Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai Châu

Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai ChâuĐánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai Châu

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

PHAN THU HUYỀN

ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ

HỢP CHẤT PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY KHÔI TÍA (ARDISIA

SILVESTRIS PITARD) TẠI TỈNH LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

HÀ NỘI - 2024

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2

1.1 VIÊM VÀ CÁC THỬ NGHIỆM VỀ CƠ CHẾ KHÁNG VIÊM 2

1.1.1 Viêm và các yếu tố gây viêm 2

1.1.2 Cơ chế chung của thuốc chống viêm không steroid 3

1.2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHI ARDISIA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 4

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới về chi Ardisia 4

1.2.3 Các nghiên cứu về loài Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) ở Việt Nam 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12

2.1.1 Mẫu nghiên cứu 12

2.1.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 12

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.2.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc 13

2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY KHÔI TÍA 21

3.1.1 Quy trình ngâm chiết và phân lập chất sạch từ lá cây Khôi tía 21

3.1.2 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ lá cây Khôi tía 24

3.2 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA LÁ CÂY KHÔI TÍA 32

3.2.1 Kết quả đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO 32

3.2.2 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế PGE2 34

3.2.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính iNOS và COX-2 36

3.2.4 Đánh giá khả năng ức chế biểu hiện cytokine IL-1β và IL-6 37

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

4.1 KẾT LUẬN 40

4.2 KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR Proton Magnetic Resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic

Resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement by

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân trực tiếp H  C

COSY Corrrlated Spectroscopy Phổ COSY

NOESY Nuclear Overhauser Effect

Spectroscopy

Phổ NOESY

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại IR

MS Mass spectrometry Phổ khối lượng MS

TMS Tetramethylsilance

DMSO Dimethyl sulfoxide

FBS Fental bovine serum

L-NMMA NG-Methyl-L-arginine acetate

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide

Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt

MIC Minimum Inhibitory

Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle

Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

A-549 Human lung cancer Ung thư phổi

HT-29 Human colon cancer Ung thư đại tràng

OVCAR Human ovarian cancer Ung thư buồng trứng

KB Human epidemic carcinoma Ung thư biểu mô

LU-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi

HepG2 Hepatocellular carcinoma Ung thư gan

LNCaP Hormone dependent human

prostate carcinoma

Ung thư tuyến tiền liệt

COX-2 Enzym cyclooxygenase-2

COX-1 Enzym cyclooxygenase-1

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất ASE2.1 và hợp chất tham khảo 24

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất ASB1 và chất tham khảo 26

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất ASB2 và chất tham khảo 29

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất ASE1 và chất tham khảo 31

Bảng 3.5 Tác dụng ức chế sản sinh NO của mẫu nghiên cứu 33

Bảng 3.6 Tác động của mẫu nghiên cứu đến biểu hiện PGE-2 35

Bảng 3.7 Tác động của mẫu nghiên cứu đến mức độ biểu hiện protein 36 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu trên mức độ biểu hiện cytokine 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các bệnh liên quan đến bệnh lý viêm 2

Hình 1.2 Một số thuốc điều trị viêm theo cơ chế ức chế các cytokine 3

Hình 1.3 Một số khung chất cơ bản phân lập từ chi Ardisia trên thế giới 5

Hình 1.4 Một số hợp chất phân lập từ chi Ardisia ở Việt Nam 8

Hình 1.5 Một số hợp chất phân lập từ cây Khôi tía thu hái tại Việt Nam 10

Hình 2.1 Các phương pháp kỹ thuật ELISA 15

Hình 3.1 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất ASE2.1 25

Hình 3.2 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất ASB1 27

Hình 3.3 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất ASB2 30

Hình 3.4 Các hợp chất phân lập được từ lá loài Khôi tía 32

Hình 3.5 Biểu đồ giá trị hàm lượng PGE2 35

Hình 3.6 Biểu hiện enzym COX-2 và iNOS dưới tác động của các mẫu thử 37

Hình 3.7 Biểu đồ đường chuẩn IL-1β 38

Hình 3.8 Biểu đồ đường chuẩn IL6 38

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mẫu nghiên cứu trên mức độ biểu hiện cytokine 38 Hình 3.9 Biểu đồ mức độ biểu hiện IL-1β và IL6 của ASB1 39

Hình 3.10 Biểu đồ mức độ biểu hiện IL-1β và IL6 của ASE1 39

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình ngâm chiết mẫu thực vật 21

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc 22

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước 23

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có tài nguyên thiên nhiên rất dồi dào và nguồn dược liệu vô cùng phong phú Xã hội ngày càng phát triển, xu thế chung của toàn cầu về việc sử dụng các sản phẩm

có nguồn gốc thiên nhiên để làm các sản phẩm bảo vệ, chăm sóc sức khoẻ, thuốc chữa bệnh, dược mỹ phẩm ngày càng gia tăng, đòi hỏi nhu cầu cấp thiết cho việc tìm ra các loại thuốc mới có hoạt tính cao và được sử dụng rộng rãi để phòng và điều trị bệnh

Viêm vừa là phản ứng tự vệ và thích nghi của cơ thể nhằm phá hủy hoặc loại trừ các vật lạ khi chúng xâm nhập vào cơ thể, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối loạn chức năng cơ quan… có thể

ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [1] Phản ứng viêm diễn ra trên cơ thể gây nhiều khó chịu, hơn nữa, nếu viêm mà không được điều trị có thể gây ra những

hệ luỵ nguy hiểm cho người bệnh Trên lâm sàng sử dụng nhiều nhóm thuốc khác nhau để ức chế, làm giảm triệu chứng như các thuốc chống viêm là NSAIDs hay nhóm thuốc glucocorticoid Thuốc tân dược hiện nay đem lại nhiều lợi ích quan trọng Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích của thuốc tân dược thì đi cùng với nó là những tác dụng không mong muốn của từng nhóm thuốc này, có thể kể đến như: xuất huyết tiêu hoá, tổn thương gan, thận, tim mạch, kích ứng, viêm loét, hội chứng salicyle, phản ứng quá mẫn gây nhờn thuốc, nghiện thuốc, tác dụng không mong muốn trên hệ hô hấp…[2],[3] Bên cạnh sử dụng thuốc tây y, hệ thống y tế Việt Nam còn song hành tồn tại nền y học cổ truyền với những vị thuốc: Độc hoạt [4], Tần giao [5], Phòng phong [6], Hy thiêm [7] có tác dụng chống viêm Với mục đích tìm ra cây dược liệu trong nước có hoạt tính kháng viêm,

chúng tôi đã lựa chọn lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) làm đối tượng

nghiên cứu với tên đề tài: "Đánh giá hoạt tính kháng viêm của một số hợp

chất phân lập từ lá cây Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) tại tỉnh Lai Châu"

với mục tiêu được đặt ra như sau:

