• Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ơ hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng tư tư trên bếp điện đến khi hiện màu.
• Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240- 430 mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50
µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi
• Tinh chế các hợp chất
Các hợp chất được tinh chế bằng sắc kí cột; kết tinh. Đối với các hợp chất khó tinh chế thì sử dụng thiết bị sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100, cột J’sphere H-80 kích thước 250 mm × 20 mm. Tùy vào bản chất (độ phân cực) của chất mà lựa chọn các điều kiện dung mơi thích hợp để phân tách các hợp chất.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hố học các hợp chất
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định trên cơ sơ sử dụng các phép xác định thông số vật lý và các phương pháp đo phổ bằng các thiết bị hiện đại đồng thời kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo. Các phương pháp đo được sử dụng bao gồm:
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ NMR đo trên các máy: máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
Phổ cộng hương tư hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
Phổ cộng hương tư hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC.
Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CDCl3, CD3OD, DMSO. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của tưng mẫu, theo nguyên tắc dung mơi phải hịa tan hoàn toàn mẫu thử.
Phổ 1H-NMR:
Trong phổ 1H-NMR độ dịch chuyển hóa học (δH) của các proton được xác
định trong thang ppm tư 0 -14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học và tương tác spin-spin.
Phổ 13C-NMR:
Phổ này cho biết thông tin tín hiệu phổ vạch carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hương ơ một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau.
Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence):
Phổ HSQC cho biết tín hiệu các tương tác trực tiếp H-C trong phân tử.
Trên phổ một là trục phổ 1H-NMR, còn trục kia là 13C-NMR.
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation):
Phổ HMBC cho biết thơng tin tín hiệu các tương tác xa của các dị hạt nhân qua 2-3 liên kết. Phân tích các tín hiệu trên phổ này sẽ quy kết được tưng phần hoặc toàn bộ cấu trúc trong phân tử.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm2.2.3.1. Nguyên liệu 2.2.3.1. Nguyên liệu
Vật liệu: Lipopolysaccharides (LPS) tư Escherichia- coli của Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) were from Life Technologies, Inc., (Gaithersburg, MD, USA). Sodium nitrite, sulfanilamide, N-1- napthylethylenediamine dihydrochloride and dimethyl sulphoxide (DMSO) của Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
Dòng tế bào: RAW 264.7 do GS. TS. Domenico Delfino, Đại học Perugia, Italia cung cấp.
2.2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
- Dịng tế bào RAW264.7 được ni cấy trong môi trường DMEM với thành
phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO).
- Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2
ơ điều kiện 37oC, 5% CO2.
2.2.3.3. Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của tế bàomacrophage RAW 264.7 macrophage RAW 264.7
- Tế bào RAW 274.7 được đưa vào đĩa 96 giếng ơ nồng độ 2 x 105 tb/giếng và
nuôi trong tủ ấm ơ 37oC và 5% CO2 trong 24h.
- Tiếp theo, môi trường nuôi cấy được loại bỏ, thay bằng mơi trường DMEM
- Tế bào sau đó được ủ mẫu nghiên cứu ơ các nồng độ khác nhau trong 2h trước khi được kích thích sản sinh yếu tố NO bằng LPS (1μg/mL) trong 24h.
- Một số giếng không được ủ mẫu mà chỉ sử dụng dung dịch pha mẫu được coi
là đối chứng âm. Trong khi đối chứng dương được sử dụng là NG-Methyl-L-
arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) ơ các nồng độ 100; 20; 4 và 0.8 μg/ml.
- Nitrite (NO2-), được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ được xác định nhờ
bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Cụ thể là, 100 μL môi trường nuôi tế bào (ủ mẫu) được chuyển sang đĩa 96 mới và được thêm vào 100 μL Griess reagent: 50 μL of 1% (w/v) sulfanilamide trong 5% (v/v) phosphoric acid và 50 μL 0.1% (w/v) N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride pha trong nước.
- Hỗn hợp này được ủ tiếp ơ nhiệt độ phòng trong 10 phút và hàm lượng
nitrite sẽ được đo bằng máy microplate reader ơ bước sóng 540 nm. Mơi trường DMEM khơng FBS được sử dụng như giếng trắng (blank).
