Nghiên cứu tác dụng cộng hợp của cao chiết trùng thảo (cordyceps militaris) và huperzine a trong Định hướng Điều trị bệnh alzheimer

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

ĐẠI HỌC HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐẶNG NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A

TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A

TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

Người hướng dẫn 1 Người hướng dẫn 2

: QH.2018.Y : TS Hồ Ngọc Anh

: PGS.TS Bùi Thanh Tùng

Hà Nội - 2023

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các thầy, cô, anh, chị tại Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô của trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn TS Hồ Ngọc Anh, người Thầy đã tin tưởng giao đề tài cho em Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo trong quá trình làm khóa luận Những chia sẻ, kinh nghiệm quý báu của Thầy là hành trang giúp em hoàn thành khóa luận và phát triển trong sự nghiệp sau này Đề tài này nằm trong khuôn khổ dự án “Phát triển sản phẩm hỗ trợ phòng, điều trị bệnh sa sút trí tuệ với thành phần chính là hoạt chất huperzine A và cao chiết Trùng thảo” cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam do ThS Hồ Thị Thương làm chủ nhiệm dự án

Em xin cảm ơn PGS.TS Bùi Thanh Tùng¸ chủ nhiệm bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy đã hết lòng giúp đỡ, chỉnh sửa tận tình để em hoàn thành khóa luận này Thầy cũng chia sẻ rất nhiều kiến thức bổ ích trong quá trình học tập và làm khóa luận của em

Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị tại viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, bộ môn Dược lý và các thầy cô trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp

Trong quá trình làm khóa luận không tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận được sự góp ý của các Thầy cô để khóa luận của em được tốt hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2023 Sinh viên

Đặng Nhật Minh

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 6-OHDA 6-hydroxydopamine

ACTI acetylthiocholine iodid

AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionate ATP Adenosine triphosphate

ĐTHT Đông trùng hạ thảo

DTNB acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic HCS Sàng lọc hàm lượng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSA Highest Single Agent (Tác nhân đơn cao nhất) HTS Ống nghiệm xét nghiệm sàng lọc

IC50 Nồng độ ức chế 50% IC50 Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hấp thụ hồng ngoại LD50 Liều gây chết 50% LDL Cholesterol tỉ trọng thấp MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

NGF Yếu tố tăng trưởng thần kinh NMDA N-methyl-D-aspartate

NSAID Thuốc giảm đau chống viêm không steroid PBS Phosphate-bufered saline

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của một số nucleotide trong trùng thảo 6

Hình 1.2 Cấu trúc của Huperzine A 11

Hình 1.3 Mô hình HSA để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc 19

Hình 2.1 Sắc ký đồ chuẩn mix adenosine và cordycepin 24

Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman 25

Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn adenosine 29

Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn cordycepin 30

Hình 3.3 Phổ UV của mẫu HupA 30

Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu HupA 31

Hình 3.5 Phổ UV của chất chuẩn huperzine A 31

Hình 3.6 Hoạt tính gây độc tế bào của 6-OHDA 34

Hình 3.7 Hoạt tính bảo vệ TBTK của các mẫu thử 35

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Chương trình rửa giải Gradient HPLC định lượng adenosine và cordycepin 23 Bảng 2.2 Chương trình chạy gradient HPLC đối với HupA 24 Bảng 2.3 Các tỷ lệ phối hợp giữa chất sạch Huperzine A và hỗn hợp A + C 27 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE của chất sạch Huperzine A, hỗn hợp A + C, donepezil 32

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNGMỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về trùng thảo 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại, tác dụng 3

1.1.2 Thành phần hóa học của trùng thảo 4

1.1.3 Tác dụng dược lý của trùng thảo 8

1.2 Tổng quan về huperzine A 10

1.2.1 Lịch sử huperzine A 10

1.2.2 Cấu trúc huperzine A 10

1.2.3 Tác dụng dược lý của huperzine A 11

1.3 Acetylcholine, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 13

1.3.1 Acetylcholine 13

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase 14

1.3.3 Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer 14

1.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 15

1.5 Tác dụng cộng hợp của các chất 16

1.5.1 Định nghĩa 16

1.5.2 Ý nghĩa của tác dụng cộng hợp giữa các thuốc 17

1.5.3 Mô hình đánh giá tác dụng cộng hợp giữa các thuốc 18

1.5.4 Phương pháp ô bàn cờ tổ hợp 20

CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Hóa chất và vật tư 22

2.3 Thiết bị 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp định lượng adenosine và cordycepin trong Trùng thảo 23

2.4.2 Phương pháp xác định độ tinh sạch của huperzine A bằng HPLC 24

2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase 25

2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp của hỗn hợp adenosine + cordycepin (A+C) và chất sạch huperzine A 26

2.4.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 27

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ 29

3.1 Kết quả định lượng adenosine và cordycepin từ cao chiết trùng thảo 29

3.2 Đánh giá độ tinh sạch của HupA 30

3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE, xác định tác dụng cộng hợp của các tỷ lệ phối trộn hỗn hợp A+C và chất sạch huperzine A 32

3.4 Đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 33

CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN 37

4.1 Về phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp của các hợp chất 37

4.2 Về kết quả đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

Kết luận 42

Đề xuất 42TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Sa sút trí tuệ (SSTT) là bệnh liên quan đến các rối loạn não, có ảnh hưởng đến khả năng suy nghĩ hoặc ghi nhớ của một người, dẫn đến sự suy giảm khả năng nhận thức đủ nghiêm trọng để cản trở cuộc sống hàng ngày Trong đó, Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, chiếm 60%-80% nguyên nhân sa sút trí tuệ

AD là nguyên nhân thứ 6 gây tử vong nói chung và là nguyên nhân thứ 5 gây tử vong ở người trên 65 tuổi Các đánh giá gần đây ước tính rằng trên toàn cầu có gần 8 triệu người phát triển chứng SSTT mỗi năm, sau mỗi bốn giây thì có thêm 1 trường hợp mắc chứng SSTT Năm 2015, chứng SSTT đã ảnh hưởng đến hơn 47 triệu người trên toàn thế giới, một con số ước tính sẽ tăng lên 76 triệu người vào năm 2030 và 145 triệu người vào năm 2050 Năm 2010, chi phí chăm sóc người SSTT trên toàn cầu là ước tính là 604 tỷ đô la Mỹ, chiếm 1% tổng sản phẩm quốc nội toàn cầu Đến năm 2030, chi phí chăm sóc cho những người mắc chứng SSTT trên toàn thế giới ước tính khoảng 1200 tỷ đô la Mỹ hoặc hơn, tổng số có thể làm suy yếu sự phát triển kinh tế và xã hội trên toàn cầu

