Nghiên cứu phát hiện chọn lọc và chính xác serotonin trong mẫu sinh học bằng việc kết hợp hạt nano vàng (aunps) và aptamer

Nghiên cứu phát hiện chọn lọc và chính xác serotonin trong mẫu sinh học bằng việc kết hợp hạt nano vàng (aunps) và aptamer Nghiên cứu phát hiện chọn lọc và chính xác serotonin trong mẫu sinh học bằng việc kết hợp hạt nano vàng (aunps) và aptamer

i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Ngọc Bích

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CHỌN LỌC VÀ CHÍNH XÁC SEROTONIN

TRONG MẪU SINH HỌC BẰNG VIỆC KẾT HỢP HẠT NANO VÀNG (AUNPS) VÀ APTAMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội 2024

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Ngọc Bích

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CHỌN LỌC VÀ CHÍNH XÁC SEROTONIN

TRONG MẪU SINH HỌC BẰNG VIỆC KẾT HỢP HẠT NANO VÀNG (AUNPS) VÀ APTAMER

Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học : TS Phạm Gia Bách

PGS TS Phạm Thị Ngọc Mai

Hà Nội 2024

LỜI CẢM ƠN

Sau quá trình học tập và nghiên cứu khoa học tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới những người đã hướng dẫn, hỗ trợ và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Phạm Gia Bách, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai, đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi

cũng như truyền đạt kinh nghiệm cùng những tri thức quý báu để em hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học này

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy (Cô) trong Bộ môn Hóa Phân tích và các Thầy (Cô) trong khoa Hóa đã giảng dạy, tạo điều kiện tốt nhất, hỗ trợ thiết bị và cơ sở vật chất để em tham gia các đề tài nghiên cứu Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị, em và các bạn trong Phòng thí nghiệm Hóa phân tích đã đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em

trong công việc nghiên cứu tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà

Nội

Em xin gửi những tình cảm sâu sắc và lòng biết ơn tới gia đình, các anh chị và bạn bè đã luôn ở bên ủng hộ, động viên và là chỗ dựa tinh thần to lớn cho em trong những lúc gặp khó khăn

Cuối cùng, em xin gửi những lời chúc tốt đẹp nhất đến tất cả các thầy cô, gia đình và bạn bè luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và đạt được nhiều thành công trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 25 tháng 08 năm 2024

Học viên

Trần Ngọc Bích

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 29

2.1.2 Nội dung nghiên cứu: 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp tổng hợp dung dịch nano vàng bằng phương pháp Turkevich 30

2.2.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng hạt nano Au kết hợp aptamer để xác định serotonin 31

2.2.3 Phổ phát xạ huỳnh quang (FL) 33

2.2.4 Phương pháp đo thế Zeta 35

2.2.5 Độ lặp lại của phương pháp phân tích 36

2.2.6 Độ đúng thông qua sai số của đường chuẩn 37

2.4.1 Điều chế dung dịch nano vàng với chất ổn định là citrate 40

2.4.2 Khảo sát đặc trưng của dung dịch aptamer và nano vàng 41

2.4.3 Khảo sát các quy trình phân tích Serotonin 41

2.4.4 Khảo sát tín hiệu huỳnh quang của aptamer-comp-sero FAM 42

2.4.5 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp xác định serotonin bằng phương pháp quang học sử dụng dung dịch Apt-AuNPs 42

2.6 Xây dựng đường chuẩn 43

2.7 Đánh giá phương pháp phân tích 44

2.8 Đánh giá độ chọn lọc 44

2.9 Thông tin mẫu và phương pháp xử lý mẫu 44

2.9.1 Thông tin mẫu 44

2.9.2 Xử lý mẫu 45

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Khảo sát đặc trưng của dung dịch aptamer và nano vàng ( Apt-AuNPs) 46

3.2 Khảo sát các quy trình xác định serotonin 47

3.5.4 Khảo sát thời gian ủ aptamer với serotonin 55

3.6 Đánh giá phương pháp xác định serotonin bằng dung dịch Apt-AuNPs 56

3.6.1 Xây dựng phương trình đường chuẩn 56

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của Serotonin 3

Hình 1 2 Hạt nano vàng (Au) với lớp điện kép trên bề mặt 17

Hình 1 3 Cấu trúc và tương tác giữa aptamer và chỉ dấu sinh học 22

Hình 1 4 Chu trình SELEX 22

Hình 1 5 Số lượng các công bố khoa học bằng tiếng Anh về aptasensor 25

Hình 2 1 Cơ chế tạo hạt nano vàng từ natri citrate 30

Hình 2 2 Nano vàng được bảo vệ bởi một lớp anion citrate 30

Hình 2 3 Cơ chế của phương pháp xác định serotonin với phức hợp Apt-AuNPs 33

Hình 2 4 Cơ chế bật- tắt huỳnh quanh của phức hợp Apt-AuNPs 34

Hình 2 5 Sơ đồ chuẩn bị dung dịch nano vàng với Citrate 40

Hình 3 1 Phổ UV-Vis chỉ của AuNPs (màu đen) và sau khi ủ với 50 nM chỉ serotonin (màu xanh lá cây), hỗn hợp aptamer và các nồng độ khác nhau của serotonin (đỏ và xanh lam) 46

Hình 3 2 Hình ảnh thể hiện tín hiệu dung dịch Apt-AuNPs với các cặp aptamer 47

Hình 3 3 A) Sơ đồ minh họa ba phương pháp phát hiện serotonin B) Tỷ lệ A530/A650 của mẫu có và không có serotonin bằng ba phương pháp 48

Hình 3 4 So sánh cường độ huỳnh quang của aptamer-comp-sero FAM sau khi ủ với các mục tiêu khác nhau 49

Hình 3 5 Điện thế zeta của AuNPs khi có mặt aptamer và serotonin 50

Hình 3 6 Ảnh hưởng của dung dịch muối điện ly 51

Hình 3 7 Ảnh hưởng của pH 53

Hình 3 8 Ảnh hưởng thời gian ủ aptamer và serotonin với các hạt nano vàng 54

Hình 3 9 Ảnh hưởng thời gian ủ của aptamer với serotonin 55

Hình 3 10 Đồ thị đường chuẩn xác định serotonin 57

Hình 3 11 Phổ UV-Vis của mẫu trắng và mẫu chứa 2,2 nM serotonin 58

Hình 3 12 Khảo sát độ chọn lọc A) Phương pháp đề xuất, B) Phương pháp thông thường chỉ với aptamer-sero 61

Hình 3 13 Ảnh hưởng của nền mẫu đến dung dịch AuNPs 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Thế Zeta và tính chất ổn định của chất keo 35 Bảng 2 2 Công thức tính độ lặp lại 36 Bảng 3 1 ΔA530/A650 của dung dịch Apt-AuNPs và Apt-AuNPs-serotonin theo pH 52 Bảng 3 2 ΔA530/A650 theo thời gian ủ Apt và serotonin với nano vàng 54 Bảng 3 3 A530/A650 của các nồng độ serotonin 56 Bảng 3 6 Xác định hàm lượng serotonin trong mẫu huyết tương 61

DANH MỤC VIẾT TẮT

Apt/AuNPs Aptamer/ gold nanoparticles Aptamer và hạt nano vàng

AOAC

Association of Official Analytical

Communities

Hiệp hội các cộng đồng phân

tích chính thức

AuNPs Gold nanoparticles Các hạt nano vàng

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

SWV Square Wave Voltammetry vôn ampe sóng vuông

Voltammetry vôn ampe xung vi phân

HPLC-UV High Performance Liquid

Chromatography- Ultraviolet

Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối UV

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

R2 Correlation Factor Hệ số tương quan

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SPR Surface plasmon resonance Hiện tượng cộng hưởng

MỞ ĐẦU

Serotonin là chất dẫn truyền tín hiệu cho các tế bào thần kinh, điều chỉnh khả năng nhận thức, vận động, cảm xúc, duy trì tâm trạng và cảm giác thèm ăn Serotonin còn tham gia vào việc cấu thành những cục máu đông, do tiểu cầu giải phóng ra khi cơ thể bị thương Sự bất thường về mức độ serotonin có liên quan chặt chẽ với các rối loạn thần kinh và tâm thần khác nhau như trầm cảm, rối loạn lo âu và rối loạn ám ảnh cưỡng chế Việc phát hiện và định lượng chính xác serotonin cung cấp thông tin chính xác về sự mất cân bằng của các chất nội sinh trong não, cho phép đưa ra pháp đồ điều trị hiệu quả với từng cá nhân Việc theo dõi mức độ chất chuyển hóa serotonin cũng rất cần thiết để đánh giá hiệu quả của các liệu trình trị liệu

Hiện nay, việc phân tích serotonin thường yêu cầu các thiết bị phân tích hiện đại với thời gian phân tích dài Các kỹ thuật được sử dụng phổ biến như sắc ký lỏng (LC), xét nghiệm miễn dịch (Immunoassay) và khối phổ (MS) yêu cầu đội ngũ kĩ thuật viên có tay nghề cũng như trang thiết bị, hóa chất và cơ sở vật chất hiện đại Những yêu cầu này khó có thể đáp ứng được tại tất cả các bệnh viện và cơ sở y tế Đây là rào cản đặc biệt lớn đối với việc điều trị bệnh nhân tại bệnh viện cấp cơ sở, tại nhà, hoặc tại những nơi hạn chế về nguồn nhân lực và cơ sở vật chất

