Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn escherichia coli trên thịt lợn bán tại thành phố thái nguyên

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐỖ BÍCH DUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TRÊN THỊT LỢN BÁN TẠI THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, đời sống xã hội ngày nâng cao, chất lƣợng sống ngày cải thiện, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm trở thành vấn đề đƣợc quan tâm ngành, cấp toàn thể ngƣời tiêu dùng Thực phẩm phải đảm bảo tiêu chuẩn: tƣơi, sạch, giàu dinh dƣỡng an toàn cho ngƣời sử dụng Trong đó, thịt tƣơi loại thực phẩm thông dụng thực đơn hàng ngày gia đình Tuy nhiên, trình vận chuyển, tiêu thụ ngƣời thƣờng quan tâm tới lợi nhuận trƣớc mắt mà sẵn sàng bỏ qua quy chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP), nguồn thực phẩm tƣơi sống nói chung, nguồn thịt nói riêng bị ô nhiễm ngày lớn đe dọa sức khỏe ngƣời Thực phẩm ô nhiễm nhiều nguyên nhân, chủ yếu vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli thực phẩm trở thành đề tài nghiên cứu nhiều tác giả năm gần E coli gây bệnh nhiều yếu tố khác nhƣ nhiễm trùng huyết, sinh tổng hợp độc tố gây ngộ độc thực phẩm (NĐTP), rối loạn tiêu hóa hấp thu Nếu bệnh xảy khơng đƣợc điều trị kịp thời dẫn đến tử vong Điều đáng ngại hơn, ngƣời ta lo ngại nguy biến chủng loài vi khuẩn Nếu khơng đƣợc kiểm sốt xử lý kịp thời, gây ngộ độc hàng loạt nhƣ Đức số nƣớc Châu Âu thời gian vừa qua Với vị trí địa lý trung tâm vùng khu vực trung du miền núi phía bắc, thành phố Thái Ngun có nhiều quan, xí nghiệp, nhà máy, cơng ty đặc biệt có nhiều trƣờng Đại học, Cao đẳng nằm địa bàn nên nhu cầu tiêu thụ thực phẩm thịt lợn lớn Mặt khác, việc giết mổ lợn bán thịt chủ yếu tƣ nhân thực hiện, phƣơng tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chƣa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y cán kiểm dịch cịn gặp nhiều khó khăn, dừng lại mức độ kiểm tra cảm quan thịt đƣợc bày bán chợ Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Escherichia coli thịt lợn bán thành phố Thái Nguyên” Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá tình trạng nhiễm E coli thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu số đặc điểm sinh học, hóa học đặc điểm di truyền phân tử số chủng E coli phân lập đƣợc, xác định gen gây ngộ độc thực phẩm, từ có biện pháp hạn chế, giảm thiểu thiệt hại cho ngƣời dân Nội dung nghiên cứu - Lấy mẫu phân lập vi khuẩn E coli gram thịt lợn tƣơi - Tìm hiểu đặc điểm sinh hóa, khả mẫn cảm kháng sinh, type huyết chủng vi khuẩn E coli phân lập đƣợc Tìm gen gây ngộ độc thực phẩm (VT1; VT2 ) kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR, polymerase chain reaction) - Nghiên cứu đặc điểm di truyền việc đọc trình tự gen mã hóa riboxom 16S + Ni cấy chủng vi khuẩn phân lập + Tách chiết DNA tổng số, nhân đoạn gen mã hóa riboxom 16S kỹ thuật PCR, thiết kế plasmid tái tổ hợp, tạo tế bào E coli DH 5α khả biến, biến nạp plasmid vào E coli DH 5α, tách tinh plasmid + Đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT 1.1.1 Đặc tính chung thịt Thịt loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng dễ tiêu hóa, cung cấp nhiều loại axit amin không thay thế, cần thiết cho hoạt động sống thể, giúp ngƣời phát triển tốt thể lực Thịt loại thực phẩm giàu khoáng chất, đặc biệt khoáng chất dễ hấp thu [23] Thịt tƣơi thịt chƣa bị biến chất q trình tự phân hủy, chƣa có thay đổi cảm quan độc chất có hại 1.1.2 Thành phần hóa học thịt Thành phần hóa học thịt khác nhau, phụ thuộc vào yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy điều kiện chăm sóc, ni dƣỡng Nhƣng nhìn chung thành phần hóa học thịt bao gồm: + Nƣớc : 50 - 75% + Protein : 14 - 21% + Lipit : 3,5 - 21,5 % + pH thịt tƣơi thơng thƣờng mức - 6,5% Ngồi thành phần thớ thịt cịn có khoáng chất, loại vitamin, loại men chất dinh dƣỡng khác cần thiết cho ngƣời Đánh giá cảm quan thịt tƣơi theo phƣơng pháp Nguyễn Vĩnh Phƣớc [13] trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y Trung ƣơng I - Cục thú y [19] đƣa số đánh giá cảm quan thơng qua bảng 1.