Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt (piper longum l ) thuộc họ hồ tiêu

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt (piper longum l ) thuộc họ hồ tiêu Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt (piper longum l ) thuộc họ hồ tiêu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thu Hậu

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA LOÀI TIÊU

LỐT (PIPER LONGUM L.) THUỘC HỌ HỒ TIÊU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Thu Hậu

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA LOÀI TIÊU LỐT

(PIPER LONGUM L.) THUỘC HỌ HỒ TIÊU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440112.02

Cán bộ hướng dẫn: TS Lê Thị Huyền

Hà Nội - 2023

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập sau đại học và tiến hành triển khai nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Tiêu lốt (Piper longum L.) thuộc họ Hồ tiêu” tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc

gia Hà Nội, em cũng đã hoàn thành luận văn thạc sĩ khoa học chuyên ngành Hóa hữu

cơ của mình Luận văn được hoàn thành không chỉ là công sức của riêng bản thân em

mà còn có sự giúp đỡ và hỗ trợ của nhiều cá nhân và tập thể

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS Lê Thị Huyền,

cô đã tận tâm hướng dẫn, khích lệ và động viên em trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu và cả quá trình em hoàn thành luận văn khoa học này Cô đã dành cho em nhiều thời gian quý báu của mình để mang đến cho em những ý kiến, góp ý

và nhận xét quan trọng để giúp luận văn của em được hoàn thiện hơn về mặt nội dung

và hình thức

Đồng thời, em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình đã luôn luôn quan tâm, ủng hộ, khích lệ với những lời động viên, lời khuyên, góp ý bổ ích và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em để em có thể tiếp bước trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu sau đại học

Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể bạn bè, đồng nghiệp, các bạn/anh/chị cùng lớp cao học, sinh viên và những thành viên của phòng thí nghiệm Hóa Dược đã luôn quan tâm, động viên, hỗ trợ và giúp đỡ em trong quá trình học tập và tiến hành nghiên cứu tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2023

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hậu

1.1 Giới thiệu về chi Piper 4

1.1.1 Giới thiệu về họ Hồ tiêu (Piperaceae) 4

1.1.2 Chi Piper 5

1.2 Giới thiệu về loài Tiêu lốt 5

1.2.1 Đặc điểm thực vật 5

1.2.2 Công dụng 6

1.3 Tình hình nghiên cứu của loài P longum 7

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học 7

1.3.2 Các nghiên cứu về dược lực học và hoạt tính sinh học 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Phương pháp chiết nguyên liệu thực vật 28

2.3 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất 28

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng 28

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 28

2.3.3 Sắc ký cột (CC) 29

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 30

2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ 31

2.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 34

2.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 34

2.5.2 Phương pháp xác định khả năng ức chế sản sinh NO của đại thực bào

3.2 Cấu trúc hoá học của các hợp chất đã được phân lập 63

3.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 63

KẾT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 71

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A2780 A human ovarian cancer cell line Dòng tế bào ung thư buồng trứng

của người A549 A human lung carcinoma cell line Dòng tế bào ung thư phổi của người ACE Angiotensin Converting Enzyme Enzyme chuyển đổi angiotensin B16F10 A murine melanoma cell line

from a C57BL/6J mouse

Dòng tế bào khối u ác tính từ chuột C57BL/6J

CAMs Cell adhesion molecules Phân tử liên kết tế bào

CDDP Indomethacine and cisplatine Indomethacine và cisplatine

DLA Dalton’s lymphoma ascites cell Tế bào ung thư hạch Dalton từ

chuột C3H DU-145 A human prostate cancer cell line Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

của con người DMEM Dulbecco’s Modified Eagle

HR-ESI-MS High Resolution Mass

Spectrometry

Phổ khối lượng phân giải cao

HepG2 A human liver cancer cell line Dòng tế bào ung thư biểu mô gan ở

người HeLa HeLa cell lines Dòng tế bào bất tử ở người

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

Chất đệm acid zwitterionic sulfonic

IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

nghiệm IGR-OVI-1 A human ovarian cancer cell line Dòng tế bào ung thư buồng trứng

của người ICAM-1 Intercellular adhesion molecule – 1 Phân tử kết dính giữa các tế bào - 1 L-929 Mouse fibrolast cell line from a

C3H/An male mouse

Dòng tế bào nguyên sợi ở chuột đực C3H/An

LNCaP A human prostate cancer cell line Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

của người LPS Lipopolysaccharide Đại phân tử lipo-polysaccharide L-NMMA A nitric oxide synthase inhibitor

(N G-Methyl-L-arginine acetate)

Chất ức chế tổng hợp NO

(N G-Methyl-L-arginine acetate) MIC Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MCF-7 A human breast cancer cell line Dòng tế bào ung thư vú của người MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl tetrazolium bromide]

[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromid]

NO Nitric oxide Nitơ oxit

PlCE P longum chloroform extraction Phần chiết chloroform của P

longum

PLHA P longum hydro alcoholic

extraction

Chiết xuất cồn của P longum

PLW Aqueous fraction of P longum Dịch chiết nước của P longum

PLE Ethylacetate fraction of P

longum

Dịch chiết EtOAc của P longum

PLB n-Butanol fraction of P longum Dịch chiết n-BuOH của P longum

PC-3 A human prostate cancer cell line Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt

của con người PARP Poly ADP ribose polymerase

inhibitors

Chất ức chế enzyme tự phục hồi tổn thương DNA

ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoá mạnh

RAW264.7 A macrophage cell line Dòng tế bào đại thực bào

SE Supercritical fluid CO2 extraction Chiết siêu tới hạn CO2

S-180 A murine Sarcoma cancer cell

carcinoma cell line

Dòng tế bào ung thư biểu mô buồng trứng biệt hóa

THP-1 A human leukemia monocytic

cell line

Dòng tế bào bạch cầu đơn nhân của người

UE Ultrasonic extraction Chiết siêu âm

VCAM-1 Vascular adhesion molecule - 1 Phân tử kết dính tế bào mạch máu - 1

CÁC DUNG MÔI

CHCl3 Chloroform (Trichloromethane) Triclometan

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimetyl sulfoxit

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Loài Peperomia pellucida (L.) Kunth thuộc họ Hồ tiêu 4

Hình 1.2: Loài Piper nigrum L thuộc họ Hồ tiêu 4

Hình 1.3: Loài Tiêu lốt – Piper longum L 5

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ loài P longum 10

Hình 1.5 Cấu trúc các hợp chất tinh dầu từ loài P longum 13

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất khác từ loài P longum 15

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập các hợp chất từ loài P longum 38

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo 1a 39

Hình 3.2 Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC của hợp chất 1 42

Hình 3.3: Phổ 1H-NMRcủa hợp chất 1 42

Hình 3.4: Phổ 13C-NMRcủa hợp chất 1 43

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo 2a 43

Hình 3.6 Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC của hợp chất 2 45

Hình 3.7: Phổ 1H-NMRcủa hợp chất 2 47

Hình 3.8: Phổ 1H-NMRcủa hợp chất 2 47

Hình 3.9: Phổ 13C-NMRcủa hợp chất 2 48

Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 48

Hình 3.11 Các tương tác 1H-1H COSY và HMBC của hợp chất 3 50

Hình 3.12: Phổ 1H-NMRcủa hợp chất 3 51

Hình 3.13: Phổ 13C-NMRcủa hợp chất 3 51

Hình 3.14 Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo 4a 52

Hình 3.15 Các tương tác HMBC của hợp chất 4 55

Hình 3.16 Cấu trúc hóa học của hợp chất 5 55

Hình 3.17 Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 58

Hình 3.18 Cấu trúc hóa học của hợp chất 7 60

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm

của Châu Á, với ba phần tư diện tích phần lục địa là đồi núi, trải dài từ Bắc xuống Nam, một phần tư địa hình thông với đại dương, với chiều dài hơn 3.000 km bờ biển, vùng biển rộng trên 1 triệu km2 nên có hệ động – thực vật thiên nhiên đa dạng, phong phú Theo thống kê sơ bộ, nước ta có gần tới 13.000 loài thực vật bậc cao có mạch thuộc hơn 2.256 chi, 305 họ (chiếm 4% tổng số loài, 15% tổng số chi, 75% tổng số

họ thực vật trên toàn thế giới)

Từ cổ xưa, tại Việt Nam, hệ động – thực vật đã mang đến một tiềm năng to lớn về nguồn dược liệu thiên nhiên đa dạng và phong phú, có tác dụng điều trị - phòng tránh bệnh Năm 2014, Việt Nam ước tính có hơn 4.000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 loài động vật được dùng làm thuốc Trong

đó, có nhiều loại dược liệu quý được thế giới công nhận như cây hồi, quế, artiso, sâm Ngọc Linh, tam thất hoang, bách hợp, thông đỏ, vàng đắng