Trong khi đó, cảm biến sinh học có thể khắc phục những nhược điểm của các phương pháp nêu trên một cách đơn giản, nhanh chóng, hiệu quả và có thể phát triển thành công cụ cầm tay cho việc xác định nồng độ thuốc trong điều trị Aptasensors là loại cảm biến linh hoạt có thể phát hiện các chất phân tích khác nhau, trong đó aptamer đặc hiệu được sử dụng như các yếu tố nhận dạng sinh học Aptamer là phân tử oligonucleotide đơn sợi ngắn có độ đặc hiệu cao và ái lực liên kết mạnh với phân tử đích Do đó, các cảm biến từ aptamer không chỉ có độ chọn lọc cao mà còn có độ nhạy tốt, giới hạn phát hiện chất có thể đạt đến dưới nM Liên hợp hạt nano vàng (AuNPs) và aptamer có thể được tạo ra bằng cách hấp phụ aptamer lên trên bề mặt AuNPs hoặc thông qua liên kết với nhóm thiol Về cơ bản, sự thay đổi màu của liên hợp Apt-AuNPs phụ thuộc vào sự kết tụ của các hạt nano vàng trong dung dịch Khi không có chất phân tích, các Apt-AuNPs bị kết tụ và khiến dung

dịch chuyển từ màu đỏ sang màu xanh lam/tím Sau khi tạo liên kết với chất phân tích, aptamer sẽ thay đổi cấu trúc và làm thay đổi bề mặt của hạt nano vàng và dung dịch có màu đỏ Theo tìm hiểu của chúng tôi, hiện tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về ứng dụng và phát triển aptasensor, đặc biệt trong việc theo dõi thuốc điều trị Do đó, trong

nghiên cứu này, chúng tôi sẽ thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát hiện chọn lọc và chính xác các chất dẫn truyền thần kinh serotonin trong mẫu sinh học bằng hạt nano vàng (AuNPs) và aptamer ”, góp phần nhỏ vào xây dựng tạo tiền đề cho việc phát triển một

công cụ mới trong xét nghiệm lâm sàng, giúp tăng hiệu quả và giảm tác dụng phụ của thuốc cũng như cá nhân hóa điều trị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Serotonin

1.1.1 Giới thiệu về Serotonin

Serotonin được Rapport Green và Page phân lập lần đầu tiên từ huyết thanh vào năm 1948, đến năm 1951 đã được tổng hợp bởi Hamelin và Fischer Trong cơ thể, serotonin là một trong những chất hóa học trung gian quan trọng của hệ thần kinh trung ương và có nhiều vai trò quan trọng trong sinh bệnh lý [52,17]

Serotonin được tổng hợp ở tế bào ưa Crôm của ruột và trong tổ chức thần kinh từ tryptophan [74, 88] Serotonin tạo thành do các nhân ở não giữa và nhiều vùng của não bài tiết, đặc biệt là được giải phóng ở sừng sau tủy sống và ở vùng dưới đồi Nó có tác dụng ức chế lên đường dẫn truyền đau ở tủy sống, có vai trò trong các hoạt động xúc cảm và gây ngủ

Serotonin có nhiều trong thực vật (chuối), nhưng khó hấp thu qua ruột và bị chuyển hóa nhanh nên không bị ngộ độc khi ăn thức ăn có nhiều serotonin Với động vật có vú, 90% serotonin có trong tế bào ưa Crôm của ruột, 8% ở tiểu cầu, 2% ở thần kinh trung ương (đặc biệt ở tuyến tùng và vùng dưới đồi)

Công thức cấu tạo và tính chất hóa lý

Tên khoa học: 5-Hydroxytryptamine( 5-HT) or 3-(2-aminoethyl)-1H-indol-5-ol

Hình 1 1 Công thức cấu tạo của Serotonin

Công thức phân tử: C10H12N2O Khối lượng phân tử: 176,215 g/mol Nhiệt độ nóng chảy: 167 - 168°C Moment lưỡng cực: 2,98 D

Dạng muối serotonin hydroclorid(C10H12N2O.HCl) là tinh thể, hút ẩm, nhạy cảm với ánh sáng Muối tan nhiều trong nước, tạo dung dịch ổn định ở pH = 2 - 6,4; không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường

Sinh tổng hợp Serotonin

Serotonin được sản xuất trong não, với nguyên liệu ban đầu là amino acid tryptophan (xuất hiện nhiều trong hoa quả như chuối, dứa, mận hay thức ăn như thịt và sữa ) Quá trình diễn ra qua hai giai đoạn như sau [81]:

Bước 1 Enzym trytophan hydroxylase gắn một nhóm hydroxy vào tryptophan, tạo thành 5-hydroxytryptophan

Vai trò và ảnh hưởng đến sinh lý cơ thể:

Khoảng 80% lượng serotonin trong cơ thể được tìm thấy trong các tế bào enterochromaffin đường ruột [60] Tại đây serotonin có vai trò điều hòa nhu động ruột Phần còn lại được tổng hợp trong các nơron serotonergic ở hệ thần kinh trung ương và có

chức năng như một chất hóa học dẫn truyền thần kinh Serotonin giúp con người nhận thức được mình phải phấn đấu để phát triển và sức mạnh từ đâu để phát triển và khiến mỗi người

hiểu rõ tầm quan trọng của cộng đồng trong sự phát triển của mình

Trong đường tiêu hóa

Serotonin điều hòa chức năng đường tiêu hóa, ruột được bao quanh bởi các tế bào enterochromaffin, giải phóng serotonin để đáp ứng với thức ăn trong lòng ruột Tiểu cầu trong tĩnh mạch dẫn lưu ruột thu thập serotonin dư thừa Sự bất thường serotonin gây ra các rối loạn tiêu hóa như táo bón và hội chứng ruột kích thích

Tương tự như vậy, serotonin đã được mô tả như là một bộ chuyển đổi quan trọng của thông tin về ruột, tạo ra các phản xạ giãn mạch máu, bài tiết và mạch máu Nếu có các chất kích thích trong thực phẩm, các tế bào enterochromaffin sẽ giải phóng nhiều serotonin để làm ruột di chuyển nhanh hơn, gây ra tiêu chảy và giải phóng các chất độc hại ra khỏi ruột Nếu serotonin được giải phóng trong máu nhanh hơn mức độ tiểu cầu có thể hấp thụ, mức độ serotonin tự do trong máu sẽ tăng lên làm kích hoạt thụ thể 5-HT3 trong vùng kích hoạt chemoreceptor gây nôn mửa Do đó, thuốc và độc tố kích thích giải phóng serotonin từ các tế bào enterochromaffin trong thành ruột Các tế bào enterochromaffin không chỉ phản ứng với thực phẩm xấu mà còn rất nhạy cảm với chiếu xạ và hóa trị ung thư Thuốc chặn 5-HT3 rất hiệu quả trong việc kiểm soát buồn nôn và nôn do điều trị ung thư và được coi là tiêu chuẩn vàng cho mục đích này

Chuyển hóa xương

Ở chuột và người, sự thay đổi nồng độ serotonin và tín hiệu đã được chứng minh là điều chỉnh khối lượng xương Những con chuột thiếu serotonin trong não bị loãng xương, trong khi những con chuột thiếu serotonin trong ruột có mật độ xương cao Ở người, nồng độ serotonin trong máu tăng đã được chứng minh là yếu tố dự báo tiêu cực đáng kể về mật độ xương thấp Serotonin cũng có thể được tổng hợp, mặc dù ở mức rất thấp, trong các tế bào xương Những nghiên cứu này đã mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới về chuyển hóa xương có thể được khai thác để điều trị rối loạn khối xương [26]

Phát triển cơ quan

Serotonin ảnh hưởng đến sự phát triển của cơ quan Nhiều nghiên cứu trên người và động vật đã chỉ ra rằng dinh dưỡng ở giai đoạn đầu đời có thể ảnh hưởng đến mỡ cơ thể, mỡ máu, huyết áp, xơ vữa động mạch, hành vi, học tập và tuổi thọ khi đến tuổi trưởng thành Bằng cách điều trị chuột bình thường và chuột bị thiếu chất vận chuyển serotonin bằng fluoxetine, các nhà khoa học cho thấy các phản ứng cảm xúc bình thường ở tuổi trưởng thành, như thiên hướng khám phá môi trường mới phụ thuộc vào lượng chất vận chuyển serotonin hoạt động trong thời kỳ sơ sinh

Serotonin của con người cũng có thể hoạt động như một yếu tố tăng trưởng trực tiếp Serotonin có trong máu kích thích tăng trưởng tế bào để sửa chữa tổn thương gan, kích hoạt các tế bào xương, tạo ra xương Tuy nhiên, serotonin cũng ức chế các nguyên bào xương

Yếu tố tăng trưởng tim mạch

Trong máu, serotonin hoạt động ở bất cứ nơi nào tiểu cầu liên kết trong các mô bị tổn thương, với vai trò chất co mạch để cầm máu, và với vai trò nguyên bào sợi (yếu tố tăng trưởng), để hỗ trợ chữa lành Serotonin có lẽ là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng nhất ở người, thực hiện một số lượng lớn các hoạt động và các chức năng có tầm quan trọng sống còn cho sự ổn định và hạnh phúc Tuy nhiên, mặc dù thường được gọi là chất của tình yêu và hạnh phúc, các chức năng của serotonin không chỉ giới hạn trong việc điều chỉnh tâm trạng mà còn thể hiện trên nhiều hành động khác có tầm quan trọng sống còn đối với hoạt động tối ưu của não và cơ thể

Đông máu

Một trong những chức năng vật lý quan trọng nhất của serotonin là hình thành cục máu đông Khi chúng ta bị thương, tiểu cầu sẽ tự động giải phóng serotonin để bắt đầu các quá trình tái tạo nội sinh có liên quan Khi serotonin được giải phóng, sự co mạch xảy ra, nghĩa là các tiểu động mạch (động mạch nhỏ) hẹp hơn bình thường Việc thu hẹp này cho

phép giảm lưu lượng máu, góp phần hình thành cục máu đông, giúp giảm chảy máu và mất ít máu Nếu không có serotonin trong cơ thể, chúng ta sẽ không bị co mạch khi bị thương và có thể mất máu một cách nguy hiểm

