Nghiên cứu tác dụng cộng hợp của cao chiết trùng thảo (cordyceps militaris) và huperzine a trong định hướng điều trị bệnh alzheimer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐẶNG NHẬT MINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐẶNG NHẬT MINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa Người hướng dẫn Người hướng dẫn : QH.2018.Y : TS Hồ Ngọc Anh : PGS.TS Bùi Thanh Tùng Hà Nội - 2023 LỜI CẢM ƠN Khóa luận kết trình học tập, rèn luyện em Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội trình nghiên cứu, thực hành Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trong q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận này, em nhận nhiều giúp đỡ quý báu từ thầy, cô, anh, chị Viện Công nghệ sinh học thầy cô trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Trước hết, em xin chân thành cảm ơn TS Hồ Ngọc Anh, người Thầy tin tưởng giao đề tài cho em Thầy hết lịng tận tình, bảo q trình làm khóa luận Những chia sẻ, kinh nghiệm quý báu Thầy hành trang giúp em hồn thành khóa luận phát triển nghiệp sau Đề tài nằm khuôn khổ dự án “Phát triển sản phẩm hỗ trợ phòng, điều trị bệnh sa sút trí tuệ với thành phần hoạt chất huperzine A cao chiết Trùng thảo” cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ThS Hồ Thị Thương làm chủ nhiệm dự án Em xin cảm ơn PGS.TS Bùi Thanh Tùng¸ chủ nhiệm môn Dược lý, trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy hết lòng giúp đỡ, chỉnh sửa tận tình để em hồn thành khóa luận Thầy chia sẻ nhiều kiến thức bổ ích q trình học tập làm khóa luận em Em xin chân thành cảm ơn anh chị viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, môn Dược lý thầy cô trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện cho tơi thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ em trình học tập làm đề tài tốt nghiệp Trong q trình làm khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận góp ý Thầy để khóa luận em tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Đặng Nhật Minh DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 6-OHDA 6-hydroxydopamine A Độ hấp thụ A+C Hỗn hợp adenosine + Cordycepin ACh Acetylcholine AChE Acetylcholinesterase ACN Acetonitrile AcOH Acid acetic AcONH4 Amoni acetate ACTI acetylthiocholine iodid AD Bệnh Alzheimer AMPA α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionate ATP Adenosine triphosphate Aβ Beta-amiloid BuChE Butyrylcholinesterase CAT Catalase ChAT Choline acetyltransferase CI Mơ hình số kết hợp CNS Hệ thống thần kinh trung ương DMSO Dimetyl sulfoxide DRG Hạch rễ ĐTHT Đông trùng hạ thảo DTNB acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic HCS Sàng lọc hàm lượng cao HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao HSA Highest Single Agent (Tác nhân đơn cao nhất) HTS Ống nghiệm xét nghiệm sàng lọc HupA Huperzine A IC50 Nồng độ ức chế 50% IC50 Nồng độ ức chế 50% IR Phổ hấp thụ hồng ngoại LD50 Liều gây chết 50% LDL Cholesterol tỉ trọng thấp MIC Nồng độ ức chế tối thiểu NGF Yếu tố tăng trưởng thần kinh NMDA N-methyl-D-aspartate NSAID Thuốc giảm đau chống viêm không steroid PBS Phosphate-bufered saline ROS Phản ứng oxi hóa SI Chỉ số chọn lọc SOD SSTT superoxide dismutase Sa sút trí tuệ TBTK Tế bào thần kinh UV Phổ hấp thụ tử ngoại DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học số nucleotide trùng thảo .6 Hình 1.2 Cấu trúc Huperzine A 11 Hình 1.3 Mơ hình HSA để đánh giá tác dụng cộng hợp thuốc 19 Hình 2.1 Sắc ký đồ chuẩn mix adenosine cordycepin 24 Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng tạo màu phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman .25 Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn adenosine 29 Hình 3.2 Đồ thị đường chuẩn cordycepin .30 Hình 3.3 Phổ UV mẫu HupA 30 Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu HupA 31 Hình 3.5 Phổ UV chất chuẩn huperzine A 31 Hình 3.6 Hoạt tính gây độc tế bào 6-OHDA 34 Hình 3.7 Hoạt tính bảo vệ TBTK mẫu thử 35 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Chương trình rửa giải Gradient HPLC định lượng adenosine cordycepin 23 Bảng 2.2 Chương trình chạy gradient HPLC HupA 24 Bảng 2.3 Các tỷ lệ phối hợp chất Huperzine A hỗn hợp A + C 27 Bảng 3.1 Kết đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE chất Huperzine A, hỗn hợp A + C, donepezil 32 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan trùng thảo 1.1.1 Đặc điểm hình thái, phân loại, tác dụng 1.1.2 Thành phần hóa học trùng thảo 1.1.3 Tác dụng dược lý trùng thảo .8 1.2 Tổng quan huperzine A 10 1.2.1 Lịch sử huperzine A 10 1.2.2 Cấu trúc huperzine A 10 1.2.3 Tác dụng dược lý huperzine A 11 1.3 Acetylcholine, enzym acetylcholinesterase giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer .13 1.3.1 Acetylcholine 13 1.3.2 Enzym Acetylcholinesterase 14 1.3.3 Giả thuyết vai trò hệ cholinergic bệnh Alzheimer 14 1.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 15 1.5 Tác dụng cộng hợp chất .16 1.5.1 Định nghĩa .16 1.5.2 Ý nghĩa tác dụng cộng hợp thuốc 17 1.5.3 Mơ hình đánh giá tác dụng cộng hợp thuốc .18 1.5.4 Phương pháp ô bàn cờ tổ hợp 20 CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu .22 2.2 Hóa chất vật tư 22 2.3 Thiết bị 23 2.4 Phương pháp nghiên cứu .23 2.4.1 Phương pháp định lượng adenosine cordycepin Trùng thảo 23 2.4.2 Phương pháp xác định độ tinh huperzine A HPLC 24 2.4.3 Phương pháp đánh giá khả ức chế enzym acetylcholinesterase .25 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp hỗn hợp adenosine + cordycepin (A+C) chất huperzine A 26 2.4.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh .27 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ 29 3.1 Kết định lượng adenosine cordycepin từ cao chiết trùng thảo .29 3.2 Đánh giá độ tinh HupA 30 3.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE, xác định tác dụng cộng hợp tỷ lệ phối trộn hỗn hợp A+C chất huperzine A 32 3.4 Đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 33 CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN 37 4.1 Về phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp hợp chất 37 4.2 Về kết đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 Kết luận 42 Đề xuất 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Sa sút trí tuệ (SSTT) bệnh liên quan đến rối loạn não, có ảnh hưởng đến khả suy nghĩ ghi nhớ người, dẫn đến suy giảm khả nhận thức đủ nghiêm trọng để cản trở sống hàng ngày Trong đó, Alzheimer (AD) dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, chiếm 60%-80% nguyên nhân sa sút trí tuệ AD nguyên nhân thứ gây tử vong nói chung nguyên nhân thứ gây tử vong người 65 tuổi Các đánh giá gần ước tính tồn cầu có gần triệu người phát triển chứng SSTT năm, sau bốn giây có thêm trường hợp mắc chứng SSTT Năm 