Nghiên cứu mối tương quan giữa các snp với một số tính trạng nông học của tập Đoàn lúa màu việt nam

Nghiên cứu mối tương quan giữa các snp với một số tính trạng nông học của tập Đoàn lúa màu việt nam Nghiên cứu mối tương quan giữa các snp với một số tính trạng nông học của tập Đoàn lúa màu việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Phạm Hùng Cương PGS.TS Đỗ Thị Phúc

Hà Nội - 2023

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn thạc sĩ này Tôi cũng xin được gửi lời chân thành cảm ơn đến GS.TS Robert Henry và nhóm nghiên cứu tại Liên minh Đổi mới Nông nghiệp và Thực phẩm Queensland ( Queensland Alliance for Agriculture and Food Innovation – QAAFI), trường Đại học Queensland đã tận tình hướng dẫn tôi trong một số công việc phân tích số liệu dưới khuôn khổ Nhiệm

vụ Nghị định thư NĐT.77.AU/20 Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thành viên thuộc Nhiệm vụ Nghị định thư NĐT.77.AU/20 đã cùng tôi hoàn thành một số đánh giá liên quan đến các tính trạng nông học chính của bộ giống lúa màu Tôi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn các thầy cô các thầy cô giáo của Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội cùng các cán bộ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn bè, nhưng người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn thạc sĩ này

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2023

Học viên cao học

Vũ Thị Thảo Mi

ii

MỤC LỤC

Mở đầu 1

Chương 1: Tổng quan tài liệu 3

1.1 Giới thiệu về cây lúa màu 3

1.1.1 Nguồn gốc phát sinh của cây lúa 3

1.1.2 Phân loại lúa 4

1.1.3 Phân bố của lúa màu 6

1.1.4 Vai trò và giá trị của lúa màu 7

1.1.5 Giới thiệu tập đoàn giống lúa màu trong nghiên cứu 8

1.2 Tính trạng nông học ở lúa 10

1.2.1 Tính trạng nông học ở lúa nói chung 10

1.2.2 Tính trạng nông học ở lúa màu 11

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tính trạng nông học ở lúa màu 12

1.3 Đa hình đơn nucleotide (SNP) và mối tương quan với tính trạng nông học ở lúa 13

1.3.1 Giới thiệu SNP 13

1.3.2 Phương pháp phát hiện SNP 14

1.3.3 Nghiên cứu tương quan SNP và tính trạng nông học ở lúa 18

1.3.4 Ý nghĩa của nghiên cứu tương quan SNP và tính trạng nông học ở lúa 19

1.4 Tình hình nghiên cứu liên quan đến phân tích mối tương quan giữa các SNP và một số tính trạng nông học ở lúa 20

1.5 Ý nghĩa và vai trò của nghiên cứu tương quan giữa các SNP và tính trạng nông học của tập đoàn lúa màu 25

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 27

2.1 Vật liệu nghiên cứu 27

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp phân tích tính trạng nông học 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận 35

3.1 Một số đặc điểm nông học của lúa màu 35

3.1.1 Một số tính trạng nông học chính của bộ giống lúa nghiên cứu 37

3.1.2 Tính trạng chất lượng của các giống lúa màu nghiên cứu 39

3.2 Đánh giá chất lượng các SNP 42

3.2.1 Phân nhóm tập đoàn lúa màu theo cây phân loại 43

3.2.2 Phân tích mất cân bằng liên kết (Linkage Disequilibrium - LD ) 44

iv

Danh mục hình

Hình 1: Biểu đồ phát sinh lúa 3Hình 2 Bản đồ phân bố 83 mẫu giống nghiên cứu 9Hình 3: Hình ảnh SNP array được phát triển và chạy dựa trên công nghệ Illumina Infinium 16Hình 4 Quy trình xác định hàm lượng amylose 29Hình 5: Hình ảnh một số giống lúa màu trong bộ giống nghiên cứu 35Hình 6: Đồ thị phân phối của một số tính trạng nông học chính của bộ giống lúa nghiên cứu 38Hình 7: Đồ thị hình chuông cho các tính trạng chất lượng của tập đoàn lúa màu 40Hình 8: Cây phân loại 83 giống lúa màu 44Hình 9: Phân phối mất cân bằng liên kết (LD) 45Hình 10: Biểu đồ phân bố của 3 thành phần chính đầu tiên mang ý nghĩa lớn nhất của các SNP nghiên cứu 46Hình 11: Đồ thị phân phối lượng tử - lượng tử (Q - Q) của các SNP với tính trạng năng suất của tập đoàn lúa màu 48Hình 12: Biểu đồ Manhattan về tương quan giữa các SNP và tính trạng năng suất của tập đoàn lúa màu 49Hình 13: Đồ thị phân phối lượng tử - lượng tử (Q - Q) của các SNP với tính trạng hàm lượng amylose của tập đoàn lúa gạo màu 52Hình 14: Biểu đồ Manhattan về tương quan giữa các SNP và tính trạng hàm lượng amylose của tập đoàn lúa màu 53

v

Danh mục bảng

Bảng 1: Bảng phân loại và phân bố cơ bản của lúa trên thế giới 4Bảng 2: Tham số thống kê mô tả về một số yếu tố cấu thành năng suất và thời gian sinh trưởng của 83 giống lúa màu 37Bảng 3: Bảng tham số thống kê mô tả 4 tính trạng chất lượng của 83 giống lúa màu 39Bảng 4 Bảng các SNP liên quan đến tính trạng năng suất 50Bảng 5: Bảng các SNP liên quan đến tính trạng hàm lượng amylose 53Bảng 6: Bảng các gen nằm trên hoặc gần 24 SNP ứng viên liên quan đến năng suất lúa màu 58

vi

Danh mục từ viết tắt

AS-PCR Allele -specific - polymerase chain

GBS Genotyping by sequencing Xác định kiểu gen bằng giải

trình tự

GWAS Genome-wide association studies Nghiên cứu liên kết trên toàn

bộ bộ gen HDRA High-Density Rice Array Bảng SNP lúa mật độ cao

SSCP Single-strand conformational

polymorphism Đa hình hình dạng sợi đơn

SCAR Sequence characterized amplified

regions

Vùng khuếch đại đặc hiệu trình

tự WGS Whole Genome Sequencing Giải trình tự toàn bộ bộ gen

1

MỞ ĐẦU

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực có diện tích trồng và năng suất đứng

hàng đầu thế giới (theo số liệu thống kê của FAOSTAT, 2021) Phổ biến nhất trong các giống lúa gạo là gạo trắng, theo sau đó là gạo lứt Theo Chaudhary (2003)

(Chaudhary, 2003), khái niệm lúa màu (Oryza sativa L.) đề cập đến loại lúa có màu

đỏ, tím hoặc màu đen

Việt Nam có nguồn lúa gạo rất đa dạng phong phú đặc biệt với vỏ ngoài nhiều màu sắc: nâu, đỏ, tím, đen, vàng xanh… Theo thống kê từ Trung tâm Tài nguyên thực vật, hiện trên 1900 giống lúa màu sắc các loại được thu thập từ các vùng sinh thái khác nhau trên khắp cả nước đang được bảo tồn Do lúa màu có chứa hàm lượng dinh dưỡng và chất chống oxi hóa cao, các nghiên cứu nhằm phát triển và chọn giống lúa màu ngày càng được chú trọng, nhất là các nghiên cứu có mục tiêu về năng suất và chất lượng

Những năm gần đây, với sự phát triển của các chỉ thị phân tử nói chung và công nghệ giải trình tự DNA nói riêng, mối quan tâm đối với các SNP trên các đối tượng nghiên cứu ngày càng được chú ý hơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là những thay đổi một nucleotide trong trình tự bộ gen của các cá thể trong quần thể được gọi là đa hình nucleotide đơn Đây là kỹ thuật đầy tiềm năng, do SNP có số lượng lớn, được xác định trên toàn bộ bộ gen của đối tượng nghiên cứu, có tính di truyền, ít bị thay đổi (Duran và cộng sự, 2009) Có thể dễ dàng tìm được đa hình SNP giữa các mẫu giống trong quần thể và xây dựng bộ chỉ thị lớn bao phủ toàn bộ bộ gen Các phương pháp để xác định SNP có tính tự động hóa cao như Beadchip assay, WGS (Whole Genome Sequencing), với độ chính xác tương đối cao và có thể xây dựng được bộ chỉ thị lớn trong thời gian ngắn

Tuy tiềm năng của SNP là rất lớn, nhưng với đối tượng cây trồng nhất là lúa tại Việt Nam, việc khai thác và sử dụng SNP trong nghiên cứu vẫn còn rất hạn chế Do

đó, việc sử dụng SNP kết hợp với các tính trạng kiểu hình quan tâm của cây lúa là một hướng đi đầy triển vọng cho công tác chọn tạo giống, đặc biệt rất có ý nghĩa

2 trong việc đánh giá tiềm năng di truyền của quỹ gen đang bảo tồn góp phần phát triển

bền vững nguồn gen lúa Chính vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu mối tương quan giữa các SNP với một số tính trạng nông học của tập đoàn lúa màu Việt Nam” được