Tâm trạng và giấc ngủ

Đây có lẽ là chức năng được biết đến nhiều nhất của serotonin, và là lý do tại sao serotonin được gọi là hormone hạnh phúc Sự gia tăng của serotonin tạo ra cảm giác hạnh phúc, tự tin, thư giãn và tập trung Thiếu hụt serotonin có liên quan đến trầm cảm, suy nghĩ tự tử, rối loạn ám ảnh cưỡng chế, mất ngủ và trạng thái hung hăng Serotonin thúc đẩy giải phóng melatonin, một chất thúc đẩy sự xuất hiện của giấc ngủ Vào ban ngày, lượng serotonin trong não cao, cho phép chúng ta giải phóng từ từ lượng melatoninn Khi melatonin rất dồi dào, giấc ngủ xuất hiện Và khi chúng ta đi ngủ, nồng độ serotonin giảm để làm gián đoạn quá trình sản xuất melatonin

1.1.2 Các phương pháp xác định Serotonin

Do tầm quan trọng của serotonin trong cơ thể con người, việc đo chính xác nồng độ serotonin trong các mẫu sinh học rất được quan tâm nghiên cứu Mức serotonin bất thường có liên quan đến rối loạn tâm thần kinh tăng huyết áp, bệnh thoái hóa thần kinh, biến chứng mạch máu do rối loạn chuyển hóa và tiểu đường Ngoài ra, mức độ serotonin cao hay thấp đã được quan sát thấy ở nhiều bệnh khác nhau, chẳng hạn như khối u carcinoid, rối loạn trầm cảm và tiểu đường Ví dụ, giá trị serotonin được tìm thấy là khoảng 300 nM trong máu và 3 nM trong dịch não tủy ở bệnh nhân trầm cảm Giá trị khoảng 300 µM được phát hiện thấy trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân có khối u carcinoid Với người khoẻ mạnh, giá trị serotonin nằm trong khoảng 270 nM-1490 nM trong huyết thanh, 300 nM–1650 nM trong nước tiểu và dưới 0,0568 nM trong dịch não tủy [34] Cho đến nay, các phương pháp được sử dụng để xác định hàm lượng của serotonin bao gồm: phương pháp vôn ampe sóng vuông (SWV), phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp điện di mao quản,…

1.1.2.1 Phương pháp điện hóa

Để phát hiện serotonin bằng điện hóa, các kỹ thuật như vôn ampe vòng (CV), vôn ampe sóng vuông (SWV) và vôn ampe xung vi phân (DPV) được sử dụng nhiều nhất [37] Vôn ampe vòng là một kỹ thuật rất hữu ích để thu được các thông tin liên quan đến các phản ứng phức tạp ở bề mặt điện cực [73] Trong kĩ thuật SWV, điện thế giữa điện cực làm việc và điện cực so sánh thay đổi theo thời gian, tuân theo mô hình xung SWV nổi bật bởi độ nhạy cao, tốc độ ghi nhanh, và dòng nền thấp [44] DPV là một kỹ thuật phân tích điện hoá nhanh và hiệu quả, được sử dụng rộng rãi do có độ nhạy cao và giới hạn phát hiện thấp [58]

Tác giả Reddaiahnin khi có mặt adrenaline trong cùng một dung dịch Các ảnh hưởng của các thông số thí nghiệm đến đặc tính điện hóa như tốc độ quét thế, pH của dung dịch, thời gian tích lũy và nồng độ đã được khảo sát Giới hạn phát hiện và định lượng của serotonin lần lượt là 1,8 × 10 −7 mol/L và 17,52 × 10 −7 mol/L Cảm biến điện hóa đã được sử dụng để xác định trực tiếp serotonin trong mẫu huyết thanh người, cho độ nhạy, độ ổn định và khả năng tái sử dụng cao hơn so với điện cực carbon thủy tinh không biến tính [53]

Một nghiên cứu khác đã so sánh hiệu suất của điện cực cacbon thủy tinh không biến tính và điện cực cacbon thủy tinh biến tính với poly(L-arginine)(P-Arg), oxit graphene khử (rGO) và hạt nano vàng (Au NP) để phát hiện đồng thời dopamine, serotonin và L-tryptophan khi có mặt axit ascorbic Điện cực biến tính cho khả năng hoạt động điện hóa rất tốt với dopamine (DA), serotonin (5-HT) và L-tryptophan (L-Trp) ở pH 7 Đối với dopamine, dòng điện phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ trong hai khoảng nồng độ, 1-50 nM và 1-50 µM, tại điện áp 202 mV (so với Ag/AgCl); giới hạn phát hiện là 1 nM; đối với serotonin, các thông số này lần lượt là 10-500 nM và 1-10 µM, 381 mV, 30 nM, và đối với L-tryptophan tương ứng là 10-70 nM và 10-100 µM, 719 mV, 0,1 µM Điện cực NP GCE/P-Arg/rGO/Au có thể tách thành công pic của các chất phân tích Với hoạt tính điện hóa cao, độ ổn định và khả năng tái sử dụng tốt, cảm biến có thể được sử dụng trong phân tích dopamine, serotonin và L-tryptophan trong các mẫu sinh học và trong chẩn đoán y tế [32]

Các kết quả rất tốt cũng thu được trong việc phát hiện serotonin khi sử dụng các cảm biến dựa trên điện cực được biến đổi bằng nanocompozit lai poly(3,4-ethylenedioxythiophene) graphen oxit dạng khử-hạt nano bạc (PEDOT/rGO/Ag NP) Kết quả đo phổ trở kháng điện hóa (EIS) cho thấy điện trở truyền điện tử rất thấp (198 Ω) đối với điện cực biến tính Điện cực PEDOT/rGO/Ag NPs/GCE cho hiệu quả làm việc tốt nhất khi sử dụng kĩ thuật xung vi phân, với giới hạn phát hiện thấp là 0,1 nM, độ ổn định hoạt động cao, độ tái lập, thời gian đáp ứng ngắn và độ nhạy cao Quá trình oxy hóa serotonin trên màng PEDOT/rGO/Ag NP/GCE xảy ra ở 0,280 V và cho đáp ứng tuyến tính trong khoảng nồng độ serotonin từ 1 nM đến 0,5 mM [55]

Một cảm biến điện hóa mới đã được phát triển để phát hiện đồng thời norepinephrine và serotonin bằng phương pháp vôn ampe vòng và vôn ample sóng vuông trên cơ sở điện cực in (SPE) được biến tính bằng hỗn hợp MWNTs-ZnO-chitosan Các pic thu được của norepinephrine và serotonin lần lượt nằm ở khoảng 90 và 280 mV, cho phép phân tích đồng thời cả hai chất trong các mẫu phức tạp Khoảng tuyến tính của noradrenaline và serotonin tương ứng nằm trong khoảng 0,5-30 µM và 0,05-1 µM, và giới hạn phát hiện là 0,2 và 0,01 µM Điện cực đã biến tính, MWNTs-ZnO-chitosan/SPE, cần được bảo quản ở nhiệt độ 4°C và ổn định trong 3 tháng Cảm biến dựa trên công nghệ in có chi phí thấp và khả năng nhân rộng cao Cảm biến có thể được sử dụng thành công trong việc phân tích norepinephrine và serotonin trong các mẫu lâm sàng [76]

Một bài báo khác đề xuất một phương pháp mới và đơn giản để phát hiện serotonin trong mô não chuột, sử dụng cảm biến dựa trên MWCNTs/Al2O3/chitosan lắng đọng trên điện cực in lụa Điện cực này cho thấy hoạt tính xúc tác điện tuyệt vời đối với quá trình oxy hóa serotonin trên các mẫu mô não thật Kĩ thuật von-ampe sóng vuông được sử dụng để tối ưu hóa các điều kiện thí nghiệm cho cảm biến Tại các điều kiện tối ưu, cảm biến có khoảng tuyến tính từ 0,01 đến 1,0 µM, giới hạn phát hiện rất thấp là 0,005 µM So với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp được đề xuất cũng cho kết quả tốt trong việc phát hiện serotonin trong não và có thể được sử dụng trong chẩn đoán trầm cảm [78]

Cảm biến dựa trên vật liệu lai nano chứa graphene (GR) được bọc trong hợp kim AuAg (AuAg-GR) rất hữu ích trong việc xác định và phát hiện chất dẫn truyền thần kinh serotonin trong phạm vi nồng độ rộng, từ 2,7 nM đến 4,82 µM với giới hạn phát hiện rất thấp là 1,6 nM Nhiễu là không đáng kể và khả năng tái lặp của phép đo là rất cao Ngoài ra, cảm biến dựa trên AuAg-GR đã được sử dụng thành công trong việc phát hiện chính xác serotonin trong huyết thanh người [68]

Một cảm biến điện hóa mới dựa trên vật liệu nanocompozit SnO2-SnS2 đã được phát triển để phát hiện chọn lọc và đồng thời các dấu ấn sinh học liên quan đến chứng trầm cảm (serotonin và tryptophan) khi có mặt axit ascorbic Điện cực carbon thủy tinh được biến tính bằng SnO2-SnS2 thể hiện hai đỉnh oxy hóa rõ rệt ở 0,43 và 0,83 V, tương ứng với serotonin và tryptophan, trong dung dịch đệm phot phat ở pH 7 Tại các điều kiện tối ưu, dòng điện cực đại phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ chất phân tích trong khoảng 0,1-700 µM đối với serotonin và 0,1-800 µM đối với tryptophan Giới hạn phát hiện tương ứng là 45 và 59 nM Cảm biến đã được sử dụng để phát hiện serotonin và tryptophan trong mẫu huyết thanh người và tảo xoắn [45]

1.1.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng

Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất bởi các đặc điểm nổi trội về khả năng phân tách cũng như độ nhạy cao Nhiều nghiên cứu áp dụng phương pháp này để xác định serotonin trên các nền mẫu khác nhau như trong thực phẩm, dược phẩm và mẫu sinh học Các nghiên cứu được thực hiện trên thiết bị sắc ký lỏng với những detector khác nhau như detector UV, huỳnh quang, MS,… đều cho kết quả phân tích tốt

