GIỚI THIỆU MÔN HỌC GIỚI THIỆU KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG
GIỚI THỆU MÔN HỌC KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC NỀN SÁNG
AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm cung cấp cho người học kiến thức về các kỹ thuật cơ bản trong vi sinh vật học, phương pháp định lượng vi sinh vật, khảo sát hình thái và các tính chất sinh lý của nhóm vi sinh vật thường gặp trong thực phẩm Bên cạnh đó, bài học cũng đề cập đến các phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm và vệ sinh công nghiệp.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Kỹ thuật gieo cấy và phân lập giúp tách biệt các loại vi sinh vật, từ đó định lượng và quan sát chúng một cách hiệu quả Bài viết này mời thầy và các bạn cùng tham khảo những nội dung chính liên quan đến các phương pháp và kỹ thuật trong lĩnh vực vi sinh vật học.
II Giới thiệu kính hiển vi quang học nền sáng
Kính hiển vi quang học nền sáng là một dụng cụ thiết yếu trong phòng thí nghiệm vi sinh, giúp quan sát và nghiên cứu các mẫu sinh học một cách chi tiết và chính xác Một kính hiển vi tốt đóng vai trò quan trọng trong việc phát hiện và phân tích vi sinh vật.
Kính hiển vi này sử dụng nhiều thấu kính kết hợp với nguồn ánh sáng trắng để phóng đại và chiếu sáng các vật thể nhỏ như vi khuẩn và các vi sinh vật khác mà mắt thường không thể nhìn thấy.
Figure 1: Kính hiển vi quang học nền sáng
III.Các bộ phận chủ yếu và chức năng của kính hiển vi quang học nền sáng
Kính hiển vi được trang bị một chân đế vững chắc và tay cầm, giúp người dùng dễ dàng di chuyển kính đến vị trí khác.
Bần chứa tiêu bản có lỗ tròn ở trung tâm, cho phép ánh sáng từ dưới chiếu lên thấu kính phía trên Tiêu bản cần quan sát được đặt trên bàn chứa tiêu bản để thực hiện quá trình quan sát.
Đèn chiếu được đặt bên trong chân đế, cho phép ánh sáng đi xuyên qua tụ Abbe, một thiết bị quang học chứa thấu kính Tụ quang được trang bị cửa sập để điều chỉnh lượng ánh sáng, kèm theo thanh gạt để dễ dàng điều chỉnh Ngoài ra, tụ quang có thể nâng hạ nhờ núm điều chỉnh, và nên giữ ở vị trí cao nhất, chỉ điều chỉnh lượng ánh sáng bằng cách mở hoặc đóng cửa sập.
Trên bàn chứa tiêu bản, có một ống tròn với các thấu kính phóng đại được gắn với tay cầm, giúp người dùng dễ dàng điều chỉnh Dưới ống tròn là một cổ xoay được trang bị ba hoặc bốn vật kính khác nhau Thị kính nằm ở phía trên ống tròn cho phép quan sát bằng cả hai mắt, mang lại trải nghiệm xem rõ nét và chi tiết hơn.
Khi sử dụng thiết bị, hãy vặn nút sơ cấp một cách nhẹ nhàng để điều chỉnh độ cao của bàn chứa tiêu bản Nút thứ cấp sẽ giúp di chuyển bàn chứa tiêu bản từ từ, nhưng sự di chuyển này khó nhận thấy khi quan sát.
6 Lưu ý chỉ hạ bàn chưa mẫu vật đi xuống khi đưa mắt vào quan sát thị kính để tránh trường hợp vật kín.
7 Khi xoay nút thứ cấp quá nhanh thì có thể làm nút bị kẹt cứng, phải thông báo cho giáo viên hướng dẫn.
Tổng số lần phóng đại của kính hiển vi phụ thuộc vào loại vật kính và thị kính được sử dụng Khi nhìn vào thị kính, sinh viên sẽ thấy kí hiệu "10X", biểu thị mức độ phóng đại.