Việt Nam chính thức bước vào giai đoạn già hóa dân số từ năm 2011 khi có 11% số dân là những người trên 60 tuổi Năm 2001, Viện Sức khỏe Tâm thần Quốc gia nghiên cứu ở Thái Nguyên cho biết tỷ lệ hiện mắc sa sút trí tuệ là 7,9% Năm 2005, Phạm Thắng và cộng sự cho thấy ở Ba Vì, tỷ lệ hiện mắc suy giảm nhận thức nhẹ là 1,4% và SSTT là 4,63% [1, 2] Theo điều tra dân số năm 2017, cả nước có 11 triệu người trên 60 tuổi chiếm khoảng 11,95% dân số, trong đó có khoảng gần 2 triệu người từ 80 tuổi trở lên

Hiện nay trên thị trường các nhóm thuốc điều trị và hỗ trợ điều trị Alzheimer và các bệnh SSTT chỉ nhắm vào 2 cơ chế chính là ức chế enzym thủy phân Acetylcholinesrase (AChE) và thuốc ngăn chặn N-methyl-D-aspartate (NMDA) Trong đó hiệu quả nhất là sử dụng phối hợp cả 2 cơ chế với hỗn hợp thuốc là donepezil và memantine, nhưng sự phối kết hợp này vẫn có rất nhiều tác dụng phụ, nguy hiểm đối với người sử dụng Ở Việt Nam, phần lớn thuốc điều trị bệnh SSTT và AD là biệt dược ngoại nhập với giá thành cao và có một số tác dụng phụ

Việt Nam là một trong những nước có mức độ đa dạng sinh học cao, nền y học cổ truyền Việt Nam có rất nhiều bài thuốc sử dụng các cây dược liệu để cải thiện và điều trị các bệnh về suy giảm trí nhớ, tăng tuần hoàn máu não, giúp an

thần Huperzine A (HupA) đang được sử dụng như một chất hỗ trợ điều trị các bệnh SSTT và AD mà không đem lại các tác dụng phụ như các chất đang được lưu hành [3] Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng 58% bệnh nhân Alzheimer cải thiện đáng kể cả chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200µg HupA mỗi ngày Mặc dù HupA có cơ chế tác động là ức chế enzym thủy phân acetylcholinesrase để hỗ trợ phòng và điều trị bệnh AD nhưng hướng nghiên cứu này vẫn tồn tại vài nhược điểm đó là khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi sự tổn thương và chết [4] Đông trùng hạ thảo (Trùng thảo, ĐTHT) là loại nấm dược liệu tự nhiên nổi tiếng và truyền thống có tác dụng bồi bổ sức khỏe, trong đó trùng thảo cũng được báo cáo về hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh [5] Tuy nhiên, những nghiên cứu về phối kết hợp của chúng trong tăng cường trí nhớ, hỗ trợ phòng và điều trị bệnh sa sút trí tuệ và Alzheimer chưa hề được quan tâm nghiên cứu tại Việt Nam Trong khi đó, tại Hàn Quốc, châu Âu, các quốc gia Mỹ la tinh, rất nhiều loại thực phẩm chức năng đã được phát triển giúp tăng cường trí nhớ và hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh này Dựa trên các cơ sở phân tích tài liệu nghiên cứu đã công bố về tác dụng của huperzine A và trùng thảo trong việc bảo vệ tế bào thần kinh, tăng cường trí nhớ, hỗ trợ phòng và điều trị bệnh sa sút trí tuệ và Alzheimer, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng cộng của cao chiết Trùng thảo và huperzine A trong định hướng điều trị bệnh Alzheimer” với các mục tiêu sau:

- Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng cộng của huperzine A và hỗn hợp chất chuẩn adenosine, cordycepin bằng phương pháp ô bàn cờ

- Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh của hỗn hợp huperzine A và cao chiết Trùng thảo

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về trùng thảo

1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại, tác dụng

Trùng thảo là một loại nấm dược liệu quý truyền thống nổi tiếng có nguồn gốc từ Trung Quốc, tên tiếng anh là Cordyceps Không chỉ ở Trung Quốc, một số loài Cordyceps đã được sử dụng làm thuốc ở Nhật Bản, Hàn Quốc và một số nước Đông Á nhờ tác dụng của những thành phần như adenosine, cordycepin, exopolysacharide (EPS) Người Tây Tạng gọi là yarsa gumba, người Trung Quốc gọi là dong chong xia cao, có nghĩa là mùa đông là sâu, mùa hè là cây cỏ Loài nấm này còn được người Ấn Độ gọi là “Keera Jhar” (nghĩa là thảo mộc côn trùng)/ Keeda ghass/Jeevan buti/Chyou kira/Sanjeevani buti hay còn được ví như Viagra của dãy Himalaya [6] Người Bhutia thường sử dụng 1 mẩu trùng thảo với cùng 1 cốc rượu, ngâm trong 1giờ sau đó uống mỗi buổi sáng để bồi bổ Trùng thảo có tác dụng kéo dài tuổi thọ, rối loạn cương dương, cải thiện chứng suy nhược cơ thể, kháng khối u, tốt cho những người bệnh gan, thận,… [6] Trùng thảo có thể được dùng đơn độc như một vị thuốc hoặc phối hợp với các loại thảo dược khác

Trùng thảo không phải sâu, cũng không phải cây cỏ Bản chất của nó là dạng ký sinh của loài nấm Cordyceps sinensis thuộc nhóm nấm Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm thuộc chi Thitarodes Loài nấm này nhiễm vào cơ thể sâu bướm qua đường miệng, bào tử của chúng nảy mầm và sử dụng cơ thể sâu bướm như là môi trường dinh dưỡng cho hệ sợi nấm phát triển Khi sợi nấm lan toàn cơ thể, con sâu bướm chết đi, và trùng thảo giữ nguyên hình dạng như một con sâu trong mùa đông Mùa hè trên cao nguyên đến mang theo khí hâụ nóng ẩm, loài nấm này tiến hành phát tán bào tử sinh sản để phát triển nòi giống của chúng bằng cách mọc quả thể (quả thể được biết như là các mũ nấm để nấu ăn) Tuy nhiên quả thể của trùng thảo không có dạng tán hình nấm, mà quả thể của chúng là dạng sợi mảnh, hình trụ, trông giống như chiếc sừng

Hai loài Cordyceps được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris Cordyceps sinensis nổi tiếng hơn cả bởi nó đã được sử dụng khoảng 2000 năm ở Trung Quốc nhưng tài liệu đầu tiên ghi chép về C sinensis được tìm thấy vào thời nhà Thanh (Trung Quốc) vào năm 1757

C sinensis thường ký sinh trên vật chủ là ấu trùng thuộc họ Hepialidae và xác ấu trùng, cơ thể giống con tằm, dài từ 3 – 5cm với đường kính khoảng 3 – 8mm,

màu vàng đậm đến nâu vàng với khoảng 20 – 30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn và có 8 đôi chân, nhưng 4 đôi ở trung tâm là rõ nhất C sinensis ký sinh vật chủ và phát triển một quả thể duy nhất mọc trên đầu vật chủ trông giống chiếc sừng, dài 4 – 7cm và đường kính khoảng 3mm

