 Sau khi loại bỏ tạp chất, thực vật được rửa sạch, phơi ở nhiệt độ phòng, sấy khô ở nhiệt độ 50-60°C và xay thành bột thô, thu được 2.6 kg bột khô Mẫu nguyên liệu đã được Tiến sỹ Trần Thị Phương Anh từ Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam giám định và hiện đang được lưu giữ tại Viện nghiên cứu khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam với mã số MISR2018-18.
+ Dòng RAW 264.7 do GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp
Các dòng tế bào ung thư ở người bao gồm SK-LU-1 (ung thư phổi), A549 (ung thư phổi), HeLa (ung thư cổ tử cung), PANC-1 (ung thư tụy), HepG2 (ung thư tế bào gan), và MCF7 (ung thư vú), được cung cấp bởi GS Chi-Ying Huang từ Đại học National Yang Ming Chiao Tung, Đài Loan và GS Maier J từ trường Đại học Milan, Italia.
The cell culture environment utilizes DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), enhanced with L-glutamine, sodium pyruvate, NaHCO3, penicillin/streptomycin, and 10% Fetal Bovine Serum (FBS) Additionally, Trypsin-EDTA (0.05%) is included, along with the Alexa Fluor® 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit from Invitrogen (USA).
2.1.4 Ho á chất và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
2.1.4.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu hóa học và chiết xuất
- Dichloromethane, ethyl acetat, methanol (MeOH), aceton, n-hexan (Trung Quốc, Merck) Các loại dung môi của Trung Quốc được chưng cất lại trước khi dùng
- Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s
(Merck) tráng sẵn trên đế nhôm
- Bản sắc ký lớp mỏng điều chế Silica gel 60G F254
- Silica gel 60 dùng cho sắc ký cột (Merck, cỡ hạt 0,040-0,063 mm)
- Các dung môi thông thường khác
2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) and fetal bovine serum (FBS) are essential components for in vitro cell culture, while the Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit from Invitrogen (USA) provides critical tools for apoptosis detection These high-quality products from Invitrogen (USA) are designed to enhance cell culture applications and improve experimental outcomes.
- Kit Annexin V/cell dead apoptosis của Invitrogen (Hoa Kỳ)
- Bộ kit so màu Caspase-3 của Biovision Inc (Milpitas, CA, Hoa Kỳ)
- Các loại hóa chất: TCA, SRB, ellipticine, Lipopolysaccharides (LPS) từ
Escherichia coli, sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co (St Louis,
- Các hóa chất thông thường khác
- Máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, máy JASCO DIP-1000 KUY
- Đĩa nuôi cấy tế bào sáu giếng nhựa (Corning, USA), đĩa 96 giếng nhựa và pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (BioRad)
- Tủ ấm CO2 (Sanyo), tủ lạnh sâu -80 o C (Biobase), bình nitơ lỏng (Trung Quốc),
- Kính hiển vi soi ngược (Axiovert 40 CFL), buồng đếm tế bào (Fisher), cân phân tích (Ohaus), máy đo pH và các dụng thí nghiệm thông thường
- Các thiết bị chiết xuất, quay cất dung môi, thiết bị sấy, nghiền mẫu thực vật.
Phương pháp nghiên cứ u
2.2.1 Phương pháp xử lý tạo cao chiết methanol và các cao phân đoạn của các mẫu P angulata và P minima
Sau khi thu hái, mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô ở nhiệt độ phòng và sấy ở 50-60 độ C cho đến khi khô, sau đó nghiền thành bột Bột khô này được ngâm chiết bằng methanol với sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm Dịch chiết thu được được lọc qua giấy lọc và cất để thu hồi dung môi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm, tạo ra cao chiết methanol chứa hầu hết các hợp chất trong mẫu Cao methanol sau đó được hòa vào nước và chiết phân bố lỏng lỏng với các dung môi diclomethane và ethyl acetate có độ phân cực tăng dần để tách chiết mẫu thực vật từ loài P angulata và P minima Cuối cùng, quay cất để loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao chiết tương ứng.
Bảng 2.1 Các cao chiết từ loài P angulata và P minima
Cao chiết Kí hiệu các cao chiết
Cao (MeOH) tổng PA PM
2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ loài P angulata
2.2.2.1 Tạo cao chiết methanol và các cao chiếtphân đoạntừ loài P angulate
Sau khi thu hái, loài P angulata được thái nhỏ, sấy khô và xay nhuyễn để thu được 2.0 kg bột khô Bột này sau đó được ngâm chiết với methanol qua ba lần, mỗi lần 5 lít, với sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ 50 o C trong 3 giờ mỗi lần Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, từ đó thu được cao chiết methanol.