- Hàm lượng nitrite của tưng mẫu thí nghiệm được xác định nhờ vào đường
cong hàm lượng chuẩn NaNO2 và được so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). - Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định nhờ công thức :
% ức chế =100%- [hàm lượng NOsample/hàm lượng NOLPS]*100
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Giá trị IC50 (nồng độ ức
chế 50% sự hình thành NO) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4
2.3. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT
Mẫu thân, lá P. foetida (5.0 kg) được thái nhỏ, phơi trong bóng râm, nghiền nhỏ thành bột, chiết siêu âm với methanol (MeOH) 15L (3 lần, mỗi lần 2 h) sau đó loại bỏ dung mơi dưới áp suất thấp thu được cặn chiết MeOH (PF, 150.0 g). Cặn chiết này được phân bố đều trong nước cất và lần lượt chiết với n- hexan, dichloromethane và ethyl acetate thu được các phân đoạn n-hexan (PF1, 12g), dichloromethane (PF2, 9 g), ethyl acetate (EtOAc) (PF3, 15.0 g) và nước (PF4).
Phần nước PF4 được cất loại bỏ dung môi hữu cơ, sau đó đưa lên cột diaion HP-20, loại đường bằng nước, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH:H2O
(0:100 → 100:0, v/v) lần lượt thu được 2 phân đoạn PF4A-PF4B. Phân đoạn
được chạy sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi dichloromethane:MeOH (30:1
→ 1:1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là PF4B1-PF4B5.
Phân đoạn PF4B2 (5g) được phân tách trên cột YMC RP-18 với hệ dung môi Acetone:H2O (1:2, v/v) thu được 6 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là PF4B2A – PF4B2F. Phân đoạn PF4B2A (120 mg) được phân tách trên hệ thống HPLC, sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm × 20 mm, 4 μm, 8 nm), rửa giải với dung dịch acetonitrile 14% trong nước, tốc độ chảy là 3 mL/phút, thu được hợp chất 6
(17 mg). Hợp chất 7 được tinh chế tư phân đoạn PF4B2C (80 mg) bằng hệ
thống HPLC sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm × 20 mm, 4 μm, 8 nm), rửa giải với dung dịch acetonitrile 20% trong nước, tốc độ chảy là 3 mL/phút. Phân đoạn PF4B2D (105 mg) được tách trên hệ thống HPLC, sử dụng cột J’sphere ODS H- 80 (250 mm × 20 mm, 4 μm, 8 nm), rửa giải với dung dịch acetonitrile 20% trong nước, tốc độ chảy là 3 mL/phút, thu được hợp chất 5 (5 mg). Phân đoạn PF4B2F (70 mg) được tiếp tục phân tách trên hệ thống HPLC, sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm × 20 mm, 4 μm, 8 nm), rửa giải với dung dịch acetonitrile 20% trong nước, tốc độ chảy là 3 mL/phút, thu được hợp chất 3 (3.5 mg) và hợp chất 4 (5mg).
Sử dụng cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là acetone/nước (1/4, v/v) để phân tách phân đoạn PF4B5 (2.5 g) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn, ký hiệu tư PF4B5A-PF4B5C. Phân đoạn PF4B5A (150 mg) được phân tách trên hệ thống HPLC, rửa giải với dung dịch acetonitrile 17% trong nước, tốc độ chảy là 3 mL/phút, thu được hợp chất 1 (23.0 mg). Cuối cùng, hợp chất 2 được tinh chế tư phân đoạn PF4B5C (180 mg) bằng cột sephadex với hệ dung môi rửa giải là methanol/water (1/1 v/v). Như vậy, tư cặn chiết methanol của loài Lạc tiên, đã phân lập được 7 hợp chất sạch.
D
D
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Lạc tiên
2.4. THƠNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
2.4.1. Hợp chất 1: Isoschaftoside
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
Cơng thức phân tử: C26H28O14. Khối lượng phân tử: 564.
[�]25-35.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 215-217 oC
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.1
2.4.2. Hợp chất 2: Apigenin 6,8-di-C-β-D-glucopyranoside
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
Cơng thức phân tử: C27H30O15. Khối lượng phân tử: 594.
[�]25 +65.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 181-183 oC.
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.2
2.4.3. Hợp chất 3: Vitexin 2ʹʹ-O-β-D-glucopyranoside
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
D
D
D
D
D
[�]25 +58.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 190-192 oC.
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.3
2.4.4. Hợp chất 4: Vitexin 2ʹʹ-xyloside
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
Cơng thức phân tử: C26H28O14. Khối lượng phân tử: 564.
[�]25 +45.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 190-192 oC.
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.4
2.4.5. Hợp chất 5: Vitexin
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
Công thức phân tử: C21H20O10. Khối lượng phân tử: 432.
[�]25 +12.0 (c 0.1, DMSO); Nhiệt độ nóng chảy: 178-180 oC.
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.5
2.4.7. Hợp chất 6: Luteolin
Chất bột vơ định hình, màu vàng.
Cơng thức phân tử: C15H10O6. Khối lượng phân tử: 286.
