đề tài phân lập xác định thành phần và đặc điểm củacác chủng vi sinh vật trong mẫu

Phương pháp nghiên cứu- Phương pháp pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật- Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật- Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học- Ph

Baó cáo thực hành môn

VI SINH VẬT HỌC

Đề tài: Phân lập, xác định thành phần và đặc điểm của

các chủng vi sinh vật trong mẫu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP HCM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

GVHD:Nguyễn Thị Lan Hương

NHÓM SINH VIÊN: Nhóm 4

Lớp: DHTP17ATT

TP HCM, ngày tháng năm

2Danh sách nhóm

Tên sinh viên MSSV

Đề tài: Phân lập, xác định thành phần và đặc điểm của các chủng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

I Mục đích nghiên cứu của đề tài

- Là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các dòng vi khuẩn thuần khiết (clon) được gọi là khuẩn lạc Khi vi khuẩn tăng trưởng

và phát triển trên bề mặt môi trường rắn sẽ tạo ra những khuẩn lạc Mỗi nhóm vi khuẩn, mẫu loại vi khuẩn có hình thái tính chất khuẩn lạc khác nhau, đặc trưng từng loại

II Nguyên tắc

- Phân lập vi khuẩn là 1 quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể

vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt thạch dinh dưỡng chọc lọc Sau

đó ủ ở điều kiện thích hợp, các vi sinh vật tách riêng biệt gọi là khuẩn lạc

- Chủng vi sinh vật thuần khiết ( hay gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu có dòng từ một tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật được thu nhận từ khuẩn lạc lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì chúng có thể hình thành bởi 1 hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi sinh vật thuần khiết

III Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật

- Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

- Phương pháp quan sát vi sinh vật bằng kính hiển vi quang học

- Phương pháp nhuộm màu vi sinh vật

- Phương pháp phân lập vi sinh vật

IV Kết quả dự kiến

- Sau khi thực hiện đề tài thu được ít nhất 5 chủng vi sinh vật khác nhau,trong đó có ít nhất 1 chủng nấm mốc, 1 chủng nấm men, 1 chủng vi khuẩngram (+), 1 chủng vi khuẩn gram (-), 1 chủng cầu khuẩn

V Tài liệu tham khảo :Thực tập Vi sinh vật học

Mục lục

Kế hoạch thực hiện đề

tài 5

Buổi 1 Pha chế môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật 6

Mục đích 6

Nguyên tắc 6

Tiến hành thí nghiệm 6

Buổi 2 Cấy phân lập bằng phương pháp cấy hộp trải và hộp đổ 10

Mục đích 10

Nguyên tắc 10

Chuẩn bị dụng cụ 10

Tiến hành thí nghiệm 10

Kết quả và biện luận kết quả 12

Buổi 3 Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi .13 Nguyên tắc của cấy truyền làm thuần 13

Mục đích của cấy truyền làm thuần 13

Nguyên tắc của kính hiển vi 13

Cấu tạo của kính hiển vi 13

Tiến hành thí nghiệm 14

17

Mục đích 17

Nguyên tắc 17

Chuẩn bị dụng cụ 18

Tiến hành thí nghiệm 18

Kết quả và biện luận kết quả 19

Buổi 5 Cấy giữ giống vi sinh vật trong ống nghiệm 20

Mục đích 20

Nguyên tắc 20

Tiến hành thí nghiệm 20

Kết quả và biện luận kết quả 21

Sơ đồ phân lập vi sinh vật 22

Too long to read on your phone? Save

to read later on your computer

Save to a Studylist

Kế hoạch thực hiện đề tài

Buổi 1 Pha chế môi trường dinh dưỡng

Buổi 2 Cấy phân lập bằng phương pháp cấy hộp trải và hộp đổ

Buổi 3 Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinh vật dưới kính hiển viBuổi 4 Cấy truyền làm thuần và nhuộm màu vi sinh vật

Buổi 5 Cấy giữ giống vi sinh vật trong ống nghiệm

- Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất

có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa - khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự

ổn định độ pH của môi trường

- Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết;

có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố đọc hại;hoàn toàn vô trùng đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật

III Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Đo PH môi trường

- Phối trộn vào dụng cụ chứa ( erlen, ống nghiệm, bình thủy tinh, đỉa petri )

- Hấp tiệt trùng môi trường (121 ,30 phút,1 atm)

- Đổ đĩa petri

2 Quy trình nuôi cấy vi sinh vật ( Môi trường PDA )

Bước 1: Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất

+ 1 bình erlen

+ 1 becher

+ 12 đĩa petri

+ 5 ống nghiệm

Bước 3: Phối trộn hóa chất

+ Cho agar và glucozo vào becher trộn đều

Bước 4: Đun sôi

+ Cho khoai tây và 150ml nước vào nồi đun sôi khoảng 15-20 phút.+ Sau đó lấy nước luộc khoai tây