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây lúa màu

1.1.1 Nguồn gốc phát sinh của cây lúa

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây trồng lâu đời và là cây lương

thực hàng đầu thế giới Hầu hết các giống lúa được biết đến hiện nay là sản phẩm của việc thuần hóa lâu đời Với sự kết hợp của cả khảo cổ và nghiên cứu di truyền, trung tâm thuần hóa lúa sớm nhất trên thế giới được cho là ở lưu vực sông Dương Tử, Trung Quốc Khi lúa được thuần hóa, nó đã trải qua quá trình chọn lọc và cải thiện để phát triển thành các giống cây lúa mà ngày nay được trồng rộng rãi trên khắp thế giới (Fuller và cộng sự, 2010) Quá trình phát triển và thuần hóa cho ra các giống lúa hiện nay được mô tả theo Fuller và cộng sự (Fuller và cộng sự, 2010), thời điểm phát sinh của lúa đã phát sinh từ rất sớm, từ thời kỳ Pleistocence sớm đã bắt đầu có các loại lúa dại được chọn lọc và phát triển qua các thời kỳ (hình 1)

Hình 1: Biểu đồ phát sinh lúa (Fuller và cộng sự, 2010)

Hiện nay, lúa gạo phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, ở khắp các châu lục với hàng ngàn giống và xuất hiện với nhiều màu sắc khác nhau như trắng, đen, tím, đỏ, nâu, Phổ biến nhất và được biết đến nhiều nhất là lúa gạo trắng với lượng tiêu thụ chiếm đa số trong các loại lúa gạo, theo sau đó là gạo lứt Tuy nhiên, lúa gạo có màu

vỏ lụa là màu đỏ, tím hay đen đã được trồng lâu đời ở Châu Á, gắn liền với lịch sử

4

cổ đại nơi đây và được coi như một loại thức ăn bổ dưỡng và cao quý (Oikawa và cộng sự, 2015)(Kushwaha, 2016) Cũng theo Oikawa, các giống lúa có màu đen (tím) này tuy được trồng từ lâu đời trước cả các triều đại Trung Quốc cổ đại nhưng lại

không có ghi chép về màu này trên các giống lúa cổ O rufipogon, vì thế có khả năng

màu này được xuất hiện do thuần hóa Các giống lúa này còn được coi là có dinh dưỡng cao hơn hẳn các giống lúa có màu khác, và được tiêu thụ từ hàng nghìn năm trước ở Trung Quốc, Ấn Độ và Thái Lan (Kushwaha, 2016)

1.1.2 Phân loại lúa

Lúa thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ

Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima Oryza sativa là loài lúa được thuần hóa và trồng lâu đời ở châu Á trong khi Oryza glaberrima

là loài lúa trồng ở Châu Phi (Kushwaha, 2016; Singh và cộng sự, 2000) Theo Kushwaha và cộng sự, có trên 25 loài của chi Oryza được ghi nhận trên thế giới với

phần lớn trong số đó là lúa thuộc nhóm giống indica, theo sau là japonica và các giống javanica (Kushwaha, 2016)

Theo Garris và cộng sự (2005), loài Oryza sativa được thu thập từ khắp thế giới chia ra thành 5 nhóm nhỏ dựa trên các chỉ thị SSR là các nhóm Indica, Aus, Aromatic,

temprate Japonica, tropical Japonica (Garris và cộng sự, 2005) Các nhóm này được

phân tách rõ ràng và có khoảng cách di truyền tương đối cao Garris và cộng sự cũng

cho rằng nhóm indica và aus có quan hệ gần hơn so với ba nhóm còn lại, tương đồng

với sự phát sinh các nhóm lúa hiện đại trong nghiên cứu của Fuller và cộng sự năm

2010 (Fuller và cộng sự, 2010)

Bảng 1: Bảng phân loại và phân bố cơ bản của lúa trên thế giới (The Biology

and Ecology of Rice (Oryza sativa L.) in Australia, 2005)

Loài Oryza Bộ gen Châu Phi Trung hoặc Nam Mỹ Châu Á Châu Dương Đại Phức hệ O Sativa

O schlechteri Chưa biết 

Trên thế giới và nhất là ở khu vực châu Á, lúa thường được phân loại thành 2

nhóm chính dựa trên phân loại thực vật là nhóm Indica và Japonica (Y Yang và cộng

sự, 2014) Lúa đen là một dạng khác thuộc nhóm lúa màu có nguồn gốc từ châu Á

Lúa đen được phát hiện ở cả hai nhóm Indica và Japonica (Chaudhary, 2003) Theo

thống kê chưa đầy đủ, trên 1900 mẫu giống lúa màu của Việt Nam được lưu trữ tại

Trung tâm Tài nguyên thực vật, hầu hết được phân loại theo 2 nhóm chính Indica và

Japonica (Đới Hồng Hạnh và cộng sự, 2017)

1.1.3 Phân bố của lúa màu

Lúa (Oryza sativa) là một trong những cây trồng quan trọng nhất trên thế giới

và được trồng rộng rãi ở nhiều khu vực với điều kiện khí hậu và đất đai phù hợp

Theo tổng hợp của Văn phòng quản lý công nghệ gen, Úc, Oryza sativa được phân

bố rộng rãi trên toàn thế giới (Bảng 1) Phần lớn và phổ biến nhất được phân bố và trồng rộng rãi là các giống lúa trắng, các giống lúa màu khác bao gồm lúa tím, lúa đỏ, được trồng và tiêu thụ hạn chế hơn

Do có yêu cầu về điều kiện nhiệt độ và ánh sáng với nhiệt độ thích hợp trong khoảng trung bình 24oC (IRRI, 2015) và yêu cầu về lượng nước tương đối lớn, khoảng 150cm nước mưa tự nhiên/năm, lúa được phân bố nhiều ở các vùng nhiệt đới hơn so với các vùng ôn đới

So với sự phân bố rộng rãi của các giống lúa trắng, các giống lúa màu phân bố rải rác khắp châu Á (Oikawa và cộng sự, 2015) Có hơn 200 giống lúa màu trên thế giới, với Trung Quốc trồng nhiều lúa màu nhất, tiếp theo là Sri Lanka, Indonesia, Ấn

Độ và Philippines, v.v Trong đó Trung Quốc chiếm 62% sản lượng lúa màu toàn

7 cầu và đã phát triển hơn hơn 54 giống lúa màu hiện đại với các đặc tính năng suất cao

và chống chịu tốt (Ichikawa và cộng sự, 2001)

Ở Việt Nam, các giống lúa màu hiện nay được phát triển và đưa vào canh tác nhiều hơn do các lợi ích về sức khỏe và hàm lượng dinh dưỡng Theo thống kê chưa đầy đủ của Ngân hàng Gen cây trồng Quốc gia, các giống lúa màu địa phương được phân bố rải rác nhưng vẫn được ghi nhận ở các vùng miền trên Việt Nam

1.1.4 Vai trò và giá trị của lúa màu

Lúa màu là nguồn cung cấp hàm lượng dinh dưỡng cao hơn hẳn so với các giống lúa khác (Kushwaha, 2016; Oikawa và cộng sự, 2015), không chỉ với hàm lượng protein và dinh dưỡng cao hơn hẳn, chúng còn mang trong mình hàm lượng các chất chống oxi hóa tuyệt vời như anthocyanin, flavonoid, polyphenol Trong các loại lúa màu, lúa màu có màu đen là loại có hàm lượng dinh dưỡng cao nhất, không chứa gluten, không chrolesterol, ít đường, muối và chất béo trong khi chất xơ, chất chống oxi hóa như anthocyanin, vitamin B và E, sắt, magie, niacin và phốt pho lại có được ghi nhận là chứa hàm lượng nhiều Do đó, đây là loại thực phẩm bổ dưỡng, lại thích hợp với nhiều đối tượng người, nhất là những người mang chứng dị ứng với gluten

và những người cần hạn chế chrolesterol trong khẩu phần ăn hàng ngày

Ngoài ra, về mặt di truyền, lúa màu là một đối tượng rất được quan tâm ngoài mối quan tâm chung đối với các loại gạo, nhất là các chất chống oxi hóa và màu sắc của hạt gạo Điển hình là di truyền về tích lũy anthocyanin trong lúa đã được nghiên cứu từ hơn nửa thế kỷ qua Màu sắc của anthocyanin cũng như các hợp chất màu khác nhìn chung được quy định bởi các gen cấu trúc và gen điều hòa của chúng Kinoshita (1995) tổng kết có 26 gen liên quan đến màu sắc anthocyanin, 10 gen liên quan đến

sự ức chế màu sắc của anthocyanin, và 15 gen liên quan đến màu sắc của các các hợp chất khác, như các proanthocyanidin (Kinoshita, 1995) Các màu sắc tạo nên sự đặc biệt của những loại lúa này đã được chứng minh là được kiểm soát của nhiều loại gen như: gen A, B, C (Dhulappanavar, 1973), gen Ra, Rb (Hu và cộng sự, 2000), gen Rc,

Rd mã hóa protein DFR và một số yếu tố phiên mã (ChangKug Kim và cộng sự,

8 2009) Trong lúa màu, locus Pb và Pp được tìm thấy có liên quan đến sự tích lũy anthocyanins (Yoshimura và cộng sự, 1997) Gen Ra và Rc cũng như các marker phân tử RM339 và RM316 liên quan đến hàm lượng các hợp chất phenolic, hàm lượng flavonoid và khả năng chống ôxy hoá (Shao và cộng sự, 2011) Ngoài ra, ở Việt Nam, rất nhiều loài lúa màu bản địa được trồng quảng canh chọc lỗ bỏ hạt, trồng trên địa hình hiểm trở và không có nguồn dinh dưỡng và môi trường hoàn hảo cho trồng trọt, nhưng vẫn có thể cho chất lượng và năng suất ổn định, đây là nguồn vật liệu phong phú cho chọn lọc và lai tạo giống sau này