Trong khi đó C militaris phát triển quả thể màu vàng cam đến màu đỏ cam, dài khoảng 5cm, dẹt và hơi cong

Vật chủ trong tự nhiên của C militaris gồm ấu trùng (sâu bướm) và nhộng của lepidopteran (Euprepia caja, Bombyx mori, Cymatophora duplaris, Cocytodes coerulea,…), các loại côn trùng như coleoptera (Lachnosterna quercina, Ips sexdentatus, Tenebrio molitor), hymenoptera (Cimbex similis), diptera (Tipula paludosa) Nhờ khả năng ký sinh trên một phổ rộng vật chủ mà các vùng phân bố địa lý của C militaris rất đa dạng trên khắp thế giới Người ta đã tìm thấy C militaris từ các vùng có độ cao so với mặt nước biển từ 0 – 2000m Trong khi đó C sinensis chỉ được tìm thấy ở những khu vực có độ cao từ 3540 – 5050m so với mặt nước biển (Nepal), từ 3200 – 4200m ở Ấn Độ, từ 4200 – 5200 ở Bhutan, từ 3000 – 5000m ở Tibet

Trong nuôi cấy, vật chủ thường được sử dụng cho C militaris thường là tằm Bombyx mori, hoặc Antherea pernyi, Mamestra brassicae Với tỷ lệ nuôi cấy thành công ở nhộng tằm cao hơn so với ấu trùng của nó Tuy nhiên nhược điểm của việc sử dụng côn trùng là khó xử lý và dễ bị nhiễm vi sinh vật, do vậy mà ngày nay người ta đã sử dụng các giá thể hữu cơ như bột đậu, gạo,… để thay thế trong sản xuất thương mại

1.1.2 Thành phần hóa học của trùng thảo 1.1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học chất quan trọng [7]

Acid amin

Năm 2008, một nghiên cứu của Huyn cho thấy trong quả thể nấm C.militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể

và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 - 15,06 mg/g (đối với quả thể) và 0,36 - 2,99 mg/g (đối với sinh khối) Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), acid glutamic (8,79 mg/g), proline (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) [8] Nghiên cứu của Chang và cộng sự thực hiện năm 2001 cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) [9]

Acid béo

Năm 2008, Hur đã thực hiện một nghiên cứu và cho thấy rằng quả thể nấm C militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối [10]

Adenosine và cordycepin

Adenosine và cordycepin được biết đến là hai hợp chất có giá trị dược liệu cao trong trùng thảo Hoạt chất chính trong C.sinensis là adenosine trong khi hoạt chất chính trong C.militaris là cordycepin Báo cáo của nhóm nghiên cứu của Liu năm 2015 cho biết C.sinensis khi nuôi trồng nhân tạo có thành phần cordycepin thấp dưới ngưỡng phát hiện [11] Năm 2017, nghiên cứu của Xia và cộng sự chỉ ra rằng gen tổng hợp cordycepin có tên Cns1-Cns4 không có ở C.sinensis nhưng có ở C.militaris [12] Trên cây phát sinh chủng loại, 2 loài này thuộc hai nhánh khác nhau

Polysaccharide

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide: mannose và galactose Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Một số monosaccharide có trong nấm đông trùng hạ thảo như rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…

Các nucleotide

Nucleotide là một trong những thành phần có hoạt tính trong nấm trùng thảo, trong đó các hoạt chất adenosine, cordycepin được sử dụng là các hoạt chất để đánh giá chất lượng của trùng thảo Ngoài ra trong trùng thảo còn nhiều loại nucleotide khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosine (cấu trúc này được đưa vào các hợp chất

có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân đã bị nhiễm HIV như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này chưa tìm thấy được ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên

Công thức hóa học của cordycepin Công thức hóa học của adenosine

Công thức hóa học của guanosine Công thức hóa học của cytidine

Công thức hóa học của thymidine Công thức hóa học của uridine Hình 1.1 Công thức hóa học của một số nucleotide trong trùng thảo Các sterol

Các phytosterol trong trùng thảo (cholesterol, campesterol, β sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị, phòng chống ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư trực tràng [13]

Các nhóm hoạt chất khác

Trùng thảo có chứa các loại acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic, arginine…và các hợp chất kiểu polyamine là cadaverine, spermidine, spermine…, các

cyclodipeptide như cordycedipeptide A Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus và vi khuẩn Theo kết quả nghiên cứu của Filipa và các cộng sự vào năm 2013, chiết xuất methanol của C militaris đã được thử nghiệm về tính chất chống oxy hoá, kháng khuẩn, chống nấm và chống tăng sinh ở các dòng tế bào khối u ở người [14] Mannitol (2,01 g/100 g) và trehalose (24,71g/100g) là các loại đường tự do trong C militaris Các acid béo không bão hòa (68,87%) chiếm ưu thế hơn các acid béo bão hòa (23,40%) và δ-tocopherol là dạng duy nhất của vitamin E được phát hiện (55,86 μg/100 g) Các acid hữu cơ được tìm thấy trong nấm này là acid oxalic, citric và fumaric (lần lượt là 0,33, 7,97 và 0,13 g/100 g) Chiết xuất methanol của C militaris đã ức chế lipid peroxidation, làm giảm sự phát triển của các gốc tự do Chiết xuất này cũng cho thấy tính kháng khuẩn và chống nấm mạnh Cuối cùng, chất chiết xuất từ C militaris có thể ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư biểu mô tế bào ung thư người (MCF-7, ung thư vú), NCI-H460 (non-small lung), HCT-15 (đại tràng) và heLa (cổ tử cung)

1.1.2.2 Tại Việt Nam

Theo Đỗ Tất Lợi, trùng thảo chứa 25-32% chất protide Khi thủy phân bởi các enzym trong cơ thể sẽ cho ra các loại acid amin khác nhau như glutamic, proline, histidine, valine, oxyvaline, arginine, phenyllalanine, analine, Ngoài ra, còn có 8,4% chất béo trong đó acid béo no chiếm 13%, axit không no chiếm 82,2% Người ta còn chiết được acid cordycepic chứng minh là có D-mannitol Từ Cordyceps militaris (ĐTHT nuôi dưỡng trong môi trường), người ta còn chiết được cordycepin 3’ deoxyadenosine (C10H13O3N5) [15]

Theo Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, hoạt chất sinh học 3’deoxyadenosin có vai trò tương tự như thuốc tổng hợp hóa học acryclorvir trong điều trị các bệnh virus, nhiễm khuẩn và ung thư [16]

2’-Các phân tích hóa học cũng cho thấy trong sinh khối của trùng thảo có 17 acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na…) Quan trọng hơn là trong sinh khối trùng thảo có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị dược liệu thần kỳ, trong đó phải kể đến acid cordiceptic, cordycepin, adenosine, hydroxyethyl-adenosine, đáng chú ý hơn là nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs)