Qiang Wang và cộng sự [75] đã thiết lập một phương pháp đơn giản, nhanh chóng

và chính xác để xác định serotonin trong tiểu cầu Serotonin được xác định trong tiểu cầu

sau khi khử protein, bằng thiết bị sắc ký lỏng hiệu suất cao cặp ion (HPLC) trên cột pha đảo Nova-pak C18 (150 mm x 4,6 mm, 4 microm) với detector huỳnh quang Hiệu suất thu hồi trung bình của serotonin trong tiểu cầu là 97,5%, khoảng tuyến tính là 20 - 20000 nmol/L và giới hạn phát hiện là 1 nmol/L Axit 5-hydroxyindole acetic (5-HIAA), Trp, Phe và Tyr không gây ảnh hưởng

Qiangqiang He, Maoru Li và các cộng sự [24] đã phát triển một phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao đơn giản, hiệu quả và nhanh chóng kết hợp với detector UV (HPLC–UV) để phân tích định tính và định lượng 5-HT trong cả chiết xuất tế bào và môi trường nuôi cấy tế bào (RIN-14B) Các thí nghiệm sử dụng các chu kỳ đông lạnh-rã đông lặp đi lặp lại sau đó ly tâm và tiêm trực tiếp phần dịch trong vào sắc ký Nghiên cứu sử dụng cột tách C18 (Agilent Zorbax Extend, 4,6 × 250 mm, 5 μm); pha động kali dihydro phosphat (KH2PO4 ) 0,05 mol/L /acetonitril (90:10 v/v); rửa giải đẳng dòng ở tốc độ 1,0 mL/phút; thời gian phân tích là 8 phút Đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ 0,1-10 μg/mL Phương pháp có độ thu hồi cao (92,02-103,28%) và độ chính xác cao (hệ số biến thiên trong ngày và giữa các ngày ≤ 4,69%) Phương pháp này có thể áp dụng để nghiên cứu mối quan hệ thuốc/tình trạng đáp ứng trong chức năng tổng hợp và tiết 5-HT trong tế bào RIN-14B nuôi cấy trong nhiều nghiên cứu in vitro khác nhau

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với hệ phát quang hóa học luminol đã được Li Ma và cộng sự [40] phát triển để xác định 7 chất dẫn truyền thần kinh monoamine và chất chuyển hóa Tại các điều kiện tối ưu, giới hạn phát hiện (3S/N) của epinephrine (E), levodopa ( L -DOPA), dopamine (DA), serotonin (5-HT), 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG), acid 3,4-dihydroxyphenylacetic (DOPAC) và acid 5-hydroxyindoleacetic (5-HIAA) lần lượt là 20,0 μg/L, 15,0 μg/L, 15,0 μg/L, 8,0 μg/L, 2,0 μg/L, 2,0 μg/L và 3,0 μg/L Khoảng tuyến tính của các chất tương ứng là từ 50–1000 μg/L, 50-1000 μg/L, 50-1000 μg/L, 25-1000 μg/L, 5-25 μg/L, 5-25 μg/Lvà 10-μg/L Độ thu hồi trung bình thay đổi trong khoảng từ 84,82% đến 110,4% Phương pháp có ưu điểm là đơn giản, độ nhạy cao và hiệu quả cao

Ag(III)-1.1.2.3 Phương pháp huỳnh quang

Hiện nay, đã có những nghiên cứu dựa trên phép đo huỳnh quang để xác định hàm lượng serotonin trong mẫu thuốc và mẫu sinh học Phương pháp cho khả năng phát hiện tương đối tốt khi đối chứng với một số phương pháp khác và không có sự khác biệt đáng

kể

Yong-Yi Zhao và cộng sự [91] đã phát triển một cảm biến hóa học dựa trên nanohybrid của Multifarene [3, 3] và oxit graphene dạng khử (RGO) để xác định Serotonin Hydrochloride bằng cả phương pháp huỳnh quang và von-ampe Sự lai hóa của multifarene [3, 3] (S) với oxit graphene dạng khử đã cải thiện đáp ứng của serotonin hydrochloride trong cả phương pháp huỳnh quang và von-ampe, cho giới hạn phát hiện thấp là 3,9 × 10 −7 M Cảm biến đã được sử dụng để xác định serotonin trong huyết thanh người

Đầu dò huỳnh quang để phát hiện Serotonin dựa trên chấm lượng tử ZnS pha tạp Mn@hạt nano silica@polyme in dấu phân tử (QDs@SiO2 @MIPs) đã được nhóm nghiên cứu Zhihua Wang nghiên cứu thành công [77] Khi phức tạo thành giữa nhóm amino của QDs@SiO2 @MIPs và nhóm hydroxyl của 5-HT, năng lượng của QDs sẽ được truyền đến phức và làm dập huỳnh quang của QDs Vật liệu MIP có độ chọn lọc cao với hệ số in dấu là 5,96 Phương trình hồi quy tuyến tính của đường chuẩn là F0/F = 0,0036 Cq-0,0512, hệ số tương quan là 0,9928, trong khoảng nồng độ Serotonin từ 50 đến 500 ng/mL Giới hạn phát hiện (LOD) là 0,69 ng/mL Quy trình phân tích đơn giản, độ nhạy cao, tính chọn lọc tốt, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích ngắn và có thể được áp dụng để phát hiện 5-HT trong huyết thanh người

Một cảm biến sinh học bật huỳnh quang dựa trên các cụm nano vàng được bọc transferrin (NC Tf-Au) đã được chế tạo để phát hiện 5-hydroxytryptamine (5-HT)với độ nhạy cao (NC Tf-Au) Sự tăng phát xạ huỳnh quang của NC Tf-Au được kích hoạt bởi 5-HT do ái lực cao giữa 5-HT và các dư lượng axit sialic (SA) của transferrin Với cảm biến này, có thể định lượng 5-HT trong khoảng nồng độ từ 0,2-50 μM (R2  = 0,994) với giới hạn phát hiện là 0,049 μM (S/N = 3) Cảm biến được phát triển cũng đã được áp dụng thành công để phát hiện 5-HT trong huyết thanh người với tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu là 96,20 -108,6% [59]

1.1.2.4 Phương pháp điện di

Điện di mao quản (CE) là một công cụ hấp dẫn và hiệu quả để phân tích các ion hoặc các hợp chất ion hóa, đã chứng minh được tính cạnh tranh/bổ sung cho sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) Phương pháp tách này được đặc trưng bởi nhiều ưu điểm như hiệu

suất tách cao, tính linh hoạt, mềm dẻo, sử dụng nước, lượng mẫu nhỏ Gần đây, điện di mao quản được áp dụng rộng rãi để tách và phân tích các chất dẫn truyền thần kinh monoamine và chất chuyển hóa dựa vào các ưu điểm như khả năng tách tốt, tốc độ phân giải cao và thể tích mẫu nhỏ

Nhóm tác giả Roychoudhury, A đã nghiên cứu thành công thiết bị điện di mao quản vi mạch giấy đơn giản, không cần bộ tách để phát hiện đồng thời dopamine, epinephrine và serotonin Nghiên cứu này đưa ra một cấu hình mới và đơn giản sử dụng một chip vi lưu giấy được in bằng phương pháp in sáp giá rẻ kết hợp với phương pháp in lưới để tách điện di và phát hiện đồng thời bằng kĩ thuật von-ampe ba chất hóa học thần kinh trong một lần chạy mà không cần xử lí mẫu Phát hiện các chất hóa học thần kinh như dopamine, epinephrine và serotonin rất quan trọng để dự đoán sớm các rối loạn thần kinh bao gồm bệnh Parkinson, Alzheimer, chứng mất trí, cũng như các tình trạng thần kinh-tâm thần tiến triển như trầm cảm, lo âu, cũng như một số bệnh tim mạch Việc phát hiện đồng thời các chất hóa học thần kinh như vậy trong hỗn hợp phức tạp như huyết thanh người đòi hỏi phải tách chúng trước khi phát hiện Tuy nhiên, với phương pháp trên, tách và phát hiện các chất hóa học thần kinh đã được thực hiện trong vòng 650 giây mà không cần xử lý trước Đường chuẩn thu được có hệ số hồi quy là 0,98, 0,98 và 0,96; lần lượt cho dopamine, epinephrine và serotonin trong dung dịch chuẩn (PBS, 50 mM, pH 7, NaCl 0,9%) Giới hạn phát hiện (LOD) cho dopamine, epinephrine và serotonin khi phát hiện đồng thời ba chất phân tích lần lượt là 2,39; 3,59 và 4,56 μM Vì thể tích của từng chất phân tích chỉ là 0,67 μL trên chip, các LOD này tương ứng với 1,6, 2,4 và 3,05 pmol [54]

Phương pháp điện di mao quản kết hợp điện di đẳng điện mao quản và điện di vùng mao quản với phụ gia cyclodextrin, đã được phát triển để xác định hiệu quả serotonin trong nước tiểu người [50] Điện di đẳng điện phục vụ cho quá trình tách mẫu, làm sạch mẫu và làm giàu chất phân tích Cyclodextrin tăng cường khả năng tách chọn lọc của điện di mao quản vùng Theo cách này, serotonin có thể được tách thành công khỏi nền mẫu trước khi di chuyển trong bước điện di mao quản vùng, do đó nước tiểu người có thể được tiêm trực tiếp (tức là không cần chuẩn bị mẫu bên ngoài) vào máy phân tích Phương pháp đề xuất cho giới hạn phát hiện serotonin là 2,32 ng/mL; độ tuyến tính cao (hệ số hồi quy cao hơn

0,99); độ lặp lại của thời gian di chuyển và diện tích pic lần lượt nằm trong khoảng 1,17% và 5,25-7,88%; độ thu hồi 90,0-93,6% Phương pháp đã được áp dụng thử nghiệm trên các mẫu nước tiểu của người lấy từ những người tình nguyện khỏe mạnh Nồng độ serotonin xác định được trong các mẫu nằm trong khoảng 12,4 - 491,2 ng/mL

0,02-Phương pháp điện di mao quản (CE) với detector phát quang hóa học (CL) đã được Liangliang Zhang và cộng sự [87] phát triển để định lượng đồng thời axit 5-hydroxyindoleacetic (5-HIAA) và 5-hydroxytryptamine (5-HT) Trong phương pháp này, chấm lượng tử CdTe (QD) và peroxidase (HRP) được sử dụng làm thuốc thử tăng cường để đồng xúc tác phản ứng CL giữa luminol và hydrogen peroxide, cho phát xạ CL hiệu quả cao 5-HIAA và 5-HT ức chế phát xạ CL dẫn đến hình thành các đỉnh âm trong điện di đồ Mức độ ức chế CL tỷ lệ thuận với nồng độ 5-HT và 5-HIAA Khoảng tuyến tính để xác định 5-HIAA và 5-HT là 25-2500 nM và 25-5000 nM với giới hạn phát hiện (tín hiệu/nhiễu=3) lần lượt là 7,0 nM và 6,0 nM Độ chính xác trong ngày không vượt quá 5,0% Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 98% đến 104% Phương pháp hiện tại đã được áp dụng thành công để định lượng 5-HIAA và 5-HT trong nước tiểu người Nồng độ 5-HT và 5-HIAA trong nước tiểu người được tìm thấy nằm trong khoảng từ 0,78-1,2 μM và 3,2-5,1 μM [92]

1.1.2.5 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Một trong những phương pháp có chi phí thấp, nhanh và thuận tiện nhất để xác định serotonin là phương pháp quang phổ UV-Vis Đã có nhiều nghiên cứu xác định serotonin trên các nền mẫu đa dạng từ mẫu thuốc đến mẫu sinh học bằng phương pháp này

Phương pháp quang phổ đơn giản, chính xác và nhạy để phân tích các chất ức chế tái hấp thu serotonin có chọn lọc (SSRI) đã được phát triển dựa trên sự hình thành các phức

chuyển điện tích có màu giữa phân tử thuốc SSRI với vai trò chất cho n -electron và

tetracyanoquinodimethane (TCNQ) hoặc axit p -chloranilic (pCA) với vai trò chất nhận electron Các phức hình thành được đo bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 842 và 520 nm cho TCNQ và pCA Trong điều kiện phản ứng tối ưu, độ hấp thụ tuyến tính với nồng độ của các thuốc với hệ số tương quan tốt (0,9975-0,9996) trong khoảng nồng độ lần lượt là 450 và 20-400 µg/mL với TCNQ và pCA Với tất cả các loại thuốc được nghiên

cứu, TCNQ cho kết quả nhạy hơn pCA; giới hạn phát hiện của phép thử lần lượt là 2,5-4,8 và 20-40 g/mL với TCNQ và pCA Độ chính xác trong và giữa các phép thử đều đạt yêu cầu; độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 2% Các quy trình đề xuất đã được áp dụng thành công để phân tích các loại thuốc được nghiên cứu ở dạng tinh khiết và các công thức dược phẩm với độ chính xác cao, độ thu hồi là 98,4-102,8 ± 1,24-1,81 Các kết quả thu được từ phương pháp đề xuất có thể so sánh về mặt thống kê với các kết quả thu được từ các phương pháp đã báo cáo trước đó [11]

Tania M Godoy-Reyes và cộng sự đã nghiên cứu một phương pháp đơn giản, nhạy và chọn lọc để phát hiện serotonin (5-HT) trong môi trường nước bằng cách sử dụng các

hạt nano vàng (AuNP) [18] Đầu dò bao gồm AuNP được chức năng hóa bằng dithiobis

(succinimidylpropionate) (DSP) và N-acetyl-L-cysteine (NALC) DSP được chọn để phản ứng với nhóm amino của 5-HT, trong khi NALC được chọn để liên kết nhóm hydroxyl trong 5-HT thông qua liên kết hydro và tương tác tĩnh điện Tương tác kép giữa các hạt nano và nhóm hydroxyl và amino của serotonin dẫn đến sự kết tụ liên kết chéo giữa các hạt, làm màu của dung dịch chuyển từ đỏ sang xanh, có thể quan sát được bằng mắt thường Đầu dò chọn lọc với 5-HT và không biến đổi màu khi có mặt các chất dẫn truyền thần kinh khác (dopamine, epinephrine, norepinephrine), các phân tử sinh học được chọn (L-tyrosine, axit gamma-aminobutyric, L-cysteine, axit uric, axit oxalic, axit aspartic và axit glutamic) và các chất vô cơ phổ biến Giới hạn phát hiện thấp tới 0,1 μM trong dung dịch đệm ở pH 7 Đầu dò cho đáp ứng tương tự với 5-HT trong huyết thanh mô phỏng, với giới hạn phát hiện là 0,12 μM và khoảng tuyến tính từ 0-3 μM, nằm trong phạm vi nồng độ 5-HT được quan tâm trong lâm sàng Hiệu quả làm việc của đầu dò trong các mẫu máu người thật cũng đã được đánh giá và cho thấy khả năng phân biệt đáng kể giữa mức 5-HT bình thường và mức 5-HT biểu hiện bệnh

Serotonin đã được nghiên cứu xác định bằng cảm biến quang học dựa trên tổ hợp AuNPs-aptamer Khi chỉ có aptamer, aptamer có thể ngăn chặn sự kết tụ AuNPs do clorua gây ra vì chúng dễ dàng liên kết với các AuNP thông qua các bazơ của aptamer để tăng điện tích dương của bề mặt AuNPs Khi phức hợp serotonin và aptamer được hình thành, phức hợp này sẽ làm xáo trộn sự hấp phụ của aptamer trên AuNP, dẫn đến độ ổn định của

AuNP giảm và các hạt nano dễ dàng kết tụ Do đó, có thể xác định được nồng độ serotonin thông qua sự thay đổi màu sắc của dung dịch AuNPs, tương ứng với sự thay đổi cường độ hấp thụ cực đại trong phổ hấp thụ UV-Vis Cảm biến thể hiện độ nhạy tốt với giới hạn phát hiện là 1 ng/mL (5,7 nM) đối với serotonin, tương đương hoặc tốt hơn so với các phương pháp phát hiện so màu dựa trên các aptamer khác, đồng thời thể hiện khả năng chọn lọc với các chất có thể gây ảnh hưởng [27]

Như vậy, đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu phát triển để phát hiện serotonin nhạy và có chọn lọc trong các mẫu phức tạp, nhưng thường đòi hỏi thời gian dài, đắt tiền, cần thuốc thử và dung môi hóa học, cần xử lý phức tạp và chỉ có thể được thực hiện bởi nhân viên có trình độ Các phương pháp quang học thường có chi phí thấp và tương đối dễ thực hiện Việc sử dụng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trong phân tích xác định serotonin gần đây đã được công bố trong một số nghiên cứu Kết quả thu được cũng tương tự như các phương pháp khác nhưng chi phí thấp hơn, tiêu tốn một lượng mẫu nhỏ và thời gian phân tích ngắn Nhược điểm của phương pháp UV-Vis là độ chọn lọc đôi lúc không cao, nhiều chất dễ gây ảnh hưởng do hấp thụ cùng bước sóng với chất phân tích Để giải quyết vấn đề này, phương pháp UV-Vis thường được kết hợp với các phương pháp tách chiết để loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu, nhưng các bước xử lý mẫu này thường tốn khá nhiều thời gian và dung môi thường gây ô nhiễm môi trường Do đó, bằng cách tận dụng độ chọn lọc cao của aptamer, luận văn này hướng đến việc kết hợp hạt nano vàng và aptamer đặc hiệu để xác định nhanh serotonin bằng phương pháp UV-Vis

1.2 Nano vàng

Vàng (Au) là một kim loại hiếm, có cấu trúc lập phương tâm mặt được mệnh danh là vua của các kim loại và có giá trị vô cùng to lớn với con người chúng ta từ xưa đến nay Là nguyên tố kim loại đứng ở vị trí thứ 79 trong bảng hệ thống tuần hoàn Mỗi nguyên tử vàng liên kết với 12 nguyên tử xung quanh tạo nên cấu trúc xếp chặt chẽ Mỗi nguyên tử lại có các electron rất linh động nên ở dạng khối Hạt nano vàng có kích thước từ 1 nm đến 100 nm

Khi được chia nhỏ ở trạng thái phân tử có kích thước vài nanomet (nm), nguyên tố Au có rất nhiều đặc tính riêng biệt Trước tiên chúng sẽ thay đổi màu sắc chuyển từ màu vàng sang màu đỏ hoặc hoặc màu tím nhạt Sự chuyển màu này có được là do phân tử nano vàng không hấp thụ ánh sáng có bước sóng nằm trong vùng quang phổ như các miếng vàng khối thông thường

Hình 1 2 Hạt nano vàng (Au) với lớp điện kép trên bề mặt

Ở trạng thái nano, vàng có khả năng cố định các phân tử hữu cơ và phân tử sinh học (kháng nguyên và kháng thể) Vì vậy, các phân tử vàng có thể sử dụng trong rất nhiều

xét nghiệm sinh học hay chuẩn đoán y khoa 1.2.1 Tính chất của nano vàng

Các hạt nano vàng (AuNPs) là vật liệu có nhiều ứng dụng nhờ vào các tính chất vật lý, hóa học, điện tử và khả năng biến tính bề mặt của chúng Những tính năng này đã làm cho các hạt nano vàng trở thành một trong những vật liệu nano được sử dụng rộng rãi nhất cho nghiên cứu khoa học và là thành phần không thể thiếu trong các thiết bị y tế cũng như các sản phẩm công nghiệp trên toàn thế giới

Tính chất vật lý: Một trong những đặc điểm nổi trội của hạt nano vàng là tính chất

cộng hưởng plasmon bề mặt (SPR) Khi có tác động của ánh sáng tới với một tần số nhất định, chúng sẽ tương tác với các điện tử tự do trên bề mặt kim loại giàu điện tử (bề mặt hoạt động) dẫn tới sự hình thành các dao động đồng pha [21] Cộng hưởng plasmon bề mặt có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi kích thước hoặc hình dạng của các hạt nano, làm cho các hạt có đặc tính quang học phù hợp với các ứng dụng khác nhau [25] Đối với các hạt nano vàng đơn phân tán nhỏ (~30 nm), hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt gây ra sự hấp thụ ánh sáng ở phần xanh lục của quang phổ (~450 nm) trong khi ánh sáng đỏ

(~700 nm) bị phản xạ, tạo ra màu đỏ đậm màu sắc Khi kích thước hạt tăng lên, bước sóng hấp thụ liên quan đến cộng hưởng plasmon bề mặt chuyển sang bước sóng dài hơn, đỏ hơn và phản xạ ánh sáng xanh lam Khi kích thước hạt tiếp tục tăng, các bước sóng cộng hưởng plasmon bề mặt di chuyển vào phần IR của quang phổ và hầu hết các bước sóng nhìn thấy được đều bị phản xạ, làm cho các hạt nano có màu trong hoặc mờ Để giảm thiểu sự kết tụ, bề mặt của hạt nano vàng có thể được bọc bằng polyme, các phân tử nhỏ khác hoặc phân tử nhận dạng sinh học Nhờ sự chồng lấp tốt giữa phổ phát xạ của các chất huỳnh quang bị kích thích và dải plasmon bề mặt của AuNPs, các hạt nano Au có khả năng dập tắt huỳnh quang của các chất phát quang [1, 82]

Ngoài ra, các đặc tính như tỷ lệ bề mặt trên thể tích lớn, khả năng tương thích sinh học tốt và độc tính thấp [57] cũng là điều kiện giúp cho AuNPs trở thành một nhân tố quan trọng trong công nghệ sinh học

Tính chất hóa học: AuNP có thể hình thành liên kết hóa học ổn định với các nhóm

chứa S và N Điều này giúp cho AuNPs gắn vào nhiều loại phối tử hữu cơ hoặc polyme có chức năng cụ thể Những biến tính bề mặt này mang lại cho AuNPs khả năng tương thích sinh học, nhắm mục tiêu và phân phối thuốc vượt trội [28] Cụ thể, phối tử trên AuNP có thể bị thay thế bởi các thiol thông qua phản ứng trao đổi phối tử để tạo nên một lớp bảo vệ AuNPs Trong phương pháp này, các thiol bên ngoài sẽ thay thế các phối tử AuNPs hiện có qua một quá trình cân bằng Bên cạnh đó, liên kết không cộng hóa trị cũng là cách đơn giản để các phân tử liên kết với AuNPs, vì chúng có thể gắn thông qua các tương tác khác nhau như tương tác ái lực, tương tác tĩnh điện và tương tác kỵ nước Các tương tác không cộng hóa trị này được sử dụng rộng rãi trong các phân phối thuốc và cảm biến do tính chất dễ giải phóng và thuận nghịch của chúng Ngoài ra, liên kết cộng hóa trị của các phân tử với AuNPs giúp ổn định các liên kết, giúp tạo nên các cấu trúc ổn định [82]

1.2.3 Chế tạo nano vàng

Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương pháp từ trên xuống Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các nguyên tử kết hợp lại với nhau Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật liệu nano từ vật liệu khối ban đầu Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim,… phương pháp

thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên Nguyên tắc là khử các ion kim loại như Ag+, Au+ để tạo thành các nguyên tử Ag và Au Các nguyên tử sẽ liên kết với nhau tạo ra hạt nano Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này

Kể từ khi lần đầu tiên Faraday nghiên cứu sự tạo thành dung dịch nano vàng bằng cách khử AuCl+ bằng phospho năm 1857, đã có nhiều phương pháp tổng hợp dung dịch vàng nano được công bố Nói chung, phương pháp tổng hợp dung dịch vàng nano có thể được chia thành ba nhóm chính: nhóm phương pháp hóa học, nhóm phương pháp bức xạ và nhóm phương pháp khử sinh học Phương pháp bức xạ sử dụng các bức xạ tử ngoại, khả kiến, vi sóng, bức xạ gama [30],… để khử AuCl+ về Au0 khi có mặt chất ổn định thích hợp Phương pháp này cho hiệu suất tổng hợp cao nhưng yêu cầu phải có thiết bị tương ứng Nguyên tắc chung của phương pháp khử hóa học là sử dụng một chất khử để khử Au3+ trong muối vàng thành nguyên tử Au0, và sử dụng một chất bảo vệ để tránh sự kết tụ của các hạt lại với nhau Trong nhóm phương pháp này, trước hết phải kể đến phương pháp Turkevich, phương pháp này được phát minh bởi Turkevich và các cộng sự [16] vào năm 1951, sau đó được cải tiến bởi Frens vào năm 1970 và là một phương pháp tổng hợp vàng nano đơn giản nhất cho đến thời điểm hiện tại Nhìn chung, phương pháp này tạo ra các hạt vàng nano đơn phân tán dạng cầu tan trong nước với kích thước từ 10-20 nm với độ bền cao Quy trình tạo hạt vàng nano tạo thành nhờ phản ứng giữa dung dịch nóng chloauric với natri citrat Ở đây, natri citrat vừa đóng vai trò làm chất khử vừa là tác nhân làm bền

Phương pháp khử hóa học tiếp theo là phương pháp Brust, được Brust và Schiffrin [28] tìm ra vào đầu những năm 1990 Các hạt vàng nano chế tạo theo phương pháp này có kích thước trung bình khoảng 5-6 nm NaBH4 đóng vai trò là tác nhân khử, còn tetraoctylammonoum bromide (TOAB) đóng vai trò là chất xúc tác chuyển pha và chất làm bền Tuy nhiên, TOAB không bao bọc xung quanh hạt nano một cách bền vững, do đó dung dịch sẽ bị kết tủa sau khoảng thời gian 2 tuần Để hạn chế hiện tượng này, sử dụng một tác nhân làm bền mạnh hơn ví dụ như thiol (alkanethiol) để liên kết cộng hóa trị với

hạt vàng nano

Năm 2009, Perault và Chan [16] đã phát minh ra phương pháp mới để tổng hợp vàng nano (phương pháp Perault), sử dụng hydroquinone để khử HAuCl4 trong dung dịch có chứa sẵn các hạt vàng nano Trong phương pháp này, các hạt vàng nano có thể đóng vai trò là chất cầu nối với hydroquinone để xúc tác việc khử các ion vàng trên bề mặt Sự tồn tại các chất ổn định như các ion citrate có thể giúp các hạt lớn lên một cách có kiểm soát và tạo ra các hạt nano với kích thước rất lớn, khoảng 30-250 nm

Một phương pháp khử hóa học khác được nhóm tác giả Eah phát minh vào năm 2010, gọi là phương pháp Martin [12] Phương pháp này tạo ra các hạt vàng nano trong nước bằng cách khử HauCl4 bằng NaBH4 Mặc dù không sử dụng các chất hoạt động bề mặt như citrate, các hạt vàng nano vẫn có độ phân tán cao

Raveendran và cộng sự [20] lần đầu tiên sử dụng phương pháp xanh để tổng hợp vàng nano với dung môi nước, chất khử là 𝛽-D-glucose và chất ổn định là tinh bột Sau đó, nhóm tác giả này đã sử dụng β-D-glucose vừa làm chất khử và chất ổn định để tổng hợp vàng nano Bên cạnh glucose và tinh bột, chitosan là một polysacchride được sử dụng nhiều cho mục đích này bởi hai lý do sau: Thứ nhất chitosan là dẫn xuất của chitin – polysaccharide có mặt rộng rãi trong tự nhiên Thứ hai, sự có mặt của một lượng lớn các nhóm amino (-NH2) và nhóm hydroxyl (-OH) tự do trong mạch chitosan đã làm cho chitosan có những đặc tính hóa lý đặc biệt như polycation, tạo phức và tạo màng [4, 10] Theo Huang và cộng sự [10], chitosan là một polymer có tính tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, do đó ngày càng có nhiều công trình sử dụng chitosan để tổng hợp vàng nano

1.2.4 Ứng dụng của Nano vàng

Gần đây, AuNPs được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực công nghệ cao như quang điện hữu cơ, đầu dò cảm giác, tác nhân trị liệu, phân phối thuốc trong sinh học và y tế, chất dẫn điện tử và chất xúc tác Nano vàng còn được sử dụng để làm sạch không khí, bao gồm loại bỏ mùi hôi và khí CO có hại trong phòng, quản lý khí thải, lọc nước, pin năng lượng,…

Trong sinh y: Ứng dụng trong điều trị ung thư và khối u nhờ vào khả năng tương

thích sinh học tốt, nhắm mục tiêu và vận chuyển thuốc, AuNPs được sử dụng để chẩn đoán

và điều trị khối u [89] Khi biến tính bề mặt có thể làm tăng khả năng lưu giữ chúng trong các mô khối u và giảm sự tích tụ của chúng trong các mô khác Đồng thời, khi kết hợp với các loại thuốc hóa trị, protein hoặc axit nucleic thông qua hấp phụ tĩnh điện hoặc liên kết cộng hóa trị, AuNPs trở thành phương pháp phân phối nhắm mục tiêu khối u hiệu quả [82]

Trong phân tích: Nhờ tính chất quang học độc đáo, AuNPs được ứng dụng nhiều

trong lĩnh vực hóa phân tích Hiện tượng cộng hưởng plasma bề mặt hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến, giúp ta nghiên cứu sự hấp phụ các chất phân tích lên bề mặt hạt nano Cụ thể, xác định các cation kim loại nặng Pb2+, Cr2+, Hg2+ trong nước ô nhiễm [48], phát hiện DNA (97); xác định các anion như F-, các anion độc hại như CN- và AsO33-/ AsO43-, các chất hoạt động bề mặt dạng anion PFOS[15], các chất hữu cơ như axit nucleic, protein, acetamiprid [79], amoxicilin [3], dopamine [90], morphine, ibuprofen,…

Tuy nhiên, một trong những điểm yếu của hạt nano vàng là độ chọn lọc chưa cao, nhiều chất phân tích có thể tương tác với hạt nano vàng Để tăng độ chọn lọc, AuNPs thường được kết hợp với nhiều các phối tử đặc hiệu khác nhau như các phối tử hữu cơ, các kháng thể đặc hiệu, hay aptamer

1.3 Aptamer 1.3.1 Giới thiệu về Aptamer

Aptamer là một đoạn ngắn oligonucleotide (ADN hoặc ARN) hoặc peptide có cấu

trúc nhỏ hơn 100 nucleotide (Hình 1.3) Aptamer có khả năng liên kết với một phân tử đích

một cách đặc hiệu bởi ái lực cao và độ đặc hiệu về cấu trúc ba chiều [19, 43]

Hình 1 3 Cấu trúc và tương tác giữa aptamer và chỉ dấu sinh học

Aptamer được chọn lọc bằng phương pháp làm giàu phát triển hệ thống phối tử theo cấp số nhân (quy trình SELEX-Systematic Evolution of Ligands by Exponential

Enrichment) Công nghệ SELEX được áp dụng rộng rãi như một phương pháp chọn lọc in vitro (trong ống nghiệm) để tiến hóa các hạt nhân phối tử axit, được gọi là aptamer, với các

chức năng mới (Hình 1.4) [13, 71] Các bước chính: chuẩn bị thư viện aptamer, ủ thư viện

aptamer với chất đích, tách riêng các aptamer có thể liên kết với chất đích, làm giàu bằng phương pháp PCR Chu trình SELEX được lặp lại nhiều vòng (thường từ 6-12 vòng) để có thể sàng lọc được các aptamer có tính đặc hiệu và ái lực tốt nhất với chất đích

Hình 1 4 Chu trình SELEX

1.3.2 Tính chất của aptamer

Aptamer có tính ái lực và độ đặc hiệu cao, độ nhạy tốt Đặc biệt aptamer có tính ổn định khiến aptamers được sử dụng làm bộ phận nhận biết trong các cảm biến sinh học Kích thước nhỏ và tính linh hoạt của aptamer cho phép cố định chúng với mật độ cao trên các cảm biến, giúp tăng độ nhạy trong khi vẫn giữ được kích thước của thiết bị [65] Hơn nữa, các chất phân tích có thể được rửa khỏi aptamer bằng một số loại dung dịch đệm, cho phép tái sử dụng cảm biến nhiều lần

Tính ổn định của aptamer cũng là một khía cạnh quan trọng đối với sự phát triển của cảm biến sinh học Nhờ cấu trúc hóa học ổn định, các aptamer không cần phải bảo quản lạnh như đối với các các mAbs [42]

Aptamer được biết đến như một “kháng thể nhân tạo” với nhiều ưu điểm vượt trội

so với kháng thể Aptamer có khối lượng phân tử trong khoảng từ 5 đến 15 kDa và kích thước cỡ 3 đến 5 nm, nhỏ hơn so với kháng thể cả về khối lượng (khoảng 150 kDa đối với kháng thể IgG) và kích thước (12-15 nm) Aptamer có khả năng tương tác với các phân tử sinh học nhỏ như amino axit đến các phân tử lớn như protein, tế bào, virus, vi khuẩn cao hơn so với kháng thể [49] Bên cạnh đó, aptamer còn có khả năng đặc hiệu với các phân tử không đáp ứng miễn dịch như ion kim loại và các độc tố [29] Cấu trúc của aptamer có thể dễ dàng thay đổi bởi các phản ứng hóa học linh hoạt đáp ứng nhiều mục đích khác nhau Aptamer có thể gắn thêm các nhóm chức như thiol, disulfite, amin hoặc biotin giúp cố định trên bề mặt điện cực rắn hoặc gắn với các chất phát huỳnh quang (fluorophore) và chất hấp phụ quang (quencher) ứng dụng trong các cảm biến sinh học trên cơ sở phép đo quang học Aptamer có độ tinh khiết cao và khả năng tổng hợp số lượng lớn với chất lượng ổn định nhờ tính lặp lại của các phản ứng hóa học trong chuỗi tổng hợp SELEX Trong khi kháng thể được tách chiết từ sản phẩm của phản ứng miễn dịch trên các cơ thể sống nên hiệu suất của kháng thể là không đồng đều và phụ thuộc vào từng lô sản xuất [64, 67]

Ngoài ra, aptamer có tính ổn định cao hơn so với kháng thể: Tại điều kiện nhiệt độ cao, kháng thể dễ bị phân hủy và phá vỡ cấu trúc bậc ba trong khi các chuỗi oligonucleotide lại có tính ổn định nhiệt và khả năng duy trì cấu trúc [43] Hoạt tính của aptamer có thể lưu

giữ trong thời gian dài và không đòi hỏi điều kiện bảo quản phức tạp như đối với kháng thể Đặc biệt, giá thành và thời gian tổng hợp aptamer ngắn hơn hơn so với việc sản xuất các kháng thể, có khả năng tạo ra trong điều kiện in vitro không cần các đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm, không sinh đáp ứng miễn dịch khi sử dụng in vivo

1.3.2 Ứng dụng của aptamer

Aptamer là cơ chất cho nhiều enzym có vai trò quan trọng trong tế bào Aptamer hiện nay đang được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán, điều trị, vận chuyển thuốc, phát hiện độc tố Ứng dụng aptamer đặc hiệu với ricin trong sản xuất các sinh phẩm nhằm phát hiện nhanh Nó có thể đặc biệt nhận ra các phân tử mục tiêu như kháng thể và nhận biết các phân tử có kích thước nhỏ như các ion kim loại, các hợp chất hữu cơ và lớn như protein, tế bào, vi khuẩn [35,36,56,63]

Aptamer có khả năng liên kết chặt chẽ với các mục tiêu cụ thể So với các đối tác protein của chúng, aptamer cung cấp một số các ưu điểm bao gồm khả năng sinh miễn dịch thấp, tương đối dễ dàng tổng hợp quy mô lớn với chi phí hợp lý với ít hoặc không có sự thay đổi theo từng đợt, tính ổn định vật lý và biến đổi hóa học dễ dàng Những ưu điểm này đã đưa aptamer đi đầu trong nhiều ứng dụng thực tế như phát triển các tác nhân điều trị và chẩn đoán cũng như xây dựng các nền tảng cảm biến sinh học [69,84] Các aptamer biến đổi hóa học được sử dụng thành công trong phân phối thuốc, trong các ứng dụng trị liệu và làm thiết bị cảm biến sinh học

Ứng dụng aptamer trong cảm biến sinh học:

Theo số liệu thống kê số các bài báo trên website Science Direct đã có rất nhiều nghiên cứu đáng chú ý và có tiềm năng ứng dụng cao trong thực tế về cảm biến sinh học dựa trên aptamer đặc hiệu trên nguyên tắc ghi nhận tín hiệu quang học như phổ hấp thụ, huỳnh quang, lân quang, phổ tán xạ Raman, phổ nhiễu xạ, phổ tán sắc,… Các cảm biến sinh học này sử dụng bộ chuyển đổi quang có độ nhạy cao, thời gian đáp ứng nhanh Trong vòng 23 năm, đã có gần 5000 bài báo về aptasensor đã được xuất bản, riêng quý 1 của năm

2024 đã có hơn 250 bài báo được đăng tải (theo pubmed.gov) (Hình 1.6) Mặc dù chỉ mới

được nghiên cứu và phát triển trong thời gian ngắn nhưng đã có nhiều công trình về aptasensor mang tính ứng dụng thực tiễn cao, có triển vọng trong các lĩnh vực sinh hóa

Hình 1 5 Số lượng các công bố khoa học bằng tiếng Anh về aptasensor

Nguồn: pubmed.gov

Nhờ độ nhạy cao, phương pháp phân tích nhanh chóng và đơn giản [36; 84], aptamers đã trở thành một công cụ triển vọng để chẩn đoán ung thư, tế bào ung thư, biệt hóa các tế bào, các phân tử ảnh hưởng đến hành vi của khối u, hoặc dấu ấn sinh học của tế bào ung thư và các bệnh truyền nhiễm [35] Gần đây, Saraf và nhóm nghiên cứu (2019) đã phát triển một thiết bị để chẩn đoán đồng thời vi rút chikungunya và zika bằng cách sử dụng các aptamer đặc hiệu với protein màng bọc virus (viral envelope protein) và hạt nano vàng Bằng phương pháp đo màu, aptasensor này có thể chuẩn đoán chính xác nồng độ của protein màng bọc virus tới cỡ 100 pM trong mẫu máu [56] Ngoài ra, các cảm biến sinh học dựa trên aptamer đã được nghiên cứu thành công để phát hiện nhanh chóng các mầm bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, như virus Dengue 2, virus cúm H3N2 và H1N1, và virus Ebola [5, 9, 63]

Ngoài những nghiên cứu sử dụng aptamer để xác định các bệnh nguy hiểm, aptamer còn được sử dụng để phát triển các cảm biến sinh học theo dõi nồng độ thuốc trong trị liệu Federico Polo và các cộng sự (2021) đã sử dụng aptamer đặc hiệu để phát triển nền tảng cảm biến sinh học phát hiện và theo dõi thuốc điều trị ung thư imatinib trong huyết tương Cảm biến sinh học này có thể phân tích nhanh chóng và chính xác nồng độ imatinib với giới hạn phát hiện cỡ 0,4 µM Kết quả nghiên cứu cho thấy độ chọn

0200400600800

lọc và hiệu quả của cảm biến có thể vượt qua những quy định nghiêm ngặt của FDA, và cung cấp một công cụ xác định nồng độ imatinib hỗ trợ các bác sĩ trong quá trình điều trị cho bệnh nhân ung thư [84]

Cảm biến sinh học dựa trên aptamer còn được ứng dụng trong việc phát hiện những độc tố gây hại cho cơ thể có trong thực phẩm, dược phẩm Pengfei Yu và các cộng sự (2024) đã thành công sử dụng phương pháp aptamer quang điện hóa dựa trên tiếp xúc dị thể BiOI/CdWO4 và chấm lượng tử Ag2S để phát hiện ochratoxin A (OTA), một loại nấm nguy hiểm và có thể gây ung thư thường xuất hiện trong các sản phẩm từ tinh bột với giới hạn phát hiện là 0,823 pg/mL Cảm biến aptamer PEC được thiết kế với dị vòng BiOI/CdWO4 là một vật liệu hoạt động quang điện tử có độ ổn định hóa học vượt trội AgNO3 và Na2S được chọn để phát triển tại chỗ các chấm lượng tử Ag2S, được làm nhạy để tăng cường khả năng hấp thụ ánh sáng khả kiến và thúc đẩy quá trình tạo ra dòng quang Nhờ vậy mà cảm biến có độ ổn định, độ nhạy và khả năng tái tạo đặc biệt, giúp khả năng phát hiện OTA một cách hiệu quả và nhạy [83]

Sự kết hợp giữa aptamer và hạt nano vàng đã được nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới ứng dụng trong việc phân tích nhiều đối tượng khác nhau từ các đại phân tử sinh học đến các chất hữu cơ trong môi trường Liên hợp nano vàng và aptamer có thể được tạo ra bằng cách hấp phụ aptamer lên trên bề mặt AuNPs hoặc thông qua liên kết với nhóm thiol [47; 86] Về cơ bản, sự thay đổi màu của liên hợp Apt-AuNPs phụ thuộc vào sự kết tụ của các hạt nano vàng trong dung dịch Khi không có chất phân tích, các Apt-AuNPs bị phân tán và khiến dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu xanh lam/tím Sau khi tạo liên kết với chất phân tích, aptamer sẽ thay đổi cấu trúc và làm thay đổi bề mặt của hạt nano vàng và dung dịch có màu đỏ Borghei và cộng sự (2016) đã phát triển một phương pháp đo màu đơn giản và có độ nhạy cao để phát hiện các tế bào ung thư vú MCF-7, sử dụng liên hợp aptamer nucleotide-vàng nano AS 1411 (AuNPs) Phương pháp này giúp phát hiện tế bào ung thư vú ở nồng độ thấp chỉ 10 tế bào MCF-7 [7] Ngoài ra, nhóm nghiên cứu Shayesteh (2020) đã kết hợp aptamer polyA (polyA apt) và các hạt nano vàng để phát triển một aptasensor phát hiện kanamycin (KAN) trong mẫu huyết thanh[62]

Cảm biến này không yêu cầu chuẩn bị mẫu phức tạp, và có thể được thực hiện trong vài phút mà không cần dụng cụ đắt tiền hoặc người sử dụng có tay nghề cao Cảm biến cũng có một tuyến tính rộng từ 1-300 nM với giới hạn phát hiện là 0,05 nM KAN Kết quả này cho thấy tính khả thi của việc sử dụng aptasensor theo dõi nồng độ KAN trong các ứng dụng lâm sàng Ngoài ra, sự kết hợp giữa aptamers với hạt nano vàng cũng được sử dụng rộng rãi để phát triển phương pháp phân tích quang học xác định chính xác nhiều loại kháng sinh như ampicilin [61], streptomycin [14, 39], neomycin B [33], và tobramycin [23; 41] Cảm biến sinh học aptamer không chỉ được nghiên cứu trong phạm vi phòng thí nghiệm mà đã phát triển thành các sản phẩm thương mại ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y tế, môi trường và công nghệ thực phẩm Hiện nay, xu hướng phát triển của cảm biến sinh học aptamer đang được các nhóm trên thế giới tập trung nghiên cứu là ứng dụng cảm biến trong các thiết bị phân tích cầm tay, thiết bị xét nghiệm y sinh tại chỗ (POC- point of care)

Cảm biến sinh học dựa trên các aptamer đặc hiệu đã bắt đầu được nghiên cứu tại Việt Nam trong những năm gần đây Đối tượng phân tích rất đa dạng từ các chất hữu cơ, các đại phân tử sinh học cho đế các vi sinh vật [70] Bằng cách sử dụng aptamer và nano vàng, nhóm nghiên cứu của PGS TS Lê Quang Huấn và Nguyễn Trường Giang (2021) đã phát triển thành công aptasensor điện hóa sử dụng aptamer đặc hiệu xác định dư lượng neomycin trong sữa [69] Nghiên cứu cũng cho thấy kết quả phân tích neomycin trong 20 mẫu sữa bổ sung kháng sinh cho thấy kết quả tương đồng với kết quả phân tích được bằng phương pháp LC-MS/MS.Trong một nghiên cứu của PGS TS Chử Đức Trình tại Bộ khoa học và công nghệ- Cục thông tin và khoa học công nghệ quốc gia đã phát triển hệ thống vi lỏng để kết hợp với aptamer nhằm phát hiện tế bào ung thư Phương pháp này mở ra một triển vọng mới cho việc chẩn đoán trong phòng thí nghiệm một cách nhanh chóng bệnh ung thư cũng như các bệnh chuyển hóa khác Hơn nữa, các thiết bị được đề xuất là tương đối đơn giản và có thể được áp dụng trong các ứng dụng xét nghiệm tại chỗ Thiết bị này có thể là một công cụ hữu ích trong các lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng, xét nghiệm sinh học, và y sinh học

Kết luận chương 1:

Serotonin là một chất dẫn truyền thần kinh trong hệ thần kinh trung ương cần thiết cho nhiều chức năng của não và liên quan đến lo lắng và hành vi Việc phát hiện và định lượng chính xác serotonin cung cấp thông tin chính xác về sự mất cân bằng của các chất nội sinh trong não, cho phép đưa ra pháp đồ điều trị hiệu quả với từng cá nhân Hiện nay, cảm biến sinh học là loại cảm biến linh hoạt có thể phát hiện phân tích định lượng hoặc bán định lượng của chất cần phân tích thông qua việc sử dụng đầu thu sinh học được cố định lên bộ phận chuyển đổi tín hiệu Một trong những vật liệu được ứng dụng chế tạo các cảm biến là các hạt nano vàng (AuNPs) Hạt nano vàng là một loại hạt nano có kích thước từ 1 đến 100 nanomet, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y tế, điện tử, và hóa học do các đặc tính độc đáo của nó như khả năng hấp thụ và phản xạ ánh sáng, khả năng chống oxi hóa và khả năng tương tác với các phân tử khác Tuy nhiên, một trong những điểm yếu của hạt nano vàng là độ chọn lọc chưa cao, nhiều chất phân tích có thể tương tác với hạt nano vàng Để tăng độ chọn lọc, AuNPs thường được kết hợp với nhiều các phối tử đặc hiệu khác nhau như các phối tử hữu cơ, các kháng thể đặc hiệu, hay aptamer Trong đó, các aptamer đặc hiệu đã bắt đầu được nghiên cứu kết hợp với hạt nano trong các cảm biến sinh học hiệu quả Aptamer là một loại oligonucleotide hoặc peptit có khả năng gắn kết với một mục tiêu cụ thể với độ chính xác cao Khi kết hợp với hạt nano vàng, aptamer có thể được sử dụng để phát hiện chọn lọc nhiều chất phân tích khác nhau Hạt nano vàng hoạt động như một dẫn truyền tín hiệu, còn aptamer hoạt động như một “khóa” cho “ổ khóa” của chất phân tích Khi chất phân tích gắn kết với aptamer, nó thay đổi cấu trúc của aptamer, dẫn đến sự thay đổi trong tín hiệu của hạt nano vàng Điều này cho phép phát hiện và định lượng chính xác nồng độ của chất phân tích trong mẫu Hệ thống này không chỉ đơn giản và nhanh chóng, mà còn có độ nhạy và độ chính xác

Từ các thông tin tổng quan được, mục tiêu của luận văn là phát triển một cảm biến sinh học mới, dựa trên sự kết hợp giữa hạt nano vàng và aptamer đặc hiệu cho phép xác định một cách chính xác và chọn lọc serotonin trong mẫu sinh học bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

CHƯƠNG II : THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu phát hiện chọn lọc và chính xác các chất dẫn truyền thần kinh serotonin trong mẫu sinh học bằng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng tổ hợp hạt nano vàng (AuNPs) và aptamer

2.1.2 Nội dung nghiên cứu:

Nội dung nghiên cứu khoa học gồm:

1 Tổng hợp các hạt nano vàng (AuNPs) bằng phương pháp Turkevich 2 Đánh giá khả năng kết hợp aptamer và AuNPs để xác định serotonin:  Khảo sát đặc trưng của dung dịch aptamer và nano vàng

 Khảo sát quy trình phân tích serotonin  Khảo sát tín hiệu huỳnh quang của aptamer-comp-sero FAM  Khảo sát thế zeta của dung dịch Aptamer- AuNPs

3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp xác định serotonin bằng Apt-AuNPs sử dụng phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-Vis:

 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng: muối và pH  Khảo sát thời gian ủ aptamer và serotonin với nano vàng  Khảo sát thời gian ủ aptamer với serotonin

4 Đánh giá phương pháp phân tích:  Xây dựng đường chuẩn

 Xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)  Đánh giá độ đúng thông qua sai số của đường chuẩn

 Đánh gía độ chính xác thông qua độ lặp  Đánh giá độ chọn lọc

5 Xác định hàm lượng serotonin trong mẫu huyết tương

2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tổng hợp dung dịch nano vàng bằng phương pháp Turkevich

Hạt nano Au được điều chế theo phương pháp Turkevich và các cộng sự [72] trong đó muối HAuCl4 được khử xuống Au bằng natri citrate

2HAuCl + 3C6H8O7 (acid citric) → 2Au + 3C5H6O5 (3-ketoglutaric acid) + 8HCl + 3CO2

Hình 2 1 Cơ chế tạo hạt nano vàng từ natri citrate

Cơ chế tạo hạt nano vàng như sau: phản ứng citrate khử HAuCl4 tạo ra mầm tinh thể vàng có xu hướng co cụm lại với nhau để cực tiểu hóa bề mặt Tuy nhiên sự bao bọc của các ion citrate tích điện âm quanh hạt nano vàng với vai trò như một chất hoạt động bề

mặt sẽ ngăn cản sự co cụm của các tinh thể tạo thành các hạt vàng có kích thước nhỏ (Hình 2.2)

Hình 2 2 Nano vàng được bảo vệ bởi một lớp anion citrate

AuNPs