Bên cạnh đó, xét về văn hóa, ở Việt Nam, nhiều loại lúa màu được sử dụng trong các món ăn và trong các nghi lễ truyền thống như món xôi của người dân tộc Thái, Dao, Tày, Nùng, v.v

Như vậy, lúa màu có vai trò quan trọng trong việc cung cấp nguồn thực phẩm dinh dưỡng và ý nghĩa trong di truyền Nó cũng đóng góp vào bảo toàn văn hóa và bảo vệ môi trường Do đó, việc nghiên cứu về năng suất và chất lượng (trong đó có hàm lượng amylose về độ dẻo của gạo) là những nghiên cứu gắn liền với thực tiễn và

có ý nghĩa với lúa màu

1.1.5 Giới thiệu tập đoàn giống lúa màu trong nghiên cứu

Bộ 83 mẫu giống lúa địa phương sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu giống được lựa chọn trong hơn 1900 giống lúa màu đã được thu thập và bảo tồn tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, hiện được sử dụng trong đề tài Nghị định thư NĐT.77.AU/20, đồng thời được tuyển chọn lại từ bộ giống sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết và cộng sự năm 2022 (Tuyết và cộng sự, 2022) Tất cả các mẫu giống sử dụng đều là các mẫu giống có màu tím (đen), có sự khác biệt không nhiều về màu sắc (tím một phần và tím hoàn toàn) (phụ lục 2) Do toàn bộ các mẫu giống lúa đều là giống lúa màu nên sự đa dạng về màu sắc của các giống lúa khi đánh giá bằng mắt thường không cao

Tuy màu sắc không quá đa dạng do tiêu chí của bộ giống nghiên cứu chỉ tập trung vào nhóm giống lúa có màu đen, nhưng các giống lúa này có sự đa dạng về khu

9 vực thu thập Chúng được phân bố từ miền Bắc đến Bắc Trung bộ của Việt Nam Phân bố của các mẫu giống này được thể hiện tại hình 2

Hình 2 Bản đồ phân bố 83 mẫu giống nghiên cứu (màu đỏ là địa phương thu thập

mẫu giống sử dụng trong nghiên cứu)

Khu vực thu thập các mẫu giống nghiên cứu chủ yếu là các khu vực đồi núi hoặc trung du, chủ yếu các phân bố ở phía Tây của bản đồ, bao gồm Tây Bắc và phía Tây của tỉnh Thanh Hóa và tỉnh Nghệ An Khu vực thu thập các mẫu giống này là các khu vực có khí hậu và độ cao khác nhau, chịu ảnh hưởng của môi trường sinh thái khác nhau, đồng thời các mẫu giống này là các mẫu giống lúa địa phương được gieo trồng và truyền lại lâu đời và do các cộng đồng dân tộc bản địa khác nhau sở hữu, do đó các tính trạng nông học của chúng cũng tiềm tàng về sự đa dạng cao do điều kiện tự nhiên và xã hội có tính khác biệt

Theo dữ liệu nguồn gen lưu trữ tại Trung tâm Tài nguyên thực vật, cùng với phân bố địa lý (hình 2), các mẫu giống được sử dụng được thu thập từ những cộng

10 đồng dân tộc thiểu số sinh sống ở các vùng cao tại miền Bắc và Bắc Trung bộ, bao gồm: H’Mông, Mán, Thái, Dao, Kháng, Khơ Mú, Mường, Tày Đây là các giống lúa được thuần hóa lâu đời từ các giống lúa nương bởi các dân tộc nói trên, được truyền lại cho các đời sau và thường được sử dụng tại các địa phương như một loại lương thực hàng ngày và cũng là loại thức ăn đặc biệt được chế biến và không thể thiếu trong các dịp lễ Ví dụ như giống lúa khẩu cẩm xẳng thu thập tại huyện Con Cuông, Nghệ An là giống lúa lâu đời được thuần hóa và trồng bởi người dân tộc Thái Đây

là giống lúa màu không chỉ xuất hiện trong bữa cơm mà còn xuất hiện trong tất cả các dịp lễ, Tết với ý nghĩa tâm linh của bà con dân tộc Thái ở nơi đây

Như vậy, tập đoàn lúa màu địa phương sử dụng trong nghiên cứu với màu sắc

vỏ gạo chủ đạo là màu tím, được thuần hóa bởi các cộng đồng dân tộc khác nhau sinh sống tại miền Bắc và Bắc Trung bộ, do đó, có sự đa dạng về phân bố và có tiềm tàng

sự đa dạng lớn về các tính trạng nông học Ngoài ra, các giống lúa này còn có ý nghĩa lớn gắn liền với văn hóa của các dân tộc tại trung du và miền núi phía Bắc và Bắc Trung bộ

1.2 Tính trạng nông học ở lúa

1.2.1 Tính trạng nông học ở lúa nói chung

Lúa là một trong những loại cây trồng lâu đời và là cây lương thực hàng đầu thế

giới bên cạnh các loại cây lương thực phổ biến khác như ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz) và khoai tây (Solanum tuberosum L.) Lúa thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo (Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và Oryza glaberrima

Lúa có các tính trạng nông học tương đối đa dạng Theo mô tả của IRRI (2013) các tính trạng nông học của lúa được đánh giá ở tất cả các giai đoạn, từ nảy mầm, mạ, cấy đến giai đoạn sinh trưởng, sinh dưỡng, đẻ nhánh, làm đòng, trỗ, chín sữa, và chín sinh lý hay các thí nghiệm cụ thể như các thí nghiệm chống chịu điều kiện bất lợi (mặn, hạn) Với mỗi giai đoạn, các tính trạng được đánh giá bằng hàng loạt chỉ tiêu

cụ thể, ví dụ như giai đoạn mầm có thời gian nảy mầm, tỷ lệ nảy mầm, độ dài mầm,

11 đến giai đoạn đẻ nhánh có chỉ tiêu số nhánh tối đa, số dảnh/khóm, với giai đoạn trưởng thành có chỉ tiêu độ dài lá, chiều rộng lá, góc lá đòng, v.v đến giai đoạn chín sinh lý, thu hoạch xong thì đánh giá về năng suất và một số tính trạng liên quan đến năng suất như số bông/khóm, số hạt/ bông, tỷ lệ hạt chắc, Ngoài đánh giá bằng các chỉ tiêu đo đếm định lượng rõ ràng, một số chỉ tiêu định tính về màu sắc cảm quan với các tính trạng màu sắc cũng được đánh giá trên tất cả các loại lúa như màu

vỏ hạt, màu mỏ hạt, màu vỏ trấu, màu lá, màu ống rạ, Tuy nhiên, nhóm lúa có sự

đa dạng màu sắc nhất là nhóm lúa màu

Ngoài ra, các tính trạng của lúa còn được đánh giá bằng các tính trạng về chất lượng, như độ dẻo khi nấu thông qua hàm lượng amylose (Seetharaman, 1959), độ thơm, hàm lượng protein, đường khử (Dương và cộng sự, 2009), Các tính trạng về chất lượng của lúa này góp phần giúp các nhà chọn tạo giống lựa chọn các giống lúa

có chất lượng tốt, hàm lượng dinh dưỡng cao

1.2.2 Tính trạng nông học ở lúa màu

Tính trạng nông học hay đặc điểm nông học là đề cập đến các đặc điểm của cây trồng ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng và khả năng chống lại các stress sinh học và phi sinh học Những đặc điểm này bao gồm các đặc điểm về thân, lá, rễ, hoa, quả và hạt của cây trồng Trong đó đặc điểm nông học phải kể đến là chiều cao cây, khả năng đẻ nhánh, chiều dài và khối lượng rễ, kích thước và trọng lượng hạt cũng như khả năng chống chịu sâu bệnh và các tác nhân gây stress môi trường Các nhà nghiên cứu nông học nghiên cứu các đặc điểm nông học để cải thiện năng suất cây trồng

Trong nghiên cứu, các mẫu giống lúa được sử dụng cùng là mẫu giống lúa

màu, thuộc loài Oryza sativa L không thuộc loài lúa màu Oryza glaberrima O sativa

là loài lúa được thuần hóa và gieo trồng lâu đời ở châu Á (Kushwaha, 2016; Singh và cộng sự, 2000), nổi bật với màu sắc đẹp, hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là giàu các chất chống oxi hóa (Kushwaha, 2016; Oikawa và cộng sự, 2015)

12 Các tính trạng nổi bật của các mẫu giống lúa màu so với các giống lúa khác được thể hiện bằng các màu sắc khác nhau ở các vị trí, cơ quan khác nhau trên toàn

bộ cây lúa, ví dụ như màu sắc lá lúa, màu thân lúa, màu thìa lìa, màu vỏ trấu, màu mày hạt, màu mỏ hạt, màu hạt Theo bảng mô tả của IRRI, các màu sắc này sẽ được đánh giá riêng rẽ, và được quy chiếu theo thang điểm màu sắc cho từng tính trạng

Do đó, các giống khác nhau khi được đánh giá tất cả các chỉ tiêu sẽ có cho riêng mình các tính trạng màu sắc có giá trị khác nhau Đồng thời vì màu sắc này đều được đánh giá bằng mắt thường nên có thể có sự sai số giữa những người đánh giá khác nhau