 Tách chiết, tinh chế và xác định được cấu trúc một số hợp chất chính thuộc lớp chất flavonoid và terpenoid từ lá cây Khôi tía

 Đánh giá được tác dụng kháng viêm trên dòng tế bào Raw 264.7 của các hợp chất phân lập được

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 VIÊM VÀ CÁC THỬ NGHIỆM VỀ CƠ CHẾ KHÁNG VIÊM

1.1.1 Viêm và các yếu tố gây viêm

Viêm là một phản ứng miễn dịch và bảo vệ bẩm sinh của cơ thể, được kích hoạt bởi các yếu tố có hại, nhiễm trùng, độc tố, v.v… đặc trưng bởi sự sản xuất các chất trung gian và các cytokine gây viêm [8-11] Tuy nhiên, sản xuất quá mức các chất trung gian gây viêm có thể dẫn đến sự phát triển bệnh lý viêm [12-14] Vì vậy, kiểm soát tình trạng viêm rất cần thiết nhằm ngăn ngừa và chữa trị các bệnh viêm nhiễm

Hình 1.1 Các bệnh liên quan đến bệnh lý viêm [15]

Đại thực bào là cơ quan chống viêm và miễn dịch quan trọng nhất Đại thực bào đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình viêm bằng cách tiết

chất trung gian gây viêm (pro-inflammatory mediators) như NO, PGE2, iNOS

và COX-2, cũng như các cytokine gây viêm (pro-inflammatory cytokines),

chẳng hạn như IL-1β và IL-6 [16-19] Các tế bào trao đổi thông tin, hoạt hoá, kích thích các tế bào chưa hoạt động qua các cytokine để từ đó hình thành đáp ứng miễn dịch Việc sản xuất cytokine một cách bất thường này cũng là nguyên nhân cho sự tiến triển của các phản ứng viêm Vì vậy, việc ức chế hoạt động của các cytokine có thể giúp ngăn chặn sự phát sinh đáp ứng miễn dịch Các thuốc kháng viêm hiện nay đều nhằm mục tiêu là hạn chế sự sản sinh các cytokine tiền viêm này

1.1.2 Cơ chế chung của thuốc chống viêm không steroid

Các thuốc kháng viêm hiện nay được chia làm hai loại: Loại steroid và loại không steroid Trên thị trường hiện nay đa số là các thuốc kháng viêm không steroid (NSAIDs-Nonsteroidal anti-inflammatory drugs), chủ yếu là các thuốc tổng hợp và có tác dụng trên viêm không phân biệt nguyên nhân Thuốc này hoạt động dưới nguyên lý là kìm hãm hoạt động của enzyme cyclooxygenase COX-1 và COX-2, giảm tổng hợp các prostaglandin Sự ức chế tổng hợp các PG là yếu tố quyết định trong tác dụng kháng viêm của thuốc Tuy nhiên sự ức chế này lại không tốt cho thận và đường tiêu hoá khi sử dụng thuốc kéo dài Hiện nay, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 được xem là ít tác dụng phụ trên dạ dày Tuy nhiên, không có thuốc nào hoàn toàn ức chế COX-

2 mà không tác động trên COX-1 Do đó, bên cạnh các thuốc tổng hợp thì xu hướng tìm kiếm các thuốc kháng viêm có nguồn gốc tư thiên nhiên đang được đẩy mạnh bởi những tác dụng ưu việt của nó như an toàn và ít gây ra các phản ứng phụ

Hình 1.2 Một số thuốc điều trị viêm theo cơ chế ức chế các cytokine [20]

Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần nội độc tố từ Vi khuẩn gram âm,

có thể kích thích đại thực bào thông qua các thụ thể giống Toll (TLR), đặc biệt là TLR4, kích hoạt NF-κB, MAPK, Akt và các đường truyền tín hiệu viêm khác, dẫn đến việc sản xuất quá mức chất gây viêm chất trung gian và cytokine và sau đó gây ra phản ứng viêm bất thường [21] Mô hình đại thực bào RAW 264.7 kích hoạt bằng LPS được sử dụng rộng rãi như một mô hình tế bào quan trọng để sàng lọc các hoạt chất kháng viêm và nghiên cứu cơ chế kháng viêm ở cấp độ phân tử

Cơ chế tác dụng chính của thuốc chống viêm không steroid là ức chế enzyme COX, làm giảm tổng hợp PG là những chất trung gian hoá học có vai trò quan trọng trong việc làm tăng và kéo dài đáp ứng viêm của mô sau tổn thương Khi tổn thương, màng tế bào bị giải phóng phospholipid màng Dưới tác dụng của phospholipase A2, chất này chuyển thành acid arachidonic Sau

đó, một mặt, dưới tác dụng của lipooxygenase, acid arachidonic cho các leucotren có tác dụng co khí quản Mặt khác, dưới tác dụng của COX, acid arachidonic cho PGE2, PGI2, TXA2 tác động đến sự ngưng kết tiểu cầu Các thuốc chống viêm không steroid ức chế COX nên ức chế được các phản ứng

viêm [22]

1.2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CHI ARDISIA TRÊN

THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới về chi Ardisia

Chi Ardisia là một chi lớn thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae) với khoảng

500 loài trên thế giới và các loài thực vật thuộc chi này phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Mỹ, châu Úc và các đảo ở Thái Bình Dương Các nghiên

cứu về các loài thực vật thuộc chi Ardisia đã được nghiên cứu từ rất sớm trên

toàn cầu Ngay từ năm 1968, Ogawa Hideko và các cộng sự đã thấy trong loài

A sieboldi của Nhật Bản có chứa các hợp chất ardisiaquinon A, B, C Tuy

nhiên, chỉ trong một thời gian ngắn trở lại đây, các nghiên cứu về thành phần

hoá học và hoạt tính sinh học của các thực vật thuộc chi Ardisia mới thực sự phát triển Cho đến nay, đã có rất nhiều loài trong chi Ardisia đã được nghiên cứu như A japonica, A compressa, A crispa, A colorata, A crenata, A

pusilla…

Hình 1.3 Một số khung chất cơ bản phân lập từ chi Ardisia trên thế giới [30]

Kết quả của các nghiên cứu cho thấy các loài thuộc chi Ardisia có nhiều

lớp chất thú vị, trong đó có nhiều hợp chất có cấu trúc mới, bao gồm các benzoquinone, tritecpen saponin, flavonoid, polyphenolic, steroid, các dẫn xuất của resorcinol, các dẫn xuất của bergenin với nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm giảm đau, kháng virus, chống đái tháo đường, chống oxi hoá, chống loãng xương, bảo vệ gan, bảo vệ thần kinh cũng như hoạt tính chống ung thư [23] Tác giả Kobayashi đã nhận định

trong một bài review trên tạp chí Journal of Ethnopharmacology năm 2005 như sau: Chi Ardisia là một nguồn mới cung cấp các hợp chất tăng cường sức khỏe

và dược phẩm thiên nhiên quý giá [24]

