Phân tích một số thành phần hóa học chính trong dược liệu Đinh lăng bằng phương pháp hplc Phân tích một số thành phần hóa học chính trong dược liệu Đinh lăng bằng phương pháp hplc
TỔNG QUAN
Tổng quan về đinh lăng
1.1.1 Cây đinh lăng Đinh lăng có tên khoa học là Polyscias được đặt tên đầu tiên từ hơn hai thế kỷ trước bởi Forster J.R & Forster G (1775), nhiều năm sau đó tiếp tục được các nhà phân loại thực vật nghiên cứu trên thế giới như Baker (1877), Viguier (1905), Smith
& Stone (1965), Hutchinson (1967), Bernardi (1971), Frodin & Govaerts (2003), Plunkett & Lowry (2010) [38] mở rộng và thu hẹp các loài thuộc chi Polyscias và kết quả được sự đồng thuận cao của các nhà thực vật học hoàn thiện đi đến thống nhất
Hệ thống phân loại thực vật có hoa của Takhtajan A [41], loài Polyscias fruticosa (L.) Harms có vị trí phân loại sau:
- Chi đinh lăng (Polyscias) Ở Việt Nam có 8 loài thuộc chi Polyscias theo Phạm Hoàng Hộ [41] Đa số các loài thuộc chi Polyscias được làm cây cảnh, chỉ có một số loài được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học để sử dụng làm thuốc, trong đó loài Polyscias fruticosa (L) Harms được sử dụng phổ biến nhất Bảng 1.1 thể hiện thông tin về 8 loài thuộc chi Polyscias
Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Polyscias ở Việt Nam STT Tên khoa học các loài Polyscias ở Việt Nam Tên Việt Nam
1 Polyscias fruticosa (L.) Harms Đinh lăng lá xẻ/Đinh lăng lá nhỏ
2 Polyscias scutellaria (Burm F.) Fosberg Đinh lăng lá đĩa
3 Polyscias filicifolia (C Moore ex E Fourn.) L
H Bailey Đinh lăng đuôi phụng
4 Polyscias balfouriana (André) L H Bailey Đinh lăng lá tròn
5 Polyscias guilfoylei (W Bull) L H Bailey Đinh lăng lá trổ
6 Polyscias grandifolia Volkens Đinh lăng lá to
7 Polyscias sambucifolia (Sieber ex DC.) Harms Đinh lăng lá cơm cháy
8 Polyscias serrata Balf Đinh lăng lá răng
1.1.2 Thành phần hóa học chính của Polyscias fruticosa (L.) Harms
Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là OA có đặc tính dược học quan trọng là bảo vệ gan khỏi tổn thương do hóa chất mà còn bảo vệ gan khỏi xơ gan do các bệnh mãn tính gây ra [20] Các nghiên cứu trước đây cho thấy quercitrin nhóm flavonoid trong Polyscias fruticosa (L.) Harms cũng có vai trò dược học [16] Đây là những hợp chất chuyển hóa thứ cấp rất điển hình có tác dụng chống oxi hóa trong thực vật
Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là OA với phần đường thường được gắn vào vị trí C3 và C28 của aglycon Hình 1.1 trình bày về công thức tổng quát của Saponin triterpenoid [11]:
Hình 1.1 Công thức tổng quát của Saponin triterpenoid
• Công thức tổng quát và cấu trúc hóa học của OA
OA có công thức tổng quát là C30H48O3 Hình 1.2 thể hiện cấu trúc hóa học của
OA theo José M Castellano, Sara Ramos-Romero và Javier S Perona [25]:
Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Oleanolic acid
• Tính chất hóa học và vật lý Khối lượng phân tử của OA được xác định là 456,7 g/mol OA là hợp chất kỵ nước, thực tế là khụng tan trong nước (1,748 àg/L) Thụng thường OA được chiết xuất từ thực vật bằng các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, 1-butanol, etyl axetat, dietyl ete hoặc axeton [25]
Nhiệt độ sôi của OA là 309 o C Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng từ 553-554 o C ở 760 mmHg [25]
- Thành phần Flavonoid: Đa số hợp chất flavonoid trong chi Polyscias đều có khung flavonol Các flavonol này thường tạo glycosid với rhamnose gắn vào aglycon tại C3 Saito et al (1990) đã phát hiện ra 2 hợp chất flavonoid có trong lá P fruticosa là kaempferol 3- O-α-L-rhamnopyranoside và quercitrin 3-O-α-L-rhamnopyranoside Hình 1.3 thể hiện cấu trúc đơn giản của flavonoid [30]:
Hình 1.3 Cấu trúc đơn giản của flavonoid
Quercitrin có công thức tổng quát là C21H20O11 Hình 1.4 thể hiện cấu trúc hóa học của quercitrin [4, 43]:
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của quercetin-3-O-α-rhamnopyranoside
• Tính chất hóa học và vật lý Khối lượng phân tử của quercitrin 448,4 g/mol Quercitrin tan được trong một số dung môi hữu cơ như: dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, ethanol [23] Nhiệt độ sôi là 813,97 o C và 760 mmHg, nhiệt độ nóng chảy là 250-252 o C [23]
1.1.3 Tác dụng dược học của Polyscias fruticosa (L.) Harms
Tác dụng dược học của OA:
Polyscias fruticosa (L.) Harms là một loài thực vật thuộc họ Araliaceae và được sử dụng như một cây thuốc có nhiều công dụng trong việc chữa bệnh như tăng cường hệ thống miễn dịch của cơ thể, cải thiện khả năng sinh sản của nam giới, chống mệt mỏi, giải độc Trong y học dân gian Việt Nam, lá đinh lăng còn được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh như Parkinson, Alzheimer Ngoài ra, một số nghiên cứu gần đây
7 chỉ ra rằng P.fruticosa có tác dụng khác như chống trầm cảm, giảm căng thẳng, cải thiện trí nhớ, hạ đường huyết, bảo vệ gan, hạ lipid trong máu, kháng nấm và kháng khuẩn [32]
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng chất chiết xuất từ rễ và lá P.fruticosa chứa hàm lượng saponin cao nhất, đặc biệt là hợp chất saponin có trong chiết xuất methanol của lá P.fruticosa có tác dụng ức chế hoạt động chống lại α-amylase và α- glucosid, có tác dụng trong việc điều trị bệnh tiểu đường Ngoài ra thành phần chính của chiết xuất rễ cây P.fruticosa được gọi là saponin là glycoside tự nhiên với sự biến đổi cấu trúc đáng kể, được công nhận như một tác nhân chống ung thư tự nhiên [22] Các saponin đa phần xuất hiện với phần aglycon là oleanolic acid và một trong những đặc tính dược học quan trọng của oleanolic acid không những có tác dụng bảo vệ gan khỏi tổn thương do hóa chất mà còn bảo vệ gan khỏi xơ gan do các bệnh mãn tính gây ra Con đường tổng hợp OA từ BAS = b-amyrin synthase, CAS cycloartenol synthase, IPP = isopentenyl pyrophosphate được thể hiện ở hình 1.5 [20]:
Hình 1.5 Con đường tổng hợp oleanolic acid
Tác dụng dược học của Quercitrin:
Các nghiên cứu trước đây cho thấy quercitrin trong Polyscias fruticosa (L.) Harms cũng có vai trò dược học [30] Đây là những hợp chất chuyển hóa thứ cấp rất điển hình có tác dụng chống oxi hóa trong thực vật Hình 1.6 thể hiện sơ đồ chuyển hóa của quercitrin
Enzyme quercitrinase là xúc tác cho quá trình phản ứng hóa học sau: quercitrin + H2O ⇄ L-rhamnose + quercetin [16]
Hình 1.6 Sơ đồ chuyển hóa của quercitrin
Do đó, hai cơ chất của enzyme này là quercitrin và H2O, trong khi hai sản phẩm của nó là L-rhamnose và quercetin Enzyme này thuộc họ hydrolases, cụ thể là những glycosidases thủy phân các hợp chất O- và S-glycosyl Tên hệ thống của lớp enzyme này là quercitrin 3-L-rhamnohydrolase Enzyme này có thể được tìm thấy trong Aspergillus flavus Nó là một enzym trong con đường dị hóa rutin [16].
Phương pháp xác định OA và quercitrin trong dược liệu đinh lăng
Hiện nay, nhiều phương pháp xác định OA và quercitrin trong mẫu dược liệu đinh lăng lá nhỏ Các kỹ thuật phân tích chủ yếu được sử dụng là HPLC/DAD; HPLC/PDA; HPLC/SPD [2, 9, 33]
1.2.1 Phương pháp xử lý mẫu
Phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (UAE) kết hợp phương pháp chiết hồi lưu:
Nguyên tắc, cơ chế hoạt động của phương pháp UAE: dưới tác dụng của siêu âm dung môi tại các hốc nhỏ/dược liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi (chiết xuất) [44]
• Phương pháp chiết hồi lưu:
Phương pháp chiết hồi lưu là một quá trình chiết xuất rắn-lỏng ở nhiệt độ không đổi với quá trình bay hơi và ngưng tụ dung môi lặp lại trong một khoảng thời gian cụ
9 thể mà không làm thất thoát dung môi Hệ thống này được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp dược liệu vì nó hiệu quả, dễ vận hành và tiết kiệm chi phí [41]
• Phương pháp chiết lỏng-lỏng:
Chiết lỏng-lỏng (LLE), còn được gọi là chiết dung môi, là một kỹ thuật phổ biến được sử dụng để chiết và tinh chế chất phân tích Đây là một trong những phương pháp chiết xuất lâu đời nhất nhưng vẫn được sử dụng thường xuyên nhất Phương pháp chiết này dựa trên hai dung môi không thể trộn lẫn là dung môi chứa chất phân tích và dung môi hữu cơ Dung môi chứa chất phân tích được đặt trong phễu và thêm dung môi không trộn lẫn vào, tạo thành hai lớp được lắc với nhau Sau đó, chất phân tích di chuyển từ dung môi ban đầu sang dung môi thứ hai dựa trên độ hòa tan tương đối của chúng trong dung môi Tuy nhiên, phương pháp này sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ (như dichloromethane, chloroform), một quá trình tốn nhiều công sức, dung môi hóa chất và thời gian chiết lâu hơn [34]
Một số tác giả đã áp dụng phương pháp UAE kết hợp phương pháp chiết hồi lưu và phương pháp chiết lỏng lỏng với dung môi được sử dụng là chloroform trong quá trình xử lý mẫu được cho ở bảng 1.2:
Bảng 1.2 Một số phương pháp xử lý mẫu
Chất phân tích Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu
Tài liệu tham khảo Độ thu hồi (%) Độ lặp lại (%)
Mẫu rễ, thân và lá đinh lăng được đun hồi lưu cách thủy với dung môi là ethanol 70% trong 3 giờ, lọc dịch chiết, sau đó cô cạn dịch lọc, tiếp tục đun sôi hồi lưu trong 3 giờ với dung dịch HCl 4M
Cuối cùng là chiết lỏng lỏng với dung môi chloroform
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Mẫu rễ, thân và lá đinh lăng được chiết soxhlet với dung môi methanol trong 20 giờ
Dịch chiết được cô cắn sau đó đem đi thủy phân hồi lưu ở
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Chất phân tích Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu
Tài liệu tham khảo Độ thu hồi (%) Độ lặp lại (%)
LOQ (àg/mL) nhiệt độ sôi trong 6 giờ với dung dịch HCl 10% trong cồn Cuối cùng dịch thủy phân được đem đi chiết lỏng lỏng với dung môi dichloromethane
Mẫu đinh lăng được chiết siêu âm với dung môi methanol trong 60 phút ở 50 o C, lọc lấy dịch đem đun nóng trong cách thủy 60 phút ở 90 o C với dung dịch HCl 4M Cuối cùng dịch chiết được đem đi chiết lỏng lỏng với dung môi chloroform
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Chất phân tích Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu
Tài liệu tham khảo Độ thu hồi (%) Độ lặp lại (%)
Mẫu được chiết bằng methanol trong 30 phút, chiết siêu âm, lọc, sấy khô trong nồi cách thủy, hòa tan bằng methanol
Thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
0,5g mẫu được hòa tan ngâm với dung môi ethanol trong 2 giờ sau đó chiết siêu âm 30 phút Các mẫu được chiết hai lần và dịch chiết được gộp lại làm bay hơi đến khô ở nhiệt độ dưới 40 o C
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Mẫu dược liệu được chiết 3 lần với dung môi methanol ở
60 o C Cô cạn dịch chiết, hòa tan lại bằng dung môi
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Chất phân tích Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu
Tài liệu tham khảo Độ thu hồi (%) Độ lặp lại (%)
LOQ (àg/mL) methanol/nước (1:1) Cuối cùng dịch chiết được đem đi chiết lỏng lỏng với dung môi chloroform, thu được dung dịch sau chiết, đem cô cạn, hòa tan lại trong 15 mL methanol
Mẫu được chiết với dung môi methanol, chiết hồi lưu trên cách thủy trong 60 phút ở
90 o C Ly tâm thu được dịch chiết Điều chỉnh pH bằng HCl 1M đến 3M Dịch chiết thu được cho qua cột chiết pha rắn SPE
Nhiệt độ và thời gian không thay đổi trong quá trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu theo phương pháp UAE kết hợp phương pháp chiết hồi lưu và phương pháp chiết lỏng lỏng được áp dụng rộng rãi để định lượng OA trong mẫu đinh lăng Tuy nhiên quá trình áp dụng phương pháp mất nhiều thời gian dẫn đến chưa đáp ứng được trong quá trình xử lý số lượng mẫu lớn Phương pháp xử lý mẫu mà nhóm nghiên cứu áp dụng trong đề tài này nhằm giảm thiểu thời gian xử lý mẫu và giảm thiểu hóa chất, dung môi nhưng vẫn đảm bảo tính chính xác của phương pháp
Có nhiều phương pháp như HPLC/DAD; HPLC/PDA; HPLC/SPD để định lượng OA trong mẫu dược liệu đinh lăng [2, 9, 33] HPLC dựa trên nguyên lý chung là kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha là pha tĩnh và pha động Quá trình tách theo các cơ chế phân bố, trao đổi ion hay hấp thụ tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích và pha tĩnh sử dụng Cột được nhồi với các hạt có kích thước nhỏ (thường từ 3-10 μm), quá trình rửa giải dung môi diễn ra dưới áp suất cao và đạt hiệu quả tách tốt hơn so với sắc ký lỏng hiệu năng cao [31] Pha tĩnh (chất rắn hoặc chất lỏng) hấp thụ chất cần phân tích, lưu giữ lại trên cột, còn pha động (gồm một chất hoặc hỗn hợp nhiều chất lỏng) hòa tan, đẩy chất phân tích ra khỏi cột sắc ký Các chất phân tích khác nhau sẽ có sự tương tác khác nhau đối với cả pha tĩnh và pha động, do vậy chúng sẽ di chuyển ra khỏi cột với tốc độ khác nhau và sẽ tách nhau khi ra khỏi cột sắc ký [7, 17, 24, 26]
➢ Phương pháp phân tích HPLC/DAD:
Diode array detector (DAD) phát hiện sự hấp thụ từ vùng UV đến VIS DAD khác với detector UV-VIS ở chỗ ánh sáng từ đèn được chiếu trực tiếp vào flow cell, ánh sáng đi qua flow cell bị phân tán bởi cách tử nhiễu xạ và lượng ánh sáng phân tán được ước tính cho từng bước sóng trong mảng photodiode
Trên thế giới, nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC/DAD để phân tích OA với LOD cỡ ppm trong dược liệu đinh lăng hầu hết đều sử dụng cột pha đảo C18 [33] Tại Việt Nam, có Dược điển Việt Nam V đã có định lượng OA trong cao đặc đinh
15 lăng được điều chế từ rễ cây đinh lăng (Polyscias fruticosa Harms), họ Nhân sâm (Araliaceae) [1]
Trong luận văn để ứng dụng phương pháp HPLC trong định lượng OA trong dược liệu đinh lăng, chúng tôi cũng dựa trên tham khảo Dược điển Việt Nam V và các công trình khoa học trên thế giới, cải tiến một số thành phần pha động
➢ Phương pháp phân tích HPLC/PDA:
Nhận xét phần tổng quan
Dựa vào tài liệu tham khảo và trang cơ sở vật chất của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu đã chọn phương pháp để khảo sát và thẩm định đối với chất phân tích OA như sau:
- Phương pháp xử lý mẫu: phương pháp chiết hồi lưu
- Phương pháp phân tích: HPLC/DAD Đối với chất phân tích quercitrin chưa có nghiên cứu về chất phân tích này trên mẫu đinh lăng nên nhóm nghiên cứu sẽ chọn dựa trên việc tham khảo phương pháp định lượng quercitrin trong một số mẫu dược liệu bằng phương pháp HPLC/DAD và trang thiết bị phòng thí nghiệm đang có [18, 19]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Chất phân tích Đối tượng gồm 2 chất phân tích là oleanoic acid và quercitrin (quercetin-3-O- α-rhamnopyranoside)
2.1.2 Mẫu phân tích Đối tượng mẫu được lựa chọn để khảo sát và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là đinh lăng lá nhỏ bao gồm: rễ và lá Đối tượng mẫu được lựa chọn để áp dụng phương pháp phân tích gồm 30 mẫu Mẫu được thu hái tại 3 tỉnh (Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình) Số lượng mẫu lấy tại các tỉnh giống nhau, cụ thể là 10 mẫu/loại Danh sách và số lượng mẫu từng loại được đưa ra tại Bảng 2.1
Mẫu trắng: là mẫu chiết nhiều lần với dung môi và khi phân tích trên thiết bị HPLC/DAD không thấy xuất hiện tín hiệu của chất phân tích.
Nội dung nghiên cứu
Nhằm đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu được thực hiện bao gồm:
• Lựa chọn điều kiện phân tích và khảo sát tín hiệu của hai chất OA và quercitrin bằng phương pháp HPLC/DAD
• Khảo sát điều kiện xử lý mẫu rễ và lá đinh lăng nhằm xác định OA và quercitrin bằng HPLC/DAD: khảo sát phương pháp chiết; loại, hàm lượng, nồng độ dung môi và thời gian chiết
• Thẩm định và đánh giá phương pháp về các thông số: độ đặc hiệu, xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lặp lại (RSD %) và độ thu hồi (R %)
• Áp dụng phương pháp để phân tích hai chất OA và quercitrin trong 30 mẫu đinh lăng thu thập được tại các tỉnh Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình.
Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết dùng cho phân tích Nước được sử dụng cho thiết bị là nước đề ion, sử dụng cho quá trình chuẩn bị mẫu là nước cất 2 lần:
- Dung dịch H3PO4 0,1%: Hút 1 mL H3PO4 vào bình định mức 1 L, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần đã lọc qua màng lọc dung môi, lắc đều và rung siêu âm để loại bỏ bọt khí
Oleanolic acid; quercitrin (quercetin-3-O-α-rhamnopyranoside) có độ tinh khiết
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn gốc của mỗi chất chuẩn nồng độ 1000 àg/mL: Cõn 10 mg mỗi chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,01 mg cho vào 2 bình định mức
10 mL Hòa tan mỗi chất chuẩn bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch và lắc đều
Bảo quản các dung dịch ở 2 ÷ 8ºC, sử dụng được trong vòng 6 tháng
Ghi chú: Nồng độ dung dịch chuẩn gốc cần được tính thực tế theo lượng chuẩn cân và độ tinh khiết của chất chuẩn
Dung dịch chuẩn trung gian 100 àg/mL: dựng micropipet hỳt chớnh xỏc 1000 àL cỏc dung dịch chuẩn gốc cho vào bỡnh định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng MeOH và lắc đều
Bảo quản các dung dịch ở 2 ÷ 8 º C, sử dụng được trong 1 tháng
2.3.2 Dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Bình định mức các loại: 50 mL
- Bình tam giác có nút mài: 100 mL
- Màng lọc mẫu, kớch thước lỗ 0,45 àm
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò mảng diode (HPLC/DAD) Agilent 1260
- Cột sắc ký: Hạt pha tĩnh C18, kớch thước cột (25 cm ì 4,6 mm), cỡ hạt 5 àm
- Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg và 0,01 mg, Metter Toledo
- Cân kỹ thuật, chính xác 0,01 g, Metter Toledo
- Máy đồng nhất mẫu, Phillips
- Máy lắc xoáy vortex, IKA
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp phân tích HPLC/DAD
Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký đối với chất phân tích OA:
Bảng 2.1 khảo sát điều kiện phân tích bằng phương pháp HPLC/DAD cho chất phân tích OA [1, 4, 28, 35, 41]:
Bảng 2.1 Khảo sát điều kiện phân tích OA bằng phương pháp HPLC/DAD Điều kiện phân tích 1 Điều kiện phân tích 2
Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 205 nm
Cột: C18 (5àm, 250 mm; 4,6 mm) Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 205 nm
Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký đối với chất phân tích quercitrin:
Tiến hành khảo sát điều kiện dung môi pha động: acetonitril – H3PO4 0,1 % [18, 19] được cho ở bảng 2.3:
Bảng 2.2 Khảo sát điều kiện phân tích quercitrin bằng phương pháp
HPLC/DAD Điều kiện phân tích
Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 257 nm
2.4.2 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu
Mẫu rễ, thân và lá đinh lăng lá nhỏ 5 tuổi được thu hái tại 3 tỉnh (Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình)
Lượng mẫu: được lấy tối thiểu 1 kg
Bảo quản: mẫu được đựng vào túi ghép mí Sau đó, chuyển ngay về phòng thí nghiệm, loại bỏ các phần hỏng, đất, cát và sấy ở nhiệt độ 60 0 C trước khi mang đi xử lý sơ bộ mẫu Thông tin mẫu được cho ở bảng 2.2:
Bảng 2.3 Danh mục kí hiệu các mẫu rễ, thân và lá đinh lăng
Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu ban đầu
1 R1 T1 L1 xã An Lễ, huyện Quỳnh Phụ,
Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu ban đầu
Rễ Thân Lá mẫu tỉnh Thái Bình
2 R2 T2 L2 xã Hải An, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định
3 R3 T3 L3 xã Hải An, huyện Hải Hậu, tỉnh Nam Định
4 R4 T4 L4 xã Nghĩa Lạc, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định
5 R5 T5 L5 xã Kim Định, huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình
Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu ban đầu
Rễ Thân Lá mẫu Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định
7 R7 T7 L7 thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định
8 R8 T8 L8 thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định
9 R9 T9 L9 thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa
Kí hiệu mẫu Nguồn gốc mẫu ban đầu
10 R10 T10 L10 thị trấn Rạng Đông, huyện Nghĩa Hưng, tỉnh Nam Định
Phương pháp xử lý mẫu:
- Dựa vào các nghiên cứu trước [4, 18, 19, 28, 35, 41] nhóm nghiên cứu đưa ra sơ đồ xử lý mẫu đinh lăng để phân tích hàm lượng OA và quercitrin được thể hiện ở hình 2.1:
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu đinh lăng
Cân mẫu đã rây Cho vào bình nón nút mài 100 mL Thêm hàm lượng dung môi chiết, cân bình Đun hồi lưu trong cách thủy Để nguội, cân lại khối lượng bình, thêm dung môi nếu cần
Ly tâm, lọc dịch thủy phân Lọc qua màng lọc 0,45 àm trước khi phõn tớch HPLC
• Khảo sát điều kiện xử lý mẫu rễ đinh lăng để phân tích hàm lượng OA:
➢ Khảo sát hàm lượng cân mẫu
➢ Khảo sát phương pháp chiết
➢ Khảo sát dung môi chiết
➢ Khảo sát hàm lượng dung môi chiết
➢ Khảo sát nồng độ dung môi chiết
➢ Khảo sát thời gian thủy phân mẫu
• Khảo sát điều kiện xử lý mẫu lá đinh lăng để phân tích hàm lượng quercitrin:
➢ Khảo sát phương pháp chiết
➢ Khảo sát dung môi chiết
➢ Khảo sát hàm lượng dung môi chiết
➢ Khảo sát thời gian thủy phân mẫu
2.4.3 Thẩm định và đánh giá phương pháp [7]
- Xác định tính tương thích hệ thống
- Độ đặc hiệu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn
- Khoảng tuyến tính, đường chuẩn
- Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống sắc ký:
Tiêm lặp lại 06 lần mỗi dung dịch chuẩn Xác định độ lệch chuẩn tương đối của diện tích peak chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối ≤ 2,0 %
Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh peak của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn không lệch quá 2,5%
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn:
Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ) Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình) Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: y = ax + b Trong đó: a là giá trị độ dốc b là giá trị intercept (hệ số chặn)
Nếu 0,995 < R ≤ 1: Có tương quan tuyến tính rõ rệt
Dung dịch chuẩn OA: Từ dung dịch chuẩn trung gian nồng độ 100 àg/mL tiến hành pha loãng bằng methanol theo các tỉ lệ khác nhau để thu được các dung dịch đối chiếu OA cú nồng độ lần lượt là 100; 50; 25; 10; 5; 2 àg/mL dựng để xõy dựng đường chuẩn
Dung dịch chuẩn quercitrin: Từ dung dịch chuẩn trung gian nồng độ 100 àg/mL tiến hành pha loãng bằng methanol theo các tỉ lệ khác nhau để thu được các dung dịch đối chiếu quercitrin cú nồng độ lần lượt là 100; 75; 50; 25; 12,5 àg/mL dựng để xõy dựng đường chuẩn
- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):
LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N) Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio)
LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)
LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)
- Độ lặp lại: Độ lặp lại: để đánh giá độ lặp lại, tiến hành phân tích lặp lại mẫu thử có cùng nồng độ với điều kiện sắc ký đã chọn Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau theo AOAC (phụ lục 6)
- Độ đúng (thông qua việc xác định độ thu hồi): Đối với mẫu thử: tiến hành thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC (phụ lục 6) Kết quả được tính theo công thức dưới đây:
Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc: Nồng độ dung dịch chuẩn thêm vào mẫu thử
2.4.4 Phương pháp phân tích mẫu đinh lăng Đường chuẩn xây dựng được sử dụng để tính kết quả cho các mẫu tương ứng
2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả định lượng được xử lý bằng phần mềm Analyst của thiết bị HPLC/DAD Số liệu được xử lý bằng Excel
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả khảo sát điều kiện phân tích 2 chất OA và quercitrin bằng HPLC/DAD37 1 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký đối với chất phân tích OA
3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký đối với chất phân tích OA
Bảng 3.1 khảo sát điều kiện phân tích bằng phương pháp HPLC/DAD cho chất phân tích OA:
Bảng 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích OA bằng phương pháp HPLC/DAD Điều kiện phân tích 1 Điều kiện phân tích 2
Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 205 nm
Cột: C18 (5àm, 250 mm; 4,6 mm) Tốc độ dòng: 1,2 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 205 nm
Sắc ký đồ của điều kiện phân tích 1 và điều kiện phân tích 2 được cho ở hình 3.1 và 3.2:
Hình 3.1 Sắc ký đồ của điều kiện phân tích 1
Hình 3.2 Sắc ký đồ của điều kiện phân tích 2
Nhận xét: Điều kiện phân tích 2 được lựa chọn do điều kiện phân tích 1 peak bị kéo đuôi
3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký đối với chất phân tích quercitrin
Tiến hành khảo sát một số điều kiện dung môi pha động: acetonitril – H3PO4
Bảng 3.2 Khảo sát điều kiện phân tích quercitrin bằng phương pháp
HPLC/DAD Điều kiện phân tích
Tốc độ dòng: 0,8 mL/phút
Bước sóng phát hiện: 257 nm
Sắc ký đồ của điều kiện phân tích được cho ở hình 3.3:
Hình 3.3 Sắc ký đồ của điều kiện phân tích
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hệ dung môi pha động acetonitril – H3PO4
0,1 % cho hiệu quả tách quercitrin tốt.
Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu
3.2.1 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu rễ đinh lăng để phân tích hàm lượng OA theo 2.4.2
➢ Khảo sát phương pháp chiết:
Tiến hành khảo sát chiết theo 2 phương pháp thông dụng là phương pháp chiết siêu âm (SA) và phương pháp chiết hồi lưu (HL) Kết quả thể hiện ở bảng 3.3:
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát phương pháp chiết Phương pháp chiết Hàm lượng OA (%)
Nhận xét: Phương pháp chiết hồi lưu cho kết quả % hàm lượng OA cao hơn so với phương pháp chiết siêu âm
➢ Khảo sát dung môi chiết:
Tiến hành khảo sát dung môi chiết là ethanol, methanol và dung dịch HCl pha trong methanol Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4:
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát dung môi chiết
STT Ký hiệu mẫu Dung môi Kết quả hàm lượng OA (%)
Nhận xét: Sử dụng dung môi HCl pha trong methanol cho kết quả cao hơn khi sử dụng các dung môi chiết khác
➢ Khảo sát hàm lượng dung môi chiết:
Tiến hành khảo sát hàm lượng dung môi chiết HCl pha trong methanol lần lượt là: 30 mL, 50 mL và 70 mL Kết quả thể hiện ở bảng 3.5:
Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hàm lượng dung môi chiết
STT Ký hiệu mẫu Hàm lượng dung môi (mL) Kết quả hàm lượng OA (%)
Nhận xét: Hàm lượng dung môi sử dụng để chiết là 50 mL cho kết quả % hàm lượng OA là ổn định sau quá trình làm lặp lại
➢ Khảo sát nồng độ dung môi chiết:
Tiến hành khảo sát nồng độ HCl pha trong methanol lần lượt là 1,8 M; 2M; 4M và 6M Kết quả thể hiện ở bảng 3.6:
Bảng 3.6 Kết quả khảo sát nồng độ HCl pha trong methanol
STT Ký hiệu mẫu Nồng độ HCl (M) Kết quả hàm lượng OA (%)
Nhận xét: Có thể thấy kết quả khảo sát hàm lượng và nồng độ dung dịch
HCl trong dung môi chiết cho kết quả % OA là gần như nhau vì vậy nhóm nghiên cứu chọn hàm lượng HCl 1,8 M thủy phân là 50 mL theo kết quả khảo sát trên Kết quả so sánh hàm lượng và nồng độ dung dịch HCl trong dung môi chiết methanol được cho hình 3.4 và sắc ký đồ từ hình 3.5 đến hình 3.8 dưới đây:
Hình 3.4 Kết quả khảo sát nồng độ HCl
Kết quả khảo sát nồng độ HCl
42 Hình 3.5 Sắc ký đồ của OA khi sử dụng HCl 1,8 M
Hình 3.6 Sắc ký đồ của OA khi sử dụng HCl 2 M
Hình 3.7 Sắc ký đồ của OA khi sử dụng HCl 4 M
Hình 3.8 Sắc ký đồ của OA khi sử dụng HCl 6 M
➢ Khảo sát thời gian thủy phân mẫu:
Bảng 3.7 thể hiện kết quả khảo sát thời gian thủy phân:
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát thời gian thủy phân
STT Ký hiệu mẫu Thời gian thủy phân (giờ) Kết quả hàm lượng OA (%)
Nhận xét: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân cho thấy hàm lượng OA trong mẫu thủy phân 3 giờ và 4 giờ cao hơn so với các mẫu được thủy phân trong 1 giờ, 2 giờ So sánh thời gian thủy phân được cho ở hình 3.9 dưới đây:
Hình 3.9 So sánh kết quả khảo sát thời gian thủy phân Sắc ký đồ của khảo sát thời gian được thể hiện ở các hình từ 3.10 đến 3.13:
Hình 3.10 Sắc ký đồ của OA với thời gian thủy phân là 1 giờ
Kết quả khảo sát thời gian thủy phân
Hình 3.11 Sắc ký đồ của OA với thời gian thủy phân là 2 giờ
Hình 3.12 Sắc ký đồ của OA với thời gian thủy phân là 3 giờ
Hình 3.13 Sắc ký đồ của OA với thời gian thủy phân là 4 giờ
3.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu lá đinh lăng để phân tích hàm lượng quercitrin
➢ Khảo sát phương pháp chiết:
Tiến hành khảo sát chiết theo 2 phương pháp thông dụng là phương pháp chiết siêu âm (SA) và phương pháp chiết hồi lưu (HL) Kết quả thể hiện ở bảng 3.8 và hình 3.14:
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát phương pháp chiết
Hình 3.14 Kết quả khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát, nhận thấy phương pháp hồi lưu chiết kiệt quercitrin hơn phương pháp siêu âm
Ph ươ ng p há p ch iết
Khảo sát phương pháp chiết và thời gian chiết
➢ Khảo sát dung môi chiết:
Tiến hành khảo sát với 2 loại dung môi chính là ethanol, methanol và hỗn hợp của 2 loại dung môi này với nước theo các tỷ lệ 100%, 75% và 50% dung môi hữu cơ Kết quả thể hiện ở bảng 3.9 và hình 3.15:
Bảng 3.9 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Hình 3.15 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát, nhận thấy dung môi methanol 75% cho hàm lượng quercitrin cao nhất, chứng tỏ methanol 75% là dung môi chiết kiệt quercitrin
MeOH 100 MeOH 75 MeOH 50 EtOH 100 EtOH 75 EtOH 50
Khảo sát dung môi chiết
48 nhất ra khỏi nền mẫu dược liệu lá đinh lăng Vì vậy, lựa chọn methanol 75% là dung môi chiết
➢ Khảo sát thể tích dung môi chiết:
Tiến hành khảo sát thể tích dung môi chiết lần lượt là 25mL; 50mL và 100mL Kết quả thể hiện ở bảng 3.10 và hình 3.16:
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát thể tích dung môi chiết
Hàm lượng dung môi chiết
Hình 3.16 Khảo sát tỷ lệ dược liệu/ dung môi
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hàm lượng quercitrin không chênh lệch đáng kể ở các thể tích khảo sát Do đó, lựa chọn thể tích dung môi là 25mL cho phương pháp chiết
➢ Khảo sát thời gian chiết:
Tiến hành khảo sát phương pháp chiết hồi lưu (HL) ở các mức thời gian 30, 60,
120, 180 phút Kết quả thể hiện ở bảng 3.11 và hình 3.17:
Bảng 3.11 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Hình 3.17 Kết quả khảo sát thời gian chiết
Nhận xét: Từ kết quả khảo sát, nhận thấy phương pháp hồi lưu chiết kiệt quercitrin hơn phương pháp siêu âm Phương pháp chiết hồi lưu ở 120 phút và 180 phút cho kết quả hàm lượng quercitrin cao nhất và tương đương nhau, chọn 120 phút là thời gian tối ưu
HL 30ph HL 60ph HL 120ph HL 180ph
Kết quả khảo sát thời gian chiết
Kết quả thẩm định và đánh giá phương pháp
3.3.1 Thẩm định quy trình định lượng quercitrin trong mẫu dược liệu lá của đinh lăng
➢ Xác định tính tương thích hệ thống:
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn quercitrin ở nồng độ 49,34 àg/mL Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12:
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tính thích hợp hệ thống
TT Thời gian lưu (phút) Diện tích peak (mAU.s)
Kết quả cho thấy giá trị RSD (%) của thời gian lưu và diện tích peak đều < 2,0% Như vậy, hệ thống sắc ký phù hợp để tiến hành định lượng quercitrin trong dược liệu đinh lăng
Tiến hành phân tích sắc ký mẫu trắng, dung dịch chuẩn quercitrin, mẫu trắng thêm chuẩn Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện peak ở thời gian lưu tương ứng với peak quercitrin Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn, tín hiệu peak quercitrin phân tách tốt, peak cân đối Sắc đồ của các mẫu được trình bày ở hình 3.18; 3.19 và 3.20:
Hình 3.18 Sắc ký đồ của mẫu trắng
Hình 3.19 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Hình 3.20 Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn
➢ Khoảng tuyến tính, đường chuẩn:
Chuẩn bị dãy 5 dung dịch chuẩn pha trong methanol Tiến hành phân tích sắc ký các dung dịch chuẩn, mỗi dung dịch tiêm 1 lần Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong các dung
52 dịch chuẩn và diện tích peak thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Kết quả được thể hiện ở bảng 3.13 dưới đây và sắc ký đồ ở phụ lục 1:
Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Dung dịch chuẩn Khối lượng chuẩn (mg)
Phương trình đường chuẩn có hệ số tương quan > 0,995, cho thấy tương quan tuyến tính tốt giữa nồng độ và diện tích peak tương ứng Đường chuẩn của quercitrin được cho ở hình 3.21 dưới đây:
Tiến hành phân tích ANOVA single factor trên excel thu được giá trị p-value
