(TIỂU LUẬN) báo cáo THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM PHA CHẾ môi TRƯỜNG GIÁ đậu ĐƯỜNG kỹ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH vật HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP đổ đĩa)

GIỚI THIỆU MÔN HỌC GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG

GIỚI THỆU MÔN HỌC KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG

AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

-"Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm" giới thiệu tới người học các kiến thức: một số kỹ thuật cơ bản của vi sinh vật học, một số phương pháp định lượng vi sinh vật, khảo sát hình thái và một số tính chất sinh lý của nhóm vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm, phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm, vệ sinh công nghiệp.

-Trình bày các nội dung chính như: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kỹ thuật gieo cấy và phân lập, định lượng – tách vi sinh vật, quan sát vi sinh vật nói chung trên,… Mời thầy và các bạn cùng tham khảo.

II Giới thiệu kính hiển vi quang học nền sáng

-Một kính hiển vi tốt là một dụng cụ rất quan trọng trong phòng thí nghiệm vi sinh Loại kính thường dùng nhất là kính hiển vi quang học nền sáng.

-Kính hiển vi này có nhiều thấu kính và có một nguồn ánh sáng trắng Chúng phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ như vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà chúng ta không nhìn thấy được băng mắt thường.

Figure 1: Kính hiển vi quang học nền sáng

III.Các bộ phận chủ yếu và chức năng của kính hiển vi quang học nền sáng

1 Kính hiển vi được đặt trên một chân đế vững chắc và có bộ phận tay cầm để chúng ta có thể di chuyển kính hiển vi đén vị trí khác

2 Bần chứa tiêu bản có một lỗ tròn ở vị trí trung tâm Nó cho phép ánh sáng bên dưới đi xuyên qua và đến được thấu kính bên trên Tiêu bản cần quan sát sẽ được đặt trên bàn chứa tiêu bản

3 Một đèn chiếu được đặt bên trong chân đé Ánh sáng sẽ đi xuyên qua tụ Abbe Tụ quang có chứa thấu kính Tụ quang có cửa sập dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng Một thanh gạt được kèm theo để điều chỉnh cửa sập Tụ quang có thể nâng lên hạ xuống nhờ núm điều chỉnh, cách tốt nhất là giữ tụ quang ở ị trí cao nhất và chỉ điều chỉnh lượng ánh sáng bằng cách đóng hoặc mở cửa sập.

4 Phía trên bàn chứa tiêu bản, được gắn với tay cầm, là một ống tròn có các thấu kính phóng đại Bên dưới là một cổ xoay được gắn với ba hay bốn vật kính Bên trên ống tròn là thị kính cho phép chúng ta có thể nhìn bằng hai mắt.

5 Khi sử dụng phải vặn nút sơ cấp một cách nhẹ nhàng để nâng hoặc hạ bàn chứa tiêu bản Nút thứ cấp sẽ làm di chuyển bàn chưa tiêu bản một cách chậm chạp vì vập không thể thấy sự di chuyển này khi nhìn.

6 Lưu ý chỉ hạ bàn chưa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát thị kính để tránh trường hợp vật kín.

7 Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh thì có thể làm nút bị kẹt cứng, phải thông báo cho giáo viên hướng dẫn.

8 Tổng số lần phóng đại tùy thuộc vào vật kính và thị kính đang dùng. Nhìn vào thị kính, sinh viên sẽ thấy một kí hiệu “10X”, có nghĩa là phóng dại

10 lần Nhìn vào các vật kính sẽ thấy ký hiệu “4X”, “10X”, “40X” và “ 100X”, tương ứng với độ phóng đại 4,10,40,và 100 lần Vật kính low-power còn được gọi là vật kính 10X hay 16mm Vật kính high- dry còn gọi là vật kính 40X hay 4mm. Khi sử dụng dầu sôi kính, dầu soi kính sẽ được đặt ở vị trí chính giữa tiêu bản và vật kính.

9 Độ dài tiêu cự ( focal length) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó

10 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi bị bám bụi

11 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính.