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về các loài trong chi Ardisia, tuy nhiên những nghiên cứu về loài A silvestris vẫn còn rất hạn chế Tác giả

Lei Huang và cộng sự (2023) đã nghiên cứu đặc tính bảo vệ da của dịch chiết

ethanol A silvestris thu hái tại Hàn Quốc (As-EE) bằng cách sử dụng các xét

nghiệm DPPH, ABTS, TPC, CUPRAC và FRAP và xét nghiệm dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide để kiểm tra độc tính tế bào Kết quả nghiên cứu cho thấy, As-EE có thể ngăn ngừa lão hóa da và chết

3-(4-5-tế bào do tia cực tím gây ra cũng như tăng cường tác dụng bảo vệ của da

As-EE không có tác dụng có hại đối với các tế bào HaCaT và As-As-EE cho thấy khả năng bẫy gốc tự do ở mức độ vừa phải As-EE đã tăng cường mức độ biểu hiện

của axit hyaluronic synthase-1 và constludin trong tế bào HaCaT Hơn nữa,

As-EE điều chỉnh tăng việc sản xuất occludin và transglutaminase-1 một cách phụ thuộc vào liều lượng sau khi ức chế do UVB ngăn chặn đường truyền tín hiệu protein-1, đặc biệt là kinase phản ứng ngoại bào và kinase c-Jun N-terminal Kết quả của nghiên cứu có ý nghĩa tích cực đối với ngành mỹ phẩm và da liễu [25] Rutin được phát hiện là một trong những thành phần chính trong dịch chiết này thông qua phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao Đáng chú ý, đây là

nghiên cứu duy nhất về loài A silvestris được thực hiện ở nước ngoài

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước về chi Ardisia

Tại Việt Nam, có khoảng 101 loài thuộc chi Ardisia (chi Cơm nguội)

được phân bố rộng khắp từ Bắc vào Nam Cây Khôi tía là loài cây gỗ nhỏ, cây

bụi hoặc nửa bụi gần với dạng cây thân thảo Nhiều loài Ardisia đã được dân gian sử dụng làm thuốc, đặc biệt chữa các bệnh viêm nhiễm như viêm gan (A

mamillata), viêm hạch limpho (A crenata), viêm tai (A crispa), viêm tinh hoàn

(A chinensis), viêm khớp (A corymbifera, A solanacea), viêm phổi (A

chinensis, A.crassinervosa), mụn nhọt, lở loét (A gigantifolia, A lindleyana),

bệnh phụ khoa (A attenuatta, A colorata) Mặc dù các thực vật trong chi

Ardisia đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền làm thuốc chữa bệnh

nhưng đến nay vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của chúng Việc định hướng nghiên cứu các loài thuộc chi này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, góp phần thúc đẩy cho nghiên

cứu cơ bản và bước đầu lý giải được tác dụng làm thuốc của một số loài Ardisia

trong dân gian [26-29]

Trong một nghiên cứu của tác giả Trịnh Anh Viên và cộng sự năm 2017,

cấu trúc của 40 hợp chất từ 04 loài Ardisia là cơm nguội rạng (A splendens), cơm nguội đảo (A insularis), cơm nguội thắm (A incarnata), và cơm nguội balansa (A balansana) đã được phân lập và xác định Trong nghiên cứu này,

một số chất đã thể hiện hoạt tính tốt với các chủng vi sinh vật kiểm nghiệm như các hợp chất rutin, desmanthin-1, norbergenin, myricitrin, quercitrin, afzeline thể hiện có hoạt tính đối với giá trị MIC là 200 µg/ml Kết quả hoạt tính kháng virut Coxsackie A16 gây bệnh tay chân miệng ở trẻ em cho thấy, các hợp chất myricitrin, desmanthin-1 và corilagin có hoạt tính tốt với giá trị IC50 tương ứng

là 40,1, 32,2 và 30,5 µM Một số chất còn thể hiện khả năng ức chế với các

dòng tế bào ung thư (A-549, HT-29, OVCAR, KB, LU-1, HepG2 và LNCaP) như hoạt chất ardinsuloside và rutin [30]

Trong quá trình phân lập hoạt chất định hướng hoạt tính kháng lao của dịch chiết CHCl3 từ phần lá và thân của loài Khôi trắng (A gigantifolia), hai dẫn xuất

alkylresorcinol là 5- (8Z-heptadecenyl) resorcinol và 5- (8Z-pentadecenyl)

resorcinol cùng 15 dẫn xuất khác đã được phân lập bởi tác giả Phạm Văn Cường,

Nguyễn Văn Hùng và cộng sự năm 2016 Kết quả nghiên cứu đánh giá hoạt

tính chống lao trên vi khuẩn lao Mycobacterium H37RV cho thấy rằng hai dẫn

xuất resorcinol đã biểu hiện hoạt tính chống lao với các giá trị MIC là 34,4; 79,2 μM theo phương pháp MABA và 91,7; 168,3 μM theo phương pháp Lora [31]

Kết quả của nghiên cứu về cao chiết ethanol từ loài Ardisia villosa đã

được tác giả Lê Thị Thanh Hương và cộng sự công bố, cho thấy rằng trong

thành phần có chứa saponin và tanin nhưng không chứa triterpennoid và

alkaloid Cao chiết này đã cho thấy có khả năng ức chế sự tăng sinh và làm thay đổi kiểu hình của tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 với giá trị IC50 là 144,54 µg/mL [32]

Hình 1.4 Một số hợp chất phân lập từ chi Ardisia ở Việt Nam [30]

Năm 2014, nghiên cứu khảo sát về khả năng kháng viêm của dịch chiết

metanol từ loài Cơm nguội nhuộm (A tinctoria) đã thực hiện bởi tác giả Seong Kim, Trần Thế Bách và cộng sự Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng khả

Hui-năng ức chế sự biểu hiện của enzym tổng hợp NO (iNOS) và enzym cyclooxygenase-2 (COX-2), dẫn tới sự giảm đáng kể hàm lượng nitric oxide (NO) và prostaglandin E2 (PGE2) cũng như hàm lượng hai loại protein được điều hòa bởi chúng là: IL-1β và IL-6 ở trong đại thực bào RAW 264.7 được

kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) Ngoài ra, kết quả nghiên cứu còn chỉ

ra rằng dịch chiết methanol của loài A tinctoria có khả năng làm giảm các phản

ứng viêm thông qua ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa MEK, ERK cũng như bằng cách kích hoạt NF-κB Những nghiên cứu này đã làm sáng tỏ tiềm năng

của dịch chiết từ loài A tinctoria trong việc điều trị bệnh viêm nhiễm Đây có

thể coi là những nghiên cứu đầy tiên về hoạt tính kháng viêm của dịch chiết từ

loài A tinctoria, từ đó mở ra những triển vọng mới trong lĩnh vực điều trị y khoa [33]

