Nghiên cứu hiệu quả và cơ chế kháng ung thư của mycophenolic acid mpa trên tế bào ung thư máu

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI CƠ SỞ CẤP TRUNG TÂM Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu hiệu chế kháng ung thư mycophenolic acid (MPA) tế bào ung thư máu Mã số: YD03/16-17 Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phòng CNSH Y Dược Chủ nhiệm nhiệm vụ: CN Huỳnh Vũ Cán tham gia: CN Huỳnh Vũ TS Nguyễn Lê Xuân Trường TS Nguyễn Đăng Quân Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC Trang PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Quá trình biến dưỡng tế bào ung thư Quá trình tế bào ung thư thúc đẩy tổng hợp GTP Nhiều loại tế bào ung thư có biểu IMPDH cao Điều hòa biểu tăng GTP cần thiết cho phát triển tế bào ung thư Các thử nghiệm lâm sàng MMF cho hoạt tính kháng ung thư Sự tổng hợp ribosomal RNA (rRNA) ung thư 10 7.Yếu tố khởi đầu phiên mã I (TIF- IA) 10 III VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 Phương pháp phân lập tế bào sơ cấp từ tủy xương người bình thường từ bệnh nhân ung thư máu cấp tính AML 12 Phương pháp khảo sát tăng sinh MTS 12 Phương pháp nuôi cấy môi trường thạch mềm 12 Phương pháp Matrigel 13 Phương pháp đánh giá tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosome RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562 13 5.1 Phương pháp tách chiết RNA 13 5.2 Phương pháp phiên mã ngược 14 5.3 Phương pháp realtime PCR định lượng tiền phân tử rRNA 14 Phương pháp western blot phát protein PNCA, pH2X 15 6.1 Phương pháp tạo dịch ly giải tế bào 15 6.2 Phương pháp Bradford định lượng protein 16 6.3 Phương pháp SDS- PAGE Western bloting 15 Phương pháp kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể 17 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 1.Nghiên cứu hiệu ức chế phát triển tế bào ung thư MPA dòng tế bào ung thư máu K562 19 1.1 Tác động MPA lên tăng sinh tế bào 21 1.2 Tác động MPA lên hình thành colony 21 1.3 Tác động ức chế MPA lên di qua màng nhân tạo Matrigel 22 1.4 So sánh tác động MPA tăng sinh tế bào tủy xương bình thường tế bào ung thư máu 23 Tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562 24 2.1 Tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA) 25 2.2 Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết RNA Polymerase I vào ribosomal DNA (rDNA) 26 Tác động phối hợp MPA chất ức chế tăng sinh khác bao gồm AZD8055 (chất ức chế phân tử mTOR AKT) CAL-101 27 Nghiên cứu vai trò mức độ biểu protein TIF-IA ức chế MPA phát triển tế bào ung thư máu 28 4.1 Nghiên cứu tác động MPA gắn kết protein yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA GTP dòng tế bào ung thư máu K562 28 4.2 Nghiên cứu vai trò mức độ biểu protein yếu tố khởi đầu TIF-IA tác động ức chế MPA lên tổng hợp rRNA phát triển tế bào ung thư máu 31 V KẾT LUẬN 31 VI KIẾN NGHỊ 27 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 32 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosinetriphosphat ChIP Chromatin immunoprecipiation ETS External transcribed spacer FDA Food and drug administration GTP Guanosinetriphosphate GAPDH Glyceroldehyde -3- phosphate dehydrogenase IMP Inosine monophosphate MPA Mycophenolic acid MMF Mycophenolate mofetil IMPDH Inosine monophosphate dehydrogenase mTOR Mammalian target of rapamycin PI3K Phosphatidylinositol 3- kinase Pol I RNA polymerase I PBS Phosphate - buffered saline PCNA Proliferating cell nuclear antigen pH2AX Phosphoration histon H2AX rDNA Ribosome DNA rRNA Ribosome RNA siRNA Small interfering RNA TIF- IA Transcription initiation factor IA UBF Upstream binding factor VEGF Anti-vascular endothelial growth factor XMP Xanthosinemonophosphate DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Con đường tổng hợp purine nucleotide Hình Vai trò yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA trình hình thành phức hợp khởi đầu phiên mã RNA Polymerase I 11 Hình Tác động ức chế MPA lên tăng sinh tế bào dòng tế bào ung thư máu K562 20 Hình Tác động ức chế MPA lên tăng sinh tế bào tế bào ung thư máu sơ cấp phân lập từ bệnh nhân 21 Hình Tác động ức chế