đề tàiphân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNGĐề tài:Phân tích tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc GVHD: Đinh Thị Hải Thuận... Hạn chế: 1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG

Đề tài:Phân tích tổng số

vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn

lạc

GVHD: Đinh Thị Hải Thuận

Nội dung trình bày

TỔNG QUAN

VỀ PHƯƠNG

PHÁP

01

1.1 Cơ sở lý thuyết

-Dựa vào sự tăng trưởng của vi sinh vật

hiếu khí thành khuẩn lạc trong điều kiện

-Đơn vị hình thành khuẩn lạc: CFU/g hoặc

CFU/ml (Colony forms unit)

Hạn chế:

1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

-Dùng để xác định mật độ vi sinh vật trong một mẫu

-Vi khuẩn được cấy trên đĩa thạch phát triển hình thành các khuẩn lạc từ một hoặc một số vi khuẩn ban đầu -Khuẩn lạc này có thể được thấy và đếm bằng mắt thường hoặc kính hiển vi

-Các đơn vị hình thành khuẩn lạc có thể là một tế bào đơn, một chuỗi tế bào hoặc cả một cụm tế bào -Không tính được tế bào chết, cần phải cân nhắc kỹ khi bạn cần mật độ tế bào trong mẫu ban đầu

1.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp đếm thủ công

Phương pháp đếm

tự động

1.2.1 Phương pháp đếm thủ công

• Mỗi chấm khuẩn lạc đặc trưng cho loại vi khuẩn đích

được đếm một lần

• Để kiểm soát quá trình đếm, người ta thường đặt đĩa

petri lên một lưới ô và đếm các khuẩn lạc trong mỗi ô,

đánh dấu khuẩn lạc đếm được ở đằng sau của đĩa petri

• Để chính xác, mỗi mẫu thử nghiệm cần nuôi cấy ít nhất

3 đĩa và lượng khuẩn lạc thích hợp là 15 _ 300 khuẩn lạc

• Các đĩa có quá nhiều hoặc quá ít khuẩn lạc đều không

thích hợp và cần pha loãng và cấy lại mẫu.

• Nguyên lí cơ bản của máy đếm khuẩn lạc tự động là máy đếm sẽ

chụp một ảnh của đĩa, sau đó sẽ sử dụng một thuật toán để tách và đếm các khuẩn lạc có trên đĩa

Môi trường, hóa chất và dụng cụ,

02

2.1 Môi trường và hóa chất

Saline Pepton Water (SPW) Pha loãng mẫu

Plate count Agar (PCA) Nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí

HCL 10%

Chỉnh pH NAOH 10%

Thành phần Khối lượng/

thể tích Vai tròPepton từ casein 5,0 g Chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển, sinh trưởng của VSV

Cao nấm men 2,5 g Cung cấp nguồn dinh dưỡng cho VSV

Glucoza, dạng khan

(C6H12O6) 1,0 g

Thạch 9 g đến 18 g Làm đông tụ môi trường

Nước 1 000 ml

2.1.1 Môi trường cấy.

-Môi trường PCA

Thành phần:

TCVN nào Dựa trên TCVN 4884 : 2015

2.1.1 Môi trường cấy.

-Môi trường PCA Các bước pha: Hòa tan peptone,

glucoza, cao nấm men

2.1.2 Dung dịch pha loãng.

2.2 Các thiết bị, dụng cụ.

Tủ sấy

Nồi hấp tiệt trùng

Tủ ấm

Máy đếm khuẩn

Quy trình phân tích

03

3.1 Sơ đồ qui trình phân tích

Mẫu Đồng nhất Pha loãng mẫu Cấy mẫu

Ủ (30C trong 726h) Đếm khuẩn lạc (15  n  300)

3.2 Các bước tiến hành phân

tích

Bước 2: Pha loãng mẫu

3.2 Các bước tiến hành phân

tích

Bước 3: Cấy, ủ mẫu

- Rót vào mỗi đĩa petri khoảng từ 12-15 ml môi trường PCA ở 44 0 C đến 47 0 C.

- Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay đều đĩa petri để cho hỗn hợp đông đặc.

- Sử dụng 1 đĩa petri đối chứng để kiểm soát bằng cách lấy 1ml dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri, thêm 12-15 ml môi trường PCA và nuôi ủ cùng điều kiện

-Lật ngược các đĩa đã cấy và đặt vào tủ ấm ở 30 ± 10C trong 72 ± 3 giờ

*Lưu ý: không xếp quá sáu đĩa và các đĩa cần được tách khỏi nhau, cách xa thành, nóc tủ.

3.2 Các bước tiến hành phân

3.3 Thu nhận kết

nhận được

Lượng khuẩn lạc

- Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 300 khuẩn lạc/đĩa

để đếm

- Sử dụng máy đếm nếu cần thiết

- Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là khuẩn lạc đơn lẻ Nếu

ít hơn ¼ đĩa mọc dày lan rộng, thì đếm các khuẩn lạc còn lại

và tính số tương ứng cho cả đĩa Nếu quá ¼ đĩa bị mọc dày lan

Tính Kết Quả

04

4.1 Công thức tính kết quả

Tính số lượng khuẩn lạc vi sinh vật có trong mẫu thử theo trung bình từ hai

độ pha loãng liên tiếp

(CFU/g hay CFU/ml)

Trong đó

• N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu.

• : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại từ 2 độ pha loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa chứa tối thiểu 15 khuẩn lạc.

• V: Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit.

• Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất, thứ hai được giữ lại

• d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại.

4.1 Công thức tính kết quả

Trường hợp có hai dĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

(CFU/g hay CFU/ml)

Trong đó

• N: Số khuẩn lạc trên 1ml (1g) mẫu.

• : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên hai đãi.

• V: Thể tích dịch cấy đĩa cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit

• n: Số đĩa được giữ lại (trong trường hợp này n = 2).

• d: Độ pha loãng của huyền phù ban đầu hoặc của độ pha loãng thứ nhất đã được cấy hoặc được giữ lại

Câu hỏi trắc nghiệm

Câu 1: Trường hợp nào sau đây sử dụng công thức

A Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại nhiều hơn 15ml

B Thể tích dịch cấy đã cấy trên mỗi đĩa ít hơn 15ml

C Có 2 đĩa chứa ít hơn 15 khuẩn lạc

D Tổng số khuẩn lạc đếm được nhiều hơn 15

Câu 2 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí

bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ở nhiệt độ bao

Câu 3: Nếu tổng số khuẩn lạc N tính được là

129870 CFU/g thì đâu là kết quả làm tròn đúng?

A 1,2×106CFU/g

B 1,2×105 CFU/g

C 1,3×106 CFU/g

D 1,3×105 CFU/g

Câu 4 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc ở thời gian bao lâu?

A 30 giờ

B 50 giờ

C 70 giờ

D 72 giờ

Câu 5: Nếu khuẩn lạc mọc lan rộng nhiều hơn ¼ đĩa

thì chúng ta phải?

A Loại bỏ đĩa đó và không đếm

B Đếm các khuẩn lạc còn lại trong đĩa và tính số lượng

tương ứng trên cả đĩa

C Đếm tất cả khuẩn lạc có trong đĩa và tính số tương

ứng trên cả đĩa

D Tất cả đều sai

Câu 6 Tổng số vi sinh vật hiếu khí có thể gồm:

Câu 7 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đếm khuẩn lạc là phương pháp?

Câu 8 Ở bước chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu thì đâu là ý đúng

A Cân 25g hoặc 25ml mẫu thử + 90ml dd SPW

B Cân 10g hoặc 10 ml mẫu thử + 90ml dd SPW

C Cân 10g hoặc 10 ml mẫu thử + 225ml dd SPW

D Tất cả đều sai

Câu 29 Một số vi sinh vật thực hiện quá trình hô hấp hiếu khí ở điều kiện?

A Có oxi phân tử

B Có oxi nguyên tử

C Không có oxi nguyên tử

D Có khí CO2

Câu 10 Cách xác định vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp nào trong các phương pháp sau?

A Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường acid

B Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường bazo

C Đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng

D Cả a và b đều đúng