1.2.3 Các nghiên cứu về loài Khôi tía (Ardisia silvestris Pitard) ở Việt Nam

Khôi tía hay còn gọi là cơm nguội rừng, khôi nhung là một loài thực

vật thuộc chi Cơm nguội (Ardisia), họ Đơn nem (Myrsinaceae) Theo tác giả

Võ Văn Chi, Khôi tía có một số đặc điểm như: mọc hoang ở rừng rậm nguyên sinh hay rừng thứ sinh, trên đất ẩm nhiều mùn, gần suối ở độ cao 400-1.500m Cây Khôi tía là loại cây nhỏ cao khoảng 2m, thân rỗng xốp, ít phân nhánh Hoa mọc chùm, có màu trắng pha màu hồng tím gồm 5 lá đài và 3 cánh hoa Hoa ra

từ thàng 4 đến tháng 7, quả chín từ tháng 9 đến tháng 12 Theo Sách đỏ Việt Nam, cây Khôi tía đã được tìm thấy ở Lạng Sơn (Hữu Lũng), Thanh Hóa (Lang Chánh, Ngọc Lạc, Thạch Thành), Lào Cai (Sa Pa), Quảng Ninh, Hà Nội (Ba Vì), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Ninh Bình (Cúc Phương)… [34-35]

Theo tài liệu Y học cổ truyền, Khôi tía là một loại dược liệu quý, trong

lá có chứa là tanin và glucosid, có tác dụng chống viêm giảm đau, se vết loét, liền sẹo và ức chế quá trình tăng axit dạ dày Lá Khôi tía có thể dùng kết hợp

với bồ công anh (Lactuca indica), khổ sâm (Croton tonkinensis) để điều trị đau

dạ dày tá tràng Đặc biệt, lá Khôi tía phối hợp với các dược liệu như nghệ vàng, phục linh, ý dĩ, sa nhân, cam thảo còn hỗ trợ bổ tỳ vị, cải thiện chức năng hệ tiêu hoá Lá Khôi tía được dùng với lá Vối, lá Hòe nấu nước tắm cho trẻ bị sài

lở, hoặc giã cùng lá Vối trộn với dầu vừng trị nhọt cho trẻ Rễ cây Khôi tía có thể thái nhỏ phơi khô ngâm rượu uống cho bổ huyết, sắc lá uống để trị kiết lỵ

ra máu, đau yết hầu và đau cơ nhục [36-37]

Các nghiên cứu về cây Khôi tía ở trong nước còn rất hạn chế và chưa có nhiều các nghiên cứu về dược lý của loài này Nghiên cứu đầu tiên về thành

phần hóa học của loài A silvestris tại Vườn quốc gia Cúc Phương do tác giả

Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự thực hiện năm 1996 Một số hợp chất resocinol, sterol và tritecpen đã được công bố trong bài nghiên cứu này [38]

Hình 1.5 Một số hợp chất phân lập từ cây Khôi tía thu hái tại Việt Nam [30]

Năm 2020, việc tiến hành nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa thực vật, định lượng một số hợp chất và xác định khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa

từ lá cây Khôi tía thu hái tại Vườn quốc gia Cát Tiên – Đồng Nai đã được thực hiện bởi tác giả Cẩm Hồng và cộng sự Kết quả của nghiên cứu đã cho thấy rằng các hợp chất như chất béo, alkaloid, tinh dầu, tanin, flavonoid, courmarin, carotenoid, anthocyanoid, các chất khử, các acid hữu cơ, saponin, anthraquinon

và proanthocyanidin đã được phát hiện trong lá cây Khôi tía Hàm lượng polyphenol trong lá cây là 0,26% chất khô, hàm lượng tanin 8,80% và flavonoid

là 1,442 mg/g Đặc biệt là dịch chiết nước từ lá cây Khôi tía và ethyl acetate có khả năng chống oxy hóa, nhưng thấp hơn acid ascorbic lần lượt là 4,4 và 4,2 lần Đặc biệt, tính kháng vi khuẩn của dịch chiết ethyl acetate và dịch chiết ethanol từ lá cây đã được xác định thông qua đường kính vòng vô khuẩn, đối

với vi khuẩn E.coli lần lượt từ 9,67 mm đến 20,67 mm và Salmonella sp là

14,67 mm và 15,33 mm, tuy nhiên không thể hiện đối với vi

khuẩn Staphylococus aureus [39]

Hiện nay, nền y học hiện đại đã chứng minh được khả năng ức chế vi

khuẩn Helicobacter pylori (HP) của lá Khôi tía trên quy mô phòng thí nghiệm

và thực tế lâm sàng Do đó trên thị trường có các sản phẩm hỗ trợ điều trị viêm

loét dạ dày và trào ngược dạ dày trong đó có chứa thành phần lá Khôi tía như Bình Vị An, Bình vị Thái Minh, HPmax… Tác giả Phạm Bá Tuyến - Đại học

Y Hà Nội năm 2014 đã chứng minh hiệu quả của chế phẩm HPmax (kết hợp lá cây Khôi tía, Cao khô Chè dây , Dạ cẩm) trong điều trị loét hành tá tràng có vi khuẩn (HP) Kết quả nghiên cứu cho thấy HPmax có tính an toàn cao, có hiệu

quả trong điều trị loét hành tá tràng, diệt HP trên động vật thực nghiệm và trên lâm sàng Chế phẩm HP Max có hiệu quả giúp giảm đau, hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày mãn tính có vi khuẩn HP và đau dạ dày cấp tính [40]

Cây Khôi tía, một loài cây được ghi trong Sách Đỏ Việt Nam (1996, 2007) với mức độ cảnh báo “sẽ nguy cấp” (V) và khuyến nghị “Chỉ khai thác

có mức độ và giữ lại những cây con chưa đến tuổi thu hái Cấm khai thác loài này trong tự nhiên” Tai Việt Nam, cây Khôi tía có khu phân bố rộng trên cả nước Tuy nhiên do sự tái sinh của loài này kém và bị khai thác làm dược liệu với số lượng lớn, dẫn đến việc số lượng cá thể giảm sút Hơn nữa, việc chặt phá rừng làm giảm sút số lượng cây mới mọc, dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng Cây Khôi tía hiện đã được trồng thử nghiệm theo tiêu chuẩn GACP-WHO (tiêu chuẩn về thực hành tốt nuôi trồng và thu hái) ở nhiều địa phương trên cả nước như Bắc Giang (chùa Bổ Đà), Quảng Ninh (vườn Quốc gia Bái Tử Long), Thái Nguyên, Hà Nội, Hà Giang, Tuyên Quang, Lai Châu, Yên Bái, Hòa Bình, Lào Cai, Thanh Hóa, Nghệ An… Kết quả cho thấy cây dễ trồng, thích ứng phát triển nhanh và đạt năng suất cao Việc nhân rộng mô hình trồng dược liệu này đã tạo việc làm, tăng thêm thu nhập cho người dân, làm giàu từ vùng đất quê hương mình