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 Đánh giá cảm quan thịt Chỉ tiêu Trạng thái bên ngồi Vết cắt Thịt tƣơi Hơi khơ, màu nhạt Hơi ƣớt, màu hồng Rắn chắc, đàn hồi cao, ấn ngón tay vào Độ đàn hồi thịt tạo vết lõm, nhấc tay không để lại vết Mỡ Gân Tuỷ Nƣớc luộc Thịt tƣơi, thịt Khơ, có ƣớt nhớt, màu sẫm Ƣớt nhớt, màu thẫm Hơi nhão, nhão, ấn ngón tay vào để lại vết nhẹ (thịt tƣơi), vết hằn sâu, không (thịt ôi) Màu sáng, độ rắn mùi vị tự nhiên Màu tối, độ rắn giảm, có vị thịt tƣơi, khơng có mùi lạ Gân trong, bám chặt vào thành ống Kém trong, độ đàn hồi xƣơng Tuỷ trong, bám chặt vào thành ống Đục, co lại, không đầy ống xƣơng xƣơng Trong, mùi vị thơm ngon, mặt có Đục, mùi vị ơi, bề mặt giọt mỡ to có giọt mỡ nhỏ Theo phƣơng pháp sinh hóa học, thịt tƣơi đƣợc đánh giá phản ứng sinh hóa học dựa theo tiêu chuẩn nhƣ bảng 1.2 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi phản ứng sinh hóa học Tiêu chuẩn Thịt tƣơi Thịt tƣơi Thịt ôi pH nƣớc thịt ngâm 5,4 - 6,4 6,5 - 6,7 > 6,7 Hàm lƣợng NH3 (mg) < 1,26 1,27 - 1,68 > 1,68 Phản ứng CuSO4 làm sa Nƣớc thịt Nƣớc thịt vẩn đục Nƣớc thịt đục có lắng protein đục có hạt cặn sánh nhƣ keo Nƣớc thịt ngâm, Nƣớc thịt ngâm, Phản ứng tìm peroxydaza (thử benzidin) lọc có màu xanh lọc khơng có mạ, sau phút lâu có màu chuyển màu nâu xanh mạ Nƣớc thịt ngâm, lọc không biến đổi màu sắc Nƣớc thịt ngâm, Nƣớc thịt ngâm, lọc có màu vàng lọc có màu vàng nhạt vỏ chanh Giấy lọc giữ Giấy lọc có màu Giấy lọc có màu nguyên màu nâu nhạt nâu sẫm đen Phản ứng Nestler tìm Nƣớc thịt ngâm, NH3 lọc khơng màu Phản ứng tìm H2S (dùng axetat chì) 1.1.3 Các nguyên nhân gây hƣ hỏng thịt * Quá trình tự phân giải thịt Trong mơ bào có chứa loại enzym, chúng sản phẩm trình sống, giúp cho phản ứng hóa học mơ bào diễn nhanh hay chậm [31] Thịt q trình bảo quản bị biến chất hƣ hỏng Sau giết mổ, thịt chƣa bị biến chất Nhƣng nếu, thịt để lâu chƣa kịp tiêu thụ cất giữ dùng dần điều kiện khơng thích hợp bị biến chất enzyme có sẵn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thịt vi sinh vật tạp nhiễm dẫn đến ôi, thiu, hỏng trạng thái cảm quan, hình thành độc chất có hại Những tƣợng hƣ hỏng thịt thƣờng gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có chấm màu bề mặt thịt, thịt mốc [10] * Vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt Mặc dù nhiều biện pháp vệ sinh kỹ thuật chống nhiễm khuẩn đƣợc áp dụng vật trƣớc giết mổ trình giết mổ, nhƣng tƣợng nhiễm khuẩn vào thân thịt xảy [26] Vi khuẩn nhiễm vào thịt gồm có số loài vi khuẩn gây hƣ hỏng thịt nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời [46] - Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt tươi Dựa vào khả phân hủy thịt vi khuẩn ngƣời ta chia chúng theo nhóm [35] + Nhóm Proteolytic có men phân giải protein thành chất đơn giản cần thiết cho hoạt động sống chúng, đại diện vi khuẩn Pseudomonas + Nhóm vi khuẩn có khả lên men đƣờng phân hủy glucogen dự trữ thành rƣợu, axit + Nhóm vi khuẩn có enzym phân giải lipit phân hủy mỡ thành axit béo glycerol Dựa vào khả