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền khoa học tiên tiến, ngành y - dược học cổ truyền Việt Nam vẫn luôn có những bước tiến mới Dựa trên việc kế thừa các bài thuốc y học cổ truyền, gắn liền với tên tuổi của nhiều danh y nổi tiếng như: thiền

sư Tuệ Tĩnh, Hải Thượng Lãn Ông Lê Hữu Trác để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe Trước xu thế phát triển mạnh mẽ của nền khoa học, công nghệ thì công tác

kế thừa, chọn lọc, ứng dụng và bảo tồn nguồn dược liệu Việt Nam và các bài thuốc quý đã phát huy giá trị của nền y dược học cổ truyền Việt Nam trong việc chăm sóc sức khỏe con người Từ đó, đưa dược liệu Việt Nam trở thành nguồn nguyên liệu của nền công nghiệp tân dược tương lai, thay thế cho những nguồn nguyên liệu hóa dược

mà con người mất nhiều thời gian và công sức theo đuổi trong nhiều năm qua

Trên thế giới, một số nước công nghiệp hiện đại như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Úc, Mỹ… sự phát triển ngành dược liệu thiên nhiên hiện nay tương đối phát triển Thật vậy, các nhà khoa học trên thế giới đã tập trung nghiên cứu, phát triển

và tìm thấy rất nhiều các hoạt chất sinh học đáng quý, mang đến nhiều ý nghĩa thực tiễn về mặt sinh hóa học Từ đó, cung cấp một nguồn nguyên liệu lớn các bằng chứng khoa học trên cơ sở về tác dụng của dược liệu thiên nhiên Thành công của nghiên cứu không chỉ là sự xuất hiện của hàng loạt các sản phẩm thực phẩm chức năng bảo

vệ sức khỏe mà nó còn là mục tiêu hướng đến các sản phẩm thuốc khác nhằm mục đích đưa dược liệu làm thuốc để phòng và điều trị bệnh tật Tính đến năm 2022, các sản phẩm thực phẩm chức năng với những thương hiệu nổi tiếng như Blackmores, Natural Made thuộc sở hữu của hãng dược phẩm Pharmavite, Kirkland Signature, Puritan’s Pride, Healthy Care, Schiff Nutrition International, Doppelherz đã phát triển tương đối phổ biến trên thị trường dược phẩm Việt Nam và trên toàn thế giới

Ở Việt Nam, tiêu lốt không chỉ là gia vị đáng chú ý trong ẩm thực văn hóa Việt mà còn được biết đến như một vị thuốc có giá trị trong kho tàng y dược học cổ truyền Việt Nam Từ xa xưa, tiêu lốt được sử dụng trong y học cổ truyền với tác dụng

ôn trung, tán hàn, hạ khí, chỉ thống nhờ tính cay, vị nóng Do vậy, tiêu lốt có hiệu quả trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh về đường hô hấp (như viêm xoang), các bệnh về tiêu hóa (như đau bụng, tiêu chảy, kiết lỵ, khó tiêu, đầy bụng, trướng bụng) Ngoài ra, khi sử dụng phối hợp tiêu lốt và các cây thuốc khác đã mang đến các bài thuốc quý khác có tác dụng giảm đau răng, đau thắt vùng ngực, kháng khuẩn, bảo

vệ gan, ngăn ngừa ung thư gan, điều hòa kinh nguyệt ở phụ nữ Theo các nghiên cứu

khoa học, loài tiêu lốt (P longum) sở hữu đa dạng các thành phần hóa học như tinh

dầu, alkaloid, flavonoid, lignan [23, 48] Bên cạnh đó, khi nghiên cứu các dịch chiết

methanol và ethanol của loài tiêu lốt (P longum) đều cho thấy các hoạt tính sinh học

đặc trưng như kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, chống tiểu đường [23, 25]

Sự đa dạng về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loài tiêu lốt (P longum) chính là một điểm đáng chú ý về mặt thực tiễn của nghiên cứu này Tuy

nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của loài tiêu lốt (P longum) cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế

Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của loài tiêu lốt, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt

tính kháng viêm của loài Tiêu lốt (Piper longum L.) thuộc họ Hồ tiêu.”

Mục tiêu của luận văn: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu

của loài tiêu lốt (Piper longum L.) và đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất

được phân lập để tìm kiếm một số chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo

Nội dung của luận văn bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất từ loài tiêu lốt (Piper longum L.) bằng các phương

pháp sắc ký;

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được từ loài tiêu lốt

(Piper longum L.) bằng các phương pháp vật lý và hóa học;

3 Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chi Piper

1.1.1 Giới thiệu về họ Hồ tiêu (Piperaceae)

Họ Hồ tiêu (Piperaceae) là họ thực vật có hoa thuộc bộ Piperales, gổm 5 chi

với hai chi lớn quan trọng là chi Piper (khoảng 2000 loài) và chi Peperomia (khoảng

1600 loài), phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là các vùng Đông Nam Á và nhiệt đới châu Mỹ [18] Đây là một họ cây thân cỏ hoặc dây leo thân

gỗ có nhiều rễ xuất phát từ đốt Lá đơn, nguyên, mọc cách, phiến lá có hình tim hay hình trứng, gân lá hình chân vịt hay chân chim Trong thân và lá có mùi thơm cay đặc trưng Cụm hoa dạng bông dày, mọng nước, không phân nhánh, mọc ở nách lá hay đối diện với lá Trục phát hoa thường mập, mỗi hoa mọc ở nách một lá bắc, xếp theo đường xoắn ốc và thông thường áp sát vào trục

Hình 1.1: Loài Peperomia pellucida

(L.) Kunth

Hình 1.2: Loài Piper nigrum L

Ở Việt Nam, họ Hồ tiêu được biết đến có 5 chi với khoảng 50 loài và dưới loài, các loài phân bố liên nhiệt đới, và thường phân bố rộng rãi ở các rừng mưa [2] Các loài cây thuộc họ Hồ tiêu thường có nhiều công dụng khác nhau, nhiều loài có giá trị kinh tế cao, được sử dụng rộng rãi làm thực phẩm ăn uống hàng ngày (như

Peperomia pellucida (L.) Kunth - rau càng cua) (Hình 1.1.1), gia vị (như P nigrum

L - hạt tiêu) (Hình 1.1.2) hoặc chất điều vị (như P lolot C DC - lá lốt) do có mùi

thơm, vị hăng, cay Theo Đỗ Tất Lợi (năm 2019), các loài thuộc họ Hồ tiêu mang nhiều giá trị thực tiễn về mặt y dược học Trong y dược học cổ truyền, nhiều loài đã

được dùng làm thuốc, một trong số đó là loài P betle L (trầu không) có thân, lá và

quả được dùng để chữa nhức mỏi, đau dạ dày, ăn không tiêu, loài P lolot C DC

dùng để chữa phong hàn, rối loạn tiêu hóa

1.1.2 Chi Piper

Chi Piper là một trong những chi lớn đa dạng nhất thuộc họ Piperaceae với

hơn 1000 loài thực vật phân bố rộng rãi ở các khu rừng mưa nhiệt đới trên toàn thế

giới [9, 12, 18] Các loài thuộc chi Piper khá nổi tiếng trong hệ thống y học Ayurvedic

của Ấn Độ và trong y học dân gian của châu Mỹ Latinh và Tây Ấn vì những đặc trưng trong tác dụng chữa bệnh của chúng Theo các nghiên cứu đã báo cáo trước đó, chiết

xuất từ các loài thuộc chi Piper như loài P aborescens, P amalago, P hispidum ở

Mexico – Brazil đều thể hiện các hoạt tính kháng viêm, giảm đau ngực, hay hoạt tính

chống ung thư máu Ngoài ra, chiết xuất từ thân, lá, cành và quả của một số loài P futokadsura, P guineensen, P chaba ở Đài Loan, Trung Quốc, Ấn Độ, và Tây Phi

cũng cho thấy các hoạt tính giảm đau, và kháng viêm Không những thế, khi nghiên

cứu về hóa thực vật của các loài thuộc chi Piper, các nhà khoa học cũng đã phân lập,

phân nhóm và công bố nhiều các lớp chất đặc trưng có tác dụng sinh học từ chi này Tính từ tháng 6 năm 1996 cho đến nay, các lớp hợp chất đã được phân lập từ chi

Piper bao gồm: các hợp chất alkaloid và dẫn xuất của chúng, các hợp chất lignan,

neolignan, phenolic, flavonoid, terpene, steroid, …[11, 32]

1.2 Giới thiệu về loài Tiêu lốt

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hình 1.3: Loài Tiêu lốt – Piper longum L

Mô tả: Tiêu lốt hay còn gọi là tiêu lốp, hồ tiêu dài, tiêu dài, tiêu thất, tiêu lá tím, tiêu ớt, tất bạt, trầu không dại, tiêu Ấn Độ… Đây là một cây bụi nhỏ, thuộc dạng thân thảo có phần gốc mọc bò và thân cành đứng thẳng có gốc gỗ lớn và nhiều thân leo, có khớp nối dài ở các đốt Cây mọc hoang hoặc được trồng lấy quả làm gia vị và làm thuốc Lá tiêu lốt thuôn dài, đầu nhọn, mọc so le, mặt trên nhẵn và mặt dưới có lông Các lá thấp nhất dài 5 – 7 cm, lá trên cùng dài 2 – 3 cm Hoa mọc đơn độc có gai Những quả mọc thành gai thịt dài 2.5 – 3.5 cm, dày 5 mm hình thuôn dài và có màu xanh đen Quả tiêu lốt thuộc dạng quả mọng với những chùm quả có dạng hình trụ như trái ớt Lúc đầu màu xanh lúc sau chuyển dần thành màu đen khi chín

Tên khoa học của loài: Piper longum L

Phân bố: P longum là một loài thảo dược có thân leo phân bố phổ biến ở các

vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới, chẳng hạn như Ấn Độ, Việt Nam, Sri

Lanka, các nước Trung Đông và châu Mỹ [27] Ở Việt Nam, loài P longum thường

mọc hoang và tương đối phổ biến ở các vùng cao nguyên như Gia Lai, Lâm Đồng, Đắk Lắk…

1.2.2 Công dụng

P longum là một gia vị quan trọng trong văn hóa ẩm thực với vị cay nồng và

có mùi thơm đặc trưng Mặc dù chúng là một thành phần rất hiếm trong ẩm thực châu

Âu, tuy nhiên chúng là một trong những gia vị tương đối phổ biến được tìm thấy trong món dưa chua của Ấn Độ, một gia vị hỗn hợp của Bắc Phi, và có trong các món

ăn của Indonesia và Malaysia Ngoài ra, quả và rễ của loài P longum còn được dùng

như một loại thuốc bổ trong y học cổ truyền ở các vùng thuộc châu Á và Trung Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal… để chữa các bệnh về đường hô hấp như viêm phế quản, ho và cảm lạnh hay là thuốc giải độc khi rắn cắn và bọ cạp đốt [27]

Ở Việt Nam, loài P longum không chỉ được dùng phổ biến trong văn hóa ẩm

thực Việt mà chúng còn có nhiều giá trị trong y học cổ truyền Việt Nam xưa Theo

dân gian, các bộ phận của loài P longum có tác dụng tốt trong điều trị các bệnh về

đường hô hấp như viêm xoang, đau lỗ mũi, hốc mũi… và các bệnh về đường tiêu hóa như đau bụng, lạnh bụng gây nôn thổ, nôn ra nước chua, tiêu chảy, kiết lỵ, sôi bụng hay khó tiêu Khi phối hợp tiêu lốt với các dược liệu khác có thể trở thành bài thuốc quý làm giảm đau răng, đau thắt vùng ngực, đau bụng kinh ở phụ nữ

1.3 Tình hình nghiên cứu của loài P longum

1.3.1 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Trong những năm gần đây, những nghiên cứu về thành phần hóa học của loài

P longum tương đối phổ biến, và cho thấy nhiều các nhóm hợp chất đặc trưng Trong

đó, các hợp chất alkaloid phân lập được từ loài P longum chiếm hàm lượng lớn nhất

trong loài Ngoài ra, một số các hợp chất có hàm lượng thấp khác cũng được phân lập

từ loài này bao gồm: tinh dầu, lignan, terpene và các hợp chất khác [29]

a Các hợp chất alkaloid

Alkaloid là nhóm các hợp chất hữu cơ phổ biến, được quan tâm và phân lập

nhiều nhất trong số các hợp chất có mặt trong loài P longum Đây là một nhóm những

hợp chất phân lập được, có cấu trúc hóa học tương đối đa dạng nên chúng được coi

là một đối tượng nghiên cứu rất quan trọng trong thực tiễn P longum không chỉ dồi

dào về hàm lượng các hợp chất alkaloid mà các hợp chất alkaloid từ loài này cũng mang đến những hoạt tính sinh học đặc trưng Trong quá trình nghiên cứu, tính từ

năm 1996 đến nay, hợp chất chủ yếu được tìm thấy nhiều nhất trong loài P longum,

cũng như chi Piper là piperine (1) [29] Dưới đây là bảng tổng hợp cấu trúc của nhóm

các hợp chất alkaloid đã phân lập được từ loài P longum (Bảng 1.1) (Hình 1.4)

Hình 1.4: Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ loài P longum

Hình 1.4: Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ loài P longum (tiếp)

Hình 1.4: Cấu trúc các hợp chất alkaloid từ loài P longum (tiếp)

b Tinh dầu

Tinh dầu là nhóm hợp chất điển hình của chi Piper và được thể hiện ở mùi thơm đặc trưng của các loài cây thuộc chi này Trong loài P longum, các hợp chất

tinh dầu thường được tìm thấy từ các bộ phận của cây gồm: lá, quả, thân và rễ Theo báo cáo năm 2014, hàm lượng tinh dầu thu được từ quả và lá được đánh giá là cao hơn nhiều so với hàm lượng tinh dầu thu được từ thân và rễ, trong đó, các thành phần chính trong rễ, thân và quả là tương đương nhau [44] Ngoài ra, trong nghiên cứu năm

2014 còn chỉ ra rằng, thành phần tinh dầu của rễ chiếm 62.0%, quả chiếm 71.5%, và thân chiếm 69.2% với sự hiện diện của nhóm các hợp chất monoterpene hydrocarbon

là thành phần chính, trong khi lá chiếm 68.7% thành phần chính là sesquiterpene hydrocarbon [44] Những hợp chất monoterpene và sesquiterpene này được coi là nhóm chất phong phú về cấu tạo hóa học với công thức cấu tạo của chúng có thể có hoặc không có nguyên tử oxygen Dưới đây là một số các hợp chất tinh dầu phân lập

được từ loài P longum (Bảng 1.2) (Hình 1.5)

Hình 1.5: Cấu trúc các hợp chất tinh dầu từ loài P longum (tiếp)

c Các hợp chất khác

Theo các nghiên cứu từ năm 1996 đến nay, thành phần hóa học của loài P longum cũng rất đa dạng và phong phú Ngoài những nhóm hợp chất chính được nêu

ở phía trên, P longum còn sở hữu một số ít những nhóm hợp chất khác như lignan,

sterol, ester, flavonoid,… [29] (Bảng 1.3) (Hình 1.6)

Hình 1.6 Cấu trúc các hợp chất khác từ loài P longum

1.3.2 Các nghiên cứu về dược lực học và hoạt tính sinh học

Từ xa xưa, y học cổ truyền được coi là trái tim của nền y học cổ điển trong việc dùng thảo dược thiên nhiên làm thuốc để chữa bệnh cho con người, bảo vệ con

người trước sự tấn công của nhiều mầm bệnh khác nhau Trên thế giới, sự phát triển của nền y học cổ truyền xuất hiện hầu hết ở tất cả các nước Ngày nay, sự phát triển của các sản phẩm thuốc tân dược ngày càng mạnh mẽ như thuốc kháng sinh, thuốc kháng virus, thuốc chống viêm, thuốc chống phù nề… đều mang đến hiệu quả cao trong điều trị nhưng cũng để lại không ít tác dụng phụ không mong muốn Do đó, trong nền y học hiện đại, các sản phẩm thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên được coi là ưu tiên lớn nhất trong nghiên cứu cũng như điều trị và phòng ngừa bệnh tật Một trong những loài thực vật có tác dụng sinh học được dùng

để nghiên cứu và phát thuốc có thể kể đến là loài tiêu lốt (P longum) [38] Theo các nghiên cứu về P longum cho thấy, các chiết xuất, và hợp chất được phân lập, mang

đến rất nhiều hoạt tính sinh học đặc trưng như hoạt tính bảo vệ tim mạch, bảo vệ gan, kháng viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống tiểu đường, chống trầm cảm, chống kết tập tiểu cầu và một vài các hoạt tính đặc trưng khác [15, 33, 34, 38]

a Hoạt tính chống ung thư

Ung thư là một thuật ngữ chung để chỉ một nhóm các bệnh gây ra khi các tế bào bất thường phân chia nhanh chóng, xâm lấn và lan tràn sang các mô và cơ quan khác của cơ thể Cùng với bệnh lý tim mạch, ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Vì vậy, ung thư vẫn luôn là mối quan tâm trên toàn cầu Do đó, các nghiên cứu mới hiện nay trong việc tập trung vào nguồn dược liệu thiên nhiên để tìm ra hoạt chất kháng ung thư rất được quan tâm Theo các nghiên cứu tính đến năm 2019, đã cho thấy hoạt tính chống ung thư của các hợp chất phân

lập được từ loài P longum [13, 34, 38]

Trong một nghiên cứu vào năm 2004, cơ chế chống ung thư của dịch chiết

EtOH và hợp chất piperine (1) từ loài P longum cũng được chứng minh qua các phản

ứng điều hoà miễn dịch của tế bào và cơ thể Cụ thể, dịch chiết EtOH từ quả của loài

P longum cho thấy hiệu quả 100% gây độc tế bào với nồng độ 500 µg/mL trên tế bào

DLA và 250 µg/mL trên tế bào EAC Trong khi đó, hợp chất piperine (1) lại cho thấy

hiệu quả gây độc tế bào trên cả hai dòng tế bào DLA và EAC tại nồng độ 250 µg/mL

Không những thế, trong nghiên cứu năm 2004 này, tác giả cũng đề cập đến khả năng

gây độc tế bào của dịch chiết EtOH và hợp chất piperine (1) trên các tế bào L-929

trong môi trường nuôi cấy ở nồng độ tương ứng lần lượt là 100 và 50 µg/mL Hơn nữa, khi sử dụng dịch chiết EtOH của loài P longum với liều lượng là 10 mg/liều/con

cũng như hợp chất piperine (1) với liều lượng là 1.14 mg/liều/con đã đưa ra kết quả

ức chế sự phát triển khối u ở chuột gây ra bởi tế bào DLA và sự gia tăng tuổi thọ của chuột được cấy tế bào ung thư ECA với tỷ lệ lần lượt là 37.3% và 58.8% Đối với

dòng chuột Balb/c, chiết xuất từ quả của P longum và hợp chất piperine (1) có tác

dụng làm tăng số lượng bạch cầu lên lần lượt là 142.8% và 138.9% Đồng thời, số lượng tế bào tạo mảng bám cũng tăng lên đáng kể khi sử dụng dịch chiết (100.3%)

và hợp chất piperine (1) (71.4%) vào ngày thứ 5 sau khi chủng ngừa [13, 39]

Báo cáo năm 2012, Gottumukkala và cộng sự đã báo cáo về hoạt tính ức chế

sự kéo dài dendrit của tế bào B16F10 melanoma Kết quả của báo cáo đã cho thấy,

hai hợp chất 1 và hợp chất isopiperlongumine phân lập từ loài P longum thể hiện

hoạt tính tốt trong hoạt động ức chế sự kéo dài dendrit tại nồng độ 50 µg/mL với độ dài dendrit bị ức chế lần lượt là 56.6 ± 5.5 và 56.6 ± 4.1 µm Hơn nữa, các phần chiết

của MeOH và CH2Cl2 cũng cho thấy hiệu quả trong việc ức chế tế bào melanin tại

nồng độ 50 µg/mL, với tỷ lệ phần trăm melanin bị ức chế lần lượt là 40% và 32% [34]

Một nghiên cứu khác năm 2012, Wan Lee và cộng sự đã nghiên cứu về cơ chế

hoạt động của hợp chất pipernonaline (2) trong hoạt tính chống ung thư trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở người PC-3 Trong nghiên cứu này, pipernonaline (2) có tác

dụng ức chế sự phát triển của tế bào PC-3 độc lập với androgen và các tế bào tuyến tiền liệt LNCaP phụ thuộc vào androgen theo sự phụ thuộc vào liều lượng (30 – 90

µM) và thời gian (24 – 48 giờ) Sự ức chế của tế bào PC-3 có liên quan đến tích luỹ

các tiểu phân ở giữa pha G1 và pha G0/G1, được xác nhận bởi sự điều chỉnh giảm của CDK2, CDK4, cyclin D1 và cyclin E, tương quan với pha G1 của chu kỳ tế bào

Pipernonaline (2) được điều chỉnh tăng để phân cắt procaspase-3/PARP, nhưng

không làm thay đổi biểu hiện của hai protein bax proapoptotic và antiapoptotic

bcl-2 Ngoài ra, pipernonaline (2) gây ra việc sản xuất ROS làm tăng Ca2+ nội bào và khử cực màng ty thể, những hiện tượng này đã bị đảo ngược bởi N-acetylcystein, một chất

thu hồi ROS Kết quả thử nghiệm đã cho thấy pipernonaline (2) thể hiện đặc tính

apoptotic thông qua quá trình sản xuất ROS, gây ra sự gián đoạn chức năng ty thể và cân bằng nội môi Ca2+ Từ đó dẫn đến hoạt hoá caspase-3 và phân tách PARP trong các tế bào PC-3 [28]

Trong bài đánh giá tổng hợp về hoạt tính sinh học của loài P longum năm

2019, tác giả Vashali Yadav đã đề cập đến nghiên cứu khác năm 2014 về khả năng chống ung thư của loài [45] Năm 2014, nghiên cứu của Amit Kumar Sharma và cộng

sự đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư ở người gồm

DU-145, A549, THP-1, IGR-OVI-1 và MCF-7 của dịch chiết quả từ loài P longum ở nồng độ 100 µg/mL theo phương pháp Sulforhodamine B (SRB) Báo cáo đã chỉ ra

rằng tiềm năng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư hiệu quả ở hầu hết các dịch

chiết Trong đó, dịch chiết n-hexane, C6H6 và acetone có hiệu quả gây độc tế bào đáng kể với tỷ lệ 91 – 95% đối với dòng tế bào A549 Tương tự, hai dịch chiết n-

hexane và C6H6 cũng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với tỷ lệ ức chế là 84 – 92% trên hai dòng tế bào ung thư MCF-7 và IGR-OV-1 Đối với dòng tế bào THP-1, hầu

hết các dịch chiết: n-hexane, C6H6, CHCl3, EtOAc, acetone, EtOH và nước đều thể hiện hoạt tính ức chế với tỷ lệ từ 76 – 90% Riêng phân đoạn chiết n-hexane của P longum cho thấy hiệu quả gây độc tế bào lên đến 80% trên dòng tế bào ung thư DU-

145 Hơn thế nữa, chiết xuất EtOAc và acetone của loài cũng chỉ ra tiềm năng ức chế chống lại sự phát triển của dòng ung thư vú MCF-7 là 65 – 74% Các dịch chiết còn lại đều cho hiệu quả ức chế từ thấp đến trung bình là 11 – 60% đối với sự phát triển của các dòng tế bào thử nghiệm Trong khi, thuốc chống ung thư tiêu chuẩn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào từ 51 - 67% đối với các dòng tế bào khác nhau [mitomycine

C (10 µM) chống lại DU-145, paclitaxel (10 µM) chống lại MCF-7, adriamycin (1 µM) chống lại IGR-OVI-1, 5-flourouracil (20 µM) chống lại THP-1 và A549] [35]

Theo báo cáo của Hakim Md Osman Gani và cộng sự vào năm 2019, các tác

giả đã đề cập về hoạt tính chống ung thư của hai hợp chất piperine (1) và piplartine (48) trên dòng tế bào ung thư Sarcoma 180 (S-180) cấy trên chuột Kết quả cho thấy,

cả hai hợp chất này đều cho hiệu quả ức chế tốc độ tăng sinh khối u sau 7 ngày điều trị Tỷ lệ ức chế với liều lượng thấp hơn và cao hơn lần lượt là 28.8% và 52.3% đối

với piplartine (48), 55.1% và 56.8% đối với piperine (1) [7, 13]

Năm 2019, một nghiên cứu khác về khả năng gây độc tế bào của dịch chiết EtOH theo ba phương pháp chiết khác nhau gồm: RE, UE, SE và các hợp chất phân

lập được từ loài P longum, đã được nhóm tác giả Ziyan Guo thực hiện trên ba dòng

tế bào ung thư HepG2, HeLa và SK-OV-3 Kết quả của nghiên cứu đã thể hiện hiệu quả gây độc tế bào trên ba dòng tế bào ung thư HepG2, HeLa và SK-OV-3 với từng liều lượng riêng biệt của dịch chiết EtOH thu được Cụ thể, dịch chiết theo phương pháp SE thể hiện hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào nổi bật hơn với giá trị IC50 lần

lượt là 21.91 ± 1.44 µM, 30.44 ± 1.48 µM và 68.92 ± 2.25 µM Trong khi đó, dịch

chiết theo phương pháp RE và UE cho giá trị IC50 lần lượt là 25.34 ± 0.45 µM và

25.10 ± 0.25 µM trên dòng tế bào HepG2; 58.10 ± 0.26 µM và 39.31 ± 1.58 µM trên dòng tế bào HeLa; 74.38 ± 2.42 µM và 84.97 ± 8.40 µM trên dòng tế bào SK-OV-3 Ngoài ra, có 4 hợp chất phân lập được từ loài P longum cho thấy khả năng gây độc

tế bào đối với ba dòng tế bào ung thư trên Hợp chất guineensine (7) cho thấy hoạt

tính gây độc mạnh nhất trên ba dòng tế bào với giá trị IC50 thu được là 14.90 ± 0.62

µM, 17.13 ± 1.06 µM, 17.96 ± 0.39 µM Các hợp chất còn lại gồm hợp chất piperine

(1), pipercide (20) và pipernonaline (2) thể hiện hoạt tính gây độc trung bình trên ba

dòng tế bào ung thư HepG2, HeLa và SK-OV-3 với giá trị IC50 từ 23.46 ± 0.06 µM

đến 75.52 ± 2.52 µM [15]

Gần đây nhất, kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Phong và cộng sự năm

2022 chỉ ra rằng hợp chất 14 cũng thể hiện hoạt tính gây độc mạnh chống lại 2 dòng

tế bào ung thư kháng cisplatin (A2780 và TOV-112D), với giá trị IC50 là 6.7 ± 0.77

và 5.8 ± 0.29 µM; và hiệu quả gây độc tế bào trung bình với dòng tế bào ung thư

kháng cisplatin SK-OV-3 với giá trị IC50 là 48.3 ± 0.40 µM [33]

b Hoạt tính kháng viêm

Viêm là các phản ứng sinh học phức tạp mà nguyên nhân chủ yếu là do sự phá

vỡ cân bằng nội mô của mô Đây là quá trình phản ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch để chống lại sự tấn công của các tác nhân bên ngoài (nhiệt độ, virus, vi khuẩn, tác nhân hóa – lý) hoặc những tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh

tự miễn,…) và các biểu hiện của viêm thường chỉ thấy tại chỗ

Điều trị viêm là quá trình sử dụng các loại thuốc kháng viêm như thuốc kháng viêm steroid, hay không steroid (NSAIDs) để làm chậm lại quá trình viêm thông qua

ức chế sự sản xuất các chất trung gian gây viêm như prostaglandin, histamin, bradikynin,… mà không loại bỏ được các nguyên nhân gây viêm hay thay đổi tiến triển phát triển của bệnh lý

Ngoài những sản phẩm thuốc tổng hợp và thuốc sinh học được sử dụng trong điều trị viêm thì những thảo dược có nguồn gốc thiên nhiên cũng được sử dụng làm chất thay thế lý tưởng từ xưa đến nay Theo các nghiên cứu, có rất nhiều loài thực vật trên thế giới đã được nghiên cứu và thể hiện hoạt tính kháng viêm hiệu quả, có thể

nói đến một loài trong số đó là P longum

Năm 2007, hoạt tính kháng viêm từ chiết xuất lá của loài P longum đã được

Y Vaghasiya và cộng sự đề cập trong nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan và dextran Báo cáo đã chỉ ra rằng chiết

xuất lá của P longum thể hiện hiệu quả ức chế làm giảm phù chân chuột đến 39.81%

(dp ≤ 0.01) trong 1 giờ và 31.61% trong 3 giờ sau khi gây viêm theo mô hình carrageenan Không khác biệt mấy so với chất đối chứng dương: diclofenac sodium (5 mg/kg) là 35.90% (dp ≤ 0.05) trong 1 giờ và 41.03% trong 3 giờ Đối với mô hình

gây phù chân chuột bằng dextran, chiết xuất P longum không cho thấy hiệu quả làm giảm phù nề chân chuột trong 1 giờ đầu Tuy nhiên, chiết xuất lá của P longum lại

thể hiện khả năng làm giảm phù nề chân chuột đến 67.51% (dp ≤ 0.001) trong 3 giờ Trong khi đó, chất đối chứng dương diclofenac sodium thể hiện hiệu quả ức chế là 20.45 và 23.36% sau 1 đến 3 giờ gây viêm [43]

Một nghiên cứu năm 2008 của Naresh Singh và cộng sự đã chứng minh về

hoạt tính kháng viêm từ chiết xuất chloroform của P longum (PlCE) dựa trên khả

năng ức chế sự kết dính của bạch cầu trung tính với đơn lớp tế bào nội mô Kết quả

thử nghiệm đã cho thấy, PlCE có khả năng ức chế đáng kể biểu hiện do TNF-α gây

ra của các phân tử tế bào kết dính (CAMs) Cụ thể, PlCE cho thấy khả năng ức chế

gần 60% đối với TNF- α của ICAM-1, VCAM-1 ở nồng độ 17.5 µg/mL và E-selectin

ở nồng độ 15 µg/mL trên tế bào nội mô tĩnh mạch chính rốn [36]

Tương tự, theo một bài báo cáo khác năm 2009, tác giả A Kumar và cộng sự cũng tiến hành thử nghiệm về tác dụng chống viêm cấp trên mô hình gây phù chân

chuột bằng carrageenan từ tinh dầu quả của P longum Thử nghiệm đã cho thấy tinh dầu của P longum có hiệu quả chống viêm làm giảm phù chân chuột lên đến 65.95%

ở liều lượng 0.5 ml/kg, và 72.34% ở liều lượng 1 ml/kg so với chất đối chứng ibuprofen (100 mg/kg) là 70.21% [24]

Viêm khớp dạng thấp là một bệnh tự miễn đặc trưng bởi tình trạng viêm mãn tính của các khớp hoạt dịch dẫn đến phá huỷ xương nghiêm trọng Một số thuốc chống viêm và chống thấp khớp được dùng trong điều trị viêm khớp dạng thấp đã phát triển trong nhiều thập kỷ qua Trong đó, nhóm thuốc không steroid (NSAIDs) là một trong những phương pháp chính trong điều trị viêm khớp Tuy nhiên, ngoài hiệu quả mà chúng mang lại thì bên cạnh đó chúng tồn tại không ít những tác dụng phụ không mong muốn Do vậy trong nghiên cứu năm 2010, tác giả Subhash R Yende đã tiến

hành thử nghiệm nghiên cứu về hiệu quả chống viêm khớp từ dịch chiết nước của

loài P longum trên chuột được tiêm bằng 0.1 ml CFA (Complete Freund’s adjuvant) Kết quả thử nghiệm cho thấy, phần chiết nước của P longum cho hiệu quả làm giảm

sưng chân ở chuột theo liều lượng 400 mg/kg cũng như 200 mg/kg (p < 0.01) Ở liều lượng điều trị 400 mg/kg (p < 0.01), hiệu quả tác dụng được quan sát thấy vào ngày thứ 4, 14 và 21; trong khi liều điều trị 200 mg/kg cho hiệu quả điều trị vào ngày thứ

4 và ngày 24 sau khi chuột được tiêm CFA Vào ngày thứ 21 sau khi khởi phát bệnh

viêm khớp, dịch chiết nước của P longum 400 mg/kg thể hiện tác dụng ức chế

46.32% so với chất đối chứng dương dichlofenac sodium (13.5 mg/kg) cho tác dụng

ức chế 55.00% trong việc làm giảm sưng chân ở chuột [47]

Theo bài báo cáo năm 2019, Ziyan Guo và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng viêm của dịch chiết EtOH theo ba phương pháp: RE, UE, SE và các hợp chất phân

lập được từ quả của P longum Kết quả thử nghiệm cho thấy, dịch chiết EtOH thu

được theo ba phương pháp đều thể hiện hoạt tính ức chế NO trong các đại thực bào RAW 264.7 kích thích bởi LPS mạnh hơn so với chất đối chứng dương indomethacin (IC50 15.40 ± 3.35 µg/mL) Trong đó, giá trị IC50 thu được theo phương pháp RE là

6.15 ± 0.78 µg/mL, UE là 7.13 ± 1.16 µg/mL, và SE là 4.19 ± 0.38 µg/mL Ngoài ra,

báo cáo còn chỉ ra hiệu quả kháng viêm của 8 hợp chất phân lập được so với

indomethacin Cụ thể, hợp chất pipernonaline (2) và piperanine (8) thể hiện hoạt tính

kháng viêm mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2.48 ± 0.17 và 3.02 ± 0.06 µM Trong khi đó, 6 hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính kháng viêm trung bình với giá trị IC50 xác định được là: piperine (1) (IC50 31.36 ± 2.13 µM), pellitorine (4) (IC50 15.40

± 5.99 µM), (2E,4E,14Z)-N-isobutyleicosa-2,4,14-trienamide (24) (IC50 26.26 ± 6.06 µM), N-isobutyl-2E,4E-octadecadienamide (27) (IC50 7.21 ± 1.87 µM),

piperchabamide B (42) (IC50 38.86 ± 9.79 µM), 1,2-dihysroxybisabola-3,10-dien (97) (IC50 30.75 ± 4.86 µM) [15]

Gần đây, nghiên cứu năm 2022, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Việt Phong đã báo cáo về khả năng kháng viêm của ba hợp chất: 1-(3-phenylpropionyl)-piperidine

(57), iso-chavicine (60), piperlongumamide E (73) phân lập được từ loài P longum

Thông qua thử nghiệm ức chế sự sản sinh NO trên đại thực bào RAW264.7 được kích thích bới LPS, ba hợp chất đã thể hiện hiệu quả kháng viêm với các giá trị IC50 thu

được lần lượt là 16.1 ± 0.94, 14.5 ± 0.57 và 27.3 ± 1.11 µM [33]

c Hoạt tính kháng khuẩn – kháng nấm

Kháng khuẩn là một thuật ngữ chuyên ngành được sử dụng phổ biến trong y học, dược học cũng như hoá học Đây là vừa là hoạt tính, vừa là nhóm thuốc được sử dụng để điều trị hoặc ngăn ngừa sự nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn, vi trùng, nấm

và ký sinh trùng Hiện nay, thuốc kháng khuẩn có mặt ở hầu hết các thị trường dược thế giới, và được phân chia thành nhiều nhóm thuốc khác nhau bao gồm thuốc kháng sinh, thuốc kháng vi trùng, thuốc kháng nấm và thuốc kháng ký sinh trùng Chẳng hạn, thuốc kháng nấm fluconazole được dùng để điều trị cho bệnh nhân nhiễm

y-nấm Candida glabrata hay các loài Candida khác (không phải Candida albicans hoặc Candidda krusei) hay amphotericin B trong điều trị các trường hợp nhiễm nấm xâm

lấn và nghiêm trọng,… Tuy nhiên, dù cho các nhóm thuốc kháng khuẩn nêu trên mang tới hiệu quả điều trị cao đến mấy thì vẫn tiềm tàng những tác dụng phụ không mong muốn Đồng thời, các yêu cầu tối thiểu quan trọng đối với nhóm bệnh nhân sử dụng thuốc, đó là phải đúng liều lượng, uống đủ liều, và uống theo đúng chỉ định của bác sĩ Thực tế, một phần lớn người dân hiện nay có thói quen tự chữa trị và “bắt chước” đơn thuốc của bác sĩ, dẫn đến tình trạng sử dụng các loại thuốc kháng khuẩn tuỳ tiện, gây nên hiện tượng kháng kháng thuốc Do vậy, dựa trên các tác dụng từ thảo dược thiên nhiên trong các bài thuốc y học cổ truyền đối với việc kháng khuẩn – kháng nấm trở nên cấp thiết hơn cả Do vậy, các nghiên cứu sâu rộng về tiềm năng mang đến hoạt tính kháng khuẩn từ các loài thảo mộc cũng như các loài thuộc chi

Piper được đánh giá là một sự thay đổi lớn liên quan đến độ nhạy của vi sinh vật cũng như hiệu quả của các hợp chất đã được tìm thấy từ các loài này Đối với loài P longum

cũng có một số nghiên cứu trên thế giới đã đề cập đến hoạt động kháng khuẩn của các chiết xuất, tinh dầu - các hợp chất tinh dầu và các hợp chất khác được phân lập

từ loài sẽ được đề cập dưới đây [22, 23]

Trong nghiên cứu năm 1999 của L Arambewela và cộng sự đã thông báo về

hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu thu được từ quả chín loài P longum Kết quả nghiên cứu cho thấy trong tinh dầu của P longum có hàm lượng lớn piperine có hiệu quả trong việc ức chế hai chủng vi khuẩn là Staphylococcus aureus và Escherichis coli với giá trị MIC thu được lần lượt là 41.6 mg/mL và 83.9 mg/mL [6]

Ngoài ra, một nghiên cứu khác vào năm 2001 cũng đề cập đến hoạt tính kháng

khuẩn của các chất phân lập được từ loài P longum trong tiềm năng ức chế vi khuẩn gram dương (gồm Baccillus sphaericus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus) và

vi khuẩn gram âm (gồm Escherichia coli, Pseudomonas syringae, Salmonella

typhimurium) Kết quả cho thấy, hợp chất piperlonguminine (6) thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn cao nhất, đối với vi khuẩn B subtilis, giá trị MIC đo được là: 9 µg/mL

Trong khi đó, hai hợp chất piperine (1) và hợp chất pellitorine (4) thể hiện hoạt tính

kháng khuẩn trung bình với giá trị MIC lần lượt là 12 µg/mL và 12.5 µg/mL, cao hơn

so với kháng sinh tiêu chuẩn penicilin G với giá trị MIC là 32 µg/mL [37] Tương tự, các hợp chất phân lập được từ loài P longum trong báo cáo này đều thể hiện hiệu quả

ức chế trên vi khuẩn gram âm P syringae, nhưng không thể hiện tác dụng đối với hai chủng vi khuẩn gram âm còn lại là S typhimurium [37]

Khi đánh giá, sàng lọc về hoạt tính kháng vi trùng của M Abbas Ali và cộng

sự năm 2007 đã cho thấy hiệu quả kháng vi trùng trên nhóm vi khuẩn gram dương

(gồm Bacillus megaterium, Streptococcus β-haemolyticus, Streptococcus aureus, Bacillus subtilis, Sarcina lutea), gram âm (gồm Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Klebsiella species, Shigella boydii, Shigella flexneriae) và vi nấm (gồm Penecillum sp., Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Mucor sp., Fusarium sp., Candida albicans) của các phân đoạn chiết khác nhau từ loài P longum Cụ thể, nghiên cứu

đã thu được kết quả về hiệu quả kháng khuẩn của các dịch chiết EtOAc, CHCl3 và

MeOH thu được từ rễ, cành và lá của P longum trên các nhóm vi khuẩn gram dương

và gram âm tại 400 µg/đĩa (10 µL) đều cho hiệu quả kháng khuẩn trung bình trong khoảng 7 – 22 mm, so với kháng sinh tiêu chuẩn là kanamycin tại 30 µg/đĩa cho hiệu

quả vùng kháng khuẩn trong khoảng 20-26 mm Trong đó, dịch chiết petroleum ether

từ rễ và lá loài này lại chỉ thể hiện hoạt tính chống lại vi khuẩn S aureus, còn phần chiết cành lại chỉ thể hiện hoạt tính trên 2 chủng vi khuẩn vi khuẩn gram dương S aureus và vi khuẩn gram âm S boydii Hơn nữa, phần chiết EtOAc từ rễ thể hiện hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất đối với vi khuẩn gram dương S lutea (22 mm) và vi khuẩn gram S sonnei (21 mm), trong khi đó thì phần chiết MeOH từ rễ cho hoạt tính mạnh nhất trên vi khuẩn gram âm S flexneriae (17 mm) Đối với các phần chiết từ cành, phần chiết EtOAc thể hiện hoạt tính mạnh nhất chống lại vi khuẩn gram âm là S boydii (17 mm), S flexneriae (17 mm), còn phần chiết MeOH cho tác dụng mạnh nhất đối với vi khuẩn gram âm S β-haemolyticus (18 mm) Mặt khác, đối với các phần chiết khác nhau từ lá của loài P longum, tất cả các dịch chiết (trừ petroleum

ether) đều thể hiện tác dụng kháng khuẩn trung bình trên tất cả chủng vi khuẩn thử

nghiệm Tất cả các kết quả về tính kháng khuẩn đều cho thấy hiệu quả của ba dịch

chiết EtOAc, CHCl3 và MeOH thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với vi khuẩn gram

dương S aureus (15 – 17 mm) và vi khuẩn gram âm S boydii (17 – 20 mm) Tuy nhiên, tất cả các dịch chiết rễ, cành và lá của P longum đều không thể hiện hoạt tính trên vi khuẩn gram âm S dysenteriae Ngoài ra, các phân đoạn chiết từ rễ, cành và lá của loài P longum (300 mg/đĩa) còn cho thấy tác dụng trung bình trong việc chống

lại một số chủng vi nấm so với chất kháng nấm tiêu chuẩn fluconazol (50 mg/đĩa) với

hiệu quả khoảng 9 – 16 mm Trong đó, tất cả phần chiết từ rễ của loài P longum (trừ

phần chiết petroleum ether) cho thấy hiệu quả kháng khuẩn trung bình trên các chủng

vi nấm được khảo sát (trừ Penecillum sp.), trong khi đó thì phần chiết petroleum ether lại cho thấy hiệu quả trên 2 chủng nấm là A niger và A fumigatus Tại đây, hoạt tính kháng khuẩn của phần chiết EtOAc được cho thấy là cao nhất với Fusarium sp (17

mm) Tương tự, đối với phần chiết khác nhau của cành, tất cả chiết xuất (trừ petroleum ether) đều cho hoạt tính trung bình trên các chủng vi nấm khảo sát nhưng

không có hiệu quả đối với chủng vi nấm Penecillum sp (trừ EtOAc) Riêng phần chiết petroleum ether từ cành của loài được xác định là có hiệu quả trên chủng A niger, phần chiết EtOAc được chứng minh cho tác dụng mạnh nhất trên chủng Fusarium sp (16 mm) và phần chiết MeOH không cho hiệu quả đối với A fumigatus

và Fusarium sp Còn lại các phần chiết khác nhau từ lá của loài P longum cũng cho

thấy hiệu quả kháng vi nấm trung bình trừ một số phần chiết đều không thể hiện hoạt tính trên chủng vi nấm nhất định được khảo sát là: petroleum ether và MeOH trên

Penecillum sp và A fumigatus, phần chiết petroleum ether trên Mucor sp và Fusarium sp., phần chiết EtOAc trên A niger [4]

Đồng thời, cũng trong cùng năm 2007, một nghiên cứu khác của Y Vaghasiya

và cộng sự đã thông báo về hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm Klebsiella pneumoniae

cho hiệu quả vùng ức chế được xác định là 0.50 ± 0.28 cm so với chất đối chứng dương cefotaxime sodium là 2.85 ± 0.02 cm [43]

Năm 2010, một nhóm tác giả tại Đại học Kurukshetra đã báo cáo về hiệu quả

kháng khuẩn của các phần chiết thu được từ loài P longum trên các chủng vi khuẩn

và nấm gây bệnh đường miệng, gồm: Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Candida albicans và Saccharomyces cerevisiae Nghiên cứu đã cho thấy rằng, những phần chiết khác nhau của loài P longum (acetone, MeOH và EtOH) đều cho hiệu quả

kháng nấm tương đương nhau, với vùng ức chế dao động trong khoảng từ 10.64 đến

14 mm Đồng thời, cả ba phần chiết này đều thể hiện hiệu quả ức chế hai chủng vi

khuẩn C albicans và S cerevisiae với giá trị MIC lần lượt xác định được là 25 mg/mL

và 50 mg/mL [5]

Hơn nữa, cũng trong cùng năm 2010, tác giả Maitreyi Zaveri và cộng sự đề

cập trong báo cáo về khả năng ức chế sự phát triển của nấm của tinh dầu từ quả P longum Do vậy, tác giả đã thực hiện phân lập các hợp chất từ quả của loài P longum

và đánh giá hoạt tính trên 6 chủng nấm gồm: Pyricularia oryzae, Rhizoctonia solani, Botrytis cineria, Phytophthora infestants, Puccinia recondita và Erysiphe graminis theo phương pháp thử nghiệm in vivo Kết quả cho thấy, hai hợp chất alkaloid là

piperidine và hợp chất pipernonaline (2) được phân lập từ phần chiết n-hexane của P

longum cho thấy hoạt tính chống lại P recondita với giá trị ức chế lần lượt là 91%

và 80% tại nồng độ khảo sát là 0.5 và 0.25 mg/mL [48]

d Các hoạt tính khác

Ngoài các hoạt tính sinh học đặc trưng như chống ung thư, kháng viêm, kháng

khuẩn, kháng nấm đã được nêu trên, loài P longum còn được nghiên cứu cho thấy sự

đa dạng trong một loạt các hoạt tính sinh học khác như chống tiểu đường, chống oxy hoá, bảo vệ gan, chống trầm cảm,… [10, 12, 13, 23, 29, 30, 38, 45, 48] Chẳng hạn như trong một nghiên cứu năm 2013, nhóm tác giả Suresh Kumar và cộng sự đã phân

tích tác dụng chống tiểu đường và hạ mỡ máu của tinh dầu P longum Báo cáo đã chỉ

ra rằng, liều lượng 100 và 200 mg/kg với tinh dầu của P longum đã cho hiệu quả làm

giảm mức đường huyết trong 28 ngày ở chuột mắc tiểu đường gây ra do streptozotocin

(STZ) Tinh dầu của P longum đã được cho thấy làm tăng insulin trong huyết tương

ở chuột mắc bệnh tiểu đường và từ đó dẫn đến ức chế quá trình phân giảm mỡ và giảm nồng độ triglyceride và cholesterol trong huyết tương Hơn nữa, bệnh tiểu đường làm giảm hoạt động của glycogen synthase do đó ảnh hưởng đến quá trình lưu trữ và tổng hợp glycogen ở gan chuột và cơ xương, với liều lượng tinh dầu 100-200 mg/kg đã cho tác dụng tăng đáng kể nồng độ glycogen ở gan chuột mắc bệnh đái tháo

đường do STZ Không những thế, enzyme α-glucosidase khi bị ức chế sẽ làm giảm

quá trình hấp thụ carbohydrate của cơ thể dẫn tới gia tăng lượng đường trong máu

Trong nghiên cứu in vitro, tinh dầu P longum thể hiện hoạt động ức chế enzyme đáng

kể với giá trị IC50 là 150 ± 2.5 µg/mL so với chất đối chứng dương acarbose (IC50 90

± 1.7 µg/mL) Một yếu tố khác liên quan đến bệnh tiểu đường là tăng mỡ máu,

enzyme lipase tuyến tuỵ sẽ chịu trách nhiệm thuỷ phân 50-70% tổng lượng chất béo trong khẩu phần ăn, khi enzyme này bị ức chế sẽ gây ra ức chế hấp thu chất béo hay làm tăng tích tụ chất béo trong cơ thể Trong trường hợp này, hoạt tính ức chế lipase

tuyến tuỵ được phát hiện trong tinh dầu của P longum so với chất đối chứng dương

orlistat với giá trị IC50 lần lượt là 175 ± 1.2 µg/mL và 25 ± 0.5 µg/mL [26] Trong một nghiên cứu khác năm 2012, tác giả Sushil Kumar Chaudhary và cộng sự đã thông

báo về hoạt tính chống oxy hoá của các phần chiết từ loài P longum và hợp chất

piperine (1) dựa trên sự ức chế ACE Kết quả thử nghiệm đã cho thấy tất cả các phân đoạn chiết gồm PLHA, PLW, PLE, PLB và piperine (1) đều cho hiệu quả ức chế ACE

với giá trị IC50 từ 1.40 ± 0.07 mg/mL đến 3.78 ± 0.07 mg/mL Trong đó, phân đoạn chiết PLE và PLB thể hiện khả năng ức chế cao nhất đối với ACE với giá trị IC50 lần lượt là 1.40 ± 0.07 mg/mL và 1.75 ± 0.43 mg/mL Đối với khả năng chống oxy hoá,

tất cả các phần chiết và piperine (1) đều thể hiện hoạt tính chống oxy hoá với IC50 từ

193.12 ± 0.43 µg/mL đến 413.64 ± 0.12 µg/mL, trong đó thì phần chiết PLHA thể

hiện hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 193.12 ± 0.43 µg/mL Ngoài ra, khi phân tích hàm lượng piperine trong các phân đoạn chiết cho thấy hàm lượng piperine trong phân đoạn PLE là cao hơn so với các phân đoạn còn lại theo tỷ lệ 2.34 ± 0.20% (w/w) [8]

Như vậy, tính từ năm 1997 cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều nghiên

cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học và dược lý của loài P longum Trong

đó, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phân lập các hợp chất, và xác định hoạt tính sinh học của các chất phân lập được cũng như các dịch chiết từ các bộ phận của cây

Theo các nghiên cứu gần đây, thành phần hóa học của P longum phần lớn là các hợp

chất alkaloid Hợp chất alkaloid “piperine” là alkaloid đầu tiên được phân lập từ các

loài thuộc chi Piper, và đây cũng là thành phần chính được tìm thấy ở loài P longum,

chiếm hàm lượng lên tới 3-5% hàm lượng các hợp chất khác trong loài [33] Ngoài

ra, P longum còn sở hữu một số ít các nhóm hợp chất khác như lignan, terpene, tinh dầu, saponin, sterol, ester, flavonoid,… [10, 29] Do các loài thuộc chi Piper, điển hình là P longum có chứa hàm lượng lớn các hợp chất alkaloid nên các nghiên cứu

trên thế giới đến giờ vẫn ưu tiên tập trung trong việc phân lập thêm những hợp chất

có nhóm chất này và xác định hoạt tính sinh học của chúng Trong khi đó, một số ít

các hợp chất khác như flavonoid, lignan, phenolic, terpene,… ở loài P longum cũng

mang đến nhiều hoạt tính sinh học đặc trưng nhưng cho đến nay, các nghiên cứu trên thế giới về phân lập và đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất khác ngoài nhóm

hợp chất alkaloid vẫn chưa nhiều Ở Việt Nam, các nghiên cứu về chi Piper, hay loài

P longum vẫn còn nhiều hạn chế Cụ thể, loài P longum ở Việt Nam chủ yếu được

các nhóm nghiên cứu tập trung phần lớn vào xác định hoạt tính sinh học của các phần chiết, một số khác là tối ưu hóa quá trình chiết tinh dầu và xác định hoạt tính sinh học của chúng [16, 42] Ngoài ra, năm 2005 có nghiên cứu của Đỗ Đình Rãng về nghiên

cứu thành phần hóa học của lá cây tất bạt (Piper longum Linn) Kết quả tác giả đã phân lập thành công hợp chất N-[3-(4-methoxyphenyl)-1-oxopropyl]-pyrrol, β-

sitosterol (94), poriferasterol và xác định hàm lượng của các chất trong tinh dầu bao

gồm β-caryophyllene (11,42%), β-pinene (8,01%), α-pinene (4,9%), α-copaene

(3,95%)…[1] Năm 2022, nhóm nghiên cứu của Viện Dược Liệu cũng đưa ra báo cáo

về phân lập các hợp chất phenolic và alkaloid từ quả của loài P longum gồm 7 hợp

chất: avenalumic acid methyl ester, methyl piperate (101), piperine (1), pipernonaline

(2), (2E,4Z,8E)-N-[9-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2,4,8-nonatrienoyl] piperidine,

pipercide (20) và guineensine (7) [30] Vì vậy, việc nghiên cứu và đánh giá về thành

phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học phân lập được từ loài P longum sẽ đem lại

giá trị khoa học và thực tiễn Từ đó, đóng góp cho dữ liệu các hợp chất thiên nhiên trên thế giới, tạo tiền đề cho sự phát triển của ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Tên khoa học: Piper longum L

- Nơi thu mẫu: Trạm đa dạng sinh học Mê Linh, Vĩnh Phúc, Việt Nam

- Người giám định: TS Nguyễn Thế Cường, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Mẫu tiêu bản: NCCT-P136 tại Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp chiết nguyên liệu thực vật

Nguyên liệu thực vật được nghiền nhỏ, ngâm chiết với MeOH ở nhiệt độ

phòng Dịch chiết MeOH được cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho phần chiết MeOH Phần chiết MeOH được chiết với các dung môi theo độ phân cực tăng dần:

n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate cho các phần chiết tương ứng

2.3 Các phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất

2.3.1 Phương pháp chiết hai pha lỏng – lỏng

Phương pháp dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha lỏng

không hòa trộn (một pha nước và một pha hữu cơ) Các hợp chất hữu cơ sẽ được chuyển từ một pha nước sang một pha hữu cơ còn các chất nền phân cực sẽ ở lại trong pha nước Quá trình chiết có thể được thực hiện ở các điều kiện được kiểm soát ví dụ như pH, độ phân cực của dung môi chiết, tỷ lệ thể tích pha hữu cơ/pha nước, nhiệt độ

2.3.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng trên silica gel là phương pháp thích hợp cho phân tích các hợp chất hữu cơ Vì sự phân tích TLC trên silica gel là một quá trình hấp phụ các hợp chất được phân tách theo độ phân cực theo cách tương tự như trong sự phân tách sắc

ký cột Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích để lựa chọn các hệ dung môi rửa giải cho sắc ký cột Để định tính các chất, các giá trị Rf và màu sắc của các vệt chất được phát hiện trên bản mỏng TLC cần được mô tả Dựa vào sắc ký đồ TLC có thể đánh giá định tính số lượng các hợp chất có trong hỗn hợp

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck, Darmstadt, CHLB Đức) với chiều dày lớp silica gel là 0.2 mm

Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng: hòa tan mẫu thử trong dung môi thích hợp (1 mg/mL), sau đó dùng capilla đưa dung dịch mẫu thử lên bản mỏng (10 µL)

Dung môi triển khai: các dung môi dùng trong TLC đều được làm khan và

chưng cất lại trước khi sử dụng Các hệ dung môi được trộn theo tỷ lệ phù hợp với từng mẫu phân tích Sau khi pha phải lắc kỹ cho các dung môi trong hệ trộn đều vào nhau rồi cho mẫu vào bình triển khai sắc ký đáy bằng, có nút nhám kín đến chiều cao 0.5 cm Để yên đến khi bình được bão hòa dung môi mới tiến hành triển khai bản mỏng

Triển khai bản mỏng: bản mỏng được cắt với kích thước phù hợp với tuyến

xuất phát của dung môi, dung môi có chiều cao 1 cm Dùng kẹp sắt đưa nhanh bản mỏng đã được tẩm mẫu vào bình triển khai sắc ký, đậy kín nắp, để yên và quan sát Khi quan sát thất dung môi đã chạy đến tuyến dung môi trên, dùng kẹp sắt lấy bản mỏng ra khỏi bình và tiến hành phát hiện vệt chất trên bản mỏng

Phát hiện vệt chất trên bản mỏng: bản mỏng được phun H2SO4 10%, sau đó

được hơ nóng 120oC, đánh dấu vệt chất trên bản mỏng, tính giá trị Rf và ghi màu sắc của các vệt chất

2.3.3 Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột thường được thực hiện dưới trọng lực của dung môi Cột sắc ký được thiết kế với khóa dưới và nhám trên có đường kính trong và chiều cao tùy theo lượng mẫu cần phân tách Chất hấp phụ dùng cho CC là silica gel (Merck, Darmstadt,

CHLB Đức) với các cỡ hạt 63 – 200 μm và 40 – 63 μm

Dung môi hữu cơ dùng cho sắc ký cột được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong bình kín trước khi sử dụng

Nhồi cột sắc ký: phương pháp nhồi cột ướt: một lượng silica gel ứng với cột

sắc ký có đường kính thích hợp, có chiều cao là 100 cm được khuấy đều thành bột nhão trong một lượng vừa đủ dung môi Bột nhão này được nhồi vào cột sắc ký và được đuổi hết bọt khí Có thể dùng bơm nén hoặc trọng lực dung môi đi qua cột nhiều lần cho đến khi lớp silica gel hoàn toàn ổn định

Đưa mẫu lên cột sắc ký: phương pháp tẩm mẫu trên silica gel: mẫu được hòa

tan trong một lượng vừa đủ dung môi dễ bay hơi thích hợp Trộn dung dịch thu được

với silica gel (cỡ hạt 40 – 63 μm) với tỷ lệ là 1 g chất/ 1.2 g đến 1.5 g silica gel Hỗn

hợp này được làm bay hơi dung môi đến khi khô kiệt thi được bột mịn của mẫu chất

hấp phụ trên silica gel Bột này được đưa lên cột sắc ký phía trên lớp chất hấp phụ silica gel

Triển khai sắc ký cột: mở khóa dưới cột sắc ký để cho dung môi chảy ra khỏi

cột sắc ký, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho từ

từ mẫu tẩm trên silica gel lên cột Khi đưa mẫu lên cột cần phải chú ý đảm bảo cho

bề mặt của lớp chất phía trên cột sắc ký tạo thành mặt phẳng ngang Rắc một lớp cát lên phía trên để tránh các chất bột bị hòa tan ngược

Tiến hành rửa giải: rửa giải bằng hệ dung môi được xác định nhờ vào các

khảo sát thăm dò TLC, tốc độ rửa giải 20 giọt/ phút, thu các phân đoạn theo thể tích

150 mL, 50 mL và 20 mL (CC, FC)

Khảo sát sắc ký các phân đoạn: tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận được

bằng TLC, gộp các phân đoạn cho sắc ký đồ TLC giống nhau lại, sau đó cất loại kiệt dung môi để thu được các nhóm phân đoạn

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High – performance liquid chromatography –

HPLC) là một kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua một cột sắc ký Cột sắc

ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu trong tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khi mà chúng chảy ra khỏi cột

Sắc ký có thể được mô tả là một quá trình dịch chuyển khối lượng liên quan tới hấp phụ HPLC dựa trên hệ thống bơm để đẩy chất lỏng đã bị nén và hỗn hợp mẫu qua một cột đổ bằng một chất hấp phụ, dẫn tới sự phân tách của các thành phần trong mẫu Thành phần hoạt động của cột, chất hấp phụ, tiêu biểu là một vật liệu cấu trúc hạt làm từ những hạt rắn như silica hay polymer, có kích thước trong khoảng 2-50

μm Những thành phần của hỗn hợp mẫu được tách ra khỏi nhau bởi mức độ tương

tác khác nhau với các hạt hấp phụ Chất lỏng bị nén là hỗn hợp dung môi ví dụ nước, acetonitrile hay methanol và được gọi là “pha động” Thành phần và nhiệt độ của pha động đóng vai trò chính trong quá trình phân tách bằng cách tác động lên những tương tác xảy ra giữa những thành phần trong mẫu và chất hấp phụ ở cột Đây là những