Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).

Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng viêm của loài Lạc tiên (Passiflora foetida L.).

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Mẫu thân lá Lạc tiên (Passiflora foetida L.) được thu hái tại Hòa Bình, Việt Nam vào tháng 12/2020 Việc giám định mẫu này được thực hiện bởi TS Nguyễn Thế Cường, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hiện tại, mẫu tiêu bản (NCCT-P90) đang được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1 Hình ảnh mẫu Lạc tiên

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất

 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch

H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.

Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường và silica gel pha đảo, với kích thước hạt của silica gel pha thường dao động từ 0,040 đến 0,063 mm (240-400 mesh).

430 mesh) Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50

m, Fuji Silysia Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (MisubishiChem Ind Co., Ltd.).

 Tinh chế các hợp chất

Các hợp chất được tinh chế thông qua phương pháp sắc kí cột và kết tinh Đối với những hợp chất khó tinh chế, thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100 và cột J’sphere H-80 với kích thước 250 mm × 20 mm được sử dụng Việc lựa chọn điều kiện dung môi phù hợp để phân tách các hợp chất phụ thuộc vào bản chất và độ phân cực của chúng.

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua các phép đo các thông số vật lý và phương pháp đo phổ hiện đại Việc này kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo để đảm bảo độ chính xác Các phương pháp đo được áp dụng đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và xác định cấu trúc hóa học.

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Phổ NMR được thu thập trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn được sử dụng là TMS (Tetrametyl Silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC.

Dung môi được sử dụng trong phân tích bao gồm CDCl3, CD3OD và DMSO Việc lựa chọn dung môi phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của từng mẫu, với nguyên tắc là dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

Trong phổ 1 H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton được đo trong thang ppm từ 0 đến 14 ppm Giá trị này phụ thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử và các đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin-spin.

Phổ vạch carbon cung cấp thông tin tín hiệu quan trọng, với mỗi nguyên tử carbon cộng hưởng trong các trường khác nhau, tạo ra tín hiệu phổ độc đáo Thang đo phổ 13C-NMR được tính bằng ppm, với dải độ rộng từ 0 đến 230 ppm.

Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence):

Phổ HSQC cho biết tín hiệu các tương tác trực tiếp H-C trong phân tử. Trên phổ một là trục phổ 1 H-NMR, còn trục kia là 13 C-NMR.

Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation):

Phổ HMBC cung cấp thông tin về các tương tác xa giữa các dị hạt nhân thông qua 2-3 liên kết Việc phân tích các tín hiệu trên phổ này giúp xác định cấu trúc phân tử, từ từng phần cho đến toàn bộ.

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Vật liệu: Lipopolysaccharides (LPS) từ Escherichia- coli của Sigma

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) and fetal bovine serum (FBS) were sourced from Life Technologies, Inc in Gaithersburg, MD, USA Additional chemicals, including sodium nitrite, sulfanilamide, N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride, and dimethyl sulfoxide (DMSO), were obtained from Sigma Chemical Co in St Louis, MO, USA Other necessary reagents were acquired from reputable suppliers such as Sigma, GIBCO, Invitrogen, and Promega.

Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS TS Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp.

2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

The RAW264.7 cell line was cultured in DMEM medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, and 1.0 mM sodium pyruvate, along with an addition of 10% fetal bovine serum (FBS) from GIBCO.

- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37 o C, 5% CO2.

2.2.3.3 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7

- Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ở nồng độ 2 x 10 5 tb/giếng và nuôi trong tủ ấm ở 37 o C và 5% CO2 trong 24h.

- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng môi trường DMEM không có FBS trong 3h.

- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ở các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μM.g/mL) trong 24h.

Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu, được xem là đối chứng âm Đối chứng dương sử dụng N G-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) với các nồng độ 100, 20, 4 và 0.8 μM.g/ml.

Nitrite (NO2-), an indicator of nitric oxide production, is quantified using the Griess Reagent System from Promega Corporation (WI, USA) Specifically, a 100 μM/L sample from the cell culture medium is transferred to a new 96-well plate, where it is combined with 100 μM/L of Griess reagent This reagent consists of 50 μM/L of 1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid and 50 μM/L of 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride dissolved in water.

Hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó hàm lượng nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader tại bước sóng 540 nm Môi trường DMEM không FBS được sử dụng làm giếng trắng.

- Hàm lượng nitrite của từng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS).

- Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :

% ức chế 0%- [hàm lượng NO sample /hàm lượng NO LPS ]*100

Phép thử được thực hiện ba lần để đảm bảo độ chính xác cao Giá trị IC50, tức nồng độ ức chế 50% sự hình thành NO, sẽ được xác định thông qua phần mềm TableCurve 2Dv4.