[�]25 0 (c 0.1, DMSO).
1H-NMR (DMSO) và 13C-NMR (DMSO): Xem bảng 3.6
2.4.7. Hợp chất 7: Edulilic acid
Chất bột vơ định hình, màu trắng.
Công thức phân tử: C13H18O8. Khối lượng phân tử: 302.2790
[�]25 -108 (c 0.1, MeOH).
1H-NMR (CD3OD) và 13C-NMR (CD3OD): Xem bảng 3.7
2.5. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA CÁC HỢP CHẤT
Tất cả các hợp chất phân lập được tư lồi P. foedida được đánh giá hoạt tính kháng viêm thơng qua cơ chế ức chế sự sản sinh NO của tế bào macrophage RAW 264.7.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT
Tư loài cặn chiết MeOH của loài Lạc tiên (P. foedida) đã phân lập và xác định cấu trúc được 7 hợp chất sạch.
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ loài P. foetida.
3.1.1. Hợp chất 1: Isoschaftoside
Hình 3.2. Cấu trúc hóa học của 1
Hợp chất 1 phân lập được dưới dạng chất bột vơ định hình, màu vàng.
Trên phổ 1H-NMR của 1 xuất hiện 2 tín hiệu doublet tại δH 8.02 (2H, d, J = 8.5
Hz) và
hiệu singlet tại δH 6.79 được gán cho H-3 của khung flavone. Bên cạnh đó, sự xuất hiện tín hiệu của 2 proton anome tại δH 4.70 (1H, d, J = 10.0 Hz), δH 4.76 (1H, d, J = 10.0 Hz) cho thấy sự có mặt của 2 phân tử đường C-glycoside gắn với phần khung flavone.
Trên phổ 13C-NMR và HSQC của 1 cho thấy xuất hiện tín hiệu của 26
carbon, bao gồm: 2 nhóm methylene tại δC 70.1, 61.2; 14 nhóm methine tại δC 74.2, 68.4, 73.8, 68.4, 73.2, 70.9, 78.9, 70.6, 81.8, 102.5, 128.9 x 2, 115.8 x 2; 9 carbon không liên kết trực tiếp với proton tại δC 164.0, 158.2, 108.1, 161.1, 105.1, 155.1, 103.6, 121.5, 161.1 và một nhóm carbonyl tại δC 182.2. Trong đó, 15 carbon thuộc về phần khung flavone, 11 carbon còn lại là của 2 phân tử đường. Trên phổ HSQC, một bộ tín hiệu của carbon tại δC 73.2, 70.9, 78.9, 70.6, 81.8 (5 CH), 61.2 (CH2) có tương tác lần lượt với các proton tại δH 4.76, 3.88, 3.30,
3.40,
3.25 và 3.75/3.51 đã chỉ ra sự có mặt của một phân tử đường C-glucopyranosyl. Vị trí của phân tử đường này tại C-8 được xác nhận bằng tương tác HMBC của H-1ʹʹ (δH 4.76) với C-7 (δC 161.1), C-8 (δC 105.1, C-9 (δC 155.1). Một bộ tín hiệu
khác của carbon tại δC 74.2, 68.4, 73.8, 68.4 (4 CH), 70.1 (CH2) có tương tác
với các proton tương ứng tại δH 4.70, 3.80, 3.46, 3.80 và 3.82/3.64 trên phổ
HSQC cho thấy có sự xuất hiện của một phân tử đường C-arabinopyranosyl. Vị
trí của phân tử đường này tại C-6 được khẳng định bằng các tương tác HMBC của H-1ʹʹʹ (δH 4.70) với C-5 (δC 158.2), C-6 (δC 108.1), C-7 (δC 161.1). Trên cơ sơ phân tích dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 cho phép xác định hợp chất này hoàn toàn trùng khớp với hợp chất isoschaftoside [36]. Đây là lần đầu tiên hợp chất isoschaftoside được phân lập tư loài Passiflora foetida L.