MPA lên hình thành colony mơi trường thạch mềm dịng tế bào ung thư máu K562 22 Hình Tác động ức chế MPA lên di qua màng nhân tạo Matrigel dòng tế bào ung thư máu K562 23 Hình Tác động ức chế MPA lên tăng sinh tế bào tủy xương bình thường tế bào tủy xương AML 24 Hình Tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562 25 Hình Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết RNA Polymerase I vào ribosomal DNA (rDNA) dòng tế bào ung thư máu K562 26 Hình 10: Tác động phối hợp MPA chất ức chế tăng sinh AZD8055 (trái) CAL-101 (phải) tăng sinh dòng tế bào ung thư máu K562 28 Hình 11: Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết protein yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA GTP dòng tế bào ung thư máu K562 29 Hình 12: Vai trị mức độ biểu protein yếu tố khởi đầu TIF-IA tác động ức chế MPA lên tổng hợp rRNA phát triển tế bào ung thư máu 30 TÓM TẮT Mycophenolate mofetil (MMF)/Mycophenolic acid (MPA) thuốc ức chế miễn dịch dựa việc điều hoà tổng hợp Guanosine trisphosphate (GTP) tế bào với tiềm kháng ung thư quan FDA Mỹ thông qua sử dụng có tính an tồn cao sử dụng bệnh nhân Tuy nhiên, việc sử dụng MMF/MPA thuốc ức chế ung thư cần kiểm nghiệm lại nghiên cứu cẩn thận vai trò MMF/MPA việc điều hoà mức độ GTP tế bào ung thư cần tiến hành để hướng tới nghiên cứu lâm sàng tính kháng ung thư thuốc Trong đề tài này, nghiên cứu tác động ức chế MPA phát triển tế bào ung thư máu Chúng tìm hiểu chế phân tử tác động ức chế gây MPA tế bào ung thư máu thơng qua việc điều hồ đường tổng hợp ribosomal RNA (rRNA) Để đánh giá tác động MPA lên phát triển tế bào ung thư máu chúng tơi tiến hành xử lý MPA dịng ung thư máu cấp tính K562 với nồng độ từ thấp đến cao: 10, 100, 1000nM Hiệu ức chế MPA phát triển dòng ung thư máu đánh giá phương pháp: MTS đánh giá tăng sinh, phương pháp nuôi cấy tế bào mơi trường thạch mềm đánh giá hình thành colony, phương pháp nuôi cấy tế bào màng nhân tạo Matrigel đánh giá di Kết cho thấy MPA tác động rõ rệt lên tế bào ung thư máu làm giảm số lượng tế bào 20% so với đối chứng nồng độ MPA đạt 1000nM, số lượng colony giảm 50% so với mẫu không xử lý, lượng tế bào di giảm 30% so với đối chứng Để đánh giá tác động MPA lên tổng hợp ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562, tế bào dòng ung thư máu K562 xử lý với DMSO (đối chứng âm) MPA thời gian 24h Sau tổng RNA tế bào điều kiện thu nhận lượng tiền-rRNA đo phương pháp realtime qPCR với mồi đặc hiệu Kết cho thấy mẫu xử lý với MPA, lượng tiền rRNA giảm đáng kể gần 50% so với đối chứng Điều nói lên rằng, MPA có tác động lên trình tổng hợp rRNA Cơ chế phân tử hoạt động MPA làm rõ Theo MPA ức chế GTP tương tác với yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-1A, làm cho nhân tố giảm khả tương tác với RNA Polymerase I qua làm giảm gắn kết RNA Polymerase I vào vùng promoter ribosomal DNA dẫn đến giảm biểu rRNA Kết trình tổng hợp protein tế bào ung thư máu bị ức chế nên tăng sinh tính ung thư bị giảm thiểu Tóm lại, nghiên cứu chúng tơi làm rõ chế hoạt động MPA tế bào ung thư máu sở để thực nghiên cứu đánh giá hiệu trị ung thư máu MPA mơ hình động vật người PHẦN 1: THÔNG TIN CHUNG 1.Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu hiệu chế kháng ung thư Mycophenolic acid (MPA) tế bào ung thư máu (Mã số: YD03/16-17) Đơn vị chủ trì Phịng: Cơng nghệ Sinh học Y dược -Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Địa chỉ: 2374, Quốc lộ 1, Khu Phố 2, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12, Tp HCM Điện thoại :(84-8) 37 15 3792 Đơn vị phối hợp chính: Bệnh viện Ung Bướu Thành phố Hồ Chí Minh Viện ung thư đại học Stanford, Mỹ Chủ nhiệm nhiệm vụ: Huỳnh Vũ Phòng CNSH Y Dược – Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Cán tham gia thực hiện: CN Huỳnh Vũ – Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Lê Xuân Trường – Thành viên Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 01/2016 đến 12/2017) Kinh phí: Tổng dự tốn: 600 triệu VNĐ Kinh phí sữ dụng: 600 triệu VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: Mycophenolate mofetil (MMF)/Mycophenolic acid (MPA) thuốc