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu lá cây Khôi tía được thu hái tại huyện Tam Đường, Tỉnh Lai Châu vào tháng 6 năm 2023 được PGS.TS Vũ Tiến Chính, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam giám định mẫu thực vật

- Mẫu tiêu bản kí hiệu AS-2023/LC được lưu trữ tại Phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam

2.1.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị

2.1.2.1 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật

- Sắc ký bản mỏng TLC: Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60

F254 Merk với độ dày 0,2 mm Sắc ký cột pha thường silica gel (0,040-0,063 mm), sắc ký cột Sephadex LH-20, cột dianion

- Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4)2 và vanillin

- Các dung môi: n-hexane, ethyl axetate, diclchoromethane, acetone và

methanol đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance

600 MHz với TMS là chất chuẩn nội

2.1.2.2 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính kháng viêm

- Dòng tế bào RAW 264.7 (ATCC®-TIB-71TM) nuôi cấy bằng môi trường DMEM (bổ sung 10% fetal bovine FBS, 1% kháng sinh) ở điều kiện

(L Kit ELISA flex mouse IL(L 1β, IL(L 6 cung cấp bởi Mabtech (Swenden), kháng thể kháng iNOS, COX-2, anti-mouse IgG (ProteinTech, US)

- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), đĩa pippette (Eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Biotek ELx800)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc

2.2.1.1 Phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu nghiên cứu được sấy khô ở 40oC, sau đó đem nghiền nhỏ và ngâm chiết với etanol 96o ở 40-45oC Quá trình chiết được lặp lại 3-4 lần Gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng Tiếp

đó, hòa cao chiết tổng bằng dung môi etanol : H2O (1:1) và chiết lần lượt với

dung môi n-hexan và EtOAc Cô cất chân không thu được các cao chiết tương

 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp phân tách dựa trên việc từng chất được tách ra khỏi một hỗn hợp theo nguyên lý của sự “phân bố” liên tục giữa 2 pha Một pha không chuyển động (pha tĩnh) là silica gel hoặc aluminium oxit, được bao phủ trên một mặt phẳng chất trơ Một pha còn lại gọi là pha chuyển động (pha động) gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và được đưa lên bản sắc ký bởi mao dẫn, quá trình này giúp tách dung dịch dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch Hiện nay có một số cải tiến có thể kết hợp với kỹ thuật truyền thống nhằm đơn giản hoá một vài thao tác và tăng khả năng dung giải

của sắc ký lớp mỏng từ đó cho kết quả chuẩn xác hơn là phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC)

Hệ số lưu Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích được xác định bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển được của hợp chất

và khoảng cách di chuyển được của dung môi Hệ số lưu Rf không phải là hằng

số và chỉ có giá trị từ 0 đến 1, hệ số này phụ thuộc vào các loại dung môi và các loại bản sắc ký

2.2.1.3 Các thử nghiệm ELISA

 Nguyên lý kỹ thuật ELISA

Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent assay) là một phương pháp sinh hoá được sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự có mặt của một kháng nguyên hoặc kháng thể trong một mẫu Nguyên lý của kỹ thuật này căn cứ vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể Các bước thực hiện của kỹ thuật này như sau: đầu tiên, kháng nguyên hoặc kháng thể đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể hoặc kháng nguyên cần tìm được thêm vào giếng Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme Bước cuối cùng thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo ra tín hiệu màu có thể xác định thông qua máy đo quang phổ Nồng độ cytokine định lượng tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng thu được

Để thực hiện phản ứng ELISA thì ít nhất cần 1 kháng thể đặc hiệu bắt cặp với 1 kháng nguyên cụ thể nào đó Những mẫu có lượng kháng nguyên chưa biết số lượng được cố định bên trên một giá thể rắn có thể đặc hiệu hoặc không đặc hiệu Kháng nguyên sau khi được cố định thì kháng thể phát hiện sẽ được thêm vào và tạo ra phức hợp với kháng nguyên Kháng thể phát hiện sẽ liên kết với enzyme hoặc chính nó sẽ được phát hiện bởi kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học Trong quá trình này, dung dịch rửa sẽ được sử dụng ở giữa các bước để rửa đĩa, loại các protein và kháng thể không gắn Sau lần rửa cuối, cơ chất được thêm để enzyme phân giải và tạo ra tín hiệu nhìn thấy được từ đó cho thấy lượng kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu

ELISA trực tiếp (direct ELISA):

Phương pháp ELISA trực tiếp thường không được sử dụng nhiều trong định lượng, mà thay vào đó được sử dụng chủ yếu trong định tính Ưu điểm là

chỉ cần thực hiện ủ một lần từ đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện như: thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính toán thời gian Tuy nhiên, một điểm yếu của phương pháp này là nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn cũng như các protein cố định trên bề mặt rắn Ngoài ra, việc từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng gây chi phí lớn, đặc biệt là khi cần chẩn đoán các loại kháng nguyên khác nhau với số lượng lớn

ELISA gián tiếp (indirect ELISA):

Phương pháp ELISA gián tiếp có ưu điểm là độ nhạy cao Phương pháp này có thể nhận biết nhiều loại kháng nguyên nhưng chỉ cần tạo ra một loại kháng thể mang enzyme Tuy nhiên, nhược điểm là tăng các bước thực hiện từ

đó dẫn tới việc kéo dài thời gian chẩn đoán

ELISA sandwich:

Phương pháp ELISA sandwich được ưa chuộng vì ưu điểm hơn của nó

so với các phương pháp khác là độ nhạy cao, dẫn đến việc giảm được nhuộm màu nền và các phản ứng không đặc hiệu do phương pháp này đã loại bỏ được những thành phần tạp, phản ứng có thể thực hiện dễ dàng

ELISA cạnh tranh (competitive ELISA)

Phương pháp ELISA cạnh tranh đã được chứng minh là hiệu quả trong việc định lượng các yếu tố trong mẫu với lượng nhỏ Bằng cách sử dụng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) thực hiện phản ứng miễn dịch với kháng thể đặc hiệu với cùng loại kháng thể đặc hiệu được cố định trên mặt rắn, từ đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh thông qua hoạt tính enzyme liên kết Sự hiện diện của kháng nguyên cạnh tranh tỉ lệ nghịch với sự hiện diện của kháng nguyên đó trong mẫu

Hình 2.1 Các phương pháp kỹ thuật ELISA [41]