III CÁC QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

Người làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh phải mặc trang phục bảo vệ và đeo bảng tên

Sinh viên phải tham gia 100% các buổi thí nghiệm và 100% thời gian trong từng buổi thí nghiệm

Khi làm đổ / tràn các dung dịch hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh, sinh viên phải báo cáo cho cán bộ phòng thí nghiệm và xin ý kiến giải quyết

Sinh viên phải nắm vững các thao tác vo trùng

Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác

Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm

Không được ăn, uống trong phòng thí nghiệm

Không được nằm trong phòng thí nghiệm Đọc kĩ và làm theo các quy định trong bài thực hành

Vệ sinh bàn,ghế và dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm Đổ bỏ rác thái đúng quy trình, đúng nơi quy định

Không ngậm các đồ dùng trong miệng

Trả đầy đủ dụng cụ thí nghiệm sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm

Vệ sing phòng thí nghiệm

2 Các yêu cầu an toàn

Cột tóc, mặc áo blouse bảo hộ, găng tay y tế

Nghiêm cấm dùng miệng hút pipet

3 Trong các tình huống khẩn cấp

Lưu ý các trang bị cấp cứu khi cần

Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên huống dẫn Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp

IV AN TOÀN SINH HỌC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC

1 Các chỉ tiêu để thiết lập các cấp độ về an toàn sinh học

Có 4 mước độ an toàn sinh học được thiết lập căn cứ theo các nguy cở đó là khả năng lây nhiễm , khả năng gây bệnh, khả năng truyền bệnh, và bản chất của công việc đang được tiến hành.

An toàn sinh học cấp độ 1 là cấp độ bảo vệ cơ bản, tương tác với các tác nhân không gây bệnh ở người bình thường.

An toàn sinh học cấp độ 2 tương ứng với các tác nhân có nguy cơ ở mức trung bình và có thể gây bệnh cho người ở nhiều mức độ khác nhau thonon qua đường tiêu hóa, qua da hoặc màng nhầy.

An toàn sinh học cấp độ 3 tương ứng với các tác nhân gây bệnh có khả năng lan truyền ở dạng khí dung, có khả năng gây các bệnh nguy hiểm hoặc các bệnh có thể gây chết người.

NHUỘM BÀO TỬ VI KHUẨN

I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

- Dung dịch Malachite green bảo hòa (khoảng 7.6%)  95% ethanol

 Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính

2 Mẫu cần thực hiện: Thịt thúi

Quan sát và phát hiện

Phân biệt bào tử và tế bào tử trong tế bào. bào sinh dưỡng.

III Nguyên tắc và cách tiến hành

Tế bào phải được xử lý nhiệt- acid để tế bào của bào tử dễ bất màu Sau đó nhuộm tế bào chất của bào tử và tế bào thuốc nhuộm hoạt tính mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nó với thuốc nhuộm phân biệt khác Khi đó, tế bào chất sẽ mang một màu, bào tử sẽ mang một màu khác

- Làm vết bôi trên phiến kính

- Nhỏ dung dịch A lên vết bôi, hơ nhẹ bên dưới phiến kính để làm bay hơi hơi, tránh để sôi Thêm dần dần thuốc nhuộm để không bị cô cạn, giữ trong 5 phút. Đợi nguội đổ thuốc nhuộm đi

- Dùng dung dịch B rửa lại cho đến khi hết màu đỏ, rửa nước.

- Nhuộm lại bằng dung dịch trong 2- 3 phút, rửa nước, thấm khô.

- Soi kính: dùng vật kính dầu x100 Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh

Figure 2: Kết quả Nhuộm bào tử

IV Nhận xét và giải thích

Việc sử dụng tiểu bản phòng ẩm giúp chúng ta hạn chế được thời gian thực hiện mà còn không gây ảnh hưởng gì đến sự phát triển của nấm mốc

Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau.

Dựa vào các cấu trúc liên quan đến sự sinh sản, các đặc tính về hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc mà chúng ta có thể định dang được nấm mốc.

Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì.

Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát.

3 Nhận xét và giải thích

Từ kết quả cho thấy, nấm quan sát được có dạng sợi, theo như tài liệu cho thấy hình dạng kết quả thu được giống với Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn

Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn.

Bào tử vô tính là bào tử trần.

KỸ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA) I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

- Đĩa petri, giấy báo, bình định mức 1000ml, đèn cồn, pipette

II Pha chế môi trường giá đậu đường

 Cân 100g giá đậu ( đã rữa sạch) thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút.

 Lấy phần dịch trong, thêm nước cho đến khi đủ 1000ml.

 Bổ sung thêm glucose (5% w/v), pepton (0.1% w/v), 2.2% (w/v) agar.

III Kỹ thuật tuyệt trùng bằng AUTOCLAVE

- Đặt mẫu cần tuyệt trùng vào giỏ rồi đặt vào trong nồi hấp và đống chặt van.

- Chọn lựa các chức năng: nhiệt độ tuyệt trùng, thời gian tuyệt trùng.

- Nhấn start để bắt đầu quá trình tuyệt trùng.

- Nồi bắt đầu quá trình gia nhiệt cho đến khi đạt nhiệt độ tuyệt trùng Tuyệt trùng ở 121oC trong 15 phút Sau đos thời gian sấy bắt đầu khi hết thời gian tuyệt trùng.

-Khi kết thúc quá trình sấy, sẽ có âm báo, đèn complete sáng.

- Nhấn Emerency để xả áp suất, mở nắp khi đồng hồ báo Zero.

IV Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí a Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích

- Đem xà lách bỏ vào túi nilong, thêm nước, tiến hành đem đi đập dập, sau đó lấy phần dịch trong.

-Mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng Trộn mẫu thật kỹ Dung dịch này có độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thao thác tương tự pha loãng 10^-2,10^-3. b.Nguyên tắc

Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxi phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm.

Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản sản phẩm. c Cách tiến hành

 Dùng bút lông dầu ghi chú lên đĩa petri (tên mẫu, Giảng viên hướng dẫn, tên nhóm, độ pha loãng)

 Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa.

 Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường M1 đã được đun chảy và ổn định ở 45 - 50°C.

 Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường.

 Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn.

 Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 24 - 48 giờ (24 giờ lấy kết quả sơ bộ, 48 giờ lấy kết quả chính thức) ở trên, phần nắp nằm bên dưới)

SỐ KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000

Số khuẩn lạc( CFU) trên đĩa 27,23,11 20,19,23 17,18,16

Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:

-Nhận xét: Theo độ pha loãng giảm dần từ 10 -1 đến 10 -3 mật độ vi khuẩn giảm dần nên kết quả thu được khuẩn lạc cũng giảm dần Tuy nhiên, người tiến hành thao tác sai dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài vào.9

Khi tiến hành trải đĩa chưa trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác.

Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp.

Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn.

- NẤM MỐC BẰNG THIẾT BỊ LẤY MẪU TRONG KHÔNG KHÍ).

2 Môi trường và mẫu thưc hiện:

 Môi trường M5 (Potato dextrose agar)

 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ

 Mẫu thực hiện: xà lách

Tổng số nấm men, nấm sợi cũng là một chỉ tiêu vi sinh phổ biến trong hực phẩm. Chỉ tiêu này để đánh giá tình hình vệ sinh sản và dự đoán xuất thời gian bảo quản thực phẩm (Lê Văn Việt Mẫn, 2006)

III Nguyên tắc và cách tiến hành  Nguyên t ắc:

Trong kĩ này, một thể tích nhỏ huyền phù vi sinh vật đã được pha loãng được chuyển vào trung tâm bề mặt đĩa thạch và được trãi khắp bề mặt môi trường bằng que cấy gạt vô trùng Que cấy gạt được vô trùng bằng cách nhúng vào 95% ethanol và sau đó đốt cháy Sau một thời gian vi khuẩn sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng rẽ.

1) Ghi nhãn ở đáy đĩa petri.

2) Dùng pippet chuyển 0.1ml huyền phù vi sinh vật vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA.

3) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chứa 95% ethanol, gõ nhẹ que cấy vào thành cốc.

4) Đốt que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội que cấy bên dưới nắp đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy.

5) Trãi đều huyền phù vi sinh vật khắp bề mặt môi trường không chạm que cấy vào thành đãi petri và không đặt nắp hộp petri xuống mặt bàn.

6) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chưa 95% ethanol và đốt que cấy.

7) Lặp lại quy trình này với các đĩa petri khác.

8) Lật sấp đĩa petri vad ủ ở 30 độ C trong 24-48 giờ.

9) Quan sát hình thái của khuẩn lạc và ghi nhận lại.

(File video đính kèm: MÔI TRƯỜNG M5)

(File video đính kèm: NẤM MEN, NẤM MỐC.mp4).

IV Kết quả thí nghiệm

Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -1

Bảng 1: Số lạc khuẫn trên đĩa Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000

Số khuẩn lạc(CFU) 587, 475, 551 137, 199, 380 63, 71, 43 trên đĩa

Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:

V Nhận xét và giải thích kết quả

Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp.

Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn.

Việc chuẩn bị môi trường và pha loãng mẫu tốn nhiều thời gian.

Pha loãng mẫu cần độ chính xác cao.

Người tiến hành thao tác chậm không chuẩn xác dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài vào.

Khi tiến hành trải đĩa phải trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác

Theo độ pha loãng giảm dần từ 10 -1 đến 10 -3 mật độ vi khuẩn giảm dần nên kết quả thu được khuẩn lạc cũng giảm dần.

PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG LSB, BGBL.

I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện -Mẫu nước hồ cá

II Pha chế môi trường a Chuẩn bị môi trường LSB

Dùng 35.6g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút. b Chuẩn bị môi trường BGBL

Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng

III ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN a.Nguyên tắc

Trong thực tế phân tích, Coliforms được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37°C trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và môi trường Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động vật Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay có loại môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.

Phương pháp MPN (phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. b Cách tiến hành

 Cho vào ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 10^1, 10^2, 10^3) Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục ) Ghi nhận số lượng các ông nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng

Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dang số

MPN/ml, MPN/1 g mẫu (số vi sinh vật/ml hay số vi sinh vậg mẫu.

 Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10^-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10 ml môi trường LSB và ống Durham úp ngược Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10^-2, đến 10^-3 Ủ ống nghiệm trong 48 giờ ở 37°C Ởng dương tính là ống có sinh khí (bọt khí trong ống Durham) Ghi nhận số ống dương tính.Thử nghiệm khẳng định: dùng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL và ủ ở 37°C trong 48 giờ Ghi nhận số ống dương tính ứng với mỗi độ pha loãng

Lưu ý: cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham sau khi tiệt trùng môi trường Các ống có khả năng hiện diện của Coliforms là các ống dương tính ở cả môi trường LSB lẫn BGBL. c Kết quả

- 8 ống theo 3 độ pha loãng của môi trường LBS dương tính

- Sau khi thử nghiệm khẳng định lại với môi trường BGBL thì 8 ống đều dương tính.

D10^-1 D10^-2 Ống dương tính với môi trường là LBS. Ống dương tính với môi trường LSB

D10^-3 Ống dương tính với độ pha loãng 10^-1,10^-2, 10^-3 trong môi trường BGBL. d Nhận xét

Số ống dương tính trong mỗi mẫu pha loãng Độ pha loãng của mẫu Kết quả được MPN/ml10^-1 10^-2 10^-3 chọn

Các ống nghiệm chứa môi trường LSB cho kết quả ống dương tính (ống durham xuất hiện bọt khí) chưa chắc đã chứa vi khuẩn nhóm Coliform, để khẳng định Coliform, ta cần cấy chuyền và kiểm tra sự sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường BGBL và ủ các ống nghiệm trong tủ ấm ở 37 độ C trong khoảng 48h Nếu ống nghiệm chứa môi trường BGBL sau thời gian ủ có sinh khí và chuyển sang màu vàng thì kết quả là dương tính, ta có thể khẳng định là có Coliform trong môi trường. e Kết luận

-Phương pháp MPN cho phép chúng ta định lượng được vi sinh vật trong các mẫu có nồng độ thấp.Môi trường và điều kiện nuôi cấy cho pháp chúng ta phát hiện được sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các ống nghiệm cho dù mẫu cấy ban đầu có chứa 1 tế bào.

ỐNG NGHIỆM THẠCH NGHIÊNG + CẤY CHUYỀN (MẪU NẤM MỐC) ỐNG NGHIỆM THẠCH ĐỨNG + CẤY ĐÂM SÂU(MẪU NẤM MỐC)

 Que cấy vòng, que cấy thẳng

2 Môi trường và mẫu thực hiện

 Mẫu thực hiện: nấm mốc

Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần nghiên cứu.

Nuôi cấy giống vi sinh vật thuần khiết và nhân giống các giống vi sinh vật từ phương pháp cấy ria.

III Nguyên tắc và cách tiến hành 1 Nguyên tắc

Môi trường được tiệt trùng trong autoclve Ống nghiệm chưa môi trường thạch nuôi cấy vi sinh vật là nấm mốc.

2.1 Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng và ống nghiệm môi trường thạch sâu

 Để làm ống nghiệm thạch nghiêng, môi trường được tiệt trùng trong autoclave Sau đó, môi trường nóng chảy được lấy ra và đặt lên một mặt phẳng ngang với phần đầu được kê cao hơn so với đáy ống nghiệm sao cho môi trường bên trong chiếm 2/3 chiều cao ống nghiệm Để yên cho môi trường đông đặc lại hoàn toàn và bảo quản ống nghiệm ở vị trí thẳng đứng.

 ống thạch nghiêng sâu được chuẩn bị tương tự ống nghiệm thạch nghiêng nhưng môi trường được đông cứng và để nguội ở trạng thái thẳng đứng.

2.2 Cấy chuyền và cấy đâm sâu

 Cấy chuyền ở ống nghiệm thạch nghiêng

1) Dùng que cấy vòng đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch nghiêng PDA bằng cách cấy ria, vuốt nhẹ dây cấy để tạo đường zic-zac trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.

2) Đưa que cấy ra khỏi ống nghiệm sao cho không chạm vào thành và miệng ống nghiệm Sau đó hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa đèn cồn để vô trùng

3) Đậy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiêm lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 24-48 giờ Sau đó kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật.

 Cấy đâm sau ở ống thạch đứng

1) Dùng que cấy thẳng đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch đứng PDA.

2) Cấy nấm mốc vào ống nghiệm bằng cách đâm thẳng đứng vào chính giữa môi trường (2/3 chiều sâu của môi trường)

3) Đưa que cấy ra khỏi ống nghiệm sao cho không chạm vào thành và miệng ống nghiệm Sau đó hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa đèn cồn để vô trùng

4) Đậy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiêm lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 24-48 giờ Sau đó kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật tạo một đường đục theo vết cấy đâm sâu.

(File đính kèm: THẠCH NGHIÊNG, THẠCH ĐỨNG.)

Hình: Môi trường thạch nghiêng nấm mốc

Hình: Môi trường thạch đứng nấm mốc

Phân lập giống vi sinh vật thuần khiết và bảo quản chúng trong một thời gian dài Kỹ thuật bảo quản tốt sẽ giảm thiểu số lần phải cấy chuyền vi sinh vật.

Thao tác cấy cần chính xác, nhanh, gọn, càng kéo dài thời gian cấy khả năng bị nhiễm vi sinh vật sẽ càng cao Đối với ống thạch đứng, que cấy vòng phải cấy đâm sâu vào 2/3 chiều sâu của môi trường.

3 Nhận xét và giải thích kết quả

Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện ở điều kiện vô trùng để tránh các vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn từ môi trường ngoài.

Môi trường và các dụng cụ nuôi cấy cần phải tiệt trùng triệt để. Đối với môi trường đặc ở ống thạch đứng, các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy cột môi trường. Đối với môi trường đặc ở ống thạch nghiêng, các vi sinh vật hiếu khí phát triển tạo nên vệt nổi màu trắng đục hoặc trong trên mặt thạch

NHUỘM ĐƠN TIÊU BẢN GIỌT ÉP

- Phiến kính hình vuông, phiến kính hình chữ nhật

- Kính hiển vi, dầu soi

II Tiêu bản giọt ép a.Nguyên tắc

-Vi khuẩn không di động (non-motile) nhưng trong môi trường lỏng chúng thường di chuyển hỗn loạn, gọi là chuyển động Brown (Brownian movement). -Sự di chuyển thật sự (động lực tự thân, self-propulsion) được thấy ở một số vi khuẩn nhờ một số cơ chế khác nhau.

-Các kiểu di động hay không di động có thể được quan sát bằng tiêu bản giọt treo (hanging drop slide) Tiêu bản giọt treo cũng dùng để quan sát hình dang vi khuẩn ở trang thái sống cũng như sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau. b Cách tiến hành

-Dùng que cấy vòng chuyển một ít dung dịch mẫu vi khuẩn lên phiến kính hình chữ nhật.

- Dùng phiến kính hình vuông nhẹ nhàng đặt đè lên giọt nước chứa vi khuẩn.

Tránh không để hình thành bọt khí.

-Đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu. c Kết quả

Tiêu bản giọt ép nhìn qua kính hiển vi quang học. d Nhận Xét

Nấm mốc có dạng hình que, hình cầu.

Có sự chuyển động Brown.

Chúng ta có thể quan sát được hình dạng, kích thước, sự sắp xếp cũng như sự chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi khi sử dụng phương pháp làm tiêu bản giọt ép. e Kết Luận

-Có thể quan sát được trạng thái sống của tế bào vi khuẩn đặc biệt là sự chuyển động của chúng.Thao tác đơn giản, tiến hành nhanh.

- Nhưng,không thể xác định được rõ chính xác hình thái của vi khuẩn.Trong thao tác thực hiện dễ hình thành bọt khí khi đặt hai phiến kính chồng lên nhau, gây khó khăn trong việc quan sát.Dễ bị nhầm lẫn giữa chuyển động Brown và chuyển động tự thân.

III Nhuộm đơn a.Nguyên tắc

Kích thước của vi khuẩn và số lượng các chất trong tế bào rất nhỏ bé cho nên chúng hầu như trong suốt ngay cả khi đã được phóng đại và làm giảm độ chiếu sáng Do đó cần phải tìm cách để chúng không di động và cố định lại để dễ quan sát hơn Một trong những cách đơn giản nhất là tạo vết bôi vi khuẩn lên phiến kính thủy tinh và “cố định” chúng trên đó, sau đó nhuộm chúng bằng phẩm nhuộm.

Phẩm nhuộm vi khuẩn tốt nhất là loại aniline (phẩm nhuộm hữu cơ được làm từ nhựa than đá) Khi chúng ta sử dụng trực tiếp lên vết bôi vi khuẩn đã cố định, đường nét của vi khuẩn sẽ hiện lên rất rõ ràng Các phẩm nhuộm này gồm các dạng acid (acidic), kiểm (basic) hay trung tính (neutral) Phẩm nhuộm dang acid hay trung tính thường được dùng trong nghiên cứu về vi khuẩn Các ion tự do trong phẩm nhuộm dang acid là các ion âm sẽ kết hợp với các cation (thành phần chính của tế bào) để tạo một dạng muối Phẩm nhuộm dang cơ bản có nhiều ion âm sẽ kết hợp với một acid trong vật liệu được nhuộm để tạo một loại muối Tế bào vi khuẩn có rất nhiều ribonucleic acid vì vậy phẩm nhuộm trung tính sẽ bắt màu rất tốt Phẩm nhuộm dạng trung tính thường kết hợp cả hai loại phẩm nhuộm trên Vì vậy phẩm nhuộm dạng trung tính sẽ có tác dụng rất tốt khi nhuộm các tế bào phức tạp bởi vì chúng cho phép làm hiện rõ các cấu trúc bên trong của vi khuẩn Các tế bào và cấu trúc bị nhuộm màu bởi phẩm nhuộm cơ bản được gọi là basophilic, còn nếu bị nhuộm màu với phẩm nhuộm acid thì gọi là acidophilic. b Cách tiến hành Tạo vết bôi

-Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vòng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kính Trải đều trên diện tích khoảng ẵ inch.

- Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn.

-Nhuộm với phẩm nhuộm crystal violet trong 20 - 30 giây)

-Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây.

-Thấm khô bằng giấy thấm Không được xát lên vết

- Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu.

Nhuộm Gram với mẫu là nấm men d Nhận Xét

Vi khuẩn quan sát được đa số là hình que dạng chuỗi và một phần nhỏ là hình que Kết quả này thu được do kỹ thuật nhuộm đơn tạo sự tương phản giữa vi khuẩn và cảnh nền nên dễ dàng quan sát được. e Kết Luận

-Có thể “cố định” vi khuẩn trên phiến kính thủy tinh Vi khuẩn sẽ bị gắn chặt vào phiến kính và bị giết chết mà không bị biến dạng tế bào.

Kỹ thuật này có sử dụng thuốc nhuộm cơ bản crystal violet sẽ tạo sự tương phản giữa vi khuẩn và cảnh nền, giúp việc quan sát trở nên dễ dàng hơn.Thời gian tiến hành ngắn, nhanh chóng thu được kết quả.

- Tuy nhiên, đòi hỏi độ chính xác về thời gian trong quy trình nhuộm đơn Chuẩn bị vết bôi phải đúng cách, sử dụng một lượng vi khuẩn vừa phải vì nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều tạo nên sự chồng chéo hoặc nếu quá ít sẽ đều gây khó khăn trong việc quan sát.

KỸ THUẬT NHUỘM GRAM

II Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện

 Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính

2 Mẫu cần thực hiện: Nước dưa cải chua

Phân chia vi khuẩn thành hai nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (+) và vi khuẩn Gram âm (-).

IV Nguyên tắc và cách tiến hành

3 Nguyên tắc Đầu tiên, tiêu bản được nhuộm với phẩm nhuộm cơ bản là crytal violet Sau đó, tiêu bản được được xử lý với dung dịch odine, đóng vai trò như chất cẩn màu. Sau đó tiêu bản được tẩy màu bằng ethanol Cuối cùng tiêu bản được nhuộm bổ sung một phẩm nhuộm cơ bản có màu khác crytal violet là safranin Kết quả vi khuẩn Gram dương bắt có màu tím còn vi khuẩn Gram âm có màu hồng.

1) Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật

2) Dùng dung dịch crytal violet phủ lên vết bôi Để yên trong 1 phút.

3) Để nghiêng phiến kính 45 độ, rửa dưới vòi nước cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu)

4) Phủ lên vết bôi dung dịch iodine Để yên 1 phút.

5) Để nghiêng phiến kính 45 độ, tẩy màu bằng dung dịch 95% ethenol cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu (thông thường khoảng 10-20 giây) Đây là bước quan trọng nhất.

6) Ngay lập tức rửa phiến kính dưới vòi nước.

7) Phủ lên vết bôi dung dịch safranin O Để yên 1 phút

9) Thấm nhẹ bằng giấy thấm Hơ khô phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi.

10) Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát Chụp ảnh tiêu bản.

(File video đính kèm: NHUỘM GRAM.)

Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram

1 Ưu điểm của kỹ thuật nhuộm Gram

Cho kết quả nhanh hơn phương pháp cấy.

Phân loại được vi khuẩn Gram âm và Gram dương.