Bên cạnh đó, trùng thảo còn chứa 28 acid béo bão hòa và không bão hòa, chất dẫn xuất của chúng và các acid hữu cơ khác (oleic, linoleic, palmitic và acid

stearic); các loại vitamin như B1, B2, B12, E, và K và các chất vô cơ như K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zr, đặc biệt là Selen (Se)-một chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp ngăn ngừa ung thư Ngoài ra, nghiên cứu cũng cho thấy, các polysaccharid trong trùng thảo có tác dụng hiệu quả trong điều tiết đường trong máu và hiệu quả chống ung thư; chống di căn và tăng cường miễn dịch

Các nghiên cứu cũng cho thấy một số hợp loại sterol trong trùng thảo như ergosterol, Delta- 3 ergosterol, ergosterol peroxid, 3-sitosterol, daucosterol và campassterol… có liên quan đến steroid chống rối loạn tình dục [16]

1.1.3 Tác dụng dược lý của trùng thảo 1.1.3.1 Theo Y học cổ truyền [15]

- Trùng thảo Trung Quốc là một loại thuốc được ghi nhận trong Bản thảo cương mục thập di (năm 1765)

- Trùng thảo Trung Quốc có vị ngọt, tính ôn, quy vào kinh phế và thận

- Có tác dụng ích phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, chữa hư lao sinh ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh

1.1.3.2 Theo y học hiện đại

a Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất từ C.militaris có thể làm giảm tác dụng gây độc thần kinh của các mảng beta-amyloid (Aβ), đặc trưng của bệnh Alzheimer Năm 2010, Chen và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu cho thấy các loài trùng thảo có thể làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) do Aβ gây ra, được biết là gây ra stress oxy hóa và tổn thương tế bào thần kinh [17] C.militaris có thể làm giảm biểu hiện của các cytokine gây viêm, được biết là góp phần gây viêm thần kinh và thoái hóa thần kinh Ngoài ra, trùng thảo cũng được chứng minh là có tác dụng tăng cường nhận thức Nghiên cứu cho thấy C.militaris có thể tăng cường hoạt động của choline acetyltransferase (ChAT) và tăng nồng độ acetylcholine (ACh) trong não Thêm vào đó, loài trùng thảo còn được chứng minh là có tác dụng chống viêm và chống oxy hóa, có thể bảo vệ tế bào thần kinh khỏi bị hư hại bằng cách ức chế sản xuất các cytokine gây viêm, chẳng hạn như interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α) và tăng hoạt động của các enzym chống oxy hóa, chẳng hạn như superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT) [18]

Những phát hiện này cho thấy trùng thảo có tiềm năng được sử dụng như một tác nhân điều trị cho một loạt các rối loạn thoái hóa thần kinh

b Ức chế sự phát triển của khối u

Thí nghiệm trong ống nghiệm chứng minh rằng trùng thảo có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư ở người, bao gồm ung thư phổi, đại tràng, gan và ung thư da [19-21] Ở các thí nghiệm trên chuột cũng cho thấy trùng thảo có tác dụng chống khối u đối với ung thư hạch, u ác tính và ung thư phổi [22-24] Công dụng làm chậm sự phát triển các khối u của trùng thảo là yếu tố quan trọng giúp hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến phương pháp hóa trị, xạ trị và tăng tốc độ hồi phục hậu phẫu thuật

c Cải thiện hoạt động thể chất

Trùng thảo được cho là làm tăng cơ thể sản xuất phân tử adenosine triphosphate (ATP), chất cần thiết để cung cấp năng lượng cho cơ bắp Điều này có thể cải thiện cách cơ thể sử dụng oxi, đặc biệt khi hoạt động thể chất [25]

d Điều hòa đường huyết

ĐTHT có thể giữ cho lượng đường trong máu ở mức khỏe mạnh bằng cách bắt chước hoạt động của insulin Trong một số nghiên cứu trên chuột mắc bệnh tiểu đường, ĐTHT đã được chứng minh là làm giảm lượng đường trong máu [26-28] Một số bằng chứng cho thấy rằng chúng cũng có thể bảo vệ chống lại bệnh thận, một biến chứng phổ biến của bệnh tiểu đường Trong một đánh giá của 22 nghiên cứu bao gồm 1.746 người bị bệnh thận mãn tính, những người dùng bổ sung Cordyceps đã cải thiện chức năng thận [29]

e Lợi ích đối với sức khỏe tim mạch

Khi nghiên cứu nổi lên về tác dụng của trùng thảo đối với sức khỏe tim mạch, lợi ích của nấm ngày càng trở nên rõ ràng Trên thực tế, trùng thảo được chấp thuận ở Trung Quốc để điều trị chứng loạn nhịp tim, một tình trạng nhịp tim quá chậm, quá nhanh hoặc không đều Một nghiên cứu cho thấy trùng thảo làm giảm đáng kể chấn thương tim ở chuột mắc bệnh thận mãn tính Tổn thương tim do bệnh thận mãn tính được cho là làm tăng nguy cơ suy tim, vì vậy giảm những tổn thương này có thể giúp tránh được kết quả này [30] Các nhà nghiên cứu cho rằng những phát hiện này là do hàm lượng adenosine của trùng thảo Adenosine là một hợp chất tự nhiên có tác dụng bảo vệ tim [31] Trùng thảo cũng có thể có tác dụng có lợi đối với mức cholesterol Nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng trùng thảo làm giảm

cholesterol tỉ trọng thấp (LDL) “có hại” LDL có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim bằng cách dẫn đến sự tích tụ cholesterol trong động mạch của bạn Tương tự, Cordyceps đã được chứng minh là làm giảm mức chất béo trung tính ở chuột [32, 33]

1.2 Tổng quan về huperzine A

1.2.1 Lịch sử huperzine A

Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) và các cây khác cùng chi được sử dụng để trị bệnh sa sút trí tuệ và tâm thần phân liệt ở Trung Quốc Đầu những năm 1980, các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm kiếm các loại thuốc mới để điều trị bệnh nhược cơ Lycopodium alkaloid chiết xuất từ các loài Lycopodium (sl) là mục tiêu thuốc dẫn đầu dựa trên việc sử dụng truyền thống các loại dược liệu có chứa chúng [34] Các nghiên cứu dược lý in vitro và in vivo đã chứng minh rằng Lycopodium alkaloid tạo ra tác dụng nhất định trong điều trị các bệnh ảnh hưởng đến hệ thống tim mạch hoặc thần kinh cơ, hoặc có liên quan đến hoạt động của enzym cholinesterase Những alkaloid này đã được chứng minh là có tác dụng tích cực đối với học tập và trí nhớ [35, 36] Trong số này, huperzine A (HupA), được phân lập từ cây Huperzia serrata của nhà khoa học Trung Quốc Liu và các đồng nghiệp là hợp được biết đến nhiều nhất và có hiệu quả nhất HupA đã được đánh giá rộng rãi bởi người Trung Quốc về hoạt tính sinh học, đặc biệt là đối với hoạt động đối với các cholinesterase và điều trị bệnh Alzheimer (AD)