+ Tiếp theo cho nước vừa thu được vào hỗn hợp agar và glucozo, hòa tan.+ Sau khi hòa tan,cho hỗn hợp vừa hòa tan đun sôi trên bếp cho đến khihỗn hợp vừa sôi

Bước 5: Đo PH môi trường

+ Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCl 10% hay NaCl10% Ngoài ra có thể dùng một số hóa chất khác như: H3PO4, H2SO4,KOH, NaHCO3, Na2CO3

+ Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre).Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao Trong phòng thínghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH.Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao

Bước 6: Phối trộn vào dụng cụ chứa môi trường

Hình ảnh cân đong hóa chất

+ Cho hỗn hợp vừa hòa tan vào erlen 250 sau đó dùng giấy bạc đậy kínmiệng erlen cố định bằng băng dính hoặc dùng bông không thấm nước bịtkính miệng erlen và dùng giấy báo bịt kín thêm lần nữa và cố định bằngdây thun

Bước 7: Hấp tiệt trùng môi trường

+ Cho môi trường vào nồi hấp 30-45 phút, 121 ,1atm

+ Tiếp theo cho đĩa petri vào tủ sấy để tiệt trùng 180 30 phút

Bước 8: Đổ môi trường ra đĩa petri

+ Đổ môi trường ra 5 đĩa petri đã tiệt trùng

Hình ảnh đậykín hỗn hợpvừa hòa tanbằng giấybạc

Hình ảnh gói đĩa petri bằng giấy báo cho vào tủ

ấ

+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy giấy bạc lại bình chứa.+ Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng

Thể tích môi trường khoảng 12-15 ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dày khoảng 2 mm

+ Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin: Tên môitrường, ngày khử trùng, người pha chế

VI Kết quả và biện luận kết quả

- Sau khi đổ môi trường PDA vào đĩa petri thì sau một thời gian nó sẽ đônglại thành dạng thạch do có thành phần agar nên làm cho môi trường củachúng ta đông lại.Để một vài ngày nếu không có sự xuất hiện của vi sinhvật nào trên bề mặt môi trường vậy đã thành công

Hình ảnh

đổ môitrường rađĩa petri

Đây là kết quả sau khi đổ môi trường vào đĩa

II Nguyên tắc

- Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp, các vi vi sinh vật sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc

- Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau

+ Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vật;

+ Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu;

+ Phân lập vi sinh vật thuần khiết;

+ Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở buổi 1

IV Tiến hành thí nghiệm

1 Lựa chọn nguồn phân lập

a) Nguồn phân lập nấm mốc

- Một số chủng nấm mốc như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger vàMucor… có thể phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làmmốc tương, bánh mì để khô ít ngày

b) Nguồn phân lập nấm men

- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như: bề mặt trái cây

và dịch ép một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, trong rượu nếp,trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía, trong hạt kefia.c) Nguồn phân lập vi khuẩn

- Có thể phân lập vi khuẩn từ đất, nước giải khát nước mía nước thải,( ),

thực phẩm tươi (thịt, cá, sữa tươi, rau quả tươi…), thực phẩm bị ôi thiu…

2 Kỹ thuật nuôi cấy tạo khuẩn lạc riêng lẽ từ quần thể vi sinh vật trên cácmôi trường phân lập

Bước 1: Xử lí mẫu, pha loãng mẫu hút lấy mẫu nước mía 1ml bằngmicropipett (pipette Pasteur) và hơ với lửa, sau đó cho vào 9ml Nacl 0,9%,nước muối sinh lý Lấy 1ml ống nghiệm 1 sang ống nghiệm 2 tương tự nhưvậy tới ống nghiệm thứ 5 Trong suốt quá trình thực hiện phải gần đèn cồn.Bước 2: Thực hiện cấy đổ và cấy trải

* Cấy đỗ trên thạch đĩa ( Cho mẫu vào đĩa peptri trước)

- Dùng micropipette và đầu tuýp vô trùng, hút 1 ml mẫu đã pha loãng ở ốngnghiệm 10 vào đĩa petri

- Tiếp theo,đổ khoảng 15-20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội

- Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch mẫu và môi trường trộn đều trong môi trường cấy

* Cấy trải trên thạch đĩa ( Cho môi trường trước vào đĩa peptri trước)

- Dùng micropipette và đầu tuýp vô trùng, hút 0,1 ml mẫu đã pha loãng ở ống nghiệm 10 lên bề mặt môi trường trong đĩa petri

- Sau đó dùng que trải thủy tinh nhúng vào cồn và hơ qua ngọn lửa đèn cồn( thực hiện 3 lần), để nguội

- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó để cách đèn cồn chừng 1-2 cm, khẽ mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao chovừa đủ để cho que cấy vào

- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:

+ Theo hình zích zắc trên toàn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo hình zích zắc 3 hoặc 4 góc

Đổ môi

trường

vào mẫu

V Kết quả và biện luận kết quả

Đây là kết quả thu được, đĩa thứ nhất ta thấy những đóm vàng trên bề thạch

đổ môi trường không đều

Đĩa này trong quá trình

thao tác do để sát đèn cồn,

làm cho môi trường bị tan

hả

Buổi 3 Cấy truyền làm thuần và quan sát vi sinh

vật dưới kính hiển vi

I Nguyên tắc của cấy truyền làm thuần

- Sau khi thực hiện cấy phân lập , sau vài ngày sẽ xuất hiện các chủng VSV

trên đĩa petri Ta thực hiện cấy chuyền làm thuần bằng phương pháp cấyria và cấy điểm qua một đĩa môi trường mới và thao tác này được lặp lạinhiều lần cho đến khi VSV thuần khiết

II Mục đích của cấy truyền làm thuần

- Để tạo ra đồng nhất một chủng VSV thuần khiết từ một tế bào riêng lẽ ,

phục vụ cho các công đoạn nghiên cứu đặc điểm , hình thái , nhuộm màucủa từng chủng VSV

III Nguyên tắc của kính hiển vi

- Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500 nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt hai điểm cách nhaukhoảng 0,2 µm trở lên

- Chức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật,

ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật

IV Cấu tạo của kính hiển vi

Kính hiển vi quang học được cấu tạo gồm hai phần:

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc dichuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp)

- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng)

Ngoài ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng

V Tiến hành thí nghiệm

1 Cấy truyền làm thuần

- Sau khi cấy phân lập ở bước 1 ,bước 2 , vài ngày sau đĩa petri có cácchủng VSV khác nhau

- Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời trên đĩa petri vào một đĩa petrikhác đã chuẩn bị sẵn môi trường

- Nuôi vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian thích hợp

- Loại bỏ các đĩa petri bị nhiễm, chọn ra các đĩa petri có các chủng thuầnkhiết

- ( Cấy ria )cấy truyền bằng que cấy đầu tròn đối với vi khuẩn và nấm

men :

+Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng ( Vi khuẩn và nấm men )

+ Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và riabốn góc)

Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thựchiện đường ria tiếp theo

- ( Cấy điểm ) cấy truyền bằng que cấy đầu mốc đối với nấm mốc

+ Dùng que cấy mốc thao tác vô trùng ( nấm mốc )

+ Cấy một điểm vào trong lòng thạch hoặc ba điểm theo hình tam giác đều

2 Quan sát kính hiển vi ( quan sát vi sinh vật ở buổi 2)

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi Sau

đó cần thao tác các bước sau:

* Bước 1: Chuẩn bị kính

Kết nối kính hiển vi với nguồn điê ‡n , bật công tắc kính, điều khiển nút chỉnh ánh sáng để kính để có được ánh sáng thích hợp

* Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính

- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản.Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn)

- Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính

* Bước 3: Quan sát

Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó

Xem tiêu bản ở vật kính x10

- Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường mờ đi)

- Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kín

Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản (không được chạm vào tiêu bản)

- Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màn chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất

Xem tiêu bản ở vật kính x40

- Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn)

- Xoay vật kính x40 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang)

- Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màn chắn sáng sao cho tiêu bản thấy ảnh rõ nhấtQuan sát vi sinh vật

- Xem chi tiết hình dáng, màu sắc của nấm mốc: khuẩn ty, vách ngăn khuẩnty,cuống bào tử, thể bọng, thể bình, túi bào tử, cách sắp xếp của bào tử Xem tổng thể hình dáng của nấm mốc ở vật kính x10

- Tế bào nấm men: Xem ở vật kính x40 quan sát hình dạng tế bào: tế bào đứng riêng lẻ hay kết dính tạo sợi giả - sợi thật, trạng thái nảy chồi Vẽ hìnhmột thị trường kính hiển vi ở vật kính X40, có các tế bào nấm men

- Xem trạng thái của tế bào vi khuẩn: di động hay đứng yên, kiểu di động của tế bào, hình dạng của tế bào

VI Kết quả và biện luận kết quả

Hình ảnh của vi Hình ảnh nấm men,nhìn nó

dày vì lấy vi sinh nhiều

Hình ảnh thu được khi cấy truyền môi

trường PDA,ta thấy có màu tím là do vi sinh

vật này có mang sắc tố

II Nguyên tắc

- Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào

vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm

- Tùy theo từng loại vi sinh vật, tùy theo từng cấu trúc tế bào muốn nhuộm, ta có nhiều phương pháp nhuộm màu khác nhau Mỗi phương phápnhuộm cũng có nguyên tắc nhuộm khác nhau

- Đối với các phương pháp nhuộm màu vi sinh vật được cố định, thường

sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững

+ Dung dịch xanh methylen

+ Dung dịch tím kết tinh (crystal violet)

+ Dung dịch lugol

+ Cồn

+ Dung dịch nhuộm bổ sung

IV Tiến hành thí nghiệm