làm thay đổi đặc tính sinh học thịt ngƣời ta chia loại vi khuẩn gây hƣ hỏng theo nhóm sau [27]: + Nhóm vi khuẩn làm độ tƣơi thịt: gồm có vi khuẩn thuộc họ Alcaligenes, Chromobacteriaceae loài vi khuẩn Proteus vulgaris Pseudomonas fluorescens + Nhóm làm chua thịt: gồm có vi khuẩn thuộc họ Chromobacteriaceae, vi khuẩn Pseudomonadaceae + Nhóm làm nhớt mặt thịt: vi khuẩn Alcaligenes, Xanthomonas + Nhóm gây mùi khó ngửi thịt với điển hình Pseudomonas Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Một số vi khuẩn gây hư hỏng thịt bảo quản lạnh Nhiều lồi vi khuẩn khơng phát triển nhiệt độ thấp, nhƣng sống sót trình bảo quản lạnh Theo Bell Gill (1986) [28] tìm thấy số lồi giống Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Lactobacillus, Brochothrix, Alteromonas thành viên họ Enterobacteriaceae thịt bảo quản lạnh Nói chung, vi khuẩn dạng sinh dƣỡng tăng lên suốt thời gian bảo quản lạnh [47] Một số vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời phát triển thịt bảo quản lạnh với tốc độ chậm Số lƣợng ban đầu, chủng loại vi khuẩn gây hƣ hại thịt tốc độ sinh trƣởng chúng định thời gian bảo quản thịt [40] Tuy nhiên thịt bảo quản lạnh có vi sinh vật ƣa lạnh nhƣ: Nhóm Pseudomonas, Achrmobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Aerobacterium số loại cầu khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas nhƣ Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluoresceus, Pseudomonas geniculata, ngồi cịn có nấm men, nấm mốc phát triển Thịt có mùi đất xạ khuẩn mọc Thịt muối tồn vi sinh vật ƣa mặn làm hỏng thịt [10] 1.2 VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 1.2.1 Ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) trúng độc thức ăn xảy ăn phải thức ăn chứa chất độc Bệnh thƣờng xảy cách đột ngột, hàng loạt (nhƣng khơng phải dịch), có triệu chứng bệnh cấp tính Biểu bệnh thƣờng nôn mửa, tiêu chảy (riêng trƣờng hợp nhiễm độc tố vi khuẩn độc thịt bị táo bón) triệu chứng khác đặc hiệu cho loại ngộ độc [1] 1.2.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Thực phẩm có nguồn gốc động vật thực vật nguồn thực phẩm thiết yếu ngƣời Việc lựa chọn thực phẩm cách chế biến thực phẩm phù hợp khoa học đem lại cho ngƣời nguồn dinh dƣỡng quan trọng đảm bảo sức khỏe chất Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lƣợng dân số Tuy nhiên, việc đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho ngƣời nguồn thực phẩm chất lƣợng gây nguy hại đến sức khỏe ngƣời Ngộ độc thực phẩm xảy dùng phải thức ăn, thức uống nhiễm bẩn, bảo quản không cách bị nhiễm trùng, virus, ký sinh trùng, nấm mốc hay hóa chất độc hại Ở nƣớc ta năm gần ca NĐTP có chiều hƣớng gia tăng mà nguyên nhân nguồn thực phẩm hay nƣớc uống bị ô nhiễm Các thực phẩm có nguồn gốc động vật có xu hƣớng dễ bị nhiễm khuẩn Nhiễm độc thực phẩm chia làm hai loại: Loại 1, nhiễm độc hóa chất; loại 2, nhiễm độc vi sinh vật gây bệnh Hóa chất độc bao gồm hóa chất sử dụng công nghiệp nông nghiệp Trong sản xuất nông nghiệp nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật độc hại đƣợc sử dụng, đặc biệt nhóm clo hữu nhƣ diclo-diphenyl-tricloetan (DDT), dipteren, lindane, padane… Các hóa chất phần ngấm xuống mạch nƣớc ngầm, phân tán vào mơi trƣờng khơng khí, tồn dƣ sản phẩm nông sản, động vật ăn phải sản phẩm này, tiếp đến ngƣời sử dụng thực phẩm động vật nhiễm hóa chất, rau nhiễm hóa chất, làm gia tăng bệnh rối loạn chuyển hóa, bệnh hiểm nghèo Ngộ độc thực phẩm gây thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật độc tố vi sinh vật tạo Vấn đề NĐTP mối lo ngại đƣợc quan tâm xử lí hầu hết quốc gia giới, chí quốc gia phát triển nhƣ Mỹ (Hoa Kỳ), Anh, Nhật Bản, Trung Quốc… ngoại lệ [1] 1.2.3 Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không gây bệnh cho ngƣời sử dụng nhƣng trình trao đổi chất sản sinh yếu tố gây hại [14], [45] Một số vi sinh vật nhiễm thực phẩm gây ngộ độc, chia làm dạng: i) Ngộ độc thực phẩm xảy trƣờng hợp thức ăn nhiễm vi khuẩn tổng hợp ngoại độc tố nhƣ S aureus, C botulinum, B cereus… Các vi khuẩn sinh trƣởng phát triển thức ăn giải phóng lƣợng độc tố gây ngộ độc cấp tính cho ngƣời ăn thực phẩm bị nhiễm loại vi khuẩn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 ii) Ngộ độc thực phẩm gây số vi khuẩn nhƣ: Listeria, Salmonella, E coli, Shigella, Campylobacter nhiễm thực phẩm, xâm nhập vào thể chúng gây nên triệu chứng ngộ độc mà làm tổn thƣơng nghiêm trọng quan nội tạng * Tổng số vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện Sự phát số lƣợng lớn vi khuẩn thịt, điều chứng tỏ việc giết mổ gia súc gia cầm sở với điều kiện vệ sinh Việc xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí thực phẩm đƣợc sử dụng nhƣ yếu tố đánh dấu (maker) điều kiện vệ sinh, nhiệt độ bảo quản trình sản xuất, vận chuyển thực phẩm Đây phƣơng pháp tốt để đánh giá sơ tình trạng vệ sinh thực phẩm [29] Số lƣợng vi khuẩn hiếu khí yếm khí tùy tiện thịt thay đổi theo thời gian điều kiện bảo quản Hệ vi khuẩn hiếu khí thịt đƣợc chia làm nhóm, dựa vào nhiệt độ thích hợp để chúng phát triển đƣợc Nhìn chung vi khuẩn gây hƣ hỏng thực phẩm phát triển đƣợc từ 12oC đến 42oC Tuy nhiên, số chủng đột biến phát triển ngồi khoảng nhiệt độ Trong bảo quản thực phẩm khoảng nhiệt độ vi khuẩn phát triển đƣợc gọi vùng nhiệt độ nguy hiểm * Coliforms Coliforms vi khuẩn hiếu khí kỵ khí khơng bắt buộc, lên men đƣờng lactose môi trƣờng canh thang lactose (màu mật bò xanh dƣơng) vòng 48 35oC Các Coliforms có nguồn gốc từ rác thải hữu thực vật động vật [36] Sự có mặt thành viên thuộc nhóm Coliforms thực phẩm phản ánh tình trạng vệ sinh thực phẩm, chúng khả có mặt yếu tố gây bệnh khác ẩn thực phẩm Một số nhà nghiên cứu cho mẫu thực phẩm nhiễm Coliforms với số lƣợng lớn khả có mặt vi khuẩn gây bệnh lớn Yếu tố điểm có liên quan tới tác nhân gây bệnh hay khơng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số Giếng – 4: DNA tổng số chủng G82, G85, G897 G5 3.7.2 Kết nhân gen mã hóa riboxom 16S PCR Thực phản ứng PCR khuyếch đại gen mã hóa riboxom 16S từ DNA tổng số chủng vi khuẩn G82, G85, G897 G5 cặp mồi đặc hiệu 27F/1492R 9F/296R Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8 % Kích thƣớc đoạn DNA thu đƣợc sau phản ứng PCR đƣợc so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Kết cho thấy hình 3.3.A, phản ứng PCR cho băng DNA giếng 4, kích thƣớc khoảng 1,0 kb tƣơng đƣơng đoạn gen mã hóa riboxom16S Hình 3.3 B, thu đƣợc băng DNA kích thƣớc 1,5 kb Sản phẩm PCR đƣợc sử dụng để gắn vào vector tách dòng PJET1.2 tạo plasmid tái tổ hợp (Hình 3.3) A Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ gen mã hóa riboxom 16S A Giếng 4: G897, Giếng 5: G85, M: maker B Giếng 1: G82, Giếng 2: G5, M: maker Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 3.7.3 Kết tách dòng gen mã hóa riboxom 16S Plasmid tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α, sản phẩm đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 0,8 % Kết đƣợc thể nhƣ hình 3.4 Giếng số 4, số 5: vector gắn đƣợc plasmid Giếng đối chứng: vector không gắn đƣợc plasmid Chọn sản phẩm giếng số 4, số đem tách plasmid cắt nhờ enzyme giới hạn XhoI XbaI Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid Kết đƣợc thể hình 3.5, Khuẩn lạc giếng số có băng kích thƣớc khoảng 1,5kb, khuẩn lạc giếng số có băng kích thƣớc khoảng 1,3kb.Chọn khuẩn lạc giếng số để tinh Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm plasmid mang gen mã hóa riboxom 16S Giếng 4, 5: plasmid mang gen, Giếng (ĐC): plasmid khơng mang gen Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI 3.7.4 Kết xác định trình tự gen mã hóa riboxom 16S Sau tinh plasmid tái tổ hợp, đoạn DNA chèn vào plasmid đƣợc giải trình tự nucleotide theo nguyên lý phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa dideoxy DNA polymerase xúc tác gắn dideoxynucleotide vào đầu 3'-OH mạch đơn DNA tổng hợp, trình tổng hợp dừng lại gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang khơng có nhóm 3'-OH Kết hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm polynucleotide có kích thƣớc nucleotide đƣợc phát mẫu dò huỳnh quang máy đọc trình tự tự động ABI Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Vector pJET1.2 đƣợc gắn hai trình tự mồi xi mồi ngƣợc M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai Kết đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý phần mềm DNA Star để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền xây dựng phân loại Phân loại chủng vi khuẩn phân lập Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mong muốn đƣợc tách tinh kit QIAGEN để đọc trình tự nucleotide Đoạn gen mã hóa riboxom 16S chủng vi khuẩn phân lập đƣợc xác định trình tự nucleotide máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Sau phân tích xử lý số liệu, nhận đƣợc đoạn gen chủng G82 dài 1,5 kb, chủng G897 dài 1,0 kb Trình tự đoạn gen đƣợc so sánh với trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S chủng E coli công bố GenBank phần mềm DNAstar Kết cho thấy chủng vi khuẩn phân lập G82 có quan hệ họ hàng gần gũi với số đại diện thuộc chi Escherichia Trong đó, có độ tƣơng đồng 98,1% với chủng 4GAQ: E coli K12 JX290090.1: E coli KVP 110 Chủng vi khuẩn phân lập lại G897 có mức tƣơng đồng 100% so với chủng JX267124.1: E coli 112 4GAQ: E coli K12 (Hình 3.6.) Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại G82: E coli phân lập, JX290090.1: E coli KVP 110, 4GAQ: E coli K12, JX267124.1: E coli 112, G897: E coli phân lập, CP003301.1: E coli O104: H4; Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong số 86 mẫu thịt nghiên cứu có 68,6 % mẫu nhiễm E coli, số mẫu không đạt tiêu chuẩn chiếm 38,4 % Mức độ nhiễm trung bình dao động từ 73 CFU/g đến 5,7x102 CFU/g Các chủng E coli phân lập mẫn cảm cao với kháng sinh Amikacin (95%) Trong số 30 chủng vi khuẩn E coli phân lập, đƣợc xác định type huyết kháng nguyên O cho thấy: Có chủng thuộc nhóm O26 số type huyết đƣợc xác định gây bệnh ngộ độc chứng ngộ độc thực phẩm ngƣời Sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để tìm gen VT1 VT2 gây ngộ độc thực phẩm chủng E coli phân lập nhƣng không cho kết dƣơng tính Hai chủng vi khuẩn phân lập G82, G897 đƣợc định tên việc giải trình tự đoạn gen mã hóa riboxom16S thấy rằng: Chủng G82 có quan hệ gần gũi với chủng 4GAQ: E coli K12 JX290090.1: E coli KVP 110, với độ tƣơng đồng 98,1% Chủng G897 có mức tƣơng đồng 100% so với chủng JX267124.1: E coli 112 4GAQ: E coli K12 KIẾN NGHỊ Cần tiến hành nghiên cứu thêm E coli ( tìm thêm gen có nguy gây ngộ độc khác nhƣ ST1, ST2 phân lập xác định có mặt E coli O157:H7 khu vực Thái Nguyên) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC ẢNH Hình Hình ảnh E coli phản ứng lên men đƣờng mơi trƣờng TSI Hình Hình ảnh E coli phản ứng sinh Indol Hình Hình ảnh khuẩn lạc E coli sau Hình Hình ảnh khuẩn lạc E coli ria cấy phƣơng pháp định lƣợng Hình Hình ảnh khoanh giấy kháng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 6: Hình thái tính chất bắt màu http://www.lrc-tnu.edu.vn khuyếch tán môi trƣờng E Coli PHỤ LỤC Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử - Dịch pha loãng (nƣớc muối sinh lý 8,5%): Nacl 8,5g Nƣớc cất 1000ml - Môi trường nuôi cấy + Môi trường thạch Macconkey Peptone 20g Lactose 10g Bile Salts #3 (Hỗn hợp muối mật) 1,5g Sodium chloride 5g Neutral red 0,030g Crystal violet 0,001g Agar 15g + Nước thịt Nutrient broth Meat peptone 5g Meat extract 3g Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn +Thuốc thử: Thuốc thƣ̉ Kovac để thƣ̉ indol Cồn Isoamyl 150ml Paradimethylamino bensaldehyt 10g HCL đặc 50ml Pha chế : Hòa aldehyt cồn , sau đó cho tƣ̀ tƣ̀ axit vào Thuốc thƣ̉ này cần giƣ̃ tủ lạnh, tránh ánh sáng - Thạch TSI Meat extract 3,0 g Yeast extract 3,0 g Peptone Sodium chloride 20,0 g 5,0 g Lactose 10,0 g Sucrose 10,0 g Glucose 1,0 g Ferri citrate 0,3 g Sodium thiosulphate 0,3 g Phenol red Agar Nƣớc cất 0,024 g 12,0 g 1000,0 ml Điều chỉnh pH tới 7,4; phân ống nghiệm, ống 10 ml Tiệt khuẩn 10 phút 1210C, để nghiêng phần thạch đáy ống cao 2,5 cm - Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0-7,5, khử trùng, đối với môi trƣờng LB đặc có bổ sung 1,5% (w/v) agar Để chọn lọc chủng mang plasmid tái tổ hợp, mơi trƣờng đƣợc bổ sung 50 µg/ml ampicillin Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC Trình tự gen mã hóa riboxom 16S chủng G897 Trình tự gen mã hóa riboxom 16S chủng G82 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Vũ Văn Hạnh, Phó Trƣởng phịng, Phụ trách phịng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam tận tình hƣớng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Đặng Xuân Bình, Giám đốc Trung tâm Liên kết Đào tạo Quốc tế - Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trƣởng Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sống – Đại học Thái Nguyên, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi, truyền đạt kinh nghiệm hỗ trợ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên; Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Khoa học sống, trƣờng Đại học Khoa học Thái Nguyên, thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên, tồn thể đồng nghiệp tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến bạn bè, gia đình ngƣời thân ln bên tơi, khuyến khích, động viên tơi suốt q trình thực hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 09 năm 2012 Tác giả luận văn Đỗ Bích Duệ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT VSATTP E coli Vệ sinh an toàn thực phẩm Escherichia coli NĐTP Cs Ngộ độc thực phẩm Cộng HACCP Hazard Analysis and Critical Control Point (Phân tích mối nguy điểm kiểm sốt tới hạn) QĐ-BYT QPPL Quyết định- Bộ Y tế Quy phạm pháp luật SXKD TCVN WHO KIT PCR Sản xuất kinh doanh Tiêu chuẩn Việt Nam World Health Oganization (Tổ chức Y tế Thế giới ) Bộ sinh phẩm chẩn đoán Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) EtBr LB IMViC NEB CFU Ethydium bromide Luria- Broth Indol – Methyl Red – Voges, Proskauer - Citrat Native Elution Buffer (Dung dich rửa giải) Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) ELISA OD Phản ứng miễn dịch học gắn enzyme Optical density (Mật độ quang) ONPG w/v Ortho-nitrophenyl-D-galactopyranoside Weight/volume Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 2 Mục tiêu nghiên cứu 3 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỊT 1.1.1 Đặc tính chung thịt 1.1.2 Thành phần hóa học thịt 1.1.3 Các nguyên nhân gây hƣ hỏng thịt 1.2 VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 1.2.1 Ngộ độc thực phẩm 1.2.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 1.2.3 Một số vi khuẩn phân lập đƣợc từ thịt gây ngộ độc thực phẩm 1.2.4 Tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam giới .12 1.3 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E COLI ) .14 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 14 1.3.2 Phân loại 14 1.3.3 Đặc điểm hình thái, cấu trúc vi khuẩn E coli 15 1.3.4 Đặc tính ni cấy, đặc điểm sinh hóa 16 1.3.5 Đặc tính gây bệnh vi khuẩn E coli .17 1.4 PHƢƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI PHÁT HIỆN E COLI TRONG THỰC PHẨM 18 1.4.1 Phƣơng pháp PCR (polymerase Chain Reaction) .18 1.4.2 Phƣơng pháp ELISA 19 1.4.3 Phát hiệnE coli bằng phức hợp kháng thể , hạt nano silica phát quang 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 23 2.1 VẬT LIỆU 23 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 23 2.1.2 Mơi trƣờng, ngun liệu, hóa chất 23 2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu xét nghiệm .26 2.3.2 Phƣơng pháp xác định tiêu vi khuẩn E coli thịt lợn tƣơi 26 2.3.3 Xác định tính mẫn cảm chủng vi khuẩn E coli phân lập số loại thuốc kháng sinh 28 2.3.4 Phƣơng pháp tiến hành phản ứng ngƣng kết nhanh phiến kính (xác định type huyết thanh) 29 2.3.5 Xác định gen VT1, VT2 chủng E coli phản ứng PCR 30 2.3.6 Nghiên cứu đặc điểm di truyền nhân dịng đọc trình tự đoạn gen mã hóa riboxom 16S từ E coli 31 2.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 35 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên 36 3.2 Mức độ nhiễm vi khuẩn E coli thịt lợn tƣơi 37 3.3 Kết nghiên cứu số đặc điểm sinh học, hóa học vi khuẩn E coli 38 3.4 Kết xác định tính mẫn cảm kháng sinh .39 3.5 Kết xác định type huyết số chủng E coli phân lập đƣợc .40 3.6 Kết xác định gen gây ngộ độc thực phẩm PCR .41 3.7 Kết định danh vi khuẩn phân lập đọc trình tự gen mã hóa riboxom 16S 42 3.7.1 Tách chiết DNA tổng số 42 3.7.2 Kết nhân gen mã hóa riboxom 16S PCR 43 3.7.3 Kết tách dòng gen mã hóa riboxom 16S 44 3.7.4 Kết xác định trình tự gen mã hóa riboxom 16S 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 PHỤ LỤC ẢNH PHỤ LỤC PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Đánh giá cảm quan thịt .5 Bảng 1.2 Tiêu chuẩn đánh giá thịt tƣơi phản ứng sinh hóa học Bảng 2.1 Các thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 3.1 Kết khảo sát tình hình giết mổ tiêu thụ thịt lợn địa bàn thành phố Thái Nguyên .36 Bảng 3.2 Kết xác định vi khuẩn E coli nhiễm thịt lợn tƣơi 37 Bảng 3.3 Kết quả giám đị nh một số đặc tí nh sinh hóa của vi khuẩn E coli phân lập đƣợc 38 Bảng 3.4 Kết xác định tính mẫn cảm của vi khuẩn E coli phân lập số loại kháng sinh 39 Bảng 3.5 Kết xác định type huyết kháng nguyên O chủng vi khuẩn E coli phân lập đƣợc 41 Bảng 3.6 Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli mang gen gây ngộ độc 42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Sơ đồ 2.1 Phân lập E coli từ thịt .27 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR xác định gen VT1, VT2 42 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm DNA tổng số 43 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ gen mã hóa riboxom 16S 43 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm plasmid 44 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI 44 Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn