Nghiên cứu sàng lọc và thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin

LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan kết luận văn em thực hướng dẫn PGS.TS Lê Quang Huấn, TS Lã Thị Huyền Các số liệu kết luận văn chưa cơng bố cơng trình khác Ký tên Đoàn Thị Mai i LỜI CẢM ƠN Trong q trình làm thực tập sinh phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật _ Viện Công nghệ Sinh học _ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam em giao đề tài: “Nghiên cứu sàng lọc thu nhận aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin” Lời em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Quang Huấn, TS Lã Thị Huyền tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ em giúp em tiếp xúc, thêm hiểu biết hoàn thành công việc thời gian qua Em xin cảm ơn Ths Lê Thị Hạnh, Ths Lê Thị Minh Phúc, Ths Đặng Thị Minh Lụa hướng dẫn, bảo tận tình, ln theo sát tạo điều kiện tốt cho em suốt trình em học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật nhiệt tình bảo em giúp em hồn thành tốt công việc giao Cuối em xin gửi lời cảm tới gia đình bạn bè động viên giúp em hồn thành tốt cơng việc Hà Nội, ngày 19 tháng năm 2015 ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BẢNG Error! Bookmark not defined MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kháng sinh Neomycin 1.1.1 Giới thiệu kháng sinh Neomycin 1.1.2 Kháng sinh chăn nuôi 1.1.3 Dư lượng kháng sinh mẫu thực phẩm 1.1.4 Các thông tin hàm lượng kháng sinh an toàn thực phẩm 1.1.5 Các phương pháp xác định dư lượng kháng sinh 10 1.2 Tổng quan aptamer 12 1.2.1 Giới thiệu aptamer 12 1.2.2 Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of ligands by Exponential enrichment) sàng lọc aptamer 14 1.2.3 Tình hình nghiên cứu aptamer ngồi nước 15 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Sinh phẩm 19 iii 2.1.2 Hóa chất: 19 2.1.3 Thiết bị máy móc 19 2.1.4 Môi trường dung dịch nuôi cấy 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp PCR 20 2.2.2 Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer 23 2.2.3 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 27 2.2.4 Phương pháp điện di gel agarose 27 2.2.5 Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 28 2.2.6 Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E coli DH5α 30 2.2.7 Phương pháp tách DNA từ vi khuẩn E coli chủng DH5α 31 2.2.8 Phương pháp ELISA 33 2.2.9 Phương pháp giải trình tự nucleic acid tự động 35 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 36 3.1 Kết sàng lọc aptamer liên kết kháng sinh Neomycin 36 3.1.1 Kết tạo thư viện 36 3.1.2 Kết sàng lọc aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin 37 3.2 Kết tách dòng aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin 43 3.2.1 Nhân trình tự aptamer ssDNA liên kết kháng sinh Neomycin 43 3.2.2 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng 44 3.2.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli 45 3.2.4 Kết tách plasmid từ vi khuẩn ecoli………………………… …….47 iv 3.3 Kết xác định khả liên kết kháng sinh Neomycin aptamer 48 3.4 Xác định trình tự aptamer đặc hiệu kháng sinh Neomycin………………….51 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ATTP An toàn thực phẩm Bb Cặp base BSA Bovine Serum Albumin DMSO Dimethyl sulphat DNA Axit deoxyribonucleic DNase Enzym DNase EDTA Axit ethyenediaminetetraacetic E coli Vi khuẩn Escherichia coli IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base KN-KT Kháng nguyên- kháng thể LB Môi trường luria Bertani MPBS Milk Phosphate buffer saline PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp RT –PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực RNase Enzym RNase RNA Axit ribonucleic ssDNA DNA sợi đơn vi dsDNA DNA sợi đôi SDS Natri dodeyl sulphat TAE Tris acetate EDTA Taq polymerase Enzym polymerase chịu nhiệt TMB Tetramethylbenzidine TPBS Tween Phosphate buffer saline X – gal - Bromo - Clorua – indodyl –β – D galactoside vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ chế tác động kháng sinh Neomycin Hình 1.2: Cấu trúc aptamer liên kết với kháng sinh Neomycin 12 Hình 1.3: Các ứng dụng nucleic acid aptamer 13 Hình 1.4: Quy trình sàng lọc SELEX 14 Hình 2.1: Ba giai đoạn chu kì phản ứng PCR 21 Hình 2.2: Sản phẩm phản ứng PCR tăng theo cấp số nhân 22 Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo vector tách dòng pCR2.1 _TOPO 29 Hình 3.1: Kết phản ứng PCR làm giàu thư viện 36 Hình 3.2: Quá trình cắt dsDNA sử dụng enzym ࣅ exonuclease 37 Hình 3.3: Kết PCR với khn ssDNA sau vịng sàng lọc I với cặp mồi ApF2/ApR2-Ph 39 Hình 3.4: Kết PCR sau vòng III vòng IV 41 Hình 3.5: Kết PCR sau vòng VI 41 Hình 3.6: Kết PCR vịng VII 42 Hình 3.7: Quy trình tách dịng aptamer ssDNA liên kết đặc hiệu kháng sinh Neomycin 43 Hình 3.8: Kết PCR sau vịng loại trừ 44 Hình 3.9: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli chủng DH5α 45 Hình 3.10: Kết PCR từ khuẩn lạc 47 Hình 3.11: Kết tách plasmid từ vi khuẩn E coli 47 Hình 3.12: Hình thể nồng độ ssDNA tiến hành PCR với mồi ApF2/ApR2-Biotin hóa 49 Hình 3.13: Kết ELISA aptamer ssDNA với kháng sinh Neomycin 50 Hình 3.14: Biểu đồ thể khả gắn kết aptamer đặc hiệu Neomycin 50 viii Hình 3.15: Kết xác định trình tự nucleotide dịng chứa aptamer số có khả gắn kết với Neomycine 51 Hình 3.16: Cấu trúc khơng gian aptamer (dịng số 6) có khả gắn kết với Neomycin 52 ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Dư lượng tối đa kháng sinh neomycin thực phẩm…………… Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR làm giàu thư viện 23 Bảng 2.2: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR làm giàu thư viện 23 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng tạo sợi đơn DNA 24 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng 29 Bảng 3.1: Nồng độ ssDNA sau vòng sàng lọc I 38 Bảng 3.2: Tóm tắt điều kiện nghiêm ngặt tăng dần cho vòng sàng lọc 40 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng PCR 2.1 44 Bảng 3.4: Các thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc 46 Bảng 3.5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR từ khuẩn lạc 46 Bảng 3.6: Nồng độ ssDNA tiến hành PCR với mồi ApF2 -Biotin/ApR2 48 x 3.2 Kết tách dòng aptamer liên kết với kháng sinh neomycin Để tìm phân tử aptamer có khả liên kết tốt với Neomycin hỗn hợp aptamer ssDNA vừa thu trên, cần tiến hành tách dòng chọn dòng aptamer liên kết đặc hiệu với kháng sinh Neomycin Hình 3.7: Quy trình tách dòng aptamer ssDNA liên kết đặc hiệu kháng sinh Neomycin 3.2.1 Nhân trình tự aptamer ssDNA liên kết kháng sinh Neomycin Dịch sàng lọc sau vòng loại trừ đưa vào quy trình tách dịng xác định trình tự Đầu tiên, cần tiến hành PCR để tăng số aptamer ssDNA gắn đặc hiệu với kháng sinh Neomycin Cách tiến hành sau: Lấy 5µl dịch qua cột vịng sàng lọc để làm khn cho phản ứng PCR Cách tiến hành trước 43 M Sản phẩm PCR 100 bp Hình 3.8: Kết PCR sau vòng loại trừ Đường chạy M: Thang DNA 100 bp; Đường chạy 1-2: Sản phẩm phản ứng PCR Sản phẩm PCR băng rõ nét có kích thước 100 bp Sản phẩm sử dụng để tách dịng giải trình tự 3.2.2 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng Sản phẩm PCR gắn vào vector tách dòng PCR 2.1 - TOPO với thành phần phản ứng bảng 3.3 Bảng 3.3: Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng PCR 2.1 Thành phần Thể tích (µl) Vector pCR2.1 - TOPO Đệm Sản phẩm PCR Tổng thể tích 44 Phản ứng thực 22oC Sau sản phẩm biến nạp vào tế bào khả biến DH5α phương pháp sốc nhiệt, sau thời gian ni hoạt hóa, dịch vi khuẩn cấy trải mơi trường có kháng sinh kanamycin, Xgal, IPTG để chọn dòng tái tổ hợp mang sản phẩm PCR 3.2.3 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli Kết biến nạp thể hình 3.9: Trên đĩa biến nạp xuất khuẩn lạc xanh, trắng xen kẽ nhau, khuẩn lạc trắng khuẩn lạc có khả mang sản phẩm PCR Hình 3.9: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli chủng DH5α Những tế bào mang vector tái tổ hợp mọc mơi trường kháng sinh Tuy nhiên có khuẩn lạc trắng mọc khơng chứa đoạn gen ta quan tâm Vì vậy, ta tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc mọc riêng rẽ sử dụng cặp mồi ApF2/ApR2 để chọn dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp 45 Bảng 3.4: Các thành phần phản ứng PCR từ khuẩn lạc Thành phần Nồng độ PCR MM 2X 6,25 Mồi xi 10 pmol/µl 0,5 Mồi ngược 10 pmol/µl 0,5 DNA khn (TV gốc ) Thể tích (µl) 10-100 ng/µl 0,25 H 20 Tổng thể tích 13 Bảng 3.5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR từ khuẩn lạc Nhiệt độ 94 94 55 72 72 ∞ phút 45 giây 45 giây 45 giây phút ∞ C Thời gian 25 chu kỳ Kết điện di kiểm tra dòng khuẩn lạc sau: 46 M Sản phẩm PCR Sản phẩm PCR Hình 3.10: Kết PCR từ khuẩn lạc Đường chạy M: Thang DNA 100 bp; Đường chạy 1-6: Sản phẩm PCR với cặp mồi ApF2/ApR2 3.2.4 Kết tách DNA plasmid từ vi khuẩn E coli Sau kiểm tra sơ PCR từ khuẩn lạc, dòng khuẩn lạc chọn nuôi môi trường LB để nhân lên với số lượng lớn tiến hành tách chiết plasmid để kiểm tra dòng vector mang gen trước giải trình tự Quy trình tách chiết trình bày mục 2.2.8 Tiến hành điện di kiểm tra 3/6 plasmid tách từ dòng khuẩn lạc thể hình 3.11 Hình 3.11: Kết tách plasmid từ vi khuẩn E coli Đường chạy – 3: Sản phẩm tách plasmid 47 Từ kết điện di cho thấy sản phẩm plasmid tái tổ hợp khuẩn lạc riêng biệt tương đối sạch, khơng bị lẫn RNA, dịng plasmid tái tổ hợp đủ tiêu chuẩn để làm mẫu giải trình tự Tuy nhiên, dịng plasmid thu được, để chọn dịng chứa aptamer có khả gắn kết với neomycin tốt nhất, tiến hành xác định khả liên kết dịng aptamer thu với kháng sinh Neomycin thơng qua phản ứng ELISA 3.3 Kết xác định khả liên kết kháng sinh neomycin aptamer Sau tách riêng rẽ dòng aptamer, tiến hành PCR dòng aptamer sử dụng cặp mồi ApF2 _ Biontin/ApR2 Nồng độ ssDNA sau PCR trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6: Nồng độ ssDNA tiến hành PCR với mồi ApF2_Biotin/ApR2 ssDNA Nồng độ (ng/ µl) Apamer 318,60 Aptamer 274,13 Aptamer 310,85 Aptamer 333,81 Aptamer 313,73 Aptamer 418,60 48 Hình 3.12: Hình thể nồng độ ssDNA tiến hành PCR với mồi ApF2_Biotin/ApR2 Mồi ApR2 giảm 100 lần để tạo ssDNA có 5’- Biotin bổ sung kháng thể cộng hợp Streptavidin _ Peroxidase tạo thành phức hệ Nồng độ ssDNA khác nên ta tiến hành pha loãng aptamer nồng độ 274,13 ng/µl để aptamer có nồng độ phục vụ cho giai đoạn sau Các aptamer gắn với kháng sinh Neomycin _ BSA Và sử dụng phức kháng sinh Neomycin _ aptamer để chọn dịng aptamer có khả liên kết đặc hiệu với kháng sinh Neomycin qua phản ứng ELISA trực tiếp Kết kiểm tra ELISA thể hình 3.13 3.14 49 1 2 PBS PBS Hình 3.13: Kết ELISA aptamer ssDNA với kháng sinh Neomycin Giếng 1_6: Hình ảnh ELISA kháng sinh Neomycin với aptamer Neomycin với aptamer 6; Giếng 7: PBS Tiến hành đo mẫu máy đo huỳnh quang bước sóng OD = 630nm OD = 450nm Hiệu OD450 -630 thể hình 3.14: OD Hình 3.14: Biểu đồ thể khả gắn kết aptamer đặc hiệu Neomycin 50 Cột 1-6: Khả liên kết Neomycin với aptamer - Neomycin với aptamer 6; Cột 7: PBS (đối chứng) Qua hình ta thấy aptamer dòng số liên kết với kháng sinh Neomycin mạnh Như vậy, chúng tơi chọn dịng aptamer có lực cao với kháng sinh đích 3.4 Xác định trình tự aptamer đặc hiệu kháng sinh neomycin Theo kết ELISA chúng tơi lựa chọn dịng số chứa aptamer có khả gắn kết với Neomycine cao để xác định trình tự nucleotide kết xác định trình tự nucleotide dịng số trình bày hình 3.15 trình tự nucleotide cụ thể là: 5’-TCCGTCACACCTGCTCTCATAAGAGAGTCTGAGTAGGATGAGACTAGACAAGGTCCCAGGGGGAAGCTTTGGTGTTGGCTCCC GTAT-3’ Hình 3.15: Kết xác định trình tự nucleotide dịng chứa aptamer số có khả gắn kết với Neomycin Kết phân tích cấu trúc khơng gian aptamer (dịng số 6) có khả gắn kết với Neomycine phần mềm Mfold (http://mfold.rna.albany.edu/?q= mfold/DNA-Folding-Form) trình bày hình 3.16 51 Hình 3.16: Cấu trúc khơng gian aptamer (dịng số 6) có khả gắn kết với Neomycin Như phần nguyên liệu phương pháp trình bày, thư viện mà chúng tơi sử dụng có cấu trúc chung 5’- ATC CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG -N40AAG CTT TGG TGT TGG CTT CCG TAT -3’, nghĩa bao phủ vùng biến đổi 40 vị trí vùng định (vùng để bắt cặp primer trình sàng lọc nhân PCR) Vậy sàng lọc lại nhận aptamer có vùng biến đổi chi gồm 52 nucleotide Để giải thích vấn đề cho nguyên nhân trình tổng hợp thư viện gốc có trình tự dài ngắn khác hình thành, hay nói cách khác thư viện có chứa các trình tự mà vùng biến đổi khơng phải 40 vị trí mà nhiều Để làm rõ vấn đề cần có nhứng nghiên cứu đánh giá biến thiên chiều dài aptamer sau tổng hợp, đánh giá chất lượng tinh sợi DNA sau tổng hợp 52 KẾT LUẬN
Đã xây dựng quy trình sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Neomycine theo quy trình SELEX với phân tử đích sử dụng trình sàng lọc Neomycine
Đã sàng lọc aptamer có khả gắn kết với Neomycine có kích thước 52 bp khơng kể vùng định có khả gắn kết với Neomycine đánh giá ELISA Cấu trúc không gian aptamer xác định phần mềm Mfold 53 KIẾN NGHỊ Nghiên cứu sử dụng aptamer có khả gắn kết với Neomycine sàng lọc để tạo KIT xác định nhanh Neomycine sữa loại thực phẩm khác 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt PGS.TS Cao Văn Thu (2015), giáo trình Kháng Sinh Hà PGS.TS Mai Phương Mai, Giáo trình Dược lý học Hà Nội: NXB Y Học Tài liệu tiếng Anh Baugh, C, D Grate, C.Wilson (2000), “2.8 angstrom crystal structure of the malachite green Aptamer”, J Mol Biol 301 : 117 _128 4.Bolger M, Coker R D DiNovi M, Gaylor D, Gelderblom W, OlsenM, Speijers G J A, Fumonisins (2001) “ WHO / IPCS safety evaluation of certain mycotoxin in food” WHO Food Additives Series, 47, pp.557 – 680 Cheli F, Pinotti L, Campagnoli A, Fusi E, Rebucci R, Baldi A (2008), “Mycotoxin analysis, mycotoxin-producing fungi assays and mycotoxin toxicity bioassays in food mycotoxin monitoring and surveillance”, Italian Journal of Food Science,20, 4, pp 447 – 462, 1120 1170 David JH & Szostak JW (2002), Isolation of high _ affinity GTP aptamer from partially sructured RNA libraries”, Proc Nalt Acad Sci USA 99, 1161611621 Dieckmann T, E fujikawa, X Xhao, J Szostak, J Feigon (1995), “ Structural Investigations of RNA and DNA aptamer in Solution”, Journal of Cellular Biochemistry : 56-56 Ellington AD & Szostak JW (1992), “ Selection In vitro of single_strand DNA molecules that fold into specific ligand _ binding structures”, Nature,355, 850-852 Grate D., & Wilson C (1999), “ Laser – mediated, site – specific inactivation of RNA trancripts”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , 96, 11, (May 25), pp.6131 – 6136, 0027 – 8424 55 10 Kim M, Um H J, Bang S, Lee S H, Oh S J., Han J H., Kim Y H (2009), “Arsenic removal from vietnamxsese groundwater using the arsenic _ binding DNA aptamer”, Environmental Science & Technology, 43,24, (Dec 15), pp.9335-9340, 0013 – 936X 11 Kyung – Mi Song, Seonghwan Lee, and Changill Ban (2012), “ Aptamer and their biological applications”, Sensors (Basel) 2012;12(1):612 – 631 12 Liu M, T Kagahara, H.Abe, Y.Ito (2009), “Direct In Vitro Selection of Hemin – Binding DNA Aptamer with Peroxidase Activity”, Bullentin of the Chemical Society of Japan 82 : 99 -104 13 Ng, EWM, DT Shima P., Calias, ET Cunningham, DR Guyer, AP Adamis (2006), “Pegaptanib, a targeted anti – VEGF Aptamer for ocular vascular disease” Nature Reviews Drug Discovery (2) :123 -132 14 Stead S L., Ashwin H., Johnston B., Dallas A.; Kazakov S A., Tarbin J.A., Keely B J (2010), “An RNA – Aptamer – based assay for the detection and analysis of malachite green and leucomalatite green residues in fish tissue” Analytical Chemistry, 82, 7, (Apr 1), pp.2652 – 2660, 1520 -6882; 0003- 2700 15 Tuerk C & Gold L (1990), “ Systematic evolution of lignads by exponential enrichment: RNA lignads to bacteriophage T4 DNA polymerase”, Science, 249, 505-510 16 Xu J P., Fang Y., Mei J., Jia L., Qin A J., Tang B.Z.(2010), “Label-free fluorescence detection of mercury (II) and glutathione based on Hg2+ - DNA complexes stimulating aggregation – induced emission of a tetraphenylethene derivative” The Analyst, 135,11 (Nov),pp.3002 -3007, 1364 -5528, 0003 – 2654 17 F Pastor, M M Soldevilla, H Villanueva et al., “CD28 aptamers as powerful immune response modulators,” Molecular Therapy—Nucleic Acids, vol 2, article e98, 2013 View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus 56 18 Y Wan, Y Kim, N Li et al., “Surface-immobilized aptamers for cancer cell isolation and microscopic cytology,” Cancer Research, vol 70, no 22, pp 9371–9380, 2010 View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus 19 L H Lauridsen and R N Veedu, “Nucleic acid aptamers against biotoxins: a new paradigm toward the treatment and diagnostic approach,” Nucleic Acid Therapeutics, vol 22, no 6, pp 371–379, 2012 View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus 20 J G Bruno and J L Kiel, “Use of magnetic beads in selection and detection of biotoxin aptamers by electrochemiluminescence and enzymatic methods,” BioTechniques, vol 32, no 1, pp 178–183, 2002 View at Google Scholar · View at Scopus 21 S Jeong, H K Lee, and M Y Kim, “Use of RNA aptamers for the modulation of cancer cell signaling,” Methods in Molecular Biology, vol 542, pp 363–377, 2009 View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus 22 N Li, H H Nguyen, M Byrom, and A D Ellington, “Inhibition of cell proliferation by an anti-EGFR aptamer,” PLoS ONE, vol 6, no 6, Article ID e20299, 2011 View at Publisher · View at Google Scholar · View at Scopus 57