2 Nhược điểm của kỹ thuật nhuộm Gram

Nhuộm đơn nhiều lần với nhiều loại thuốc nhuộm khác nhau. Đòi hỏi độ chính xác về thời gian khi nhuộm màu và tẩy màu để không làm biến đổi vi khuẩn Gram dương thành vi khuẩn Gram âm.

3 Nhận xét và giải thích kết quả

Kết quả thu được vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.

Do lớp peptidoglycan ở vi khuẩn Gram âm mỏng hơn vi khuẩn Gram dương Vách tế bào chứa hàm lượng lipid cao và dễ bị hòa tan trong chất tẩy màu (alcohol, acetone hay hỗn hợp hai chất này) chính vì vậy làm cho thuốc nhuộm ban đầu là crystal violet dễ bị rửa trôi và vi khuẩn Gram âm có thể bắt màu hồng của thuốc nhuộm bổ sung là safranin (Sơn, 2018) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất tím tinh thể - iốt bị giữ lại trong tế bào.

TIÊU BẢN PHÒNG ẨM

1 Dụng cụ a) Nước cất b) Đĩa petri c) 95% ethanol d) Đèn cồn e) Que cấy vòng f) Pipette các loại g) Phiến kính hình chữ nhật, phiến kính hình vuông. h) dung dịch methylen blue

2 Môi trường và mẫu thưc hiện:

 Mẫu thực hiện: nấm mốc

Có thể quan sát cấu trúc đặc trưng về hình thái mà không gây ảnh hưởng gì đến sự phát triển của nấm mốc Phương pháp này có thể quan sát một cách dễ dàng các cấu trúc liên quan đến sự sinh sản Việc định danh nấm mốc thường dựa vào các cấu trúc liên quan đến sự sinh sản, các đặc tính về hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc (Sơn, 2018)

III Nguyên tắc và cách tiến hành

Nồng độ đường cao và pH thấp (5.6) của môi trường này không thích hợp cho sự phát triển của hầu hết vi khuẩn, do đó đảm bảo hạn chế sự tạp nhiễm Hầu hết nấm mốc phát triển tốt ở pH 5.6 Khuẩn lạc nấm mốc có thể được quan sát trực tiếp bằng cách lấy một ít sinh khối và đặt trên phiến kính (slide) với một giọt nước hay thuốc nhuộm (tiêu bản giọt ép) Có một cách khác là tiêu bản phòng ẩm (slide culture), đây là tiêu bản có nhiều ưu điểm vì có thể quan sát cấu trúc đặc trưng về hình thái mà không gây ảnh hưởng gì đến sự phát triển của nấm mốc.

- Chuẩn bị các phiến kính hình chữ nhật (glass slide) và phiến kính hình vuông (coverslips) Ngâm phiến kính trong ethanol 80% trong tối thiểu 15 phút.

- Hơ bề mặt của các phiến kính này trên ngọn lửa để vô trùng (dùng kẹp để cầm).

- Đun chảy ống nghiệm chứa môi trường Sabouraund dextrose agar hay

Potato dextrose agar, sau đó làm nguội đến 48 – 50oC Đổ môi trường vào trong đĩa petri.

- Để đĩa nguội sau đó dùng dao cắt một ô vuông khoảng ô kính hình vuông

- Cho miếng thạch đã cắt vào giữa phiến kính hình chữ nhật và đặt phiến kính hình vuông lên.

- Cho một ít giấy thấm nước (vô trùng) vào đĩa petri Cho một vài que tăm vào bên trên phần giấy thấm Đặt các phiến kính vừa chuẩn bị ở phần trước lên trên các que tăm Ủ ở nhiệt độ phòng từ 2 – 4 ngày.

- Quan sát dưới kính hiển vi Có thể dùng dung dịch methylen blue (0.3% trong ethanol) để nhuộm màu giúp quan sát rõ hơn cấu trúc của nấm mốc (cồn giúp làm mềm vách tế bào nấm mốc giúp thuốc nhuộm dễ đi vào tế bào hơn)

Figure: Kết quả tiêu bản phòng ẩm