2015, chứng SSTT ảnh hưởng đến 47 triệu người toàn giới, số ước tính tăng lên 76 triệu người vào năm 2030 145 triệu người vào năm 2050 Năm 2010, chi phí chăm sóc người SSTT tồn cầu ước tính 604 tỷ la Mỹ, chiếm 1% tổng sản phẩm quốc nội toàn cầu Đến năm 2030, chi phí chăm sóc cho người mắc chứng SSTT tồn giới ước tính khoảng 1200 tỷ la Mỹ hơn, tổng số làm suy yếu phát triển kinh tế xã hội tồn cầu Việt Nam thức bước vào giai đoạn già hóa dân số từ năm 2011 có 11% số dân người 60 tuổi Năm 2001, Viện Sức khỏe Tâm thần Quốc gia nghiên cứu Thái Nguyên cho biết tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ 7,9% Năm 2005, Phạm Thắng cộng cho thấy Ba Vì, tỷ lệ mắc suy giảm nhận thức nhẹ 1,4% SSTT 4,63% [1, 2] Theo điều tra dân số năm 2017, nước có 11 triệu người 60 tuổi chiếm khoảng 11,95% dân số, có khoảng gần triệu người từ 80 tuổi trở lên Hiện thị trường nhóm thuốc điều trị hỗ trợ điều trị Alzheimer bệnh SSTT nhắm vào chế ức chế enzym thủy phân Acetylcholinesrase (AChE) thuốc ngăn chặn N-methyl-D-aspartate (NMDA) Trong hiệu sử dụng phối hợp chế với hỗn hợp thuốc donepezil memantine, phối kết hợp có nhiều tác dụng phụ, nguy hiểm người sử dụng Ở Việt Nam, phần lớn thuốc điều trị bệnh SSTT AD biệt dược ngoại nhập với giá thành cao có số tác dụng phụ Việt Nam nước có mức độ đa dạng sinh học cao, y học cổ truyền Việt Nam có nhiều thuốc sử dụng dược liệu để cải thiện điều trị bệnh suy giảm trí nhớ, tăng tuần hồn máu não, giúp an thích cao chiết cịn có thành phần khác nên gây độc cho tế bào nồng độ cao, lượng tế bào sống sót giảm xuống rõ rệt Đối với chất đối chứng dương NGF với dải nồng độ từ 0.1 μg/mL đến μg/mL, lượng tế bào sống sót tăng dần theo nồng độ, với tỉ lệ sống sót 88%, 153%, 167% (Hình 3.7D), cho thấy khả tăng sinh tế bào mạnh mẽ chất Khả bảo vệ tế bào thần kinh chất đối chứng dopenezil giảm dần theo nồng độ, với lượng tế bào sống sót 81%, 40%, 25% nồng độ 25μM, 50μM, 100μM (Hình 3.7E) Điều cho thấy, tăng nồng độ thuốc, độc tính thuốc tăng lên, khả bảo vệ tế bào giảm Hỗn hợp chất huperzine A chất chuẩn A + C bảo vệ TBTK từ 65%90% nồng độ khác Trong hỗn hợp phối trộn chất huperzine A cao chiết bán thành phẩm cho thấy hiệu cao hỗn hợp bảo vệ TBTK thấp đạt 70% số tế bào sống sót cao vượt 100% tới 125% sau giảm xuống 80% số lượng tế bào sống sót so sánh với đối chứng không DMSO Kết giải thích cao chiết cịn có thành phần khác nên khơng thể rõ hoạt tính bảo vệ cơng thức nồng độ cao 36 CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN 4.1 Về phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp hợp chất Trong lĩnh vực y học đương đại, để khắc phục bệnh tình trạng phức tạp thường cần đến phương pháp tiếp cận toàn diện Một phương pháp sử dụng phối hợp thuốc, nhiều loại thuốc kết hợp để điều trị tình trạng bệnh cụ thể Ý tưởng phương pháp tận dụng hiệu ứng cộng hợp loại thuốc để tăng cường hiệu điều trị Cùng với gia tăng tuổi tác toàn cầu, bệnh Alzheimer trở thành bệnh ngày phổ biến xã hội Tuy nhiên, việc điều trị bệnh Alzheimer thách thức lớn y học đại Mặc dù có nhiều nghiên cứu phát triển thuốc suốt nhiều năm qua, hiệu phương pháp điều trị thuốc đơn lẻ hạn chế Vì vậy, kết hợp thuốc đóng vai trị ngày quan trọng việc điều trị bệnh Alzheimer Theo nghiên cứu cơng bố tạp chí CNS Drugs, việc sử dụng phương pháp phối hợp thuốc giải pháp tiềm cho việc điều trị bệnh Alzheimer [70] Sự kết hợp loại thuốc nhắm vào chế khác q trình phát triển bệnh Alzheimer dẫn đến tác dụng cộng hợp, giúp cải thiện hiệu điều trị giảm độc tính Tác dụng cộng hợp kết việc sử dụng nhiều loại thuốc kết hợp với Mỗi loại thuốc có tác dụng riêng, nhiên kết hợp với nhau, tác dụng loại thuốc tăng cường gấp nhiều lần so với sử dụng loại thuốc Điều có nghĩa là, việc sử dụng phương pháp phối hợp thuốc giúp cải thiện triệu chứng bệnh Alzheimer, giảm thiểu suy giảm trí nhớ, tăng cường khả tập trung, cải thiện tâm trạng giảm tình trạng lo âu [86] Ngoài ra, việc kết hợp loại thuốc nhắm vào chế khác giúp giảm độc tính thuốc Điều quan trọng việc điều trị bệnh Alzheimer, bệnh nhân thường phải sử dụng loại thuốc thời gian dài, thường xuyên phải sử dụng nhiều loại thuốc khác trình điều trị Việc đánh giá tác dụng cộng hợp thuốc trình phức tạp đầy thách thức, đặc biệt đánh giá tác dụng nhiều hợp chất lúc Để giải vấn đề này, số mơ hình phát triển để giúp xác định tương 37 tác hợp chất mơ hình isobologram, mơ hình Bliss độc lập mơ hình cộng tính Lowe [72, 73] Bên cạnh mơ hình trên, phương pháp bàn cờ tổ hợp phương pháp đặc hiệu để đánh giá tác dụng cộng hợp chất sử dụng nhiều nghiên cứu Phương pháp ô bàn cờ phương pháp phổ biến vi sinh học để nghiên cứu tương tác loại kháng sinh Trong phương pháp này, chất pha thành nồng độ khác kết hợp theo mơ hình bàn cờ 96 giếng Sau đó, đĩa 96 giếng ủ nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) loại thuốc kết hợp thuốc xác định MIC định nghĩa nồng độ thấp thuốc ức chế phát triển vi sinh vật dòng tế bào [78] Trong năm gần đây, phương pháp áp dụng để nghiên cứu tương tác loại thuốc điều trị bệnh khác nhau, bao gồm Alzheimer (AD) Trong AD, phương pháp ô bàn cờ sử dụng để nghiên cứu tương tác loại thuốc nhắm vào khía cạnh khác bệnh, chẳng hạn tập hợp Aβ, tăng phospho hóa tau viêm thần kinh Một ưu điểm phương pháp giúp xác định tương tác loại thuốc theo cách toàn diện hơn, đồng thời cho phép đánh giá hiệu việc sử dụng thuốc kết hợp [5, 51] Trong nghiên cứu này, sử dụng phương pháp ô bàn cờ tổ hợp để đánh giá tác dụng cộng hợp cao chiết Trùng thảo Huperzine A 16 tỷ lệ khác hỗn hợp Adenosine + Cordycepin Huperzine A thiết kế thành bảng ô bàn cờ, sau đánh giá khả ức chế enzym Acetylcholinesterase Tỷ lệ có hiệu ứng cộng hợp cao sau quy đổi theo tỷ lệ hoạt chất có cao chiết thử hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh để chứng minh tác dụng cộng hợp Huperzine A Trùng thảo Kết thu được, 16 tỷ lệ kết hợp hỗn hợp A +C Hupezine A có tác dụng ức chế enzym AChE in vitro Trong đó, tỷ lệ có IC50 thấp 0.0077 ± 0,0009 μg/mL cao 0,1413 ± 0.0129 μg/mL Giá trị IC50 thấp hỗn hợp kết hợp mạnh gần 1,8 lần so với chất đối chứng donepezil 9,6 lần so với HupA đơn chất Điều chứng minh kết hợp chất với nhau, chất cho tác dụng cộng hợp, giúp tăng cường khả điều trị bệnh Qua tìm hiểu, tơi thấy việc xác định tác dụng cộng hợp Trùng thảo Huperzine A 38 chưa có Việt Nam Kết nghiên cứu mở phương pháp đầy tiềm hứa hẹn việc điều trị bệnh Alzheimer tương lai Tuy nhiên, để lựa chọn công thức phát triển thành thuốc, đề xuất phải thử độc tính tỷ lệ thơng qua số chọn lọc (Selectivity index, SI) SI định nghĩa tỉ số nồng độ gây độc 50% (LD50) mẫu so với nồng độ ức chế 50% [87], cụ thể sau: SI= x100 Các thuốc có tỷ lệ SI ≥ 10 coi có hoạt tính in vitro Các thuốc xác định có giá trị SI