Bên cạnh màu sắc nổi bật, những tính trạng được quan tâm nhất của lúa màu

là các tính trạng chất lượng Lúa gạo màu nổi tiếng với hàm lượng các chất chống oxi hóa như flavonoid, polyphenol (Shao và cộng sự, 2011), anthocyanin và proanthocyanin (Kinoshita, 1995) Những năm gần đây, với sự quan tâm đặc biệt về các hợp chất thứ cấp sinh học và lợi ích của chúng đối với sức khỏe con người, hàm lượng các chất chống oxi hóa là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm khi nói đến các tính trạng của lúa màu

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tính trạng nông học ở lúa màu

Các tính trạng nông học của lúa nói chung đã được nghiên cứu từ rất lâu Năm

1965, sách The morphology and varietal characteristics of the rice plant (Chang và

cộng sự, 1965) được ban hành bởi Viện Nghiên cứu Lúa Quốc Tế, bắt đầu đưa ra các tiêu chuẩn cụ thể và là tiêu chuẩn chung cho việc đánh giá các tính trạng nông học nói chung trên lúa Đến nay, đã trải qua hơn nửa thế kỷ cùng sự phát triển không ngừng của khoa học công nghệ, đến nay các bộ tiêu chuẩn của IRRI ngày càng được cải tiến trên các tiêu chuẩn cũ, ngày càng cụ thể hơn, giúp việc mô tả lúa dựa trên đánh giá nông học được kỹ càng và sát sao nhất có thể Tuy nhiên, để các nghiên cứu mang nhiều ý nghĩa nhất và có giá trị thực tế, các nghiên cứu về tính trạng nông học của lúa rất ít khi đứng riêng rẽ mà thường đi cùng các nghiên cứu về phân tử (Gowda

và cộng sự, 2012), hoặc đi cùng những tính trạng có ý nghĩa cao như tính trạng năng suất (Luzikihupi, 1998)

13 Tuy nhiên, đối với các nghiên cứu cụ thể trên bộ giống lúa màu, phạm vi nghiên cứu ngày càng đa dạng do ngoài các tính trạng chung giống như các giống lúa gạo trắng thông thường, chúng còn có các đặc điểm đặc trưng về màu sắc, được tạo nên bởi các chất khác nhau và có hàm lượng dinh dưỡng cao hơn các giống lúa thường (Kushwaha, 2016; Oikawa và cộng sự, 2015) Các nghiên cứu về tính trạng nông học của lúa màu nhất là các giống lúa màu gần đây, ngoài các nghiên cứu về cải thiện và nâng cao năng suất (Wangiyana và cộng sự, 2022), hầu như các công bố có liên quan đến các tính trạng về chất lượng như nghiên cứu về anthocyanin trên lúa màu (Dwiningsih và cộng sự, 2022), hay các nghiên cứu đánh giá về tính trạng chất lượng trước và sau một số điều kiện nhân tạo làm tăng chất lượng lúa màu (Wangiyana và cộng sự, 2022), và đặc biệt những nghiên cứu về các tính trạng chống oxi hóa trên lúa màu (Chen và cộng sự, 2022), hay chọn giống dựa trên chức năng cấu thành chất lượng của lúa màu (Tumanian và cộng sự, 2020)

Như vậy có thể thấy các nghiên cứu về tính trạng nông học của lúa, đặc biệt là các tính trạng nông học của lúa màu hiện nay đã được quan tâm nghiên cứu rất nhiều bởi các nhà khoa học Với sự phát triển và sự chú ý với các tính trạng các chất chống oxi hóa và chất lượng tốt của các giống lúa này, ngày nay, chất lượng gạo màu cùng với năng suất (tính trạng vốn được quan tâm rộng rãi trên lúa nói chung) đang ngày càng trở thành những tính trạng nổi bật khi nghiên cứu nhằm cải tiến tính trạng nông học của lúa màu

1.3 Đa hình đơn nucleotide (SNP) và mối tương quan với tính trạng nông học

ở lúa

1.3.1 Giới thiệu SNP

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) là những thay đổi một nucleotide trong trình tự bộ gen của các cá thể trong quần thể được gọi là đa hình nucleotide đơn Kỹ thuật này gần đây đang rất được quan tâm trên đa dạng đối tượng, đặc biệt đối với thực vật, SNP đang ngày càng được quan tâm và có tiềm năng thay thế cho các chỉ thị phân tử đã được ứng dụng trong di truyền và chọn giống trước đây Do SNP có số

14 lượng lớn, mật độ của chỉ thị SNP là rất cao trong bộ gen nên rất dễ tìm thấy đa hình, khả năng tự động hóa cao nên tiết kiệm được thời gian và nhân lực được xác định trên toàn bộ bộ gen của đối tượng nghiên cứu, có nhiều trong quần thể, có tính di truyền, ít bị thay đổi và có tiềm năng lớn cho nghiên cứu liên kết dựa trên trình tự SNP của các giống cụ thể (Duran và cộng sự, 2009) Tuy nhiên, vì sự xuất hiện dày đặc trên bộ gen của sinh vật (như trên ngô, trong khoảng 100bp có 1 SNP (Edwards

và cộng sự, 2010), trên người là khoảng 1kb có 1 SNP (Zhao và cộng sự, 2003) và khả năng phân bố SNP có ở tất cả các vùng gen (kể cả vùng mã hóa và vùng không

mã hóa trên gen) nên đây là nguồn dữ liệu tuyệt vời cho phân tích về các gen trên toàn bộ bộ gen cây trồng

1.3.2 Phương pháp phát hiện SNP

Có rất nhiều phương pháp phát hiện SNP nhưng chủ yếu thuộc 4 phương pháp chính là kỹ thuật lai đặc hiệu allene, với cải tiến mới nhất là kỹ thuật lai sử dụng microarray, các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, sử dụng các dò huỳnh quang, và giải trình tự gen, ngoài ra còn có các phương pháp dựa trên tính chất vật lý của DNA khi điện di sản phẩm PCR để sử dụng các phương pháp thử nghiệm điện di (electronic assay) như SSCP, điện di gradient nhiệt độ hay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Jehan và cộng sự, 2006) Những phương pháp này dùng để phân tích SNP, tuy nhiên với số lượng ít Thường sau khi xác định được một vài SNP quan trọng người ta phát triển các SNP marker này và sử dụng cho các mục đích khác nhau

Các phương pháp PCR đặc hiệu alen (Gaudet và cộng sự, 2009), phương pháp CAPS (Clevered Amplified Polymorphic sequence), SCAR (Sequence characterized amplified regions for amplification of specific band) (Idrees và cộng sự, 2014) hay tetra-primer dựa trên phản ứng PCR hiện chỉ đang được một phần nhỏ sử dụng cho mục đích phân tích SNP, hay được sử dụng như một loại marker có tính đặc hiệu cao cho MAS (Marker assisted selection) (Gupta và cộng sự, 2001) Theo Gaudet và cộng

sự, phương pháp PCR đặc hiệu allene (AS-PCR), là một phương pháp phân tích di truyền phân tử được sử dụng để phát hiện SNP trong mẫu cây trồng (Gaudet và cộng

15

sự, 2009) dựa trên việc tạo sản phẩm PCR đặc trưng cho allene bằng cách sử dụng mồi AS (allene-specific primer) có bổ sung cơ sở đầu 3' cho vị trí SNP Đây là một phương pháp phân tích di truyền đơn giản và tiết kiệm chi phí, nhưng đòi hỏi tối ưu hóa PCR để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác cao trong phát hiện SNP Chỉ dựa trên phản ứng PCR và tính chất của enzyme cắt giới hạn, phương pháp CAPS (Clevered Amplified Polymorphic sequence) cho kết quả về SNP được tìm thấy một cách đơn giản trên gel điện di, tuy nhiên đôi khi phương pháp này không thật sự hiệu quả và đặc hiệu do bị phụ thuộc hiệu suất của enzyme cắt giới hạn Phương pháp SCAR (Sequence characterized amplified regions for amplification of specific band) cho phép giải trình tự một đoạn mồi cụ thể được khuếch đại nhờ phản ứng PCR (Idrees

và cộng sự, 2014), do đó có thể xác định được một SNP trong một locus với vị trí tương đối cụ thể dựa trên nghiên cứu đoạn gen đã được giải trình tự mà không cần phải giải trình tự cả bộ gen Ngoài ra, phương pháp tetra primer, cung cấp 4 mồi với

sự xuất hiện của 2 mồi trong (inner primers) và 2 mồi ngoài (outer primers), giúp xác định SNP ở một vị trí chính xác trên gen dựa trên các mồi đã được thiết kế đặc hiệu với vị trí SNP, giúp phân biệt một cách dễ dàng trên gel cho câu hỏi có/không có SNP cần tìm ở vị trí mong muốn xác định

Giải trình tự gen là phương pháp không xa lạ với di truyền học Chúng cho kết quả rất nhanh chóng và tương đối chính xác, góp phần lớn cho sự phát triển di truyền học hiện đại nói chung và việc xác định nhanh chóng và chính xác các SNP nói riêng Cho đến nay, giải trình tự đã bước qua 3 thế hệ, với thế hệ đầu tiên là phương pháp giải trình tự đoạn ngắn (chủ yếu là giải trình tự theo Sanger, phương pháp short-gun, ), sau đó là giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS – Next Generation Sequencing), tiêu biểu là giải trình tự với hệ thống Illumina, và gần đây là các hệ thống giải trình

tự thế hệ thứ 3, cho phép giải trình tự đoạn dài với hai hệ thống tiêu biểu là hệ thống Oxford Nanopore và hệ thống Pac-bio Giải trình tự gen thế hệ tiếp theo (NGS) là phương pháp giải trình tự mạnh mẽ, có thể đọc hàng tỷ nucleotides mỗi lần chạy, cho thông lượng cực cao (Chan, 2009), và cũng là phương pháp uy tín cho giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS - Whole genome sequencing), là tiền đề để xác định SNPs trên