2.2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc

Để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất cần phải có sự kết hợp giữa các thông số như điểm nóng chảy, độ quay cực [α]D… và các phương pháp phổ như phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) và phổ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR và DEPT)

Một trong những phương pháp hiện đại hiện nay để phân tích, xác định cấu trúc các hợp chất hoá học là sử dụng phổ NMR Nguyên tắc của phương pháp này là nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân được đặt trong cùng một

từ trường Phổ NMR có hai thông số liên quan đến cấu trúc hoá học của một

phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J Và từ

các dữ liệu phân tích phổ ta có thể xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đó

Các chất sau khi tinh chế bằng sắc ký sẽ được tiến hành đo phổ NMR để xác định cấu trúc của hợp chất hoá học Đầu tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1H-NMR Nếu như hợp chất đảm bảo độ tinh khiết sẽ được tiến hành

đo tiếp phổ cacbon 13C-NMR và DEPT Với những hợp chất đơn giản, dễ gặp

có thể xác định được cấu trúc hoá học thông qua phương pháp phổ cộng hưởng

từ hạt nhân một chiều như 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT Ngược lại, với những hợp chất phức tạp hơn thì cần phải sử dụng đến phương pháp phổ cộng hưởng

từ hạt nhân hai chiều như HSQC, HMBC, COSY, NOESY, phổ IR, phổ ray để cung cấp thêm các thông tin cho xác định cấu trúc Các hợp chất sau khi được xác định cấu trúc thông qua các phương pháp phổ thì có thể khẳng định công thức phân tử dựa vào phổ MS hoặc phổ HRMS

X-2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

2.2.2.1 Phương pháp MTT đánh giá khả năng gây độc tế bào [42]

- Tế bào RAW 264.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tế bào/giếng và được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC và 5% CO2 trong thời gian 24h

- Chất thử được bổ sung thêm vào đĩa tế bào được chuẩn bị trước đó theo các nồng độ nghiên cứu và tiếp tục nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC và 5%

CO2 trong thời gian 24h

- Tế bào nuôi trên đĩa được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/mL)

- Sau khoảng thời gian là 4 giờ môi trường sẽ được loại bỏ, tinh thể formazan được hòa tan trong 100µL dung môi DMSO và giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm bằng máy quang phổ Giếng sử dụng môi trường nuôi cấy được coi là đối chứng âm Giếng có tế bào phát triển 100% được coi là đối chứng dương

- % tế bào sống sót sẽ được tính theo công thức:

% tế bào sống sót = 100% - [(ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)–

ODchứng (-)) x 100%]

Mẫu thử >80% tế bào sống sót sẽ được tiếp thử nghiệm tác dụng kháng viêm

2.2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7 [43-44]

- Tế bào RAW 264.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 105 tế bào/giếng và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC và 5% CO2 trong thời gian 24h

- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và được thay thế bằng môi trường DMEM không có FBS trong thời gian 3h

- Tế bào sau đó được ủ với mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong thời gian 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (10 μg/mL) trong 24h

- Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ bộ Griess Reagent System Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent:

50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước Hỗn hợp được ủ tiếp ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng nitrite sẽ được đo

bằng máy microplate reader ở bước sóng 540 nm Giếng chỉ sử dụng môi trường

nuôi cấy được coi là đối chứng âm Giếng có tế bào được kích thích bởi LPS được coi là đối chứng dương Chất tham khảo được sử dụng là NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma)

- Hàm lượng nitrite của mỗi mẫu thí nghiệm được xác định dựa trên đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh với đối chứng dương

Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định bằng công thức:

% ức chế sản sinh NO = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng (-))

x 100%

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Giá trị IC50 (nồng

độ ức chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định dựa trên phần mềm máy

tính Excel

2.2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế PGE-2 [45-46]

- Tế bào RAW 264.7 được đưa vào các giếng thí nghiệm của đĩa 96 giếng với lượng tế bào phù hợp (5 × 104 tế bào trong 190 l môi trường) và ủ ở nhiệt

độ 37oC qua đêm cho tế bào ổn định

- Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng ở các nồng độ khác nhau Một số giếng không có chất thử nhưng có tế bào (190 L)

và 10 L DMSO 10% sẽ được sử dụng làm đối chứng có LPS (+LPS) Giếng chỉ có môi trường nuôi cấy là giếng blank

- Sau thời gian 2h, bổ sung LPS với nồng độ 1 g/mL vào toàn bộ giếng thí nghiệm Một số giếng chỉ có tế bào và không thêm LPS sử dụng làm chứng sinh lý (-LPS)

- Sau nuôi cấy 24 h, thu dịch nổi nuôi tế bào đã được thử chất để xác định

sự có mặt của PGE-2 có trong môi trường nuôi cấy khi sử dụng bộ kit Mouse PGE-2 ELISA Kit theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất kit (R&D Systems,

Minneapolis, US)

- Trong thành phần của bộ kit sẽ có các cytokine chuẩn tương ứng để có thể dựng đường chuẩn và phương trình đường chuẩn của các cytokine tương ứng sẽ được thành lập Khi đó, hàm lượng cytokine tương ứng được xác định theo đường chuẩn Cụ thể là: giá trị Y là OD thu được của mẫu; X là hàm lượng cytokine tương ứng

2.2.2.4 Phương pháp đánh giá mức độ biểu hiện COX-2 và iNOS [47-48]:

Phương pháp Western-blot

- Tế bào RAW 264.7 được đưa vào các giếng thí nghiệm của đĩa 6 giếng với lượng tế bào phù hợp (2 × 106 tế bào/giếng) và ủ ở nhiệt độ 37oC qua đêm cho tế bào ổn định

- Tiếp theo, tế bào được ủ với mẫu ở các nồng độ cần nghiên cứu cùng với

sự có mặt của LPS trong 24h Sau đó, loại bỏ môi trường và rửa tế bào 2 lần với PBS trước khi li giải tế bào với dung dịch RIPA có bổ sung proteinase inhibitor cocktail (Promega)

- Dịch ly giải tế bào được ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút và thu dịch nổi và định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30 µg protein của các mẫu được pha cùng với loading buffer (BioRad) và β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) sau đó được biến tính ở nhiệt độ 95oC trong 5 phút

- Mẫu được điện di trên gel SDS-PAGE 12% (Bio-Rad) với chương trình cài đặt 90V trong 10 phút và sau đó tăng lên 120V trong 90 phút Protein được

chuyển vào màng PVDF (Bio-Rad) trong đệm chuyển màng (192 mM Glycine,

25 mM Tris, 1% SDS, 20% ethanol) trong 30 phút ở 28V, 4oC và tiếp tục khóa (block) màng với đệm TBS đã bổ sung 5% BSA Các màng sau đó được ủ với kháng thể kháng iNOS (prointech) và COX-2 (Prointech) qua đêm ở 4-8oC và tiếp tục ủ với kháng thể thứ cấp (anti-rabit IgG với INOS và anti-mouse IgG với COX2) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng

- Màng được nhuộm với dung dịch ECL Hình ảnh được xác định sử dụng

hệ thống Azure Biosystem C300 Hình ảnh nghiên cứu được phân tích bằng

phần mềm ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) và so sánh mức độ biểu hiện của protein cần nghiên cứu so với đối chứng là LPS

2.2.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế biểu hiện IL-1β và IL6 [49]:

- Tế bào RAW 264.7 được đưa vào các giếng thí nghiệm của đĩa 96 giếng với lượng tế bào phù hợp (2× 105 tế bào trong 190 l môi trường) và ủ ở nhiệt

độ 37oC qua đêm cho tế bào ổn định

- Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng ở các nồng độ khác nhau Một số giếng không có chất thử nhưng có tế bào (190 L)

và 10 L DMSO 10% sẽ được sử dụng làm đối chứng có LPS (+LPS) Giếng chỉ có môi trường nuôi cấy là giếng blank

- Sau thời gian 2h, bổ sung LPS với nồng độ 1 g/mL vào toàn bộ các giếng thí nghiệm Một số giếng chỉ có tế bào và không thêm LPS sử dụng làm chứng sinh lý (-LPS)

- Sau 24 h nuôi cấy, thu dịch nổi nuôi tế bào đã được thử chất để xác định

sự có mặt của IL-1β và IL6 có trong môi trường nuôi cấy khi sử dụng bộ Kit ELISA flex mouse IL-1β, IL-6 cung cấp bởi Mabtech (Swenden) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

- Trong thành phần của bộ kit sẽ có các cytokine chuẩn tương ứng để có thể dựng đường chuẩn và phương trình đường chuẩn của các cytokine tương ứng sẽ được thành lập Khi đó, hàm lượng cytokine tương ứng được xác định theo đường chuẩn Cụ thể là: giá trị Y là OD thu được của mẫu; X là hàm lượng cytokine tương ứng

- Đọc kết quả bằng máy quang phổ ở bước sóng 450 nm Kết quả được tính toán dựa vào đường chuẩn được cung cấp từ nhà sản xuất

2.2.2.6 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được xử lí trên Excel, được trình bày dạng Trung bình (TB) ± sai

số (SE) Các thuật toán thống kê Student's t-test, F’test và phương pháp phân

tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA) để kiểm tra sự sai

khác có ý nghĩa so với đối chứng, với P<0.05 được coi là sai khác có ý nghĩa

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY KHÔI TÍA

3.1.1 Quy trình ngâm chiết và phân lập chất sạch từ lá cây Khôi tía

Lá cây Khôi tía sau khi thu hái, được phơi trong bóng mát cho khô tự nhiên Mẫu được xay nhỏ (5 kg) và ngâm chiết với cồn EtOH 96%, gia nhiệt 45-50 ̊C Quá trình chiết được lặp lại 3 lần Dịch chiết EtOH tổng được gộp lại

và quay cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao tổng EtOH Hòa cao tổng EtOH vào nước ấm, chiết phân lớp lần lượt với n-hexan, EtOAc Dung môi hữu cơ được cất loại bằng máy quay cất chân không, từ đó thu được các

cặn chiết với khối lượng tương ứng là: n-hexan (50 g), EtOAc (187 g) và cặn

nước (500 g) Quá trình ngâm chiết mẫu thực vật được trình bày ở Sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1 Quy trình ngâm chiết mẫu thực vật

Cặn chiết EtOAc (140 g) được đưa lên cột silica gel, giải hấp gradient với hệ dung môi EtOAC: MeOH (từ 100:0 đến 0:100) thu được 5 phân đoạn

(E1 - E5) Phân đoạn E1 (5 g) được tiếp tục tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (CH2Cl2 5% đến 30%) thu được 8 phân đoạn (E1.1- E1.8) Phân đoạn E1.4 (30 mg) được tiếp tục tinh chế qua cột silica gel, hệ dung

môi n-hexan/aceton (2:1) thu được chất ASE1 (6 mg) Phân đoạn E5 (6.5 g)

được tinh chiết bằng cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (1/9) thu được 5 phân đoạn (E5.1 - E5.5) Phân đoạn E5.3 (120 mg) được tiếp tục tinh chế qua cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (1/9) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn (E5.3.1 – E5.3.3) Tinh chế phân đoạn E5.3.2 bằng bản mỏng

điều chế thu được chất ASE2.1 (5 mg) Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn

EtOAc được trình bày ở Sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc

Cặn chiết nước (100 g) được đưa lên cột Diaion với hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O (100% H2O đến 100% MeOH) thu được 4 phân đoạn (B1-B4) ứng với hệ dung môi rửa giải như sau: B1 (100% H2O), B2 (70% H2O), B3 (50% MeOH), và B4 (100% MeOH) Phân đoạn B3 (240 mg) được cho lên cột

sephadex (MeOH) thu được 7 phân đoạn (B3.1 – B3.7) Phân đoạn B3.2 (50 mg) được tiến hành tinh chế lại bằng cột sephadex (MeOH) thu được hợp chất

ASB1 (9 mg) Phân đoạn B3.6 (190 mg) được tinh chiết bằng cột pha đảo

RP-18 với hệ dung môi (MeOH: H2O, 1:1) thu được 5 phân đoạn nhỏ B3.6.5) Phân đoạn B3.6.3 (60 mg) được tinh chế lại bằng cột sephadex

(B3.6.1-(MeOH) thu được chất ASB2 (12 mg) Phân đoạn B4 (305 mg) được cho lên

cột sephadex (MeOH) thu được 8 phân đoạn nhỏ (B4.1-B4.8) Quá trình phân lập các hợp chất từ cặn nước được trình bày ở Sơ đồ 3.3

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước

3.1.2 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ lá cây Khôi tía

3.1.2.1 Hợp chất ASE2.1 (3S, 5R, 6R, 9S-tetrahydroxymegastigman-7-ene)

Hợp chất ASE2.1 thu được dưới dạng bột màu trắng Phổ 1H-NMR của

hợp chất ASE2.1 xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm methyl trong đó có 3 nhóm

dưới dạng singlet ở δH 0.89 (3H, s, CH3-11), 1.12 (3H, s, CH3-13), 1.24 (3H,

s, CH3-12) và 1 nhóm dưới dạng doublet ở δH 1.28 (3H, d, J = 6.6 Hz, CH310); hai nhóm methylene ở H 4,22 (2H, m, CH2-4), 1.47 (1H, m, H-2a) và