Bảng 3.1. Số liệu NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo
No. #,aδC [36] a,bδC a,cδH (mult., J in Hz)
2 164.2 164.0 - 3 102.6 102.5 6.79 (s) 4 182.4 182.2 - 5 161.1 158.2 - 6 108.1 108.1 - 7 158.3 161.1 - 8 105.1 105.1 - 9 155.2 155.1 - 10 103.7 103.6 -
1′ 121.5 121.5 - 2′, 6′ 129.0 128.9 8.02 (d, 8.5) 3′, 5′ 116.0 115.8 6.90 (d, 8.5) 4′ 161.3 161.1 - 5-OH 13.66 (s) 1′′ 73.8 74.2 4.70 (d, 10.0) 2′′ 68.5 68.4 3.80 (dd, 10.0, 9.0) 3′′ 74.3 73.8 3.46 (dd, 9.0, 3.0) 4′′ 69.7 68.4 3.80 (m) 5′′ 71.0 70.1 3.82 (d, 11.5) 3.64 (d, 11.5) 1′′′ 73.3 73.2 4.76 (d, 10.0) 2′′′ 70.6 70.9 3.88 (dd, 10.0, 9.0) 3′′′ 78.9 78.9 3.30 (t, 9.0) 4′′′ 70.3 70.6 3.40 (t, 9.0) 5′′′ 81.9 81.8 3.25 (m) 6′′′ 61.2 61.2 3.75 (br d, 12.0) 3.51 (dd, 12.0, 5.5)
Được đo trong a)DMSO-d6, b)125 MHz, c)500 MHz; δC of Isoschaftoside [36]
Hình 3.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1
Hình 3.6. Phổ HSQC của hợp chất 1
3.1.2. Hợp chất 2: Apigenin 6,8-di-C-β-D-glucopyranoside
Hình 3.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2
Hợp chất 2 phân lập được dưới dạng chất bột vơ định hình, màu vàng. Phổ NMR của hợp chất 2 rất giống với các dữ liệu NMR của hợp chất 1, ngoại trư sự xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm oxymethylene tại [δC 59.8/δH 3.64
(2H, brs)] và tín hiệu của một nhóm oxymethylene tại [δC 70.1/ δH 3.82/ 3.64
(2H)] của hợp chất 1 đã được thay thế bằng nhóm oxymethine tại (δC 81.9/ δH
3.25) của hợp chất 2. Thêm vào đó, hằng số tương tác lớn (J = 9.5 Hz) của hai proton anome tại δH 4.81, 4.75 và các tương tác HSQC của hai proton này lần lượt với carbon tại δC 74.0, 73.3 đã khẳng định sự có mặt của hai phân tử đường
C-glycoside. Như vậy phân tử đường C-arabinopyranose ơ hợp chất 1 đã được
thay thế bằng một phân tử C-glucopyranose ơ hợp chất 2. Ngoài ra, trên phổ 1H-
NMR của 2 vẫn có sự xuất hiện 2 tín hiệu doublet tại δH 8.02 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.90 (2H, d, J = 8.5 Hz), chỉ ra sự hiện diện của 1 nhóm phenyl thế para; 1 tín hiệu singlet tại δH 6.81 thuộc về H-3 của khung flavone.
Trên phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất 2 cho thấy xuất hiện tín hiệu
của 27 carbon, bao gồm: 2 nhóm methylene tại δC 59.8, 61.2; 15 nhóm methine tại δC 74.0, 71.9, 78.8, 70.5, 81.9, 73.3, 70.9, 77.8, 69.0, 80.8, 102.6, 129.0 x 2, 115.9 x 2; 9 carbon không liên kết trực tiếp với proton tại δC 164.0, 158.5,
107.5, 161.2, 105.3, 155.0, 103.8, 121.5, 161.2 và một nhóm carbonyl tại δC 182.3. Trong đó, 15 carbon thuộc về phần khung flavone, 12 carbon còn lại là
của 2 phân tử đường. Trên phổ HSQC, một bộ tín hiệu của carbon tại δC 74.0,
71.9, 78.8, 70.5, 81.9 (5CH), 59.8 (CH2) có tương tác lần lượt với các proton tại
δH 4.81, 3.50, 3.29, 3.40, 3.25, 3.64/3.64 và một bộ tín hiệu carbon khác tại δC
77.8, 69.0, 80.8, 61.2 có tương tác lần lượt với các proton tại δH 4.75, 3.88, 3.31, 3.39, 3.33, 3.51/3.76 một lần nữa khẳng định trong cấu trúc của hợp chất 2 có 2 phân tử đường C-glucopyranosyl. Vị trí của 2 phân tử đường này tại C-6 và C-8 được xác nhận bằng các tương tác HMBC của H-1ʹʹ (δH 4.81) với C-7 (δC 161.2), C-8 (δC 105.3, C-9 (δC 155.0), H-1ʹʹʹ (δH 4.75) với C-5 (δC 158.5), C-6 (δC 107.5),
C-7 (δC 161.2). Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 được so sánh với dữ liệu phổ của hợp chất apigenin 6,8-di-C-β-D-glucopyranoside và cho thấy có sự trùng khớp hồn toàn [37]. Như vậy hợp chất 2 được xác định là 6,8-di-C-β-D-
glucopyranoside.
Bảng 3.2. Số liệu NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo