Đánh giá thực trạng hoạt động giết mổ lợn và ô nhiễm một số vi sinh vật hiếu khí trên thịt lợn bán tại khu vực quận nam từ liêm, thành phố hà nội

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ CÚC HOA ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ LỢN VÀ Ô NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRÊN THỊT LỢN BÁN TẠI KHU VỰC QUẬN NAM TỪ LIÊM, THÀNH PHỐ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y THÁI NGUYÊN - 2019 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ CÚC HOA ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HOẠT ĐỘNG GIẾT MỔ LỢN VÀ Ô NHIỄM MỘT SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ TRÊN THỊT LỢN BÁN TẠI KHU VỰC QUẬN NAM TỪ LIÊM, THÀNH PHỐ HÀ NỘI Ngành: THÚ Y Mã số ngành: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SỸ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỖ QUỐC TUẤN THÁI NGUYÊN - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 13 tháng 12 năm 2019 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Cúc Hoa ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập thực đề tài này, nhận quan tâm, bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình thầy giáo, đồng nghiệp, bạn bè động viên khích lệ gia đình Nhân dịp tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Đỗ Quốc Tuấn- Người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt trình nghiên cứu hồn thành Luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập Tơi xin trân trọng cảm ơn Trạm Thú y quận Nam Từ Liên, Trung tâm Phân tích chứng nhận chất lượng sản phẩm nơng nghiệp Hà Nội, Phịng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp tơi q trình thực đề tài Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn ủng hộ, động viên, giúp đỡ gia đình, bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành tốt luận văn Thái Nguyên, tháng 12 năm 2019 TÁC GIẢ Nguyễn Thị Cúc Hoa iii DANH MỤC CÁC TỪ, CUM TỪ VIẾT TẮT % : Phần trăm ºC : Độ C g : Gam pp : page Tr : Trang Cs : Cộng CFU : Colony Forming Unit MPN : Most Probable Number FAO : Food and Agricultural Organization NXB : Nhà xuất VK : Vi khuẩn VKHK : Vi khuẩn hiếu khí E coli : Escherichia coli S aureus : Staphylococcus aureus B cereus : Bacillus cereus CSGM : Cơ sở giết mổ VSTY : Vệ sinh thú y TT : Thứ tự VRBL : Violet Red Bile lactoza TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm nước ta giai đoạn 2011 - 2018 Bảng 1.2 Yêu cầu cảm quan thịt tươi (TCVN 7046: 2002) 18 Bảng 3.1 Điều tra quy mô, số lượng sở giết mổ lợn địa bàn quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội 32 Bảng 3.2 Địa điểm xây dựng sở giết mổ lợn địa bàn điều tra 34 Bảng 3.3 Kết điều tra điều kiện giết mổ sở giết mổ lợn 36 Bảng 3.4 Kết điều tra tình hình vệ sinh thú y sở giết mổ 39 Bảng 3.5 Điều kiện hoạt động sở giết mổ lợn địa bàn điều tra 41 Bảng 3.6 Mức độ ô nhiễm vi khuẩn hiếu khí khơng khí sở giết mổ lợn địa bàn quận Nam Từ Liêm 43 Bảng 3.7 Nguồn nước sử dụng sở giết mổ lợn 44 Bảng 3.8 Kết tiêu Coliform nước giếng khoan sử dụng cho hoạt động giết mổ lợn sở giết mổ địa bàn quận Nam Từ Liêm 46 Bảng 3.9 Kết tiêu E coli nước giếng khoan sử dụng giết mổ lợn sở giết mổ địa bàn quận Nam Từ Liêm 46 Bảng 3.10 Kiểm tra mức độ ô nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí thịt lợn sở giết mổ nghiên cứu 48 Bảng 3.11 Kết kiểm tra tiêu E coli thịt lợn điểm giết mổ 50 Bảng 3.12 Kết kiểm tra tổng số Coliform thịt lợn sở giết mổ 52 Bảng 3.13 Kết kiểm tra Salmonella thịt sở giết mổ 53 Bảng 3.14 Kết kiểm tra Staphylococcus aureus thịt lợn số sở giết mổ 55 Bảng 3.15 Kết kiểm tra độc lực số chủng vi khuẩn E coli chuột nhắt trắng 56 Bảng 4.16 Xác định độc lực vi khuẩn S aureus phân lập chuột nhắt trắng 58 Bảng 3.17 Kết kiểm tra tra độc lực số chủng vi khuẩn Salmonella chuột nhắt trắng 59 v MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Cơ sở khoa học vấn đề nghiên cứu 1.1.1 Tình hình hoạt động giết mổ nước 1.1.2 Ngộ độc thực phẩm 1.1.3 Các nguyên nhân nhiễm khuẩn vào thịt 1.1.4 Một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt 12 1.1.5 Thịt tươi dạng hư hỏng thịt 18 1.1.6 Vệ sinh an toàn thực phẩm sở giết mổ gia súc 19 1.2 Tổng quan kết nghiên cứu giới 20 1.3 Tổng quan kết nghiên cứu Việt Nam 22 Chương ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng, phạm vi 24 2.1.1 Đối tượng 24 2.1.2 Phạm vi 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp điều tra thực trạng hoạt động giết mổ lợn số sở giết mổ địa bàn quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội 25 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 25 2.3.3 Phương pháp xác định vi khuẩn nước 25 2.3.4 Phương pháp xác định vi khuẩn thịt tươi 26 2.3.5 Phương pháp kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật khơng khí 28 2.3.6 Phương pháp xác định độc lực chủng vi khuẩn E coli, Salmonella S aureus phân lập 31 vi 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Tình hình hoạt động giết mổ lợn địa bàn quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội 32 3.1.1 Điều tra quy mô số lượng sở giết mổ lợn 32 3.1.2 Điều tra tình hình đảm bảo điều kiện vệ sinh thú y hoạt động giết mổ sở giết mổ lợn quận Nam Từ Liêm 33 3.2 Kết kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật khơng khí nước sử dụng sở giết mổ lợn 42 3.2.1 Kiểm tra mức độ ô nhiễm vi khuẩn hiếu khí không khí 42 3.2.2 Đánh giá vệ sinh nguồn nước sử dụng giết mổ lợn sở điều tra 44 3.3 Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật hiếu khí thịt lợn sở giết mổ địa bàn quận Nam Từ Liêm 47 3.3.1 Kết xác định nhiễm vi khuẩn hiếu khí thịt lợn số sở giết mổ 48 3.3.2 Kiểm tra tình trạng nhiễm vi khuẩn E coli thịt lợn 49 3.3.3 Kết kiểm tra tiêu tổng số Coliform 51 3.3.4 Kết xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn Salmonella thịt lợn số sở giết mổ 52 3.3.5 Kết xác định mức độ tỷ lệ ô nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn số sở giết mổ 54 3.5 Kết xác định độc lực chủng vi khuẩn phân lập 56 3.5.1 Kết xác định độc lực vi khuẩn E coli phân lập 56 3.5.2 Kết xác định độc lực vi khuẩn S aureus phân lập 57 3.5.3 Kết xác định độc lực vi khuẩn Salmonella phân lập 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 Kết luận 62 Đề nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Nước ta thời kì hội nhập phát triển, đời sống nhân dân cải thiện nâng cao, nhu cầu sử dụng thực phẩm tươi sống có nguồn gốc động vật ngày tăng Việc đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm có nguồn gốc động vật phục vụ nhu cầu tiêu dùng xuất yêu cầu cấp thiết Trong đó, thịt lợn tươi loại thực phẩm thông dụng thực đơn hàng ngày gia đình Tuy nhiên, trình vận chuyển, tiêu thụ người thường quan tâm tới lợi nhuận trước mắt mà sẵn sàng bỏ qua quy chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP), nguồn thực phẩm tươi sống nói chung, nguồn thịt lợn nói riêng bị nhiễm ngày lớn đe dọa sức khỏe người tiêu dùng Thực tế nay, thịt loại gia súc, gia cầm không đảm bảo chất lượng: thịt nhiễm bụi bẩn, nhiễm vi khuẩn trình vận chuyển, bày bán chợ đặc biệt trình giết mổ Theo số liệu thống kê tổ chức Nông lương giới (FAO) tổ chức Y tế giới (WHO), số bệnh nhân ngộ độc có đến gần 90% thịt bị nhiễm bẩn nhiễm khuẩn trình giết mổ, có 10% thịt gia súc bị bệnh (dẫn theo Trần Thị Hồng Ánh, 2015) Điều chứng tỏ rằng, q trình giết mổ gia súc chế biến thịt nhiều sai phạm Đây lý giải hàng năm có nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy Một nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiễm vi sinh vật độc tố chúng thịt Tại Hà Nội, với số dân khoảng 10 triệu người, nhu cầu tiêu thụ thịt gia súc, gia cầm ngày địa bàn lớn, vậy, vấn đề vệ sinh an tồn thực phẩm thủ đô ngày trở nên cấp thiết Trên địa bàn Quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội hoạt động giết mổ lợn diễn đa dạng nhằm cung cấp nhu cầu thực phẩm cho người dân nội thành Tuy nhiên, điểm, hộ giết mổ nhỏ lẻ phân tán rải rác hoạt động đa dạng, số hoạt động theo mùa vụ nên việc kiểm tra, kiểm sốt cịn gặp nhiều khó khăn Theo đánh giá Chi cục trưởng Thú y Hà Nội, lực lượng thú y chủ động, tích cực cơng tác kiểm dịch động vật, sản phẩm động vật, kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y, song chưa có phối hợp giải pháp mạnh, đồng bộ, chưa có sở khoa học mang tính thực tế cao để khắc phục tình trạng Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên, tiến hành thực đề tài: “Đánh giá thực trạng hoạt động giết mổ lợn ô nhiễm số vi sinh vật hiếu khí thịt lợn bán khu vực Quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội” Mục tiêu đề tài - Xác định thực trạng hoạt động giết mổ lợn địa bàn quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội - Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn nguồn nước sử dụng giết mổ ô nhiễm môi trường không khí khu vực giết mổ - Xác định mức độ ô nhiễm vi khuẩn hiếu khí thịt lợn số sở giết mổ địa bàn điều tra - Đề xuất giải pháp quản lý hoạt động giết mổ lợn địa bàn quận Nam Từ Liêm Ý nghĩa đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Cung cấp thêm nguồn tài liệu khoa học tình hình nhiễm vi sinh vật thịt lợn số điểm giết mổ địa bàn quận Nam Từ Liêm 3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Kết đề tài góp phần cảnh báo cho người tiêu dùng đồng thời giúp quan chức cán quản lý có biện pháp hữu hiệu cơng tác vệ sinh an tồn thực phẩm 68 47 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2012), “Fatal foodborne Clostridium perfringens illness at a state psychiatric hospital Louisiana, 2010”, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 61(32), pp 605 - 608 48 Costa W L., Ferreira Jdos S., Carvalho J S., Cerqueira E S., Oliveira L C., Almeida R C.(2015), “Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in raw meats and prepared foods in public hospitals in salvador, Bahia, Brazil”, J Food Sci, 80(1), pp 147 - 150 49 Crim S M., Iwamoto M., Huang J Y., Griffin P M., Gilliss D., Cronquist A B., Cartter M., Tobin-D'Angelo M., Blythe D., Smith K., Lathrop S., Zansky S., Cieslak P R., Dunn J., Holt K G., Lance S., Tauxe R., Henao O L (2014), “Incidence and trends of infection with pathogens transmitted commonly through food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S sites, 2006-2013”, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 63(15), pp 328 - 332 50 Cuiwei Zhao, Beilei Ge, Juan De Villena, Robert Sudler, Emily Yeh, Shaohua Zhao, David G White, David Wagner and Jianghong Meng (2001), “Prevalence of Campylobacter spp, Escherichia coli and Salmonella serovars in retail chicken, turkey, pork and beef from the Greater Washington, D.C., Area”, Environmental Microbiology, pp 5431 - 5436 51 Gyles C I (1994), Escherichia coli in domestic animals and humans, University of Gyelph, Canada 52 Grant I R., Mixon C R and Patterson M F (1993), Effect of low dose irradiation on growth and toxin production by S aureus and Bacillus cereus in roast beef and gravy, Int J Food Microbiol, 18:25 - 36 53 Jamali H., Radmehr B., Ismail S (2014), “Prevalence and antimicrobial resistance of Listeria, Salmonella, and Yersinia species isolates in ducks and geese”, Poult Sci 93(4), pp 1023 - 1030 54 Mangen M J., Bouwknegt M., Friesema I H., Haagsma J A., Kortbeek L M., Tariq L., Wilson M., van Pelt W., Havelaar A H (2015), “Cost-of-illness and disease burden of food-related pathogens in the Netherlands, 2011”, Int J Food Microbiol, 196, pp.84 - 93 69 55 Meloni D., Piras F., Mureddu A., Fois F., Consolati S G., Lamon S., Mazzette R (2013), “Listeria monocytogenes in five Sardinian swine slaughterhouses: prevalence, serotype, and genotype characterization”, Journal of food protection 56 Mengesha D., Zewde B M., Toquin M T., Kleer J., Hildebrandt G., Gebreyes W A (2009), “Occurrence and distribution of Listeria monocytogenes and other Listeria species in ready-to-eat and raw meat products”, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 57 Nimri L., Abu Al-Dahab F., Batchoun R (2014), “Foodborne bacterial pathogens recovered from contaminated shawarma meat in northern Jordan”, J Infect Dev Ctries., tập (11), pg 1407 - 1414 58 Nyachuba D G (2010), “Foodborne illness: is it on the rise?”, Nutrition Reviews, 68(5), pp 257 - 269 59 Odwar J A., Kikuvi G., Kariuki J N., Kariuki S (2014), “A cross-sectional study on the microbiological quality and safety of raw chicken meats sold in Nairobi, Kenya”, BMC Res Notes, 10, pp 507:627 60 Osman K M., Amer A M., Badr J M/, Saad A S (2015), “Prevalence and Antimicrobial Resistance Profile of Staphylococcus Species in Chicken and Beef Raw Meat in Egypt”, Foodborne Pathog Dis 61 Priyanka singh, Alka Prakash (2008), “Isolation of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes from milk products sold under market conditions at agra region”, Acta agriculturae Slovenica, (92), pp 83 - 88 62 Quinn P J., Carter M E., Markey B K., Carter G R (1994), Clinical Veterinary Microbiology Wolfe publishing Mosby-Year Book Europe Limited 63 Rodríguez-Lázaro D., Ariza-Miguel J., Diez-Valcarce M., Fernández-Natal I., Hernández M., Rovira J (2014), “Foods confiscated from non-EU flights as a neglected route of potential methicillin-resistant Staphylococcus aureus transmission”, Int J Food Microbiol, 0168 - 1605(14), pp 420 - 426 64 Schoder D., Strauß A., Szakmary-Brändle K., Stessl B., Schlager S., Wagner M (2014), “Prevalence of major foodborne pathogens in food confiscated from air passenger luggage”, International Journal of Food Microbiology, pp 401 - 402 70 65 Soomro A.H., Arain M.A., Khaskheli M., Bhutto B., Memon A.Q (2003), “Isolation of Staphylococcus aureus from milk products sold at sweet meat shops of Hyderabad” Online Journal of Biological Sciences, 3(2003)1, pp.91 - 94 66 Souillard R., Woudstra C., Le Maréchal C., Dia M., Bayon-Auboyer M H., Chemaly M., Fach P., Le Bouquin S (2014), “Investigation of Clostridium botulinum in commercial poultry farms in France between 2011 and 2013”, Avian Pathol, 43(5), pp 458 - 464 67 Syne S M., Ramsubhag A., Adesiyun A A (2013), “Microbiological hazard analysis of ready-to-eat meats processed at a food plant in Trinidad, West 68 Tewari A., Singh S P., Singh R (2015), “Incidence and enterotoxigenic profile of Bacillus cereus in meat and meat products of Uttarakhand, India”, J Food Sci Technol, 52(3), pp 1796 - 1801 69 Vally H., Glass K., Ford L., Hall G., Kirk M D., Shadbolt C., Veitch M., Fullerton K E., Musto J., Becker N (2014), “Proportion of Illness Acquired by Foodborne Transmission for Nine Enteric Pathogens in Australia: An Expert Elicitation”, Foodborne Pathogens and Disease 70 Yu T., Jiang X., Zhou Q., Wu J., Wu Z (2014), “Antimicrobial resistance, class integrons, and horizontal transfer in Salmonella isolated from retail food in Henan, China”, J Infect Dev Ctries, 8(6), pp 705 - 711 71 Wall and Aclark G D Roos, Lebaigue S., Douglas C (1998), Comprehensive outbreak survellence, The key to understanding the changing epidemiology of foodborne disease, pp 212 - 224 PHỤ LỤC TCVN 6187-2: 1996 (ISO 9308-2: 1990) Chất lượng nước - xác định - phát đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt Escherichia coli giả định Phương pháp nhiều ống (số có xác suất cao nhất) Nguyên tắc: Cấy phần mẫu thử pha lỗng khơng pha lỗng vào dãy ống nghiệm chứa mơi trường ni cấy chọn lọc dạng lỏng có lactoza Kiểm tra ống thử sau 24h 48h nuôi nhiệt độ 35°C 37°C; cấy chuyển tiếp từ ống có biểu đục kèm sinh khí vào ống môi trường khẳng định chọn lọc muốn tìm E coli giả định cấy vào mơi trường mà qua quan sát thấy tạo thành indol Nuôi môi trường khẳng định 48h nhiệt độ 35°C 37°C để xác định loại Coliform chịu nhiệt E coli giả định Bằng bảng thống kê, tính tốn số xác suất cao dạng Coliform, Coliform chịu nhiệt E coli giả định có 100ml mẫu thử từ số ống thử có kết xác nhận dương tính Ni cấy: Chuẩn bị mẫu thử, tiến hành pha lỗng mẫu cấy vào mơi trường phân lập phần mẫu thử theo ISO 8199 Cấy ủ mẫu vào môi trường Trypton Lauryl Sulfat (TLS): Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào dãy liên tiếp dãy chứa ống môi trường TLS Cấy 10ml mẫu thử vào ống dãy ống đầu tiên, 1ml mẫu thử vào ống dãy ống 0,1ml mẫu thử vào ống dãy ống cuối Nuôi cấy 37ºC, đếm số lượng ống TLS cho kết dương tính dãy sau 24h - 48h Để khẳng định Coliform: Cấy chuyển vòng que cấy từ ống TLS dương tính sang ống nghiệm chứa trường Brilliant Green Bile 2% broth (BGB), ủ 30ºC 24 h Để khẳng định E coli cần thực tiếp: Cấy chuyển ủ môi trường Escherichia coli broth (EC): Cấy chuyển vòng que cấy từ ống nghiệm TLS dương tính sang ống nghiệm đựng canh thang EC, ủ 44ºC 24h  2h Đếm số lượng ống EC cho kết dương tính dãy Các ống dương tính mơi trường EC cấy chuyển sang môi trường nước pepton không indol để kiểm tra sinh Indol Cấy ủ mơi trường nước pepton khơng Indol: Cấy vịng que cấy canh khuẩn từ ống nghiệm EC dương tính sang ống nghiệm đựng 5-10ml nước pepton khơng Indol, ủ 44ºC 24h  2h Sau kiểm tra sinh khí Indol Kiểm tra sinh Indol: Nhỏ 0,5 ml thuốc thử Kovac vào ống nghiệm chứa nước pepton không Indol ủ, trộn kỹ kiểm tra sau phút Nếu xuất vịng màu đỏ phía chứng tỏ có mặt E coli Ghi nhận số lượng ống nghiệm có E.coli dương tính độ pha lỗng mẫu Tính kết quả: Từ số lượng ống nghiệm có E.coli, Coliform dương tính độ pha lỗng mẫu, dùng bảng bảng thống kê ISO 8199, số có xác suất cao vi khuẩn Coliform E coli giả định Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí thịt theo TCVN 4884: 2005 Nguyên lý: Trên môi trường thạch PCA điều kiện hiếu khí 30ºC sau 24 - 72 h, vi sinh vật hiếu khí có khả phát triển hình thành khuẩn lạc riêng rẽ Do đó, đếm số khuẩn lạc mơi trường Plate Count Agar để xác định số lượng vi sinh vật có chứa 1gam mẫu phân tích biểu diễn dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU đơn vị khối lượng thực phẩm Cách tiến hành: Dùng phương pháp đổ đĩa Với mẫu xét nghiệm phải ni cấy độ pha loãng liên tiếp, độ pha loãng cấy đĩa petri vô trùng Dùng pipet vô trùng chuyển ml dung dịch mẫu độ pha lỗng tương ứng vào đĩa petri trống vơ trùng Rót vào đĩa khoảng 15 ml mơi trường Plate Count Agar (PCA) đun tan chảy làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47oC Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ lắc sang trái phải cách nhẹ nhàng mẫu tan vào môi trường Đặt đĩa mặt phẳng ngang để thạch đông tự nhiên nhiệt độ phòng, lật úp đĩa đặt vào tủ ấm 30oC ni ấm đến 72 h Tính kết quả: Chọn tất đĩa có khuẩn lạc mọc riêng rẽ có số khuẩn lạc nằm khoảng từ 15 đến 300 khuẩn lạc/đĩa để đếm Độ pha loãng cao số khuẩn lạc phân bố khuẩn lạc đĩa nuôi cấy phải hợp lý Nếu kết khơng hợp lý phải tiến hành bước nuôi cấy lại Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g mẫu tính theo cơng thức: Trong đó: X: Tổng số vi sinh vật hiếu khí 1g thịt (CFU/g) C: Tổng số khuẩn lạc đếm đĩa độ pha loãng liên tiếp n1: Là số đĩa độ pha loãng thứ đếm n2: Là số đĩa độ pha loãng thứ đếm d: Hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ đếm - Nếu đĩa độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15-30, tính số khuẩn lạc độ pha loãng kết trung bình số học giá trị thu - Nếu đĩa nuôi cấy ứng với độ pha lỗng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì: - Nếu đĩa ni cấy độ pha lỗng 10-1 khơng có khuẩn lạc thì: Với: m trung bình số khuẩn lạc đĩa d độ pha loãng huyễn dịch ban đầu, d = 10-1 Cách biểu thị kết quả: Số thập phân từ 1.00 đến 9.99 nhân với số mũ tương ứng, ví dụ 1,56×104CFU/g Xác định E coli thịt theo TCVN 7924-2: 2008 Nguyên lý: E coli dương tính - glucuronidaza Vi khuẩn nhiệt độ 44°C hình thành khuẩn lạc màu xanh điển hình mơi trường Tryptone Bile X-glucuronide (TBX) Dựa vào đặc tính ta phát định lượng vi khuẩn E coli Cách tiến hành: Cấy độ pha lỗng 10-1; 10-2; 10-3, độ pha lỗng ni cấy đĩa môi trường Dùng pipet vô trùng chuyển ml dung dịch mẫu độ pha lỗng tương ứng vào đĩa petri vơ trùng Rót vào đĩa khoảng 15 ml mơi trường TBX đun tan chảy làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47°C Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ lắc sang hai bên mẫu tan vào môi trường, để đông tự nhiên nhiệt độ phòng mặt phẳng nằm ngang Lật ngược đĩa, cần ủ ấm đĩa 37°C/4h sau chuyển sang ủ ấm 44°C/18 - 24h Tính kết quả: Chọn đĩa có chứa 150 khuẩn lạc điển hình E coli dương tính glucuronidaza 300 khuẩn lạc tổng số đĩa thạch Số lượng khuẩn lạc E coli 1g mẫu thử tính theo cơng thức: Trong đó: N: Số khuẩn lạc E coli 1g thịt (CFU/g ); a: Là tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa giữ lại sau độ pha lỗng liên tiếp, có đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh; n1: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ nhất; n2: Số đĩa giữ lại độ pha loãng thứ hai; V: Thể tích mẫu cấy dùng đĩa, tính ml; d: Hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha loãng thứ giữ lại (d = trường hợp mẫu dạng lỏng mẫu thử cấy trực tiếp) Nếu đĩa chứa 10 khuẩn lạc, có khuẩn lạc, tính kết theo trường hợp chung báo cáo kết số ước tính nhân với VSV 1ml 1g sản phẩm Nếu tổng số khuẩn lạc từ đến 1, độ chụm kết thấp kết phải ghi sau: “Có mặt vi sinh vật nhỏ (4 × d) 1g 1ml Trong trường hợp nồng độ khơng có khuẩn lạc đặc trưng mọc lên tổng số E coli biểu thị kết sau: “ít 1/d vi sinh vật 1ml (sản phẩm dạng lỏng)” “ 1/d vi sinh vật gam (sản phẩm dạng khác) Với d hệ số pha loãng mẫu huyền phù ban đầu độ pha loãng thứ cấy giữ lại Định tính vi khuẩn Salmonella thịt theo TCVN 4829: 2005 Nguyên lý: Quá trình phát Salmonella thực phẩm cần qua giai đoạn nhau: (1) Tăng sinh sơ mẫu đồng để đảm bảo phát lượng nhỏ Salmonella bị suy giảm hoạt tính → (2) Tăng sinh chọn lọc môi trường lỏng → (3) Phân lập nhằm tách nhận dạng Salmonella khỏi quần thể vi sinh vật khác mẫu → (4) Khẳng định đặc tính sinh hóa, huyết học Một số môi trường đặc đổ đĩa sử dụng để phân lập Salmonella như: thạch XLD, HE, Mỗi mơi trường giúp nhận dạng lồi thuộc giống dựa đặc tính sinh hố đặc trưng tương ứng Cách tiến hành: Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình cắt nhỏ vào túi PE vơ trùng chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng máy dập mẫu Stomacher tốc độ 260 vịng/phút phút thu huyễn dịch có nồng độ 101 Ủ huyễn dịch mẫu đồng độ pha loãng 10-1 tủ ấm 37°C/18±2h Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann (MKTTn) Chuyển 0,1 ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS, ủ 41,5°C/24h Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h Phân lập môi trường đặc chọn lọc nhận dạng: Sau ủ, sử dụng dịch tăng sinh chọn lọc ria cấy lên bề mặt thạch đĩa Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD) Hektoen enteric agar (HE) Lật úp đĩa đặt tủ ấm 37°C/24h Khẳng định: Nếu mơi trường XLD hình thành khuẩn lạc màu hồng, trung tâm khuẩn lạc màu đen nghi Salmonella Nếu mơi trường HE hình thành khuẩn lạc màu đen nghi Salmonella Đánh dấu khuẩn lạc Salmonella nghi đĩa Ria cấy khuẩn lạc điển hình lên bề mặt đĩa thạch máu Ủ ấm 37°C/24h để thu khuẩn lạc Các khuẩn lạc dùng để để khẳng định tính chất sinh vật hoá học hệ thống VITEK compact làm phản ứng huyết học (HTH) với kháng huyết O, H đa giá Tiến hành làm phản ứng HTH với kháng huyết (KHT) đa giá O kháng huyết đa giá H (Phản ứng ngưng kết phiến kính) Trước làm phản ứng HTH cần kiểm tra khả tự ngưng kết vi khuẩn Nếu phản ứng tự ngưng kết âm tính ta tiếp tục tiến hành phản ứng ngưng kết với KHT O, H, Vi Nếu phản ứng HTH dương tính (có tượng ngưng kết) kết luận có diện vi khuẩn Salmonella mẫu thử Xác định Staphylococcus aureus thịt theo TCVN 4830-1: 2005 Nguyên lý: Vi khuẩn Staphylococci phát triển tốt môi trường Baird Parker Agar Base có bổ sung Egg-Yolk Tellurite Emulsion (BP) tạo khuẩn lạc màu đen, trịn, lồi, bờ đều, bóng có vịng suốt xung quanh chuyển hóa muối telorite de potassium dung giải protein lịng đỏ trứng Qua đếm số lượng vi khuẩn dựa số khuẩn lạc mọc môi trường nuôi cấy Việc khẳng định vi khuẩn Staphylococci (S aureus loài khác) dựa phản ứng đông huyết tương thỏ (coagulase) Cách tiến hành: Phân lập (cấy láng bề mặt thạch) Sử dụng đĩa môi trường BP để nuôi cấy đậm độ pha loãng 10-1; 10-2; 103 , độ pha lỗng ni cấy đĩa mơi trường Hút 0,1ml dung dịch mẫu độ pha loãng khác lên bề mặt đĩa thạch Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy bề mặt đĩa thạch, để khô 15 phút nhiệt độ phòng Lật ngược đĩa ủ 37oC/24h, đếm số lượng khuẩn lạc điển hình đĩa thạch, đánh dấu vị trí khuẩn lạc điển hình Ủ tiếp 37oC/24h, sau ủ đánh dấu vị trí khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình Phép thử coagulase: Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 15 đến 300 khuẩn lạc Từ đĩa chọn khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình (nếu có loại khuẩn lạc) khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình (nếu chứa loại khuẩn lạc) Từ khuẩn lạc chọn dùng que cấy vô trùng lấy phần chuyển vào môi trường Brain Heart Infusion (BHI), đem ủ 37°C/24h Sau ủ lấy 0,1ml dịch cấy vô trùng cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ, ủ 37°C, sau - 6h kiểm tra đông huyết tương Nếu phản ứng âm tính, kiểm tra lại sau ủ 24h Phản ứng dương tính thể tích kết dính chiếm nửa thể tích ban đầu chất lỏng Lấy khuẩn lạc điển hình có phản ứng catalase (+), coagulase (+) cấy môi trường thạch máu để thu khuẩn lạc Tính kết quả: Tính số lượng vi khuẩn S aureus/gam sản phẩm sau: - Đối với đĩa có chứa tối đa 300 khuẩn lạc, có 150 khuẩn lạc điển hình và/hoặc khơng điển hình, đĩa thạch chọn độ pha lỗng liên tiếp số lượng vi khuẩn S aureus tính theo cơng thức: Trong đó: a: Số lượng vi khuẩn S aureus nồng độ pha loãng liên tiếp chọn; Ac: số lượng khuẩn lạc điển hình qua phép thử coagulase; Anc: số lượng khuẩn lạc khơng điển hình qua phép thử coagulase; bc: số lượng khuẩn lạc điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; bnc: số khuẩn lạc khơng điển hình cho thấy có phản ứng dương tính với coagulase; cc: tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy đĩa; cnc: tổng số khuẩn lạc khơng điển hình nhìn thấy đĩa Số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus/1g sản phẩm tính theo cơng thức: Trong đó: ∑a: tổng số khuẩn lạc có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết tất đĩa chọn; V: thể tích chất cấy đĩa, tính mililit; n1: số đĩa chọn độ pha loãng thứ nhất; n2: số đĩa chọn độ pha loãng thứ 2; d: độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ chọn - Nếu hai đĩa tương ứng với mẫu thử huyền phù ban đầu, đĩa 15 khuẩn lạc kết tính sau: Trong đó: ∑a: Tổng số khuẩn lạc Staphylococcus có phản ứng dương tính với coagulase nhận biết hai đĩa chọn; d: Hệ số pha loãng huyền phù ban đầu; V: Thể tích cấy đĩa Nếu hai đĩa, tương ứng với mẫu thử huyền phù ban đầu khơng chứa khuẩn lạc Staphylocuccus có phản ứng dương tính với coagulase báo cáo kết sau: “ Ít 1/d Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase gam sản phẩm, d hệ số pha loãng huyền phù ban đầu” Xác định Coliforms tổng số thịt theo TCVN 6848: 2007 Nguyên tắc: Cấy lượng mẫu thử xác định (mẫu lỏng) với lượng xác định huyền phù ban đầu (mẫu khác) lên cặp đĩa petri trống vô trùng Đổ khoảng 12-15ml môi trường VRBL (Violet Red Bile lactoza) vào trung tâm đĩa Lắc xoay cho vi khuẩn phân tán lòng thạch Sử dụng dung dịch pha loãng thập phân cần thiết (10-1, 10-2, 10-3) Ủ đĩa 30oC/24h Đếm khuẩn lạc đặc trưng, cần khuẩn lạc khẳng định lên men lactoza Xử lý sơ pha loãng mẫu Đồng mẫu cách cân xác 25 g 10 g mẫu thử đặc (hoặc 25 ml 10 ml mẫu thử lỏng) túi đập mẫu vô trùng Bổ sung 225 ml 90 ml nước đệm pepton vô trùng để thu lượng dịch mẫu pha loãng ban đầu 10-1 Đập mẫu máy Stomacher, dung dịch thu gọi dung dịch mẫu Dùng pipet vô trùng chuyển 1ml mẫu thử (dạng lỏng) huyền phù ban đầu (10-1) dạng khác vào cặp đĩa Petri vô trùng Tiến hành tương tự với nồng độ pha loãng Đổ đĩa: Rót vào đĩa khoảng 15 ml thạch VRBL trước đun tan chảy làm nguội đến 44 - 47oC nồi cách thủy Trộn thạch mẫu thử cách quay sang trái phải chiều vòng cho vi khuẩn phân tán thạch Để đông tự nhiên mặt phẳng nằm ngang Chuẩn bị đồng thời đĩa để kiểm tra vô trùng Sau đông đặc hồn tồn, rót khoảng ml loại mơi trường lên bề mặt đĩa Để đông tự nhiên Lật ngược đĩa, để vào tủ ấm 30oC/24 ± 2h Đọc kết quả: Đếm khuẩn lạc điển hình mơi trường VRBL, tính kết số khuẩn lạc Coliform/g ml sản phẩm.(khuẩn lạc có màu đỏ ánh tía có ĐK 0.5mm lớn hơn, đơi có vùng mật tủa đỏ bao quanh) Với khuẩn lạc khơng điển hình, cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa canh thang mật lactoza lục sáng Ủ ống 30oC/24h Các ống Durham cho thấy sinh khí coi có chứa Coliform Tính kết từ khuẩn lạc điển hình mơi trường VRBL theo công thức sau: C: số khuẩn lạc điển hình đếm đĩa; n1, n2: số đĩa nồng độ pha loãng 1, 2; d: hệ số pha loãng thứ chọn; N: số khuẩn lạc g ml mẫu thử biếu thị kết dạng thập phân 1,0 9,9 nhân với 10x số mũ thích hợp 10 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG Q TRÌNH NGHIÊN CỨU Ảnh Khu vực giết mổ lợn không đảm bảo điều kiện vệ sinh Ảnh Thân thịt lợn sau giết mổ để sàn nhà Ảnh Khu giết mổ hẹp, lợn giết mổ sàn nhà Ảnh Khu vực giết mổ gia đình 11 Ảnh 5, Các mơi trường thạch đặc hiệu Ảnh Môi trường thạch TSA Ảnh Mơi trường Bair-Paker 12 Ảnh 9, 10 Pha lỗng độ đậm mẫu Ảnh 11, 12 Xác định vi khuẩn S aureus có thịt Ảnh 13 Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương kính hiển vi