Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp Đếm khuẩn lạc màng petrifilm

Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp màng PetrifilmTCVN/ISO Quy trình Mục đích từng bước Màu khuẩn lạc Màu của các phản ứng trên môi trường Công thức tính toán, biểu thị kết quả NỘI DUN

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH

VẬT HIẾU KHÍ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC, MÀNG

PETRIFILM

GVHD: Đinh Thị Hải Thuận

NGUYỄN THÀNH ĐẠT 2005220892

PHẠM NGỌC HẢI 2005221128

BÙI THỊ THU HẰNG 2005221213

VÕ THỊ TUYẾT LAN 2005222188

DƯƠNG THỊ ANH THƯ

2005225168

NHÓM 2

Phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp màng Petrifilm

TCVN/ISO Quy trình Mục đích từng bước Màu khuẩn lạc

Màu của các phản ứng trên môi trường

Công thức tính toán, biểu thị kết quả

NỘI DUNG

1 Giới thiệu

 Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn

lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử pHopt: 6,5 – 8,5

 Hiển thị mức độ an toàn vệ sinh của thực phẩm

 Đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật

 Nguy cơ hư hỏng của thực phẩm

 Giới hạn về thời gian, hạn sử dụng – bảo quản của sản phẩm

 Mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm

Vi sinh vật hiếu khí là

gì?

1 Giới thiệu

Là cơ sở để phân biệt thực phẩm có an toàn, có đảm

bảo vệ sinh hay có dấu hiệu hư hỏng.

Là một trong những chỉ tiêu trong kiểm tra vệ sinh thực phẩm trong quá trình sản xuất, vận chuyển và bảo quản.

1 Giới thiệu

 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu là pha loãng mẫu, cấy lên đĩa thạch và sau đó đếm các khuẩn lạc mọc trên đó.

• Phương pháp thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên đĩa petrifilm

Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố định vào các màng mỏng dùng để kiểm tra TSVSVHK, số coliform, số coliform phân, nấm mốc, nấm men Có thể đếm trực tiếp trên màng petrifilm

Phương pháp xác định

MỘT SỐ TÊN GỌI

KHÁC

 Số vi sinh vật hiếu khí (Aerobic Plate Count_

APC)

 Tổng số đệm trên đĩa (Total Plate Count_ TPC)

 Tổng số vi sinh vật sống (Total Viable Count_

TVC)

 Số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count_

SPC)

2 Môi trường – hóa

chất

Phương pháp đếm khuẩn lạc

TCVN 6507-1 : 2015 (ISO 6887-1 : 2003)

Peptone: Đây là sản phẩm thủy phân protein, vai

trò cung cấp protein để VSV sinh trưởng và phát.

Dung dịch muối peptone SPW (saline peptone water)

NaCl: Tạo điều kiện môi trường có tính

thẩm thấu phù hợp, tạo ra cân bằng thẩm

thấu giữa môi trường ngoài và bên trong

và hỗ trợ sự phát triển của VSV.

Nước cất: pha chế môi trường, là dung môi hòa tan các thành phần khác.

Môi trường Plate Count Agar (PCA)

Saline Peptone Water (SPW)

Phương pháp màng petrifilm

• Peptone từ casein

• NaCl

• Nước

TCVN 4884:2005

TCVN 6507 – 1:2005

ISO 6887 – 1:2003 ISO 4833:2003

• Cấy lên môi trường cấy quy định, sử dụng hai đĩa, dùng một lượng mẫu thử quy định.

• Cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu vào hai đĩa cho mỗi dung dịch pha loãng.

• Ủ trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 30°C trong 72± 6 giờ.

• Tính số lượng vi sinh vật trên 1g hoặc 1ml mẫu từ số lượng khuẩn lạc thu được trên đĩa đã chọn.