1.2.2 Cấu trúc huperzine A

Phân tử huperzine A cấu tạo gồm: Một tetrahydroquinolinon, cầu 3 carbon, exocyclic ethyliden, và nhóm amino Công thức phân tử C15H18N2O, trọng lượng phân tử 242, đồng phân quang học trong cây (-)-HupA là có hoạt tính HupA có độ hấp thu UV cực đại ở bước sóng 231 nm và 313 nm; Phổ IR có các đỉnh hấp thu 3180, 1650, 1615, 1550 cm-1 HupA là Lycopodium alkaloid loại lycodin với vòng C mở và mất 1 nguyên tố carbon [35] Có hơn 200 loại Lycopodium alkaloid đã được báo cáo, tuy nhiên chúng hoặc là không có hoạt tính kháng AChE hoặc có nhưng kém hơn HupA [35]

Hình 1.2 Cấu trúc của Huperzine A

Các loài trong họ Thạch tùng đã được công bố cũng có khả năng cung cấp nguồn HupA là [37]:

• Huperzia aqualupiana (Spring) Rothm • Huperzia carinata (Desv.ex Poir.) Trevis • Huperzia elmeri (Herter) Holub

• Huperzia mirabilis (Willd.) Holub • Huperzia ovalifolia Ching

• Huperzia phlegmaria (L.) Rothm

• Huperzia phlegmarioides (Gaudich.) Rothm • Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis

• Huperzia tetrasticha (Kunze) Holub • Huperzia varia (R.Br.) Trevis • Huperzia vrieseana (Spring) Rothm

1.2.3 Tác dụng dược lý của huperzine A a Ức chế enzym acetylcholinesterase

Huperzine A là một chất ức chế mạnh và chọn lọc acetylcholinesterase Nồng độ ức chế 50% (IC50) của HupA chống lại acetylcholinesterase ở vỏ não chuột in vitro được xác định là khoảng 82 nM [38] Giá trị này lớn hơn so với (±)-donepezil (10 nM) và ít hơn so với tacrine (93 nM) Qua so sánh, huperzine A có tác dụng ức chế chọn lọc gấp 900 lần đối với AChE so với Butyrylcholinesterase (BuChE) Đối với donepezil và tacrin thì tính chọn lọc này thấp hơn HupA Sự chọn

lọc theo hướng AChE hơn BuChE hcó thể giúp làm giảm bớt tác dụng phụ không mong muốn của hiệu ứng liên quan đến hoạt động ức chế BuChE [39]

Phân tích của Lineweaver-Burk cho thấy huperzine A là một chất ức chế cạnh tranh của AChE Dạng (-) HupA là dạng ức chế chủ yếu AChE và có tác dụng mạnh hơn ít nhất 50 lần so với các đồng phân (+) HupA [40] Cấu trúc AChE tạo phức với HupA, trong đó có một sự tương tác mạnh mẽ tích cực giữa nhóm amin của HupA và vòng thơm của Trp84 và Phe330 trong các vị trí hoạt động Ái lực cao của (-)-HupA đối với acetylcholinesterase là cơ sở đề xuất cho việc sử dụng nó trong điều trị AD và như là một thuốc xử lý ngộ độc thần kinh do lân hữu cơ [39]

Mặc dù nguyên nhân chính xác của AD vẫn chưa được biết nhưng các triệu chứng AD có liên quan đến việc thiếu hụt acetylcholine [41], do vậy HupA đã được tiến hành nghiên cứu trong điều trị AD Từ năm 1996, HupA đã được chấp thuận cho điều trị AD mức độ nhẹ đến trung bình ở Trung Quốc HupA phổ biến trong thị trường thực phẩm chức năng ở Mỹ [41-43]

b Tác dụng bảo vệ thần kinh do phospho hữu cơ gây ra

Chất độc thần kinh phospho hữu cơ như soman và sarin được phân loại theo Liên Hợp Quốc là vũ khí phá hủy hàng loạt Cơ chế gây độc của nó thông qua việc phosphoryl hóa AChE không đảo ngược, các triệu chứng ngộ độc từ nhẹ đến nặng gồm từ suy hô hấp, tăng tiết đến các triệu chứng nghiêm trọng hơn bao gồm co giật và mất sức, ở liều cao hơn gây tử vong Chất có tác dụng ức chế AChE dùng giải độc trong trường hợp này như pyridostigmin Pyridostigmin phản ứng với AChE tạo thành cabamoyl enzym tạo ổn định tạm thời Trong vài giờ, tương tác này được đảo ngược để giải phóng AChE, việc đảo ngược này cung cấp một cơ chế để bảo vệ AChE trong khi các tác nhân thần kinh được chuyển hóa Tuy nhiên, pyridostigmin không thể vượt qua hàng rào máu não do đó nó chỉ tác dụng đối với AChE ngoại biên Trong khi đó một hợp chất tương tự là physostigmin thì có thể vượt qua hàng rào máu não Tuy nhiên, physostigmin gây ra tác dụng không mong muốn như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và chán ăn Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tiềm năng dự phòng HupA chống lại phospho hữu cơ Trong đó, một nghiên cứu liên quan đến xác định giá trị gây chết 50% (LD50) của soman cho chuột (tiêm dưới da) và thử nghiệm với HupA (500 mg/kg, tiêm trong phúc mạc) và physostigmin (100 mg/kg, tiêm bắp) Kết quả là HupA bảo vệ gấp 2 lần trong vòng 6 giờ, trong khi đó tiền xử lý với physostigmin chỉ bảo vệ 1,5 lần trong 2 giờ [44-46]

c Suy giảm độc tính β-amyloid

Mảng già ngoại bào là một dấu hiệu mô học trong não của bệnh nhân AD Các thành phần chính của mảng già là mảnh β-amyloid (Aβ) chứa các peptide ngắn gồm 36 - 43 acid amin Mảnh β-amyloid (Aβ) được hình thành bởi sự phân giải protein màng liên kết với tiền chất protein amyloid (APP) APP bị phân tách theo hai con đường Thứ nhất là α-secretase tạo mảnh α-APP hòa tan, mảnh này có tác dụng dinh dưỡng thần kinh và bảo vệ thần kinh Thứ hai là β / γ-secretase tạo mảnh Aβ không hòa tan Chính Aβ đã được báo cáo gây apoptosis dẫn đến chết tế bào Do đó, nhiều khả năng việc chữa trị AD là tìm cách sửa đổi con đường chuyển hóa thứ hai β/ γ-secretase [47, 48]

d Chống lại tác dụng độc thần kinh bởi glutamat

Các thụ thể glutamat quan trọng trong việc góp phần vào các hoạt động của synap và đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành trí nhớ và học tập Hai thụ thể chính, tên được đặt theo chất chủ vận liên kết với nó, là AMPA (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionate) và NMDA Gần đây, NMDA được chú ý nhiều do người ta cho rằng việc quá kích thích nó có liên quan đến nhiều bệnh thoái hóa thần kinh như động kinh và AD Một lượng lớn bằng chứng gợi ý rằng ức chế thụ thể NMDA hiệu quả trong sự suy giảm các bệnh này Sự kích thích quá mức các thụ thể NMDA dẫn đến sự xâm nhập của dòng ion calci, dòng calci tăng lên kèm theo một chuỗi các quá trình suy thoái tế bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào thần kinh và làm tiến triển của một số bệnh thoái hóa thần kinh Tác dụng đối kháng thụ thể NMDA của HupA đã được nghiên cứu và chứng minh tính hiệu quả của nó Trong một nghiên cứu khác, HupA được chứng minh là có hiệu quả trước và sau điều trị chống co giật do NMDA gây ra Do đó, hoạt động đối kháng NMDA của HupA là độc lập với hoạt động ức chế AChE [39, 49, 50]

1.3 Acetylcholine, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

1.3.1 Acetylcholine

Acetylcholine (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ Acetylcholine tìm thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều nhất ở vùng vận động) Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh

ACh được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym choline acetyl transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong các túi Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể ACh sau khi được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE Đây là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra choline và acid acetic Choline sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh Do đó, những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác dụng của ACh [51, 52]

Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức năng khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh Trong đó, ACh được xem là có liên quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer [53]

1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase

AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một rãnh sâu, được gọi là hẻm Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa, vị trí oxy-anion, vị trí anion và túi acyl [54] AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất Hoạt tính của nó mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc BuChE (enzym thủy phân ACh chủ yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [55]

1.3.3 Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất dẫn truyền ACh Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [52, 54] Ở bệnh nhân Alzheimer thấy có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh Tình trạng này gây suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh Giả thuyết về vai trò của hệ cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác giả Whitehouse và cộng sự Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực cho quá trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động

của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ đó cải thiện triệu chứng bệnh [53]

1.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh

Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh (neuroprotectivity) đóng một vai trò tiềm năng chiến lược trong sàng lọc các chất cho phòng và điều trị các bệnh SSTT và Alzheimer [56] Hoạt tính này có mục tiêu là một số dòng tế bào thần kinh, được thiết kế để giảm tính dễ bị tổn thương của các tế bào này đối với các bệnh thoái hóa thần kinh xảy ra khi mắc các bệnh SSTT và Alzheimer’s (AD) Các liệu pháp tiềm năng nhằm giảm sự tích tụ của amyloid [57] hoặc các quá trình viêm [58, 59] đã được thử nghiệm nhưng vẫn chưa mang lại kết quả rõ rệt Khả năng bảo vệ tế bào thần kinh có thể dẫn đến việc trì hoãn khởi phát hoặc làm chậm tiến triển của AD Sự khởi phát muộn của suy giảm triệu chứng trong phần lớn các trường hợp AD tạo ra một phản ứng đặc biệt cao, tạo cơ hội cho các chiến lược bảo vệ các tế bào thần kinh đạt được sự trì hoãn kéo dài khởi phát bệnh

Đã có rất nhiều bằng chứng cho thấy rằng sự tích tụ beta amyloid (βA) là một yếu tố chính ngay trong giai đoạn sớm của quá trình mắc bệnh AD, có thể lập luận rằng phương pháp điều trị giảm mức độ hoặc sự nồng độ sẵn có của các chất độc hại các dạng βA sẽ tạo thành ưu tiên cao, trở thành mục tiêu đầu tiên trong các chiến lược sàng lọc các chất cho phòng và điều trị AD Các phương pháp tiếp cận đầy hứa hẹn để giảm mức βA bao gồm ức chế tạo βA, giảm hòa tan cấp độ βA và nâng cao sự đào thải βA từ hệ thống thần kinh trung ương (CNS) [57, 60]

Thêm vào đó, những cơn đau thần kinh (Neuropathic pain) xuất hiện thường từ nguyên nhân chấn thương hoặc bệnh tật ảnh hưởng đến thần kinh trung ương hoặc ngoại vi hệ thống Hiện tượng này được đặc trưng bởi cơn đau tự phát được tạo ra bởi các kích thích không gây đau đớn (chứng loạn cảm) hoặc một phản ứng quá mức đối với các kích thích gây đau đớn (hyperalgesia) Đồng thời sự rút ngắn của các sợi liên kết thần kinh (neurite) cũng được xác định là nguyên nhân dẫn đến những cơn đau thần kinh [61] Nhiều căn nguyên, bao gồm bệnh tiểu đường, nghiện rượu, bệnh di truyền, bệnh chuyển hóa hoặc nhiễm trùng liên quan đến cơ chế bệnh sinh của hội chứng này [62], cùng với các tác dụng phụ gây bệnh của một số thuốc trên tế bào thần kinh cảm giác ngoại vi Những tác động bất lợi này bao gồm một trong những giới hạn liều lượng tác dụng phụ của nhiều loại thuốc kháng virus và kháng u [63, 64] Những loại thuốc này gây ra thoái hóa tế bào thần kinh trong các dây thần kinh cảm giác dẫn đến sự phát triển của bàn tay và bàn chân rối loạn cảm

giác, bao gồm tê và đau thần kinh thường bắt đầu ở các chi xa trong sự phân bố găng tay và tất [65] Thuốc giảm đau thông thường thuốc, chẳng hạn như opioid hoặc thuốc chống viêm không steroid (NSAID), không đủ để giảm đau do thần kinh và giảm đau do bệnh thần kinh gây ra vẫn là một phương pháp y tế cần vì thiếu thuốc giảm đau hiệu quả để điều trị tình trạng bệnh lý này Do đó, các loại thuốc như thuốc chống co giật (ví dụ: pregabalin hoặc gabapentin), serotonin cụ thể Thuốc ức chế tái hấp thu và thuốc chống trầm cảm ba vòng đang được kê đơn để điều trị điều kiện này, mặc dù tất cả đều kém hiệu quả [66] Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã phát triển một thông lượng cao kiểu hình sơ cấp mới trong ống nghiệm xét nghiệm sàng lọc (HTS) dựa trên khả năng giảm kích thích gây ra bởi các chất trung gian gây viêm trong dây thần kinh cảm giác trên dòng tế bào F11, một tế bào thần kinh của hạch rễ bất tử (DRG) Sử dụng phương pháp này, chúng tôi đã phát hiện ra 5 lần truy cập (protriptyline, nicardipine, nimodipine, felodipine và nitrendipine) từ thư viện Prestwick [67] Ở đây, chúng tôi hướng đến việc phát triển một xét nghiệm in vitro kiểu hình, trong trường hợp này là xét nghiệm thứ cấp sàng lọc hàm lượng cao (HCS) để đánh giá ảnh hưởng của thuốc đối với tác dụng ngoại ý gây bệnh (rút ngắn tế bào thần kinh) của thuốc kháng vi-rút và các chất chống khối u trên dòng tế bào DRG bất tử F11 Rilpivirine kháng vi rút và tác nhân chống khối u vincristine đã được lựa chọn vì chúng là thuốc nguyên mẫu sản xuất thuốc điều trị thần kinh nỗi đau ở con người [68]