16 các đối tượng nghiên cứu, sử dụng Big dataset, thường được xây dựng thông qua Genechip (SNP assay, Beadchip assay…) Tuy nhiên, do giá thành của NGS rất cao cho phân tích SNP trên toàn bộ bộ gen và sự phức tạp của nó trong việc phân tích dữ liệu lớn (big data) nên cách tiếp cận này cũng phần nào bị hạn chế GBS (genotyping

by sequencing) hiện đang được sử dụng nhiều trong xác định SNPs với chất lượng cao cũng dựa trên NGS và giảm thiểu một phần chi phí bằng cách giảm thiểu độ phức tạp của từng đối tượng khác nhau Do đó, để đảm bảo cả tính chính xác cũng như tiết kiện chi phí, hầu hết các nghiên cứu hiện nay trên cây trồng về SNP đều sử dụng phương pháp GBS như trên lúa (Roy và cộng sự, 2023) , hồ tiêu (Chae và cộng sự, 2022), cải dầu (Ryu và cộng sự, 2023),

Hiện nay, công nghệ phân tích kiểu gen SNP hiệu suất cao (SNP-array) được sử dụng khá phổ biến và có độ tin cậy cao

bộ (in-house) rất lớn và không cần đến các siêu máy tính để xử lý số liệu tin sinh học khi so sánh với việc xác định SNP bằng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (NGS

17 – Next generation sequencing) hay xác định SNP bằng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng giải trình tự (GBS – Genotyping by sequencing) mà vẫn đạt hiệu quả cao Điển hình cho sử dụng SNP array là công nghệ 7K SNP chip của Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) được cải tiến từ 6K chip, kế thừa tất cả những điểm có lợi của 6K SNP chip nhưng với số lượng marker lớn hơn bao gồm cả các marker của các tính trạng cụ thể (trait-specific marker) Công nghệ này vừa tiết kiệm chi phí và thời gian, lại cho kết quả có độ chính xác cao (Thomson và cộng sự, 2017) Chip 7K SNP cùng

sử dụng công nghệ Illumina Infinium giống như trên 6K SNP chip, nhưng đã tăng số lượng các locus SNP chất lượng cao có thể gọi được 7.098 SNP trên sản phẩm cuối cùng bao gồm 4.007 SNP từ mảng 6K, 2.056 SNP từ Bảng trình tự lúa mật độ cao (HDRA), 910 SNP từ bộ 384-SNP GoldenGate (OPA2.1, 3.1, 4.0, 5.0, 6.2 và 7,0),

189 SNP từ mảng 44K và 21 gen-based SNP dựa trên các marker đặc trưng cho các

thông số hạt (GS3, ALK, WAXY), kháng bệnh bạc lá do vi khuẩn (Xa4, xa5, Xa21,

Xa23), đạo ôn (Pita), rầy nâu (BPH17, BPH3) và bệnh cháy lá (RTSV1) như cũng

như khả năng chịu ngập nước (Sub1) Do đó, ưu điểm lớn nhất của phương pháp xác

định SNP này là chi phí rẻ, có thể cho kết quả các SNP rất nhanh chóng, độ tin cậy tương đối cao, kết quả trả về ở dạng file Excel rất thuận tiện và đơn giản hóa cho các phân tích tương quan cũng như các phân tích các SNP Tuy nhiên, bên cạnh đó, tỷ lệ các SNP được gọi (call) hầu như không thể đạt 100%, do đó hiệu suất gọi được SNP phụ thuộc vào mẫu và các yếu tố liên quan

Ngoài ra, trên các loại cây trồng khác, SNP array cũng là công cụ rất hữu ích và được chú ý cho phân tích và chọn tạo giống ở cấp độ phân tử Như trên cây bông đã

sử dụng công cụ 80K SNP array, và được đánh giá là công cụ rất mạnh mẽ trong phân tích bộ gen của loài này (Cai và cộng sự, 2017) Hoặc bộ 60K SNP trên cây bạch đàn

đã được Silva-Junior và cộng sự (2015) phát triển thành công với với 59 222 SNP, là nguồn dữ liệu cho hàng nghìn SNP trên bạch đàn và 1 số loài liên quan, là công cụ mạnh mẽ cho chọn giống ở cấp độ phân tử và điều tra di truyền quần thể trong và trên các loài Bạch đàn (Silva-Junior và cộng sự, 2015) Hay 660K SNP trên lúa mì (wheat) được đánh giá là bộ chỉ thị đáng tin cậy, hiệu quả về chi phí và có thể là lựa chọn tốt

18 nhất để định dạng gen mục tiêu và chọn lọc có sự hỗ trợ của marker trong việc cải thiện di truyền của loài này (C Sun và cộng sự, 2020)

1.3.3 Nghiên cứu tương quan SNP và tính trạng nông học ở lúa

Các nghiên cứu về tương quan giữa SNP và các tính trạng nông học, chất lượng đặc biệt trên cây trồng hiện nay thường được sử dụng nghiên cứu tương quan trên toàn bộ gen (GWAS) hiện được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền quần

thể một loạt các sinh vật mô hình bao gồm Arabidopsis (Ferrero-Serrano và cộng sự,

2019)và chuột (Flint và cộng sự, 2012) và đến các hệ thống cây trồng (Huang và cộng

sự, 2012; Ranc và cộng sự, 2012; Minghui Wang và cộng sự, 2012) và gia súc (Olsen

và cộng sự, 2011) Tuy nhiên, với đối tượng lúa, hiện nay các nghiên cứu về tương quan giữa SNP và các tính trạng nông học, chất lượng còn rất nhiều hạn chế

Trong nghiên cứu về di truyền trên cây trồng nói chung và trên lúa nói riêng, nghiên cứu tương quan giữa các SNP và tính trạng nông học là nghiên cứu mang ý nghĩa cao Thay vì sử dụng các phương pháp truyền thống thường chỉ có thể tập trung vào một vài tính trạng với một số lượng mẫu và marker nhất định, sử dụng nghiên cứu tương quan giữa các SNP và các tính trạng nông học có thể sử dụng trên cả tập đoàn và có thể nghiên cứu cùng lúc nhiều tính trạng, với số lượng các SNP lớn hơn nhiều so với các marker phân tử dựa trên PCR khác Đồng thời nghiên cứu tương quan giúp làm sáng tỏ nhiều yếu tố di truyền trên nhiều loại cây trồng đặc biệt là trên lúa Đây là công cụ hữu hiệu để nghiên cứu với các tính trạng nông học phức tạp như năng suất, chất lượng, khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi của quần thể cây trồng; cho cái nhìn đầu tiên, sâu sắc về các tính trạng nông học trong mối tương quan với kiểu gen, cung cấp số lượng lớn các locus tính trạng số lượng (QTL) và gen tiềm năng cho các nghiên cứu sau

Việc xác định tương quan giữa các SNP và các tính trạng nông học trong các công bố đã được thực hiện và thực sự có ý nghĩa cho chọn tạo giống cả trong và ngoài nước với các nghiên cứu GWAS về các đặc điểm nông học của lúa có ý nghĩa trong sinh trưởng và phát triển của cây (Feng và cộng sự, 2016; Huang và cộng sự, 2012;

là bước khởi đầu cho các nghiên cứu cụ thể chuyên sâu sau này

1.3.4 Ý nghĩa của nghiên cứu tương quan SNP và tính trạng nông học ở lúa

Theo các nhà chọn giống truyền thống, để chọn lọc được nguồn tính trạng bố

mẹ cho các nghiên cứu thường mất đến vài năm, và chúng còn phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện tự nhiên như thời tiết, nhiệt độ mỗi vụ, mưa bão, Do đó, để chọn lọc được các tính trạng tốt sẽ tốn rất nhiều thời gian và công sức, nhưng hiệu quả đạt được lại không cao Với nghiên cứu tương quan SNP và tính trạng nông học, các tính trạng thu được sẽ được đánh giá dựa trên tương quan giữa cả kiểu gen và kiểu hình, cho cái nhìn tổng quát một cách nhanh chóng Đồng thời, đây là các nghiên cứu rất

dễ để thực hiện và đánh giá, có thể tạo nguồn cho các nghiên cứu tiếp theo

Nghiên cứu tương quan giữa các SNP và tính trạng nông học sử dụng kiểu gen

là các SNP, được phân bố trên toàn bộ bộ gen, tận dụng được tối đa các tính chất đặc trưng của SNP cho nghiên cứu Do đó, tính chính xác của nghiên cứu được tăng lên, góp phần đưa ra những nhận định chính xác về các gen/QTL liên quan đến các tính trạng nông học của lúa mà nhà chọn tạo giống mong muốn Từ đó, có khả năng chọn

và xác định các cá thể lúa mang các gen mong muốn dựa trên nhận định để chọn lọc nguồn vật liệu có tính tin cậy cao Ngoài ra, có rất nhiều các nghiên cứu tương quan

20 đến tính chống chịu của lúa như kháng mặn (Courtois và cộng sự, 2013; TA và cộng

sự, 2018), chịu hạn (Courtois và cộng sự, 2013), hay điều hiện thiếu phân lân vô cơ (Mai và cộng sự, 2021), góp phần xác định các gen liên quan đến những điều kiện bất lợi này, tạo nguồn tin cậy để xác định tính chống chịu của lúa với các điều kiện này