Nguyên tắc

10/25g mẫu rắn hoặc 10/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone

Xoay nhẹ trộn đều mẫu ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật

ngược đĩa và ủ ấm 300C trong 72h 6h

Đọc kết quảChọn các đĩa mọc 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

…

1ml mỗi đĩa

1ml mỗi đĩa

Phương pháp đếm khuẩn lạc

3 Quy trình tiến hành

Theo TCVN 6507-1:2005, TCVN 6404:2008

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu

(dung dịch pha loãng ban đầu)

 Cân chính xác 10g đối với mẫu rắn hoặc đong mẫu với thế

tích 10ml đối mẫu lỏng.

 Cho dung dịch pha loāng SPW 90ml (sai số cho phép ± 5%)

vô trùng vào bao PE (bình tam giác) chứa mẫu.

 Đồng nhất mẫu bằng máy dập trong 1 phút hoặc lắc đều

bình tam giác có mẫu và dịch pha loãng trong 2 đến 3

phút.

Tạo ra một huyền phù đồng nhất: phân tán đều vi sinh vật, tăng độ nhạy của

Loại bỏ các chất ức chế: tạo điều kiện

phát triển cho vi sinh vật

Đảm bảo tính đại diện của mẫu: phản ánh chính xác số lượng vi sinh vật trong toàn

bộ mẫu

MỤC ĐÍCH

10/25g mẫu rắn hoặc 10/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone

Xoay nhẹ trộn đều mẫu ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật

ngược đĩa và ủ ấm 300C trong 72h 6h

Đọc kết quảChọn các đĩa mọc 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

…

1ml mỗi đĩa

1ml mỗi đĩa

Phương pháp đếm khuẩn lạc

3 Quy trình tiến hành

Theo TCVN 6507-1:2005, TCVN 6404:2008

Bước 2: Pha loãng mẫu

• Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền phù ban đầu với sai số ±

5% cho vào một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha loãng SPW

vô trùng ở nhiệt độ thích hợp.

• Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để thu được dung

dịch pha loãng 10-2(đối với các loại mẫu làm từ nguyên chất

thì thu được dung dịch pha loãng là 10-1) Nếu cần, lặp lại

thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10-3 , 10-4…cho

đến khi đạt được nồng độ pha loãng thích hợp.

10/25g mẫu rắn hoặc 10/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone

Xoay nhẹ trộn đều mẫu ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật

ngược đĩa và ủ ấm 300C trong 72h 6h

Đọc kết quảChọn các đĩa mọc 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

…

1ml mỗi đĩa

1ml mỗi đĩa

Phương pháp đếm khuẩn lạc

3 Quy trình tiến hành

Theo TCVN 6507-1:2005, TCVN 6404:2008

Bước 3: Cấy và ủ mẫu

 Nếu mẫu ở dạng lỏng: Dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml.

 Nếu mẫu ở dạng rắn: dùng pipet vô trùng cho vào mỗi đĩa 1ml dịch

huyền phù ban đầu.

 Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 12-15ml môi trường PCA ở 40-47°C

 Sử dụng 1 đĩa petri đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml dung

dịch pha loãng cho vào đĩa petri, thêm 12-15ml môi trường PCA ở

cùng điều kiện.

 Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ủ ấm ở 30±1°C trong 72±3h

Mục đích của bước cấy mẫu: Phân lập vi sinh vật, gieo mẫu lên môi trường nuôi

triển đồng đều của các khuẩn lạc

MỤC ĐÍCH

10/25g mẫu rắn hoặc 10/25ml mẫu lỏng + 90/225ml Saline Peptone

Xoay nhẹ trộn đều mẫu ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật

ngược đĩa và ủ ấm 300C trong 72h 6h

Đọc kết quảChọn các đĩa mọc 300 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả

…

1ml mỗi đĩa

1ml mỗi đĩa

 Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu, điều quan trọng là các

khuẩn lạc chính phải được đếm và tránh đếm nhầm với các hạt

không hòa tan hoặc các chất kết tủa trên đĩa

 Kiểm tra các khuẩn lạc nghi ngờ, khi cần nên dùng kính lúp có

độ khuếch đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với tạp chất

khác

Ước tính số lượng vi sinh vật

Bước 4:

Đếm khuẩn

lạc

Đánh giá chất lượng sản phẩm

Kiểm soát quá trình sản xuất

Đánh giá hiệu quả của các chất bảo quản

Đánh giá mức độ ô nhiễm

MỤC ĐÍCH

Đặt đĩa cố định trên bề mặt phẳng, kéo tấm film bên trên lên.

Dùng micropipette nhỏ thẳng 1ml mẫu xuống đĩa, cố định mẫu ở giữa đĩa

Cuộn tấm film bên trên xuống, tránh tạo bọt khí Không được để tấm film rơi xuống

Dùng dụng cụ có bề mặt phẳng bên dưới, đặt miếng dàn trải mẫu trên tấm màng trong vùng cấy

Ấn nhẹ lên miếng dàn trải mẫu đều lên vùng cấy trước khi lớp gel hình thành

Lấy dụng cụ dàn trải mẫu ra, đợi lớp gel đông lại

Ủ các đĩa với bề mặt trống lên trên Nên làm ấm để hạn chế mất

độ ẩm trong suốt quá trình ủ

Đếm khuẩn lạc trực tiếp bằng mắt hay bằng máy đếm

Để định danh, kéo tấm màng phía trên và lấy khuẩn lạc từ lớp gel

8

Giáo trình phân tích vi sinh thực phẩm (2023), Trường Đại học Công Thương TP.HCM

Phương pháp màng Petrifilm

Màu của khuẩn lạc

Phương pháp đếm khuẩn lạc

Màu khuẩn lạc của vi sinh vật hiếu khí trên môi trường PCA

có thể khác nhau tùy thuộc vào loại vi sinh vật: Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa

Môi trường Plate Count Agar (PCA)

Màu nền: Môi trường PCA có màu từ trong suốt đến vàng nhạt Điều này giúp tạo độ tương phản cao, giúp dễ dàng quan sát khuẩn lạc

Màu sắc từ phản ứng sinh hóa đặc trưng: Màu đỏ trên môi trường đặc biệt, vi sinh vật có thể khử chỉ thị màu và tạo ra các khuẩn lạc màu đỏ.

Phương pháp đếm khuẩn lạc

Màu của các phản ứng trên môi

trường

Màu của khuẩn lạc

Phương pháp màng petrifilm

Khuẩn lạc có màu đỏ vì:

• Sự hiện diện của Lactose

• Enzyme β-galactosidase: E.coli sản xuất enzyme này,

thủy phân lactose thành glucose và galactose

• Sản xuất Acid: giảm pH môi trường

• Chỉ thị màu: màu xanh hoặc không màu  màu đỏ

• Nền của màng Petrifilm

Màu xanh lục, xanh lam nhạt hoặc trong suốt không màu,

tạo độ tương phản với các khuẩn lạc màu đỏ

4 Kết quả định lượng

Tính toán kết quả của phương pháp đếm khuẩn lạc

TH1: Tính số lượng khuẩn lạc vsv có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp

(Thực hành phân tích vi sinh vật thực

phẩm 1)

Tính kết quả định lượng của phương pháp đếm khuẩn lạc

TH2: Trường hợp có 2 đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

(Thực hành phân tích vi sinh vật thực

phẩm 1)

Ví dụ

Tính toán kết quả của phương pháp màng Petrifilm

Đếm khuẩn lạc trên một đĩa:

N x 1/f

 N x 1/f = 50 x 100 = 5000 (CFU/ml) N: Số khuẩn lạc

f: Độ pha loãng

Tính toán kết quả của phương pháp màng Petrifilm

Đếm khuẩn lạc trên nhiều đĩa cho cùng một độ pha loãng  tính trung bình số khuẩn lạc trên các

Tính toán kết quả của phương pháp màng Petrifilm

Không có đĩa với N > 30 (khuẩn lạc màu đỏ)  đếm CHÍNH XÁC trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).

Tất cả đĩa với N > 300  ƯỚC TÍNH đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện (đếm trung bình trên một ô vuông và nhân với 20)

Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là

"quá nhiều để đếm".

Biểu thị kết quả

Kết quả cuối cùng sẽ biểu thị dưới dạng số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩa petri.

VD: 150 khuẩn lạc/đĩa petri

you!