ức chế miễn dịch dựa việc điều hoà tổng hợp Guanosine trisphosphate (GTP) tế bào với tiềm kháng ung thư quan FDA Mỹ thơng qua sử dụng có tính an tồn cao sử dụng bệnh nhân Tuy nhiên, việc sử dụng MMF/MPA thuốc ức chế ung thư cần kiểm nghiệm lại nghiên cứu cẩn thận vai trò MMF/MPA việc điều hoà mức độ GTP tế bào ung thư cần tiến hành để hướng tới nghiên cứu lâm sàng tính kháng ung thư thuốc này.Trong đề tài này, nghiên cứu tác động ức chế MPA phát triển tế bào ung thư máu Chúng tìm hiểu chế phân tử tác động ức chế gây MPA tế bào ung thư máu thơng qua việc điều hồ đường tổng hợp ribosomal RNA (rRNA) Ngồi ra, chúng tơi nghiên cứu tác động phối hợp MPA thuốc ức chế tăng sinh tế bào khác AZD8055, CAL-101 phát triển tế bào ung thư máu nhằm đề xuất tính ứng dụng kháng ung thư MPA Trong đề tài này, đánh giá hiệu MPA việc ức chế phát triển tế bào ung thư máu in vitro Chúng chứng minh MPA điều khiển đường tổng hợp ribosomal RNA tế bào ung thư máu để ức chế phát triển tế bào Đề tài nghiên cứu việc phối hợp MPA chất ức chế tăng sinh tế bào AZD8055 (chất ức chế phân tử mTOR Akt) CAL-101 (chất ức chế phân tử PI3K) việc ức chế phát triển tế bào ung thư máu Ngoài ra, đề tài nghiên cứu tầm ảnh hưởng mức độ biểu protein yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA đáp ứng tế bào ung thư máu trước tác động MPA Các nội dung công việc thực so với đăng ký STT Nội dung đăng ký Nghiên cứu hiệu ức chế MPA dòng tế bào ung thư máu Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Kết đạt Đánh giá 01/20168/2016 + Đã đánh giá tác động MPA lên trình tăng sinh Kết MPA ức chế tăng sinh tế bào nồng độ 10, 100 1000mM Đúng + Đã đánh giá tác động MPA lên hình thành cụm tế bào Kết MPA tác động làm giảm 1/2 số lượng cụm tế bào môi trường thạch mềm Đúng Đúng hay không tiến độ + Đã đánh giá tác động MPA lên di qua màng Matrigel Kết MPA làm giảm 1/3 lượng tế bào di qua màng matrigel Đúng + Đã đánh giá tác động MPA lên trình tổng hợp RNA Kết lượng RNA tổng hợp giảm 0,5 lần so với đối chứng Đúng + Đã đánh giá tác động MPA lên mức độ gắn kết RNA polymerase I vào ribosomal DNA (rDNA) Kết cho thấy lượng rDNA đo mẫu xử lý MPA giảm đáng kể gần 0,5 lần so với đối chứng không xử lý với MPA Đúng Nghiên cứu tác 03/2016- Đã đưa chứng động phối hợp 06/2017 ức chế phối hợp MPA MPA chất chất ức chế tăng ức chế tăng sinh sinh khác bao gồm khác bao gồm AZD8055 CAL-101 AZD8055 tăng sinh tế bào CAL-101 ung thư máu tăng sinh tế bào ung thư máu Đúng 03/201612/2016 Nghiên cứu tác động MPA tổng hợp ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu 3 diện protein PCNA, pH2X Actin dịch ly giải tế bào đánh giá kỹ thuật Western blotting với kháng thể đặc hiệu Kết trình bày Hình 4, bên phải cho thấy lượng protein PCNA giảm xuống rõ rệt mẫu tế bào ung thư máu xử lý MPA so với mẫu tế bào đối chứng âm Kết phù hợp với kết thử nghiệm MST cho thấy MPA có khả ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu sơ cấp từ bệnh nhân AML Đồng thời với việc làm giảm biểu PCNA, xử lý MPA làm tăng biểu protein p-H2X tế bào ung thư máu p-H2X marker cho trình apoptosis tế bào Kết thử nghiệm tế bào K562 tế bào ung thư máu sơ cấp cho thấy MPA có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu kích hoạt q trình apoptosis tế bào *p < 0.01 Hình Tác động ức chế MPA lên tăng sinh tế bào tế bào ung thư máu sơ cấp phân lập từ bệnh nhân 1.2 Tác động MPA lên hình thành colony tế bào K562 mơi trường thạch mềm Sự hình thành colony môi trường agar mềm dấu hiệu quan trọng cho thấy khả tăng trưởng mạnh tế bào ung thư Để có thêm liệu chứng minh khả ức chế tế bào ung thư máu MPA, thực thử nghiệm đánh giá tác động ức chế hình thành colony tế bào K562 cùa MPA Tế bào dòng ung thư máu K562 xử lý với DMSO (đối chứng âm) MPA với nồng độ 100nM thời gian 24h Sau tế bào ni cấy mơi trường thạch agar mềm 14 ngày Colony hình thành nhuộm với thuốc nhuộm crystal violet, số lượng colony đếm chụp kính hiển vi soi Hình đại diện cho số lượng colony hình thành điều kiện ni cấy có khơng có xử lý MPA số lượng colony trung bình điều kiện trình bày hình Kết cho thấy giếng tế bào xử lý với DMSO