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

Mẫu thân lá P foetida (5.0 kg) được thái nhỏ và phơi trong bóng râm, sau đó nghiền thành bột và chiết siêu âm với methanol (MeOH) 15L trong ba lần, mỗi lần kéo dài 2 giờ Sau khi loại bỏ dung môi dưới áp suất thấp, thu được cặn chiết MeOH (PF, 150.0 g) Cặn chiết này được phân bố đều trong nước cất và lần lượt chiết bằng n-hexan, dichloromethane và ethyl acetate, thu được các phân đoạn n-hexan (PF1, 12g), dichloromethane (PF2, 9 g), ethyl acetate (PF3, 15.0 g) và nước (PF4).

Phần nước PF4 được xử lý để loại bỏ dung môi hữu cơ và sau đó được đưa lên cột diaion HP-20, sử dụng nước để loại đường và rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O (0:100  100:0, v/v), từ đó thu được hai phân đoạn PF4A và PF4B Phân đoạn PF4B nặng 25g được tiếp tục phân tích bằng sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi dichloromethane:MeOH (30:1).

 1:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là PF4B1-PF4B5.

Phân đoạn PF4B2 (5g) được tách trên cột YMC RP-18 với dung môi Acetone:H2O (1:2, v/v), tạo ra 6 phân đoạn nhỏ PF4B2A đến PF4B2F Phân đoạn PF4B2A (120 mg) tiếp tục được phân tách bằng HPLC sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm × 20 mm, 4 μM.m, 8 nm), với dung dịch rửa giải acetonitrile 14% trong nước và tốc độ chảy 3 mL/phút, thu được hợp chất 6.

Hợp chất 7 được tinh chế từ phân đoạn PF4B2C (80 mg) qua hệ thống HPLC với cột J’sphere ODS H-80, sử dụng dung dịch acetonitrile 20% trong nước và tốc độ chảy 3 mL/phút Phân đoạn PF4B2D (105 mg) cũng được tách bằng hệ thống HPLC tương tự, thu được hợp chất 5 (5 mg) Tiếp theo, phân đoạn PF4B2F (70 mg) được phân tách trên hệ thống HPLC, cho ra hợp chất 3 (3.5 mg) và hợp chất 4 (5 mg) với điều kiện rửa giải giống như trên.

Sử dụng cột YMC RP-18 với dung môi acetone/nước (1/4, v/v) để phân tách phân đoạn PF4B5 (2.5 g) đã thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn, được ký hiệu là PF4B5A, PF4B5B và PF4B5C Phân đoạn PF4B5A (150 mg) được tiếp tục phân tách trên hệ thống HPLC, sử dụng dung dịch acetonitrile 17% trong nước với tốc độ chảy được điều chỉnh phù hợp.

Hợp chất 1 (23.0 mg) được thu nhận với tốc độ 3 mL/phút Hợp chất 2 được tinh chế từ phân đoạn PF4B5C (180 mg) bằng cách sử dụng cột sephadex và dung môi rửa giải là methanol/nước (1/1 v/v) Từ cặn chiết methanol của loài Lạc tiên, đã phân lập thành công 7 hợp chất sạch.

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Lạc tiên

THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C26H28O14 Khối lượng phân tử: 564

[𝛼] 25 -35.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 215-217 o C

1H-NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.1

2.4.2 Hợp chất 2: Apigenin 6,8-di -C-β- D-glucopyranoside

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C27H30O15 Khối lượng phân tử: 594 [𝛼] 25

+65.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 181-183 o C 1 H-

NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.2

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C27H30O15 Khối lượng phân tử: 594.

[𝛼] 25 +58.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 190-192 o C

1H-NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.3

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C26H28O14 Khối lượng phân tử: 564 [𝛼] 25

+45.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 190-192 o C 1 H-

NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.4

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C21H20O10 Khối lượng phân tử: 432 [𝛼] 25

+12.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 178-180 o C 1 H-

NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.5

Chất bột vô định hình, màu vàng.

Công thức phân tử: C15H10O6 Khối lượng phân tử: 286.

1H-NMR (DMSO) và 13 C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.6

Chất bột vô định hình, màu trắng.

Công thức phân tử: C13H18O8 Khối lượng phân tử: 302.2790

1H-NMR (CD3OD) và 13 C-NMR (CD3OD): Xem bảng 3.7

2.5 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT

Các hợp chất phân lập từ loài P foedida đã được đánh giá về hoạt tính kháng viêm, đặc biệt thông qua cơ chế ức chế sự sản sinh NO ở tế bào macrophage RAW 264.7.