Cao chiết 90 g được phân tán trong 1.5L nước và chiết lỏng lần lượt bằng các dung môi dichloromethane và ethyl acetate với độ phân cực tăng dần Sau khi loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm, thu được các cao chiết tương ứng: dichloromethane (PAD) 24.5 g, ethyl acetate (PAE) 4.5 g và nước (PAW) 61.0 g.
PA: Cao Methanol PAE: Cao Ethyl acetate PAD: Cao Dichlomethane PAW: Cao nước
Hình 2.1 Sơ đồ điều chế các cao chiết phân lập từ loài P.angulata 2.2.2.2 Chiết xuất, phân lập các hợp chất từ cao chiết PAD của loài
Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết PAD của loài P angulata
Cao chiết dichloromethane (PAD, 24.5 g) được phân tách qua cột sắc ký silica gel và rửa giải bằng dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần, thu được 5 phân đoạn (PAD1-PAD5) Phân đoạn PAD2 tiếp tục được tách trên cột silica gel với dung môi dichloromethane/methanol (20/1, v/v), tạo ra 3 phân đoạn nhỏ hơn (PAD2a-PAD2c) Các phân đoạn PAD2a1 đến PAD2a3 được thu nhận từ sắc ký cột pha đảo RP18 (acetone/nước, 1.8/1, v/v) Phân đoạn PAD2a1 được tinh chế thêm trên cột RP18 với dung môi (methanol/nước, 1/1, v/v), thu được hợp chất PA12 (4.0 mg) Hợp chất PA7 (10.0 mg) và PA8 (8.0 mg) được thu từ phân đoạn PAD2a3 qua sắc ký cột silica gel với dung môi (dichloromethanol/acetone, 10/1, v/v) Cuối cùng, phân đoạn PAD2c được tách bằng cột RP18 với dung môi (methanol/nước, 2/1, v/v) và tiếp tục trên cột silica gel với dung môi (dichloromethanol/acetone, 5/1, v/v), thu được hợp chất PA2.
Phân đoạn PAD3 được xử lý trên cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/methanol (15/1, v/v), tạo ra 5 phân đoạn nhỏ (PAD3a - PAD3e) Hợp chất PA15 (5.3 mg) được tinh chế từ phân đoạn PAD3b qua sắc ký cột silica pha đảo RP18 với dung môi methanol/nước (1/1, v/v) Tiếp tục, phân đoạn PAD3c được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường bằng dung môi dichloromethane/acetone (15/1, v/v), thu được hợp chất PA9.
Hợp chất PA13 (12.0 mg) và PA14 (10.7 mg) được tách ra từ phân đoạn PAD3e thông qua phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng hệ dung môi dichloromethane/methanol với tỷ lệ 10/1 (v/v) Sau đó, các hợp chất này được tinh chế thêm bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi dichloromethane/acetone theo tỷ lệ 8/1 (v/v).
Phân đoạn PAD5 được tách trên cột sắc ký pha đảo RP18 với dung môi methanol/nước (2/1, v/v), tạo ra ba phân đoạn nhỏ hơn là PAD5a, PAD5b và PAD5c Qua quá trình tinh chế phân đoạn PAD5a bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (3/1, v/v), hợp chất PA3 đã được thu được với khối lượng 17.0 mg.
PA11 (7.0 mg) và PA10 (4.5 mg) được tách ra từ phân đoạn PAD5b trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi dichloromethane/acetone (6/1, v/v) Phân đoạn PAD5c được phân tách trên sắc ký pha đảo RP18 với hệ dung môi acetone/nước (1/1, v/v), thu được hợp chất PA4 (11.0 mg), PA5 (9.0 mg) và phân đoạn PAD5c3 Sau đó, phân đoạn này được tinh chế trên sắc ký cột pha thường đẳng dòng với hệ dung môi dichloromethane/methanol/nước (3/1/0.01, v/v/v), cho ra PA1 (8.0 mg).