Tóm lại, nghiên cứu tương quan giữa các SNP và tính trạng nông học giúp các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác về các gen/QTL có liên quan đến các tính trạng mong muốn, là nguồn dữ liệu bước đầu cho công tác chọn tạo giống với các tính trạng mong muốn

1.4 Tình hình nghiên cứu liên quan đến phân tích mối tương quan giữa các SNP

và một số tính trạng nông học ở lúa

Các nghiên cứu về tương quan giữa SNP và các tính trạng nông học, chất lượng đặc biệt trên cây trồng hiện nay thường được thể hiện bằng nghiên cứu tương quan trên toàn bộ gen (GWAS) hiện được áp dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền

quần thể một loạt các sinh vật mô hình bao gồm Arabidopsis (Ferrero-Serrano và

cộng sự, 2019) và chuột (Flint và cộng sự, 2012) và đến các hệ thống cây trồng (Huang và cộng sự, 2012; Ranc và cộng sự, 2012; Minghui Wang và cộng sự, 2012) Tuy nhiên, với đối tượng lúa, hiện nay các nghiên cứu về tương quan giữa SNP và các tính trạng nông học, chất lượng còn rất nhiều hạn chế

Năm 2010, Huang và cộng sự nghiên cứu GWAS với 14 tính trạng nông học của bộ giống lúa địa phương, trong đó có hàm lượng amylose Nghiên cứu cho kết quả 3 SNP được xác định liên quan đến quá trình tổng hợp amylose trên nhiễm sắc thể số 6 dựa trên phương pháp MLM (Mixed Linear Model – mô hình tuyến tính hỗn hợp) (Huang và cộng sự, 2010) Cùng đối tượng nghiên cứu GWAS với tính trạng amylose, Yang và cộng sự trên 419 giống lúa bản địa sử dụng mô hình tuyến tình hỗn hợp sử dụng mô hình tuyến tính hỗn hợp (MLM) giữa cơ cấu quần thể (Q) và ma trận

quan hệ họ hàng (kinship matrix) đã phát hiện gen LAC6 , gen mới được chứng minh

là liên kết với hàm lượng amylose thấp và kết hợp phát hiện gen này bằng qRT-PCR

21 cho thấy LOC_Os06g11130 và LOC_Os06g11340 là gen ứng cử viên chính của

LAC6 (X Yang và cộng sự, 2017) Năm 2022, Alpuerto và cộng sự nghiên cứu

GWAS cho hàm lượng amylose và hàm lượng protein với 872556 SNP, phát hiện 32 SNP có liên quan đến hàm lượng protein và chỉ 7 SNP liên quan đến hàm lượng amylose Đối với hàm lượng amylose, mặc dù chỉ tìm thấy SNP gợi ý liên kết, nhưng các mô hình gen liên kết với các SNP này có chức năng liên quan đến gen chức năng liên quan đến hàm lượng protein trong gạo, cụ thể: nhiễm sắc thể 4 phát hiện các gen liên quan đến S04_29329808 có chức năng gây bệnh và phản ứng với stress oxy hóa (Os04g0573200); nhiễm sắc thể 1, gen quy định sinh tổng hợp ABA và điều hòa hàm lượng chất diệp lục (Os01g0104600) được phát hiện có liên quan đến S01_253310; gen quy định các chất điều hòa chuyển hóa carbohydrate (Os10g0339600) được phát hiện có mối liên quan chặt chẽ với S10_10340782; protein kết dính hạt tinh bột tổng hợp (GBSS), một enzyme được biết đến có chức năng điều chỉnh quá trình tổng hợp tinh bột trong hạt gạo, được mã hóa bởi gen Waxy (Wx) (Os06g0133000) được tìm thấy trong nhiễm sắc thể 6 (Alpuerto và cộng sự, 2022) Cùng năm 2022, Verma và cộng sự thực hiện nghiên cứu GWAS phát hiện các gen ứng viên liên quan đến chất lượng hạt đa dạng giống lúa tại Đông Bắc Ấn Độ, trong đó có hàm lượng amylose trong hạt, phát hiện tối đa 11 gen khác nhau liên quan đến hàm lượng amylose trong hạt trên một QTL, qAMY_1.9, các gen này chi phối con đường enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa carbohydrate thông qua hoạt động của các phản ứng enzyme khác nhau được điều chỉnh bởi Alpha-amylase 3A, Alpha-amylase 3B, Alpha-amylase 3C, Glucose-6-phosphate isomerase và Beta-glucosidase và một enzyme α-Amylase xúc tác quá trình thủy phân tinh bột thành đường giữa các vi sinh vật, thực vật và động vật (Verma và cộng sự, 2022)

Peng Zhang, Kaizhen Zhong và cộng sự đã nghiên cứu GWAS cho 12 đặc điểm nông học quan trọng của lúa dựa trên 48 đặc điểm kiểu hình từ 2262 mẫu giống và kiểu gen của hơn 3,8 triệu SNP Trong tập đoàn lõi của nghiên cứu này đã phát hiện được 32 vị trí liên quan đáng kể với các đặc điểm nông học được phát hiện gần với các gen như Hd1, SD1, Ghd7, GW8 và GL7, và những locus này có thể là các biến

22 thể tự nhiên trong các gen được nhân bản hoặc QTL ảnh hưởng đến các đặc điểm nông học tiềm năng (P Zhang và cộng sự, 2019)

Bằng cách áp dụng GWAS trên tập đoàn lúa được thu thập trên toàn thế giới, Huang và cs (2011) nghiên cứu tương quan của hơn 4,1 triệu SNP với các tính trạng thời gian ra hoa và đặc điểm năng suất hạt, nhóm tác giả đã tìm được 32 loci mới liên quan đến thời gian ra hoa và 10 loci liên quan đến kích thước hạt (Huang và cộng sự, 2012) Từ 5291 SNP, Feng và cộng sự (2016) đã nghiên cứu về tương tác của bộ SNP này với tính trạng hình dạng hạt lúa, thu được 27 loci và 424 gen tiềm năng liên quan trực tiếp đến hình thái hạt, trong đó có 16/27 loci trên nằm gần với các QTL quy định hình thái hạt đã được công bố trước đây, đáng chú ý là hai QTL quy định chiều dài (GS3) và chiều rộng hạt (qSW5) (Feng và cộng sự, 2016)

Tại Việt Nam, những năm gần đây nhờ sự phát triển của các công nghệ giải trình tự, hiện nay, các nghiên cứu tương quan của SNP với các tính trạng kiểu hình bắt đầu được chú ý

Trong dự án hợp tác Việt - Pháp, Phùng Thị Phương Nhung và cs đã xây dựng một quần thể các giống lúa bản địa đại diện cho các hệ sinh thái canh tác đa dạng của Việt Nam gồm 182 giống được phân tích với gần 30.000 SNP bằng kỹ thuật genotyping by sequencing (GBS) tạo tiền đề cho các nghiên cứu GWAS đối với các tính trạng như cấu trúc bộ rễ, cấu trúc bông (Phung và cộng sự, 2016).Cũng trong hai năm 2011-2012, trong dự án hợp tác giữa Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm nghiên cứu John Innes và Trung tâm phân tích bộ gen (The Genome Analysis Centre - TGAC), 36 giống lúa bản địa ưu tú tại Việt Nam được giải trình tự illumina 7x, và đến năm 2017 dự án đã hoàn thành việc giải mã trên 300 giống lúa Việt Nam Thành công của các dự án giải trình tự bộ gen lúa tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung cung cấp nguồn dữ liệu vô cùng phong phú cho các nghiên cứu GWAS trên cây lúa

Nếu các phương pháp truyền thống thường chỉ có thể tập trung vào một vài tính trạng để nghiên cứu, thì GWAS lại có thể áp dụng nghiên cứu trên cả tập đoàn cùng

23 lúc nhiều tính trạng Dựa trên phân tích kiểu gen của 182 giống lúa (115 indica và 64 japonica) thu thập từ khắp các tỉnh thành trên cả nước, Phùng Thị Phương Nhung và

cs (2014) tiến hành phân tích GWAS trên các tính trạng liên quan đến cấu trúc bộ rễ như dài rễ, trọng lượng rễ ở các độ sâu khác nhau, dày rễ, số lượng rễ bên, tỉ lệ rễ/chồi

và một số tính trạng khác ảnh hưởng đến khả năng đâm sâu và hấp thụ nước, qua đó tăng cường khả năng chịu hạn Kết quả nghiên cứu tìm ra 2 QTL quan trọng và một

số gen tiềm năng trên nhiễm sắc thể số 2 và 11 ảnh hưởng lớn đến tính trạng độ dày của rễ và số lượng rễ bên (Phung và cộng sự, 2016)

Với bộ 180 giống lúa bản địa Việt Nam thực hiện bởi Viện Di truyền Nông nghiệp, Hoàng Thị Giang và cộng sự cũng thực hiện nghiên cứu “Lập bản đồ liên kết toàn bộ gen với các tính trạng khối lượng lá lúa của bộ giống lúa bản địa Việt Nam” Nhóm nghiên cứu vẫn sử dụng phương pháp nghiên cứu GWAS với 21,623 SNP markers trên bộ gen lúa, chỉ ra được 13 QTLs được liên kết với đặc điểm lá, trong đó

6 QTLs bao gồm QTL_4, QTL_5, QTL_8, QTL_11, QTL_12, và QTL_13 được xác định trên toàn bộ bộ giống lúa, 4 QTLs QTL_2, QTL_3, QTL_6, và QTL_7 được phát hiện trên phân loài phụ Indica, và 3 QTLs QTL_1, QTL_9 và QTL_10 được phát hiện cả trên toàn bộ bộ giống lúa và cả trên phân loài phụ Indica Trong 13 QTLs, 11 QTLs được xác định đối với trọng lượng lá tươi, 11 đối với trọng lượng lá bão hòa nước, một cho trọng lượng khô, một cho trọng lượng mô tương đối và một cho phần trăm chất khô của lá Trong 13 QTLs đã được phát hiện, 11 được liên kết với 2 hay 3 đặc điểm Một số gen trong các QTL này có chức năng đã biết trong quá trình phát triển hoặc sinh lý của lá như trên QTL_11 có gen Os10g33310 (OsiICK6) liên quan đến sự tăng sinh tế bào để duy trì sự phát triển đồng đều trên bề mặt phiến lá và bẹ

lá, Os10g33810 (OsMYB110 / OsMYB8) liên quan đến sự phát triển của lá và phản ứng vật lý với stress trên lúa, Os10g32980 (OsCESA7) mã hóa một loại enzim sản xuất cenlulose và noncellulosic, tổng hợp polysaccharide, có thể tham gia sản xuất sinh khối lá, ngoài ra còn có gen Os10g33780 (OsTAWAWA1) điều chỉnh hình thành

và phát triển bông; gen Os02g10900 (RAPID LEAF SENESCENCE 1 –RLS1), một protein chứa vị trí liên kết nucleotide với miền ARM, nằm trong QTL_4 và được

24 nhận định là có liên quan đến sự thoái hóa lục lạp trong quá trình già đi của lá; trên QTL_1 xác định được gen Os01g59660 (GAMYB), mã hóa yếu tố phiên mã họ MYB, mà mức độ biểu hiện của nó có liên quan đến sự già đi của lá ở cây lúa; Os03g60910 (OspTAC2) nằm trên QTL_7 được biểu hiện chủ yếu trên lá non và đóng một trò thiết yếu trong sự phát triển bình thường cuả lục lạp; trên QTL_13 phát hiện một gen sinh tổng hợp carotenoid, OsPSY2 (Os12g43130), mã hóa phytoene synthase 1 tham gia vào quá trình tổng hợp terpene cần thiết cho sự phát triển khác biệt của lục lạp (Hoang và cộng sự, 2019)

Nghiên cứu của tác giả Tạ Kim Nhung và cộng sự sử dụng nghiên cứu liên kết trên toàn bộ gen sử dụng bộ giống lúa bản địa Việt Nam đã tìm thấy các QTLs mới kiểm soát đặc điểm hình thái của bông lúa Nhóm tác giả đã sử dụng bộ 26.212 SNPs trên toàn bộ gen để phân tích cho 159 mẫu giống, xác định được 29 QTLs Có 6 QTLs

ổn định đã được phát hiện cho tính trạng số lượng gié với 2 trong số 6 QTL ổn định liên quan đến số lượng gié cũng có các đặc điểm liên quan đến số lượng khác (số lượng nhánh cấp 1 và số lượng nhánh cấp 2) trên NST 1 và 2, tương ứng (QTL_6 và QTL_9), 9 cho tính trạng số nhánh (8 cho số lượng nhánh cấp 1, 1 cho số lượng nhánh cấp 2), 17 cho các đặc điểm liên quan đến chiều dài (1 cho chiều dài trung bình của nhánh cấp 1, 1 cho chiều dài trung bình của nhánh cấp 2, 4 cho chiều dài đốt, 10 cho chiều dài trung bình của lóng cấp 1 trên bông lúa và 1 cho chiều dài trung bình của lóng cấp 2 trên bông lúa) Phân tích kết hợp đa hình đối với các QTL này bằng cách

sử dụng SNP quan trọng được phát hiện cho thấy rằng các giá trị SpN cao được liên kết với ATG haplotype trong QTL_4 và với haplotype ATATAAAT trong QTL_9 (như các giá trị số lượng nhánh cấp 2 cho QTL này) Giá trị PBN cao được liên kết với AAAAAAATAT, ATAAAAA và các kiểu haplotype ATTAT tương ứng trong QTL_1, QTL_5 và QTL_24 Đối với QTL_7, QTL_10 và QTL_11, không thể chỉ định một haplotype cụ thể cho các giá trị cao của các tính trạng liên quan Ngoài ra,

21 vùng gen đã được phát hiện đáng kể trong hai năm cũng được liên kết với các đặc điểm khác nhau (QTL_30 đến QTL_50), trong đó, 4 QTLs đã được phát hiện cho số lượng gié, 10 cho số lượng nhánh cấp 1, 4 cho số lượng nhánh cấp 2, 3 cho số lượng

25 nhánh cấp 1, 3 cho số lượng nhánh cấp 2, 10 cho chiều dài đốt, 10 cho chiều dài trung bình của lóng cấp 1 trên bông lúa và 5 cho chiều dài trung bình của lóng cấp 2 trên bông lúa (TA và cộng sự, 2018)

Ngay trong đầu năm 2022, Nguyễn Thành Tâm và cộng sự có công bố mới nhất

về tương quan trên toàn bộ bộ gen lúa đối với các tính trạng cụ thể là màu sắc hạt gạo lức và độ trở hồ của các giống lúa mùa tại Đồng bằng sông Cửu Long Nhóm nghiên cứu đã sử dụng các số liệu về độ trở hồ và màu sắc hạt gạo lức đánh giá được trên tập đoàn 65 giống lúa mùa và kết hợp với số liệu 24.946SNPs để phân tích mối tương quan trên toàn bộ gen của bộ giống lúa với tính trạng kiểu hình Kết quả thu được 18SNPs ứng viên cho màu sắc hạt gạo nằm trên các nhiễm sắc thể 6,8,12, trong

đó có 5 SNPs ứng viên nằm trên 5 gen khác nhau liên quan đến tính trạng màu sắc hạt; kiểu allele GCTCGCATAAGATTTT được xác định ở 16 SNP ứng viên có liên quan đến tính trạng màu trắng đục của hạt gạo lức Đối với tính trạng độ trở hồ, chỉ

có 2 SNP ứng viên được tìm thấy Trong đó, SNP ứng viên S08_10088669 có liên quan đến nhiệt hóa hồ thấp với allele G (Tâm và cộng sự, 2022)

1.5 Ý nghĩa và vai trò của nghiên cứu tương quan giữa các SNP và tính trạng nông học của tập đoàn lúa màu

Nghiên cứu tương quan giữa các SNP và các tính trạng nông học trên lúa có thể cung cấp lượng lớn thông tin di truyền của cây trồng, ở đây là trên đối tượng lúa gạo màu Phương pháp này giúp các nhà nghiên cứu có thể phân tích không chỉ một mà một vài tính trạng nông học, kể cả các tính trạng do đa gen quy định như năng suất, chất lượng, của cây trồng Nó giúp cung cấp thông tin quan trọng cho các nghiên cứu sau này, là công cụ hữu ích cho nghiên cứu di truyền thực vật và chọn tạo giống cây trồng, giúp xác định các gen/QTL có liên quan đến các tính trạng của cây trồng mục tiêu trong nghiên cứu

Nghiên cứu lần đầu tiên tiếp cận với kỹ thuật xác định kiểu gen trên toàn bộ gen nhờ nền tảng 7K SNP-chip cho nghiên cứu giống lúa ở Việt Nam Cung cấp số liệu kiểu gen hơn 7000 chỉ thị SNP của một bộ giống nghiên cứu trong thời gian ngắn và

26

ở định dạng dễ thao tác, không yêu cầu kiến thức thuật toán chuyên sâu khi phân tích như đối với kỹ thuật GBS Đây là tiền đề để triển khai nghiên cứu GWAS bài bản và

có hiệu, tạo nền tảng cho các nghiên cứu phân lập gen/QTLs, ứng dụng chỉ thị phân

tử trong chọn tạo, cải tạo giống lúa ở Việt Nam Nghiên cứu sử dụng bộ giống lúa được tuyển chọn thuộc ngân hàng gen cây trồng quốc gia, bộ giống lúa được tuyển chọn với các giống được thu thập trên khu vực miền Bắc và Bắc Trung bộ

Ngoài ra, trong nghiên cứu, nghiên cứu tương quan có mục tiêu là tương quan giữa các SNP và tính trạng chính là năng suất và hàm lượng amylose của bộ giống lúa màu, đây là nghiên cứu giúp cung cấp thông tin ban đầu tốt cho việc chọn tạo và xác định các gen liên quan hoặc nằm gần các gen liên quan đến hai tính trạng quan trọng này, đặc biệt của lúa màu Do đó, có thể xem đây là nghiên cứu nguồn cho việc chọn tạo lúa màu có năng suất cao và chất lượng gạo dẻo sau này

27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu thực vật nghiên cứu: 83 mẫu giống lúa màu có nguồn gốc địa phương

có vỏ lụa màu đen (purple, tím) hoặc tím một phần đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia (Phụ lục 1), là các mẫu giống được sử dụng trong Nhiệm vụ Nghị định thư NĐT.77.AU/20

Các chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu: nghiên cứu sử dụng set 7K SNP chip (IRRI) để xác định các SNP phân bố trên 12 nhiễm sắc thể của cây lúa để phân tích tương quan giữa các SNP và một số tính trạng nông học

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Các mẫu giống lúa màu được trồng và đánh giá đặc điểm nông sinh học ở Trung tâm Tài nguyên thực vật

83 mẫu giống được tách chiết DNA tại Trung tâm Tài nguyên thực vật và gửi

đi phân tích SNP tại IRRI với công nghệ 7K SNP chip array

Phân tích tương quan được thực hiện tại Trung tâm Tài nguyên thực vật và Đại học Queensland (The University of Queensland)

Thời gian: tháng 10/2022 – tháng 8/2023

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân tích tính trạng nông học

a Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng

Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp đánh giá tập đoàn của K.A Gomez

và A.A Gomez (Gomez và cộng sự, 1984) và của Nguyễn Thị Lan và Phạm Tiến Dũng (Lan và cộng sự, 2005): 83 giống lúa màu được bố trí tuần tự không nhắc lại, diện tích ô thí nghiệm 2 m2/mẫu giống, mật độ cấy: 40 khóm/m2, cấy 1 dảnh/khóm Thời gian: Vụ mùa 2022

28 Địa điểm tiến hành thí nghiệm: tại An Khánh, Hoài Đức, Hà Nội

- Lượng phân bón cho 1 ha: 1 tấn phân hữu cơ vi sinh + 80 kg N + 90 kg P2O5 + 90 kg K2O/ha

- Các chỉ tiêu theo dõi và phương pháp đánh giá

Các chỉ tiêu theo dõi được đánh giá theo “Biểu mẫu mô tả nguồn gen lúa” (Phụ lục 8) do Trung tâm Tài nguyên thực vật biên soạn trên cơ sở tài liệu hướng dẫn của IRRI và IPGRI

b Chỉ tiêu năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

Các chỉ tiêu về năng suất và yếu tố cấu thành năng suất được đánh giá trên các

ô thí nghiệm 2 m2 riêng biệt Lấy ngẫu nhiên mỗi ô 10 khóm theo phương pháp đường chéo 5 điểm, thực hiện đo đếm và đánh giá các chỉ tiêu

- Số bông/khóm: đếm tổng số bông hữu hiệu trên khóm

- Tỷ lệ hạt chắc: Số bông trên khóm chia làm 3 lớp: lớp bông to, lớp bông trung bình, lớp bông nhỏ, lấy ngẫu nhiên mỗi lớp một bông đếm tổng số hạt, số hạt chắc, tính tỷ lệ hạt chắc

- Khối lượng 1000 hạt (g): Cân 3 lần, mỗi lần 500 hạt ở độ ẩm 13%, sai số giữa các lần cân không vượt quá 2%

- Thời gian sinh trưởng (ngày): được tính từ ngày hạt bắt đầu nảy mầm đến 85%

29

2.3.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu liên quan đến chất lượng gạo

Đánh giá một số đặc điểm liên quan đến chất lượng như: hàm lượng amylose,

và một số đặc điểm đặc trung của lúa màu như flavonoid, polyphenol

a Xác định hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose xác định theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5716 - 2 2008:

Nghiền gạo thành bột mịn để phá vỡ cấu trúc nội nhũ nhằm hỗ trợ sự phân tán và gelatin hóa hoàn toàn Phần mẫu thử được hòa vào dung dịch Natri hydroxit, sau đó lấy một phần của dung dịch chiết này và cho thêm dung dịch iôt Sử dụng máy quang phổ để đo độ hấp thụ của phức màu tạo thành ở bước sóng 720nm Xác định hàm lượng amylose của mẫu dựa vào đường chuẩn

Hình 4 Quy trình xác định hàm lượng amylose

b Xác định hàm lượng anthocyanin bằng phương pháp pH vi sai

Phương pháp này giúp xác định hàm lượng anthocyanin dựa trên nguyên tắc: chất màu anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH 1,0 các anthocyanin tồn tại ở dạng

30 oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu Đo mật độ quang của mẫu tại pH 1,0 và pH 4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm Hàm lượng sắc tố anthocyanin tính theo công thức

l: là chiều dày cuvet (cm)

c Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp Folin – Ciocalteu

(Waterman và cộng sự, 1994)

Trong thành phần thuốc thử Folin – Ciocalteu có phức hợp phospho – wolfarm – phosphomolybdat Phức hợp này sẽ bị khử các hợp chất polyphenol tạo thành sản phẩm phản ứng có màu xanh dương, độ hấp thu được đobằng máy đo quang phổ Hàm lượng polyphenol có trong mẫu tỉ lệ thuận với cường độ mẫu và được tính theo acid gallic.Hàm lượng polyphenol toàn phần chứa trong mẫu cao chiết được đo lường bằng hàm lượng acid gallic đương lượng (GA) và được tính bằng công thức:

31

d Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp

Aluminum Chloride colorimetric (AlCl3) (Ribarova và cộng sự, 2005)

Dùng methanol pha loãng 4 mẫu cao chiết để đạt nồng độ 1.000 µg/mL và dung dịch flavonoid chuẩn Quercetin với dải nồng độ: 100 ppm; 50 ppm; 25 ppm; 12,5 ppm và 6,25 ppm Các dung dịch hóa chất NaNO2 5%, AlCl3 10%, NaOH 1M được pha loãng bằng nước cất Hàm lượng flavonoid toàn phần chứa trong mẫu cao chiết được đo lường bằng hàm lượng Quercetin (QE) đương lượng và được tính bằng công thức:

F = 𝑐×𝑉

𝑚

Trong đó: F: hàm lượng flavonoid tổng (mg quercetin/g chiết xuất);

c: giá trị x từ đường chuẩn với quercetin (mg/mL);

V: thể tích dịch chiết (mL);

m: khối lượng cao chiết có trong thể tích V (g)

2.3.3 Phương pháp xác định SNP

a Phương pháp thu mẫu lá lúa

Các mẫu lá lúa sử dụng để tách chiết DNA được lấy từ chỉ một khóm lúa (khóm được trồng từ một dảnh) của mỗi giống Lá được lấy là lá non ở thời kỳ đẻ nhánh để đảm bảo lượng DNA thu được sau tách chiết

b Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu lá lúa

Phương pháp tách chiết DNA từ lá lúa sử dụng dung dịch đệm CTAB 2% dựa trên quy trình chuẩn của Doyle và cộng sự (1987) (Doyle và cộng sự, 1987)

Khoảng 2g lá lúa được nghiền trong nito lỏng thành dạng bột mịn, sau đó chuyển vào ống eppendorf 2ml Sau đó, thêm vào ống eppendorf đã có bột lá lúa 800µl dung dịch đệm CTAB 2%, trộn đều bằng vontex, ủ 65oC trong 10 phút Hết thời gian ủ mẫu, cho thêm 800 µl Chloroform: isoamyalcohol (24:1), lắc đều 20 phút ở nhiệt độ phòng Các mẫu sau đó được mang đi ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút Hút

32 chuyển dung dịch ở pha trên sang ống eppendorf mới, sau đó thêm 470µl Isopropanol, lắc nhẹ, để lạnh -20oC trong khoảng 1-2 giờ Ống eppendorf sau khi để lạnh đem đi

ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Loại bỏ dung dịch trong ống, thu tủa, rửa bằng

800 µl Ethanol 70% Loại bỏ hoàn toàn dịch rửa và thu kết tủa, để khô hoàn toàn Kết tủa này là DNA cần tách chiết Kết tủa được hòa tan trong 100µl TE ở 4oC để qua đêm Để khử RNA trong dung dịch DNA đã hòa tan, thêm 2µl Rnase (10mg/ml) ủ

37oC trong 30 phút, sau đó thêm 800 µl Chloroform: isoamyalcohol (24:1) lắc nhẹ cho dung dịch trộn đều Ly tâm ống dung dịch ở 12000 vòng/phút trong 10 phút Hút phần dung dịch pha trên sang ống eppendorf 2ml mới Thêm 400µl Ethanol lạnh (-

20oC) và 1/10 thể tích Natri acetat 3M, lắc nhẹ nhàng và giữ ở -20oC trong 60 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút Loại bỏ dung dịch trong ống và rửa tủa bằng Ethanol 70%, để khô Hoà tan tủa trong 100µl TE, sau đó bảo quản dung dịch DNA tổng số ở - 4oC

Sau khi tách chiết được DNA, các mẫu DNA tổng số lúa cùng với DNA nồng

độ chuẩn (Lamda DNA 25ng/µl) được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X, sau đó nhuộm trong dung dịch Ethidium Brommide 0,5ng/ml

và scan trên máy Molecular Imager FX (BioRad Laboratories) Độ tinh sạch, nguyên vẹn của ADN được đánh giá qua hình ảnh điện di, nồng độ các mẫu ADN được xác định thông qua phương pháp so sánh cường độ quang giữa các băng điện di mẫu ADN

và Lamda ADN, và xác định thông qua máy đo quang phổ

c Phương pháp xác định SNP

Mẫu gDNA của bộ giống lúa màu sẽ được gửi đi phân tích kiểu gen bằng hệ thống 7k Infinium SNP genotyping chip tại IRRI Phương pháp này sẽ đồng thời đánh giá kiểu gen của 7.098 SNP trải đều trên 12 nhiễm sắc thể lúa (tương đương mật độ trung bình 1 SNP/60,5 kbp) trong thời gian ngắn (1-2 tuần)

Chip 7K SNP cùng sử dụng công nghệ Illumina Infinium giống như trên bộ 6K SNP chip Chúng được thực hiện trên một bảng Beadchip (hạt chip) với các điểm đánh dấu (marker) được thiết kế để gọi (call) với số lượng các locus SNP chất lượng