Để đánh giá các đặc tính bảo vệ tế bào thần kinh (TBTK), phương pháp thực hiện cần phải rõ ràng về độc tính tế bào của nó trong yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) với dòng tế bào PC12 hoặc F11 Mẫu thử nghiệm được thêm vào tế bào và ủ trong 6 giờ Khả năng tồn tại của tế bào là được đánh giá bằng xét nghiệm WST-8 (bộ kit thử sức sống của tế bào bằng so màu và các tế bào có khả năng sống sót là 80% được xem xét cho các thí nghiệm tiếp theo Sau đó, bước tiếp theo là kiểm tra tác dụng bảo vệ thần kinh bằng cách ủ tế bào PC12 hoặc F11 bằng chất độc thần kinh, 6-OHDA (6-hydroxydopamine) (300 mM), trong 24 giờ đầu tiên và sau đó với cùng các chất chiết xuất ở cùng nồng độ Sau đó hiệu quả của chất có tác dụng bảo vệ được tính bằng phân số của khả năng tồn tại tế bào của 2 kết quả thử trên (mẫu thử và mẫu đã ủ chất gây độc tế bào)

1.5 Tác dụng cộng hợp của các chất

1.5.1 Định nghĩa

Trong y học hiện đại, việc điều trị các bệnh và tình trạng phức tạp thường đòi

hỏi một cách tiếp cận đa diện Một cách tiếp cận như vậy là liệu pháp phối hợp thuốc, bao gồm sử dụng nhiều loại thuốc kết hợp để điều trị một tình trạng duy nhất Ý tưởng đằng sau liệu pháp phối hợp thuốc là bằng cách sử dụng nhiều loại thuốc, tác dụng kết hợp của các loại thuốc có thể lớn hơn tổng tác dụng của từng loại thuốc Ý tưởng này được gọi là hiệu ứng cộng hợp

1.5.2 Ý nghĩa của tác dụng cộng hợp giữa các thuốc

Tác dụng cộng hợp trong điều trị phối hợp thuốc có tầm quan trọng rất lớn trong y học hiện đại vì nhiều lý do Một trong những lý do chính là nó cho phép điều trị các bệnh và tình trạng phức tạp mà không thể điều trị hiệu quả bằng một loại thuốc duy nhất Bằng cách sử dụng kết hợp nhiều loại thuốc, tác dụng kết hợp của các loại thuốc có thể khắc phục tình trạng kháng thuốc, giảm tác dụng phụ của từng loại thuốc và tăng hiệu quả của phương pháp điều trị tổng thể [69]

Việc phối hợp các thuốc ngày càng trở nên quan trọng trong việc điều trị bệnh Alzheimer vì các phương pháp điều trị bằng thuốc đơn lẻ phần lớn không hiệu quả trong việc làm chậm sự tiến triển của bệnh [70] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sự kết hợp của các loại thuốc nhắm vào các cơ chế khác nhau trong quá trình phát triển AD có thể dẫn đến tác dụng cộng hợp, giúp cải thiện hiệu quả và giảm độc tính Nghiên cứu của Chen và cộng sự năm 2017 đã phát hiện sự kết hợp của hai loại thuốc, một loại nhắm mục tiêu tích tụ mảng bám β-amyloid, loại còn lại nhắm vào mục tiêu thoái hóa protein Tau, hiệu quả hơn trong điều trị AD so với việc chỉ sử dụng một loại thuốc [71] Liệu pháp kết hợp đầy hứa hẹn trong AD là sử dụng kết hợp kháng thể beta kháng amyloid và chất ức chế phân tử nhỏ của beta-secretase (BACE1) Kháng thể beta chống amyloid hoạt động bằng cách loại bỏ các mảng beta amyloid khỏi não, trong khi chất ức chế BACE1 làm giảm quá trình sản xuất amyloid beta Sự kết hợp này đã cho thấy kết quả đầy hứa hẹn trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và hiện đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng [71]

Mặc dù liệu pháp phối hợp thuốc có nhiều hứa hẹn trong điều trị AD, nhưng có một số hạn chế cần được xem xét Một trong những hạn chế chính là khả năng tăng độc tính khi sử dụng nhiều loại thuốc Điều này là do mỗi loại thuốc đều có tác dụng phụ riêng và việc kết hợp nhiều loại thuốc có thể làm tăng nguy cơ tác dụng phụ

Hạn chế khác của liệu pháp phối hợp thuốc là khả năng tương tác giữa thuốc và thuốc Việc kết hợp nhiều loại thuốc có thể dẫn đến tương tác làm thay đổi hiệu quả và độc tính của thuốc, làm phức tạp quá trình điều trị [70]

1.5.3 Mô hình đánh giá tác dụng cộng hợp giữa các thuốc

Việc đánh giá tác dụng cộng hợp giữa các thuốc là quá trình phức tạp và đầy thách thức Một số mô hình đã được phát triển để giúp xác định sự tương tác giữa các hợp chất, trong đó có isobologram, mô hình độc lập Bliss và mô hình phụ thuộc Loewe,…

a Mô hình độc lập Bliss

Mô hình độc lập Bliss là một trong những mô hình sớm nhất được sử dụng để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc Mô hình giả định rằng tác dụng kết hợp của hai loại thuốc bằng tổng tác dụng riêng lẻ của chúng [72] Mô hình dựa trên tác dụng cộng thêm của thuốc, trong đó tác dụng kết hợp của hai loại thuốc tỷ lệ thuận với tổng tác dụng riêng lẻ của chúng Mô hình này rất dễ sử dụng và cung cấp ước tính nhanh về tác dụng hiệp đồng của thuốc Tuy nhiên, mô hình này có một số hạn chế, vì nó giả định rằng các loại thuốc không tương tác với nhau và do đó nó có thể không phản ánh chính xác tác dụng cộng hợp thực sự của các loại thuốc

b Mô hình cộng tính Loewe

Mô hình phụ thuộc Loewe là một phần mở rộng của mô hình độc lập Bliss và dựa trên cùng một khái niệm về cộng tính thuốc Mô hình giả định rằng tác dụng kết hợp của hai loại thuốc tỷ lệ thuận với tổng tác dụng riêng lẻ của chúng, nhưng cho phép tương tác giữa các loại thuốc [73] Mô hình tính toán chỉ số tương tác, là thước đo độ lệch so với tính cộng thêm và phản ánh tác dụng cộng hợp hoặc đối kháng của thuốc Chỉ số tương tác được tính bằng cách chia hiệu ứng quan sát được cho hiệu ứng mong đợi dựa trên Mô hình Độc lập Bliss Mô hình phụ thuộc Loewe cung cấp ước tính chính xác hơn về tác dụng cộng hợp của thuốc so với Mô hình Độc lập Bliss

c Mô hình HSA (Highest single Agent) [74, 75]

Mô hình HSA là một hình biểu diễn của mô hình phụ thuộc Loewe và được sử dụng để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc Mô hình biểu thị tác dụng quan sát được của thuốc trên biểu đồ so với liều lượng của thuốc và độ dốc của đường biểu thị chỉ số tương tác Mô hình này cung cấp một biểu diễn trực quan về tác dụng cộng hợp hoặc đối kháng của thuốc và rất hữu ích trong việc xác định mối quan hệ đáp ứng liều lượng của thuốc Mô hình HSA thường được sử dụng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng và là một công cụ quan trọng để đánh giá tác dụng hiệp đồng của thuốc trong giai đoạn đầu phát triển thuốc

Hình 1.3 Mô hình HSA để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc d Nguyên lý tác dụng trung bình

Nguyên tắc tác dụng trung bình là một mô hình toán học được sử dụng để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc Mô hình này dựa trên khái niệm về mối quan hệ liều lượng-đáp ứng và giả định rằng tác dụng kết hợp của hai loại thuốc tỷ lệ thuận với tích của các tác dụng riêng lẻ của chúng [76] Mô hình này dựa trên ý tưởng rằng liều gây chết trung bình (LD50) của một tổ hợp thuốc bằng với tích của LD50 riêng lẻ của mỗi loại thuốc Nguyên tắc hiệu quả trung bình cung cấp một công cụ hữu ích để đánh giá tác dụng hiệp đồng của thuốc và đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu tiền lâm sàng

e Mô hình chỉ số kết hợp (CI)

Mô hình CI dựa trên nguyên tắc phân tích liều lượng tác dụng, được sử dụng để định lượng mối quan hệ liều lượng đáp ứng của một loại thuốc Mô hình CI giả định rằng tác dụng kết hợp của hai loại thuốc bằng tổng tác dụng riêng lẻ của chúng khi hai loại thuốc hoạt động độc lập Khi tác dụng kết hợp của hai loại thuốc lớn hơn tổng tác dụng riêng lẻ của chúng, các loại thuốc đó được coi là có tác dụng cộng hợp

Giá trị CI là thước đo định lượng về sự tương tác giữa hai loại thuốc Giá trị CI nhỏ hơn 1 biểu thị tác dụng cộng hợp, giá trị CI bằng 1 biểu thị tính cộng thêm và giá trị CI lớn hơn 1 biểu thị tính đối kháng Mô hình CI có thể được sử dụng để đánh giá tác dụng cộng hợp của hai loại thuốc bất kỳ, bất kể cơ chế hoạt động của chúng

Một ưu điểm của mô hình CI là cung cấp một thước đo định lượng về tương tác thuốc, cho phép đánh giá khách quan hơn về tác dụng cộng hợp của thuốc Ngoài ra, mô hình CI có thể được sử dụng để xác định liều lượng tối ưu của từng loại thuốc trong liệu pháp phối hợp, có thể cải thiện hiệu quả điều trị và giảm nguy cơ tác dụng phụ Tuy nhiên, hạn chế là mô hình giả định rằng tác dụng của hai loại

thuốc là độc lập với nhau Giả định này có thể không phải lúc nào cũng đúng, vì tác dụng của một loại thuốc có thể ảnh hưởng đến tác dụng của loại thuốc kia Một hạn chế khác là mô hình CI chỉ đo lường sự tương tác giữa hai loại thuốc và không tính đến tác dụng của các loại thuốc bổ sung trong liệu pháp phối hợp [77]

1.5.4 Phương pháp ô bàn cờ tổ hợp

Xét nghiệm bàn cờ là một kỹ thuật phòng thí nghiệm được sử dụng rộng rãi, cung cấp đánh giá toàn diện và định lượng về tương tác thuốc Trong xét nghiệm này, thuốc được pha thành các nồng độ khác nhau và kết hợp theo mô hình bàn cờ 96 giếng Sau đó, đĩa 96 giếng được ủ và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của từng loại thuốc và sự kết hợp thuốc được xác định MIC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của thuốc ức chế sự phát triển của vi sinh vật hoặc dòng tế bào [78]

Trong những năm gần đây, phương pháp ô bàn cờ đã được áp dụng để nghiên cứu sự tương tác giữa các loại thuốc để điều trị các bệnh khác nhau, bao gồm cả AD Trong AD, xét nghiệm bàn cờ được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác giữa các loại thuốc nhắm vào các khía cạnh khác nhau của bệnh, chẳng hạn như tập hợp Aβ, tăng phospho hóa tau và viêm thần kinh

Tập hợp Aβ là một dấu hiệu đặc trưng của bệnh lý AD và một số loại thuốc đã được phát triển để nhắm mục tiêu vào quá trình này Một số nghiên cứu đã sử dụng xét nghiệm bàn cờ để nghiên cứu sự tương tác giữa các loại thuốc ngăn chặn việc sản xuất và Aβ Ví dụ, một nghiên cứu của Lopez vào năm 2019 [79] đã sử dụng thử nghiệm bàn cờ để nghiên cứu sự tương tác giữa GSI semagacestat và BSI verubecestat Một nghiên cứu khác của Jawhar vào năm 2011 đã sử dụng xét nghiệm bàn cờ để nghiên cứu sự tương tác giữa kháng thể kháng Aβ và chất ức chế oligome Aβ [80] Kết quả cho thấy rằng sự kết hợp của hai loại thuốc có tác dụng hiệp đồng trong việc giảm Aβ trong mô hình chuột của AD

Tăng phospho hóa Tau là một cơ chế của bệnh lý AD và một số loại thuốc đã được phát triển để nhắm mục tiêu vào quá trình này Ví dụ, chất ức chế kinase và chất ổn định vi ống ngăn chặn quá trình tăng phosphoryl hóa tau và sự kết tụ của nó thành đám rối Thử nghiệm bàn cờ đã được sử dụng để nghiên cứu sự tương tác giữa các loại thuốc này Ví dụ, một nghiên cứu của Houtman vào năm 2019 [81] đã sử dụng xét nghiệm bàn cờ để nghiên cứu sự tương tác giữa chất ức chế kinase roscovitine và chất ổn định vi ống epothilone Kết quả cho thấy sự kết hợp của hai