-1.67 (1H, t, J=12.0 Hz, H-2b); 2 nhóm oxymethin ở H 4.36 (1H, m, H-9), và 4.08 (1H, m, H-3), cùng tín hiệu của một liên kết đôi ở δH 6.09 (1H, dd, J = 1.2, 15.6 Hz, H-7), 5,81 (1H, dd, J = 6.0 Hz, 15.6 Hz, H-8) (Bảng 3.1) Hằng

số tương tác của 2 proton thuộc liên kết đôi lớn J = 15.6 Hz, cho phép xác định chúng có cấu hình trans

Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất ASE2.1 cho phép xác định tín

hiệu của 13 nguyên tử carbon bao gồm 4 nhóm methyl ở δC 24.1 (C-10), 27.5 (C-11), 26.2 (C-12), 27.1 (C-13), 2 nhóm methylen ở δC 46.5 (C-2), 45.7 (C-4), 2 nhóm methin sp2 ở δC 131.1(C-7), 136.1 (C-8), 2 nhóm oxymethin ở δC

65.3 (C-3), 69.6 (C-9) và 3 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở 40.7 (C-1), 77.8 (C-5), 78.9 (C-6) Những dữ liệu phổ NMR gợi ý sự có mặt cấu trúc khung tetrahydroxy megastigman-7-ene

Bảng 3.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất ASE2.1 và hợp chất tham khảo

aĐo trong CD3OD, b150 MHz, c600 MHz, d75 MHz, ≠

Phổ COSY cho phép xác định 2 hệ tương tác spin-spin bao gồm CH22/H-3/ CH2-4 và H-7/H-8/H-9/CH3-10 (Hình 3.1)

-Các mảnh cấu trúc sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC Trên phổ HMBC cho thấy tương tác xa giữa proton thuộc nhóm methyl CH3-13 với C-4/C-5/C-6 cho phép xác định nhóm methyl này gắn với carbon C-5 Tương tác giữa proton của 2 nhóm methyl CH3-11 và CH3-12 với carbon C-1/C-2/C-

6 cho phép xác định 2 nhóm methyl này cùng gắn ở vị trí C-1 Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton H-7 với C-6/C-9, tương tác giữa H-8 với C-6/C-9/C-10, tương tác giữa proton thuộc nhóm CH3-10 với C-8/C-9 cho phép xác định mạch nhánh gắn vào vị trí C-6 của vòng no 6 cạnh (Hình 3.1)

Hình 3.1 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất ASE2.1

Kết hợp với các dữ liệu phân tích phổ ESI-MS, 1D-NMR, 2D-NMR và

so sánh với tài liệu tham khảo [50] cho phép xác định hợp chất hợp chất ASE2.1

là 3S, 5R,6R,9S-tetrahydroxymegastigman-7-ene

purin

Ngoài ra, trên phổ 1D-NMR của ASB1 còn có tín hiệu của một đơn vị đường

ribose gồm 4 nhóm oxymethine và 1 nhóm oxymethylen Cấu hình β của cấu tử đường

ribose được xác định dựa trên hằng số tương tác của proton anomeric ở δH 5.99 (d, J =

6.0 Hz, H-1′)

Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa H-2 (δH 8.20) với C-4 (δC

150.0)/C-6 (δC 157.5), tương tác giữa H-8 (δH 8.32) với C-5 (δC 121.0)/C-4 (δC

150.0)/C-1’ (δC 91.2), tương tác giữa proton H-1′ (δH 5.99) với carbon C-4 (δC

150.0)/ và C-8 (δC 141.9) khẳng định cấu trúc adenin và đơn vị đường ribose gắn với khung tại vị trí N-9 (Hình 3.2)

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất ASB1 và chất

aĐo trong CD3OD, b150 MHz, c600 MHz, d75 MHz, ≠

Hình 3.2 Một số tương tác chính trên phổ HMBC của hợp chất ASB1

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu của 2 doublet ở δH 6.19 (d, J = 1.8 Hz, H-6)

và 6.37 (d, J = 1.8 Hz, H-8) đặc trưng cho 2 proton tại C-6 và C-8 của vòng A

Ngoài ra, ở vùng trường thấp còn có tín hiệu của 1 singlet tại δH 7.32 (2H, s, 2'/6'), khẳng định vòng thơm B thế tại vị trí 1,3,4,5 Tương ứng, phổ 13C NMR

H-của ASB2 cho tín hiệu H-của 15 nguyên tử carbon khung flavanol, bao gồm 1

nhóm carbonyl tại δC 179.2 (C-4), 4 nhóm methine sp2 tại δC 100.4 (C-6), 95.2 (C-8), và 110.3 (C-2'/6'), 10 carbon không liên kết trực tiếp với hydro trong đó

có 8 carbon liên kết với oxy tại δC 158.6 (C-2), 135.6 (C-3), 163.2 (C-5), 165.9 (C-7), 158.6 (C-9), 146.3 (C-3'), 137.7 (C-4') và 146.3 (C-5') và 2 carbon không liên kết với oxy tại δC 105.1 (C-10), và 122.8 (C-1')

Ngoài ra, tín hiệu cộng hưởng của các nhóm methin nằm trong vùng δH

3,29-3,82 trên phổ 1H-NMR và δC 68,6 - 78,2 trên phổ 13C-NMR, cùng với sự xuất hiện của 2 tín hiệu doublet của 2 proton anomeric tại δH 5.05 (1H, d, J =

7.8 Hz, H-1''), và 4.54 (1H, s, H-1''') và tín hiệu của 1 nhóm methyl ở δH 1.15

(3H, d, J = 6.0 Hz), δC 17,8 và 1 nhóm methylen ở δH 3.41 và 3.82, δC 68,6 cho

phép xác định trong cấu trúc của ASB2 có chứa hai cấu tử đường

α-Lrhamnopyranosyl và β-D-glucopyranosyl Tín hiệu doublet của proton

anomeric ở δH 5.05 (d, J = 7.8 Hz, H-1'') xác nhận cấu hình β của đường

β-ᴅ-glucopyranose, trong khi, tín hiệu singlet proton anomeric ở δH 4.54 (s, H-1''')

xác nhận cấu hình α của đường α-L-rhamnopyranose

Phổ COSY cho phép xác định 2 hệ tương tác spin-spin của 2 đường Lrhamnopyranosyl và β-D-glucopyranosyl (Hình 4.16) Các mảnh cấu trúc sau

α-đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC Trên phổ HMBC cho thấy tương tác giữa proton H-1’’ với carbon C-3 (δC 135.6) cho phép xác định đường β-D-

glucopyranosyl gắn với khung flavanol ở vị trí C-3 Tương tự, tương tác xa trên phổ HMBC giữa proton H-1’’’ với carbon C-6’’ (δC 68.6) và tương tác giữa proton của nhóm methylen CH2-6’’ với C-1’’’ (δC 102.4) cho phép xác định

đường α-Lrhamnopyranosyl gắn với C-6’’ của đường β-D-glucopyranosyl

(Hình 3.3)