2.2.3 Phương pháp phân lập các hợp chất từ loài P minima
2.2.3.1 Tạo cao chiết methanol và các cao chiết phân đoạntừ loài P minima
Sau khi thu hái, loài P minima được thái nhỏ, sấy khô và xay mịn, thu được 2.6 kg bột khô Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 4 lít) dưới sự hỗ trợ của thiết bị chiết siêu âm ở 50 oC, mỗi lần 3 giờ Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dưới áp suất giảm, thu được 150 g cao chiết methanol Cao chiết này được hòa tan với 1.5 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với dichloromethane và ethyl acetate Dung môi dichloromethane và ethyl acetate được loại bỏ dưới áp suất giảm, thu được các cao chiết dichloromethane (PMD, 15.0 g), ethyl acetate (PME, 8.0 g) và lớp nước (PMW, 94.0 g).
PM: Cao methanol PME: Cao Ethyl acetate PMD: Cao Dichlomethane PMW: Cao nước
Hình 2.3 Sơ đồ điều chế các cao chiết từ loài P minima
2.2.3.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cao chiết PMD và PME của loài P.minima
- Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cao chiết PMD của loài P.minima
Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết PMD của loài P minima
Cao chiết dichloromethane (PMD, 15.0 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi gradient dichloromethane/methanol (100/1 – 1/100, v/v), tạo ra 5 phân đoạn chính (PMD1 - PMD5) Phân đoạn PMD4 được tiếp tục phân tách trên cột sắc ký với dung môi dichloromethane/methanol (20/1, v/v), thu được 2 phân đoạn nhỏ hơn là PMD4a và PMD4b Phân đoạn PMD4a được tinh chế bằng cột sắc ký pha đảo RP18 với dung môi acetone/nước (2/1, v/v), cho ra 2 phân đoạn PMD4a1 và PMD4a2, trong đó hợp chất PM1 (40.0 mg) được thu nhận từ PMD4a2 qua sắc ký cột silica gel pha thường Phân đoạn PMD4b cũng được phân tách trên cột silica gel với dung môi dichloromethane/methanol (20/1, v/v), tạo ra PMD4b1 và PMD4b2 Hợp chất PM2 (20.0 mg) được tinh chế từ PMD4b1 bằng cột sắc ký pha đảo RP18 với dung môi methanol/nước (1.5/1, v/v) Cuối cùng, phân đoạn PMD4b2 được phân tách bằng sắc ký cột pha đảo RP18 với dung môi acetone/nước (1/2, v/v) và sắc ký cột silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/methanol (20/1, v/v), thu được hợp chất PM3 (50.0 mg).
- Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cao chiết PME của loài
Hình 2.5 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết PME của loài P minima
Cao chiết ethyl acetate (PME, 8.0 g) được phân tách bằng phương pháp sắc ký trên cột silica gel pha thường, sử dụng dung môi dichloromethane/methanol (20/1, v/v), cho ra 5 phân đoạn (PME1 – PME5) Trong đó, phân đoạn PME5 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha đảo, với dung môi methanol/nước (1/1.5, v/v).
Hai phân đoạn PME5A và PME5B cùng với hợp chất PM5 (20.0 mg) đã được nghiên cứu Phân đoạn PME5A được tinh chế thêm bằng phương pháp sắc ký silica gel pha thường, sử dụng dung môi dichloromethane/acetone (tỉ lệ 2/1, v/v), dẫn đến việc thu được hợp chất PM4 (15.0 mg) Hợp chất PM6 cũng đã được xác định trong quá trình này.
(8.0 mg) thu được sau khi tinh chế phân đoạn PME5b bằng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi dichloromethane/methanol (12/1, v/v).
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
Phương pháp xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thường dựa vào việc kết hợp các thông số vật lý với các kỹ thuật phổ hiện đại.
2.3.1 Phương pháp sắc ký dùng để phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật
Việc phân lập các chất từ cao chiết được thực hiện qua nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký rây phân tử.
- Sắc ký lớp mỏng: được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60
F254 (Merck 1,05715) và RP18 F254s (Merck) là các loại bản mỏng được sử dụng trong sắc ký lớp mỏng (TLC) để kiểm tra và định hướng cho sắc ký cột TLC thường được thực hiện trên bề mặt silica gel tráng sẵn trên đế nhôm hoặc thủy tinh Quá trình sắc ký bắt đầu bằng cách chấm chất tan lên bản thành các vết nhỏ, sau đó sấy khô để loại bỏ dung môi, và triển khai với dung môi thích hợp trong bình triển khai Để phát hiện các vết chất, có thể sử dụng thuốc thử hiện màu như hơi ammoniac hoặc dung dịch axit sunfuric 10% Vết chất được hiện bằng cách nhúng bản vào thuốc thử hoặc phun lên bề mặt, sau đó hơ trên bếp điện hoặc sấy nóng để làm cho vết xuất hiện dần dần.
Tùy thuộc vào lượng và dạng chất, có thể chọn giữa hai phương pháp: phương pháp chạy thô và chạy tinh Trong phương pháp chạy thô, chất được hòa tan vào dung môi thích hợp, sau đó tẩm silica gel và cất loại dung môi đến khi khô, rồi nghiền mịn Ngược lại, trong phương pháp chạy tinh, chất thường được hòa vào dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 Việc phát hiện vệt chất có thể thực hiện bằng đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc bằng cách cắt rìa bản mỏng để phun dung dịch H2SO4 10% và hơ nóng để phát hiện vệt chất Sau đó, bản mỏng được ghép lại để xác định vùng chất, và cuối cùng, lớp Silica gel có chất được cạo ra để giải hấp phụ, thu được chất cần tinh chế.
Các vệt chất hiển thị trên sắc ký lớp mỏng được gom lại và chia thành các phân đoạn Các phân đoạn này tiếp tục được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng để lựa chọn phương pháp sắc ký phù hợp, nhằm phân tách thành các đoạn nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại cho đến khi thu được các chất có độ tinh khiết đủ để đo phổ và xác định cấu trúc.
Sắc ký cột pha thường sử dụng chất hấp phụ là silica gel với kích thước hạt từ 0,040 đến 0,063 mm (240 - 430 mesh) Các dung môi rửa giải chủ yếu bao gồm các hệ dung môi như n-hexane: ethylacetat, n-hexane: dichloromethane, n-hexane: acetone, dichloromethane: ethylacetat, dichloromethane: methanol, dichloromethane: acetone, và dichloromethane: methanol: nước, được pha trộn với các tỉ lệ phù hợp.
Sắc ký cột pha đảo sử dụng chất hấp phụ RP-18 (150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.) kết hợp với hạt YMC có kích thước 30-50 µm (Fuji Silysia Chemical Ltd.) và nhựa trao đổi Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ giữa đường kính cột (D) và chiều cao cột (L) ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tách của cột Tỷ lệ L/D cần được điều chỉnh dựa trên yêu cầu tách, tương ứng với từng hỗn hợp chất cụ thể, vì mỗi chất sẽ có một giá trị tối ưu riêng.
Rf là tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, đóng vai trò quan trọng trong thiết kế cột tách Tỉ lệ Rf thấp (từ 1/5 đến 1/10) thường được áp dụng cho quá trình tách thông thường, trong khi tỉ lệ Rf cao hơn cho quá trình tách tinh, phụ thuộc vào hệ số tách, dao động từ 1/20 đến 1/30.
+ Sắc ký rây phân tử dùng Sephadex LH20 làm pha tĩnh với dung môi chạy cột là Metanol (MeOH) hoặc dichloromethane : methanol (CH2Cl2:MeOH) với tỷ lệ
CH2Cl2 100 àM.
NO hoạt động như một chất trung gian gây viêm Do vậy, các chất ức chế sản sinh
Hợp chất PM5, được chiết xuất từ P peruviana, có tác dụng ức chế yếu sự sản sinh NO với giá trị IC50 là 70,25 ± 2.43 àM Nghiên cứu của Sang-ngern và cộng sự (2016) cho thấy PM5 không có hoạt tính ức chế NO trong tế bào đại thực bào RAW 264.7 bị kích hoạt bởi LPS Thêm vào đó, PM5 cũng không ức chế hoạt động của yếu tố TNF-α và NF-κB trên tế bào ung thư biểu mô thận, cho thấy rằng hợp chất này có thể không phải là một ứng cử viên tiềm năng cho điều trị viêm.
3.4.2 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư của các hợp chất phân lập từ loài P minima
Sáu hợp chất (PM1-PM6) được phân lập từ loài P minima đã được đánh giá về hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (SK-LU-1) và ung thư vú (MCF7) thông qua phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro Kết quả của các đánh giá này được trình bày chi tiết trong bảng dưới đây.
Bảng 3.10 Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của 6 hợp chất phân lập từ phân đoạn PMD và PME của loài P minima
Stt Tên hợp chất Kí hiệu
Kết quả đánh giá cho thấy các hợp chất PM1 và PM3 có hoạt tính gây độc mạnh đối với các dòng tế bào ung thư như HepG2 (ung thư gan), SK-LU-1 (ung thư phổi) và MCF7 (ung thư vú), với giá trị IC50 lần lượt là 0,051 ± 0,004 àM và 0,86 ± 0,09 àM, cho thấy sự mạnh mẽ gấp 3 lần.
Hai hợp chất PM2 và PM6 cho thấy hoạt tính yếu hơn với giá trị IC50 lần lượt là 11,74 ± 1,01 và 65,33 ± 4,06 µM, trong khi hai hợp chất PM4 và PM5 có giá trị IC50 > 100 µM được xem là không có hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư Kết quả đánh giá cho thấy hai hợp chất steroid thuộc khung withanolide (PM1, PM3) được phân lập từ loài P minima có tiềm năng cao và cần được nghiên cứu sâu hơn về cơ chế để định hướng ứng dụng.
Nghiên cứu cho thấy hợp chất PM1 có hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ nhờ sự hiện diện của nhóm 5β,6β-epoxy tại vòng B, gây độc cho các tế bào HepG2, SK-LU-1 và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,051 ± 0,004 àM, 0,056 ± 0,003 àM và 0,059 ± 0,006 àM Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nassra và cộng sự (2017), cho thấy PM1 gây độc tế bào với giá trị IC50 thấp hơn 1 àg/mL Hơn nữa, PM1 được chứng minh là chất cảm ứng TRAIL hiệu quả nhất trong số các withanolide từ chi Physalis, kích thích quá trình apoptosis trong tế bào khối u mà không ảnh hưởng đến tế bào lành PM1 tăng cường con đường tự chết phụ thuộc vào thụ thể bên ngoài và làm giảm nhanh chóng protein yếu tố ức chế FLICE (cFLIP), một phân tử điều hòa chính trong quá trình apoptosis qua trung gian Fas và TRAIL Việc sụt giảm hoạt động của cFLIP có thể dẫn đến tăng cường hoạt động tự chết do TRAIL gây ra.
Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất PM2 tương tự như PM1, nhưng khác biệt ở khu vực vòng A và vòng B do sự hiện diện của liên kết đôi tại C-4/C-5 và sự mất cầu nối epoxy tại C-5/C-6 Sự thay thế các nhóm thế đã ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư HepG2, SK-LU-1 và MCF7, cho thấy hợp chất PM2 có mức hoạt tính yếu hơn so với PM1.
Theo phân tích phổ NMR, cấu trúc hóa học của PM3 tương tự như PM1, nhưng PM3 có nhiều nhóm hydroxy hơn tại C-4 Sự thay thế này trong cấu trúc ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc của PM3 trên ba dòng tế bào ung thư HepG2, SK-LU-1 và MCF-7, với giá trị IC50 từ 0,80 đến 0,86 àM, cho thấy hoạt tính yếu hơn so với PM1 Nghiên cứu của Zhen-Nan Ye và cộng sự (2019) đã chỉ ra những điểm này.
PM3 ức chế sự tăng sinh tế bào bằng cách bắt giữ chu kỳ tế bào G0/G1 và kích thích quá trình apoptosis qua trung gian caspases Nó cũng làm giảm biểu hiện của các gen mục tiêu như c-Myc, Axin2, cyclin D1 và Survivin Wnt trong mô khối u, đồng thời kích hoạt sự phosphoryl hóa Ser33/Ser37/Thr41 của β-catenin.
PM3 giảm sự phát triển của khối u, ngăn chặn tín hiệu Wnt/β-catenin [167]
Hợp chất PM4 không có hoạt tính trên ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm Dữ liệu phổ NMR của PM4 tương tự như hợp chất PM2, ngoại trừ các vị trí C-23, C-24 và C-26 Ngoài ra, có sự mất mát tín hiệu của một nhóm methyl (δH).
1.99, δC 20.6) ở PM4 và thay thế bằng các tín hiệu của 1 nhóm oxymethylene (δH
4.19/4.40, δC 61.6) ở PM4 cho phép dự đoán cấu trúc hóa học của PM4 tương tự
PM2, ngoại trừ vị trí C-28, đã được thay thế bằng nhóm oxymethylene, điều này có thể giải thích cho hoạt tính gây độc của hợp chất PM2 trên ba dòng tế bào ung thư.
HepG2, SK-LU-1 và MCF-7 còn hợp chất PM4 không thể hiện hoạt tính gây độc trên 3 dòng tế bào ung thư thử nghiệm tương ứng