hình 21 thành colony khơng thay đổi so với đối chứng khơng xử lý Trong giếng tế bào xử lý với MPA 100nM, số lượng colony tế bào K562 mọc giảm sút rõ rệt (gần 50%) so với mẫu đối chứng không xử lý MPA Kết cho thấy rõ MPA ức chế hình thành colony dịng tế bào ung thư máu K562 Hình Tác động ức chế MPA lên hình thành colony mơi trường thạch mềm dòng tế bào ung thư máu K562 1.3 Tác động ức chế MPA lên di qua màng nhân tạo Matrigel dòng tế bào ung thư máu K562 Tiếp tục làm rõ hoạt tính ức chế tế bào ung thư K562 MPA, khảo sát khả ức chế xâm lấn tế bào ung thư hoạt chất kỹ thật ni cấy tế bào màng matrigel Tế bào dịng ung thư máu K562 xử lý với DMSO (đối chứng âm) MPA với nồng độ 100nM không xử lý thời gian 24h Sau 5000 tế bào nhóm ni cấy buồng Matrigel giếng đĩa 24 giếng Phía giếng bổ sung huyết để dẫn dụ tế bào di chuyển qua màng Matrigel Khả di chuyển tế bào xuyên qua màng matrigel phản ánh mức độ xâm lấn tế bào ung thư Tế bào ung thư di chuyển xuyên qua mặt Matrigel nhuộm với thuốc nhuộm crystal violet, đếm số lượng chụp kính hiển vi Kết trình bày Hình cho thấy tế bào K562 bị xử lý MPA có lượng tế bào di chuyển xuyên qua màng Matrigel bị giảm xuống đáng kể so với trường hợp tế bào không xử lý ủ với DMSO Số tế bào xử lý với MPA di chuyển qua màng Matrigel giảm gần 1/3 so với mẫu tế bào đối chứng không xử lý hoạt chất Thử nghiệm cho thấy MPA làm tế bào ung thư máu K562 giảm 22 hoạt động, làm cho tế bào ung thư yếu nên khả xâm lấn chúng giảm xuống Các kết đo tăng sinh, hình thành colony xâm lấn qua màng Matrigel MPA có hiệu ức chế phát triển hoạt động tế bào dòng ung thư máu K562 Đặc biệt liệu chúng tơi cịn cho thấy MPA có tác động ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu sơ cấp từ bệnh nhân AML Đây sở quan trọng cho thấy MPA có tiềm ứng dụng điều trị bệnh ung thư máu Hình Tác động ức chế MPA lên di qua màng nhân tạo Matrigel dòng tế bào ung thư máu K562 1.4 So sánh tác động MPA tăng sinh tế bào tủy xương bình thường tế bào ung thư máu Kế mục 1.1 (Hình 4) cho thấy MPA có tác động ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu sơ cấp từ bệnh nhân AML Câu hỏi đặt MPA có tác động tế bào tuỷ xương bình thường hay không? Đây liệu quan trọng giúp đánh giá dự đốn độc tính MPA ứng dụng lâm sàng Để trả lời câu hỏi tiến hành đánh giá tác động MPA tế bào sơ cấp phân lập từ tuỷ xương người bình thường từ bệnh nhân ung thư máu cấp tính AML Hai nhóm tế bào ni cấy môi trường DMSO xử lý 23 DMSO MPA với nồng độ 100nM 24h Sự tăng sinh tế bào xác định phương pháp MTS qua giá trị OD490nm Giá trị OD lô tế bào xử lý MPA so sánh với lô tế bào đối chứng DMSO giá trị OD lô DMSO đồng Kết hình cho thấy xử lý MPA tế bào tuỷ xương bình thường ức chế khoảng 30% tăng sinh tế bào so với đối chứng Trong đó, MPA ức chế 60% tăng sinh tế bào ung thư máu sơ cấp (Hình 7) Kết đề xuất khả ứng dụng MPA để ức chế hay kìm hãm phát triển nhanh tế bào ung thư máu, nhằm đẩy mạnh hiệu thuốc phối hợp để điều trị mà không làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến phát triển tế bào máu bình thường Hình 7: Tác động ức chế MPA lên tăng sinh tế bào tủy xương bình thường tế bào tủy xương AML Tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562 Các kết mục cho thấy MPA có khả ức chế mạnh tăng sinh, xâm lấn dòng tế bào ung thư máu K562 tế bào ung thư sơ cấp phân lập từ bệnh nhân AML Điều thú vị tế bào tuỷ bình thường MPA có hoạt tính gây độc thấp hẳn so với tế bào ung thư máu sơ cấp Điều bước đầu cho thấy MPA có tác động mang tính chọn lọc lên tế bào ung thư, đặc điểm hữu ích để ứng dụng chất vào điều trị bệnh giúp giảm thiểu tác dụng phụ thuốc Câu hỏi chúng tơi đặt MPA có tác động khác biệt tế bào ung thư tế bào bình thường? MPA biết chất ức chế tiềm năng, hiệu đặc hiệu cho đường tổng hợp GTP de novo MPA ức chế enzyme IMPDH ngăn cản tổng hợp từ IMP sang XMP làm giảm mức độ GTP tế bào (Zwerner Fiorentino, 2007) Tế bào ung thư biết có 24 q trình biến dưỡng tăng sinh mạnh tế bào bình thường nên chúng có nhu cầu sinh tổng hợp protein cao Một tác nhân tác động vào trình ảnh hưởng đến tế bào ung thư lớn so với tế bào bình thường, điều phù hợp với chúng tơi thấy MPA Trên sở đó, giả thiết chúng tơi MPA có tác động lên chế bản, hoạt động mạnh tế bào ung thư có liên quan đến GTP trình sinh tổng hợp protein 2.1 Tác động ức chế MPA lên lượng tiền ribosomal RNA tế bào ung thư máu K562 Để chứng minh giả thiết MPA ức chế trình sinh tổng hợp protein, đánh giá tác động chất lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA), thành phần tiên ribosom Tế bào dòng ung thư máu K562 xử lý với DMSO (đối chứng âm) MPA với nồng độ 100nM thời gian 24h Sau tổng RNA tế bào điều kiện thu nhận chuyển thành cDNA cDNA từ mẫu tế bào phân tích realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại cDNA tiền rRNA cDNA gene giữ nhà GAPDH (làm chứng nội) Mỗi mẫu phân tích lập lại lần giá trị Ct trung bình đường tín hiệu khuếch đại cDNA tiền rRNA GAPDH xác định Giá trị Ct trung bình dùng để so sánh biểu tiền rRNA tế bào K562 xử lý DMSO, xử lý MPA với tế bào đối chứng không xử lý theo phương pháp 2-ΔΔCt Giá trị mẫu đối chứng không xử lý quy đổi giá trị mẫu khác so sánh với mẫu đối chứng Kết cho thấy mẫu tế bào K562 xử lý với MPA có lượng tiền rRNA giảm đáng kể cịn gần 0,5 lần so với đối chứng tế bào không xử lý Kết MPA có tác động làm giảm lượng rRNA tế bào ung thư máu K562 (Hình 8) Hình Tác động ức chế MPA lên tổng hợp tiền ribosomal RNA (rRNA) dòng tế bào ung thư máu K562 25 2.2 Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết RNA Polymerase I vào ribosomal DNA Lượng rRNA bị giảm xuống tế bào K562 xử lý MPA so với tế bào đối chứng có nhiều nguyên nhân, nguyên nhân trực tiếp trình phiên mã rRNA từ ribosomal DNA (rDNA) bị giảm sút Chúng ta biết RNA Polymerase I cần gắn kết vào rDNA để xúc tác trình phiên mã tạo rRNA Để làm rõ liệu gắn kết RNA Polymerase I vào rDNA có bị tác động xử lý MPA hay không thực kỹ thuật kết tủa miễn dịch nhiễm sắc thể (ChIP) kết hợp realtime PCR bán định lượng rDNA Tế bào dòng ung thư máu K562 xử lý với DMSO, MPA không xử lý thời gian 24h Sau đó, tế bào ly giải phương pháp ChIP thực với kháng thể kháng Polymerase I để thu nhận protein có dịch ly giải tế bào kéo theo đoạn DNA mà gắn kết Kháng thể kháng IgG thỏ sử dụng làm đối chứng âm để kiểm tra tính đặc hiệu phản ứng kết tủa miễn dịch Lượng rDNA gắn kết với Polymerase I đo phương pháp realtime PCR với mồi đặc hiệu cho vùng promoter rDNA Để kiểm chứng độ đặc hiệu gắn kết RNA Polymerase I với vùng promoter rDNA, mồi cho vùng trung gian nằm xa promoter rDNA sử dụng để chạy phản ứng realtime PCR mẫu tế bào K562 không xử lý sau thực ChIP với kháng thể kháng RNA Polymerase I Sau thực realtime PCR với cặp mồi đặc hiệu promoter rDNA (hoặc mồi vùng xa promoter lô đối chứng) giá trị Ct mẫu xác định Lượng rDNA gắn kết RNA Polymerase I mẫu đối chứng, mẫu K562 xử lý DMSO MPA so sánh với mẫu tế bào không xử lý phương pháp 2-ΔCt Để kết so sánh xác, giá trị Ct mẫu đồng hoá (normalized) nhờ giá trị Ct khuếch đại gene GAPDH mẫu DNA ban đầu trước tủa ChIP với kháng thể Hình Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết RNA Polymerase I vào ribosomal DNA (rDNA) dòng tế bào ung thư máu K562 26 Kết thể Hình 9, lượng rDNA có mẫu chứng thực ChIP với kháng thể kháng IgG (IgG) thấp so với mẫu tế bào đối chứng không xử lý (CON) Như cho thấy khơng có kháng thể kháng RNA Polymerase I ChIP rDNA khơng bị đồng kết tủa Hay nói cách khác, rDNA bị đồng kết tủa với RNA Polymerase I đặc hiệu Ở mẫu thực realtime PCR sau ChIP với cặp primer cách xa vùng promoter (PolI) cho tín hiệu thấp nhiều so với mẫu tế bào đối chứng (CON) sử dụng cặp primer đặc hiệu vùng promoter rDNA Như cho thấy RNA Polymerase I tương tác vùng promoter rDNA làm đồng kết tủa rDNA rDNA đồng kết tủa thấy thí nghiệm khơng phải kết thứ cấp tương tác RNA Polymerase I vùng khác promoter Kết mẫu đối chứng IgG PolI cho thấy kết thí nghiệm ChIP xác định mức độ tương tác RNA Polymerase I với rDNA tế bào có khơng có xử lý MPA đáng tin cậy Kết thể Hình cho thấy tế bào K562 bị xử lý MPA, lượng rDNA tương tác với RNA polymerase bị giảm xuống đáng kể gần 40% so với lượng rDNA tương tác với RNA Polymerase I tế bào không xử lý MPA Các kết thu nhận MPA ức chế trình tổng hợp ribosome RNA tế bào ung thư máu cách ức chế gắn kết RNA Polymerase I vào ribosome DNA, trình tiên cho tổng hợp ribosome RNA Sự ức chế tổng hợp ribosome RNA chế giải thích cho hiệu MPA việc kìm hãm q trình tăng sinh đặc tính ung thư tế bào dòng ung thư máu K562 Đây chứng khoa học chứng minh MPA ức chế tổng hợp ribosomal RNA tế bào ung thư máu Tác động phối hợp MPA chất ức chế tăng sinh khác bao gồm AZD8055 (chất ức chế phân tử mTOR AKT) CAL-101 (chất ức chế phân tử PI3K) tăng sinh tế bào ung thư máu Các kết cho thấy MPA tác động lên tế bào ung thư theo chế ức chế tổng hợp rRNA qua ức chế tổng hợp protein tế bào ung thư Do chế hoạt động MPA khác với chất ức chế tế bào ung thư khác, thử kết hợp MPA với chất ức chế tăng sinh tế bào khác AZD8055 (chất ức chế phân tử mTOR AKT) CAL-101 (chất ức chế phân tử PI3K) tác động lên tế bào ung thư Để đánh giá tác động phối hợp MPA chất AZD8055 CAL-101, tiến hành xử lý dòng tế bào K562 với chất riêng rẽ kết hợp đánh giá mật độ tế bào phương pháp Vì sử dụng kết hợp loại thuốc nên xử lý tế bào với nồng độ chất thấp so với thí 27 nghiệm trước Cụ thể, chúng tơi xử lý MPA 20nM, AZD8055 20nM CAL-101 20nM 24h Kết đo lường tăng sinh tế bào hình 10 cho thấy AZD8055 CAL-101 xử lý riêng rẽ có tác động ức chế lên tăng sinh tế bào AZD8055 cho hiệu ức chế mạnh CAL-101 Tuy nhiên, kết hợp với MPA hoạt tính kháng tế bào ung thư hai chất ức chế cho thấy tăng mạnh (khoảng 50%) so với xử lý riêng rẻ hóa chất (Hình 10) Kết cho thấy tiềm ứng dụng MPA việc điều trị tế bào ung thư máu cách kết hợp với thuốc khác Hình 10: Tác động phối hợp MPA chất ức chế tăng sinh AZD8055 (trái) CAL-101 (phải) tăng sinh dòng tế bào ung thư máu K562 Nghiên cứu vai trò mức độ biểu protein TIF-IA ức chế MPA phát triển tế bào ung thư máu 4.1 Nghiên cứu tác động MPA gắn kết protein yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA GTP dòng tế bào ung thư máu K562 Sự gắn kết TIF –IA với Polymerase I (Pol I) yếu tố quan trọng cho trình khởi đầu phiên mã rRNA Kết thu nhận nội dung (mục 2) tác động MPA lên q trình Ngồi ra, nghiên cứu trước chứng minh trình tự TIF-IA có vị trí gắn kết GTP gắn kết TIF-IA GTP cần thiết cho hoạt động TIF-IA Pol I (Nguyen et al., 2015) Do MPA làm giảm lượng GTP tổng hợp tế bào, tiến hành đánh giá tác động MPA gắn kết TIF-IA GTP K562 xử lý với DMSO (đối chứng âm) MPA thời gian 24h Sau đó, dịch ly giải nhóm tế bào ủ với hạt liên kết GTP thực phản ứng tủa phức hợp hạt protein Hỗn hợp tách nung nóng nhiệt độ 1000C với SDS sample loading buffer Sau phức hợp lai miễn dịch với kháng thể kháng TIF-IA Mức độ biểu TIF-IA, Polymerase I (Pol I) hay protein đối chứng Akt Actin kiểm tra dịch 28 ly giải để chứng tỏ lượng mẫu đầu vào sử dụng cho phản ứng tủa GTP Kết hình 11 cho thấy so với xử lý DMSO, xử lý MPA làm giảm đáng kể gắn kết TIF-IA GTP Lượng mẫu đầu vào sử dụng cho phản ứng tủa GTP chứng minh phản ứng lai miễn dịch với kháng thể kháng TIF-IA, kháng Pol I, kháng AKT kháng Actin Như MPA làm giảm lượng GTP gắn kết với TIF-1A dịng tế bào ung thư máu K562 Hình 11: Tác động ức chế MPA lên mức độ gắn kết protein yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-IA GTP dòng tế bào ung thư máu K562 Tế bào dòng ung thư máu 4.2 Nghiên cứu vai trò mức độ biểu protein yếu tố khởi đầu TIF-IA tác động ức chế MPA lên tổng hợp rRNA phát triển tế bào ung thư máu Để làm rõ vai trò TIF-1A hiệu ức chế tế bào ung thư máu MPA, tiến hành làm giảm biểu TIF-IA tế bào K562 cách giảm biểu TIF-IA đánh giá lượng ribosomal RNA tế bào ung thư tăng sinh tế bào tác động MPA Tế bào K562 chuyển siRNA đặc hiệu TIF-1A (siTIF-1A), lô tế bào đối chứng chuyển scramble siRNA (SCR) Sau 24h, tế bào chuyển gene xử lý với MPA DMSO 24h Lượng tiền rRNA đo phương pháp realtime PCR với mồi đặc hiệu Kết hình 12 cho thấy việc giảm biểu TIF-IA làm tăng hiệu ức chế MPA lên tổng hợp rRNA (bên trái) Ngoài ra, việc giảm biểu TIF-IA làm tăng ức chế MPA tăng sinh tế bào (bên phải) Hiệu việc làm giảm biểu TIF-IA kiểm tra lai miễn dịch với kháng thể kháng TIF-IA 29 Hình 12: Vai trị mức độ biểu protein yếu tố khởi đầu TIF-IA tác động ức chế MPA lên tổng hợp rRNA phát triển tế bào ung thư máu Bên trái, lượng tiền tổng hợp rRNA; giữa, lai miễn dịch với kháng thể kháng TIF-IA, kháng PCNA kháng Actin; bên phải, mức độ tang sinh tế bào phương pháp MTS Như vậy, hiệu ức chế tế bào ung thư máu K562 MPA có liên quan đến yếu tố khởi đầu phiên mã TIF-1A 30 V KẾT LUẬN Trong đề tài này, chứng minh hiệu ức chế MPA lên tăng sinh đặc tính ung thư dịng tế bào ung thư máu K562 Chúng kiểm tra tác động ức chế tế bào sơ cấp phân lập từ tủy xương bệnh nhân ung thư máu cấp tính Kết thu nhận cho thấy tiềm MPA việc ứng dụng điều trị bệnh ung thư máu cấp tính Hơn nữa, tác động ức chế tăng sinh MPA lên tế bào sơ cấp phân lập từ tủy xương người bình thường nhiều so với tế bào ung thư máu (30% so với 60%) Kết đóng vai trò quan trọng việc đánh giá khả an toàn tiềm ứng dụng MPA xử lý điều trị người Kết xử lý phối hợp MPA chất ức chế khác AZD8055 hay CAL-101 cho thấy hiệu tăng cường việc ức chế tế bào ung thư máu tăng sinh Việc kết hợp MPA thuốc làm giảm nồng độ thuốc sử dụng lại tăng hiệu ức chế tế bào ung thư máu Do giới hạn thời gian thực đề tài, chưa khảo sát tác động phối hợp loại thuốc tế bào tủy xương bình thường Chúng tơi kiến nghị thực nội dung nghiên cứu Tế bào ung thư máu có mức tổng hợp rRNA cao nhiều so với tế bào bình thường Có thể lý nên thấy tác động MPA tế bào ung thư máu mạnh tế bào bình thường Kết nghiên cứu chúng tơi chứng minh MPA làm giảm trình tổng hợp rRNA thông qua ức chế TIF-IA Pol I gắn kết vào rDNA ức chế trình khởi đầu phiên mã Phù hợp với kết tìm trên, làm giảm biểu TIF-IA tế bào ung thư máu tác động MPA tăng lên rõ rệt Kết chế phân tử mà MPA điều khiển để ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu Đề tài hoàn thành tiến độ tất nội dung đề ban đầu đề cương nghiên cứu VI KIẾN NGHỊ - Các kết in vitro tiền đề cho đề xuất việc thử nghiệm MPA kết hợp chất ức chế khác in vivo mơ hình chuột cấy ghép tủy từ bệnh nhân ung thư máu Hướng nghiên cứu hứa hẹn nhiều tiềm việc tìm phương pháp điều trị hiệu cho bệnh ung thư máu - Nếu vượt qua thử nghiệm tiền lâm sàng động vật, đề xuất thử nghiệm hiệu trị liệu MPA bệnh nhân ung thư máu 31 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ST T Tên sản phẩm Số lượng Đánh giá Bài báo khoa học quốc tế Đang chuẩn bị thảo Đào tạo thạc sĩ Đạt Ghi Sản phẩm Sản phẩm Ghi chú: Sản phẩm dạng1: Sản phẩm dạng 2: - Mẫu (model, maket); - Nguyên lý ứng dụng; - Sản phẩm có khả thương mại - Phương pháp; hố; - Tiêu chuẩn; - Vật liệu; - Quy trình công nghệ; - Dây chuyền, công nghệ; - Các loại khác - Giống trồng; - Giống vật nuôi; - Các loại khác Sản phẩm dạng 3: Sản phẩm dạng 4: - Sơ đồ, đồ; - Bài báo khoa học; - Số liệu, sở liệu; - Sách chuyên khảo; - Kết tham gia đào tạo sau đại - Tài liệu dự báo (phương pháp, quy học; trình, mơ hình…) - Sản phẩm đăng ký sở hữu trí tuệ; - Báo cáo phân tích; - Đề án, quy hoạch; - Các loại khác - Luận chứng kinh tế-kỹ thuật, báo cáo nghiên cứu khả thi; - Các loại khác 32 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Bowne, S.J., Liu, Q., Sullivan, L.S., Zhu, J., Spellicy, C.J., Rickman, C.B., Pierce, E.A., and Daiger, S.P (2006) Why mutations in the ubiquitously expressed housekeeping gene IMPDH1 cause retina-specific photoreceptor degeneration? Invest Ophthalmol Vis Sci 47, 3754-3765 Brouwer, C., Vermunt-de Koning, D.G., Trueworthy, R.C., Ter Riet, P.G., Duley, J.A., Trijbels, F.J., Hoogerbrugge, P.M., Bokkerink, J.P., van Wering, E.R., and De Abreu, R.A (2006) Monitoring of inosine monophosphate dehydrogenase activity in mononuclear cells of children with acute lymphoblastic leukemia: enzymological and clinical aspects Pediatr Blood Cancer 46, 434-438 Cairns, R.A., Harris, I.S., and Mak, T.W (2011) Regulation of cancer cell metabolism Nat Rev Cancer 11, 85-95 Comai, L (2004) Mechanism of RNA polymerase I transcription Advances in protein chemistry 67, 123-155 Denissov, S., Lessard, F., Mayer, C., Stefanovsky, V., van Driel, M., Grummt, I., Moss, T., and Stunnenberg, H.G (2011) A model for the topology of active ribosomal RNA genes EMBO reports 12, 231-237 Fellenberg, J., Kunz, P., Sahr, H., and Depeweg, D (2010) Overexpression of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase type II mediates chemoresistance to human osteosarcoma cells PLoS One 5, e12179 Grummt, I (2003) Life on a planet of its own: regulation of RNA polymerase I transcription in the nucleolus Genes & development 17, 1691-1702 Haag, J.R., and Pikaard, C.S (2007) RNA polymerase I: a multifunctional molecular machine Cell 131, 1224-1225 Jain, J., Almquist, S.J., Ford, P.J., Shlyakhter, D., Wang, Y., Nimmesgern, E., and Germann, U.A (2004) Regulation of inosine monophosphate dehydrogenase type I and type II isoforms in human lymphocytes Biochem Pharmacol 67, 767-776 10.Jayaram, H.N., Cooney, D.A., Grusch, M., and Krupitza, G (1999) Consequences of IMP dehydrogenase inhibition, and its relationship to cancer and apoptosis Curr Med Chem 6, 561-574 11.Kim, C.K., Nguyen, T.L (2010) P42 Ebp1 functions as a tumor suppressor in non-small cell lung cancer Cancer Res;70(23):9730-41 33 12.Ko,H.R, Nguyen, L.X (2015) Negative regulation of p53 by the long isoform of ErbB3 binding protein Ebp1 in brain tumors BMB report;48(3):159-65 13.Liu, P., Cheng, H., Roberts, T.M., and Zhao, J.J (2009) Targeting the phosphoinositide 3-kinase pathway in cancer Nat Rev Drug Discov 8, 627644 14.Natsumeda, Y., Ohno, S., Kawasaki, H., Konno, Y., Weber, G., and Suzuki, K (1990) Two distinct cDNAs for human IMP dehydrogenase J Biol Chem 265, 5292-5295 15.Natsumeda, Y., Prajda, N., Donohue, J.P., Glover, J.L., and Weber, G (1984) Enzymic capacities of purine de Novo and salvage pathways for nucleotide synthesis in normal and neoplastic tissues Cancer Res 44, 2475-2479 16.Nguyen le, X.T., Raval, A., Garcia, J.S., and Mitchell, B.S (2015) Regulation of ribosomal gene expression in cancer Journal of cellular physiology 230, 1181-1188 17.Nguyen le, X.T., Lee, Y., Urbani, L., Utz, P.J., Hamburger, A.W., Sunwoo, J.B., and Mitchell, B.S (2015) Regulation of ribosomal RNA synthesis in T cells: requirement for GTP and Ebp1 Blood 125, 2519-2529 18.Pillwein, K., Chiba, P., Knoflach, A., Czermak, B., Schuchter, K., Gersdorf, E., Ausserer, B., Murr, C., Goebl, R., Stockhammer, G., et al (1990) Purine metabolism of human glioblastoma in vivo Cancer Res 50, 1576-1579 19.Russell, J., and Zomerdijk, J.C (2006) The RNA polymerase I transcription machinery Biochemical Society symposium, 203-216 20.Ruggero, D., and Pandolfi, P.P (2003) Does the ribosome translate cancer? Nature reviews Cancer 3, 179-192 21.Rodriguez-Pascual, J., Sha, P., Garcia-Garcia, E., Rajeshkumar, N.V., De Vicente, E., Quijano, Y., Cubillo, A., Angulo, B., Hernando, O., and Hidalgo, M (2013) A preclinical and clinical study of mycophenolate mofetil in pancreatic cancer Invest New Drugs 31, 14-19 22.Suzuki, S., Kimura, T., Ando, K., Sawada, M., and Tamura, G (1969) Antitumor activity of mycophenolic acid J Antibiot (Tokyo) 22, 297-302 23.Takebe, N., Cheng, X., Wu, S., Bauer, K., Goloubeva, O.G., Fenton, R.G., Heyman, M., Rapoport, A.P., Badros, A., Shaughnessy, J., et al (2004) Phase I clinical trial of the inosine monophosphate dehydrogenase inhibitor 34 mycophenolate mofetil (cellcept) in advanced multiple myeloma patients Clin Cancer Res 10, 8301-8308 24.Tong, X., Zhao, F., and Thompson, C.B (2009) The molecular determinants of de novo nucleotide biosynthesis in cancer cells Curr Opin Genet Dev 19, 32-37 25.Traut, T.W (1994) Physiological concentrations of purines and pyrimidines Mol Cell Biochem 140, 1-22 26.White, R.J (2005) RNA polymerases I and III, growth control and cancer Nature reviews Molecular cell biology 6, 69-78 27.Zwerner, J., and Fiorentino, D (2007) Mycophenolate mofetil Dermatol Ther 20, 229-238 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Đơn vị chủ trì thực Chủ nhiệm đề tài Phịng CNSH Y Dược Huỳnh Vũ TS Phạm Thị Kim Trâm ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phịng QLKH-HTQT TS Nguyễn Đăng Quân Lâm Vỹ Nguyên ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc PGS TS Dương Hoa Xô 35