Khi sử dụng kính hiển vi, các vật kính thường có ký hiệu “4X”, “10X”, “40X” và “100X”, tương ứng với độ phóng đại 4, 10, 40 và 100 lần Vật kính có độ phóng đại thấp gọi là 10X hoặc 16mm, trong khi vật kính có độ phóng đại cao gọi là 40X hoặc 4mm Đặc biệt, khi sử dụng dầu soi kính, dầu sẽ được đặt ở vị trí trung tâm giữa tiêu bản và vật kính để đạt hiệu quả quan sát tốt nhất.
9 Độ dài tiêu cự ( focal length) của một vật kính tỉ lệ với đường kính của vật kính đó
10 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính và phía trên tụ quang khi bị bám bụi
11 Sử dụng một mảnh vải mềm và sạch để lau nhẹ nhàng các thấu kính.
III CÁC QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
Người làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh phải mặc trang phục bảo vệ và đeo bảng tên
Sinh viên phải tham gia 100% các buổi thí nghiệm và 100% thời gian trong từng buổi thí nghiệm
Khi xảy ra sự cố đổ tràn dung dịch hoặc làm bể dụng cụ thủy tinh, sinh viên cần nhanh chóng thông báo cho cán bộ phòng thí nghiệm và yêu cầu hướng dẫn xử lý.
Sinh viên phải nắm vững các thao tác vo trùng
Giảm thiểu sự hình thành khí dung khi thao tác
Rửa tay trước và sau khi thí nghiệm
Không được ăn, uống trong phòng thí nghiệm
Không được nằm trong phòng thí nghiệm Đọc kĩ và làm theo các quy định trong bài thực hành
Vệ sinh bàn,ghế và dụng cụ trước và sau khi thí nghiệm Đổ bỏ rác thái đúng quy trình, đúng nơi quy định
Không ngậm các đồ dùng trong miệng
Trả đầy đủ dụng cụ thí nghiệm sau khi hoàn thành xong bài thí nghiệm
Vệ sing phòng thí nghiệm
2 Các yêu cầu an toàn
Cột tóc, mặc áo blouse bảo hộ, găng tay y tế
Nghiêm cấm dùng miệng hút pipet
3 Trong các tình huống khẩn cấp
Lưu ý các trang bị cấp cứu khi cần
Báo cáo các tình huống khẩn cấp ngay lập tức cho giáo viên huống dẫn Bình tĩnh khi có tình huống khẩn cấp
IV AN TOÀN SINH HỌC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC
1 Các chỉ tiêu để thiết lập các cấp độ về an toàn sinh học
Có bốn mức độ an toàn sinh học được xác định dựa trên các nguy cơ, bao gồm khả năng lây nhiễm, khả năng gây bệnh, khả năng truyền bệnh và bản chất công việc đang thực hiện.
An toàn sinh học cấp độ 1 là cấp độ bảo vệ cơ bản, tương tác với các tác nhân không gây bệnh ở người bình thường.
An toàn sinh học cấp độ 2 liên quan đến các tác nhân có nguy cơ trung bình, có khả năng gây bệnh cho con người qua nhiều con đường khác nhau, bao gồm đường tiêu hóa, da và màng nhầy.
An toàn sinh học cấp độ 3 liên quan đến các tác nhân gây bệnh có khả năng lây lan qua không khí, có thể gây ra những bệnh lý nghiêm trọng hoặc thậm chí là tử vong.
NHUỘM BÀO TỬ VI KHUẨN
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Dung dịch Malachite green bảo hòa (khoảng 7.6%) 95% ethanol
Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính
2 Mẫu cần thực hiện: Thịt thúi
Quan sát và phát hiện
Phân biệt bào tử và tế bào tử trong tế bào. bào sinh dưỡng.
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Để xử lý tế bào bào tử, cần thực hiện quá trình xử lý nhiệt và acid nhằm làm cho bào tử dễ dàng mất màu Tiếp theo, nhuộm tế bào chất bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh, sau đó tẩy màu tế bào chất và nhuộm lại bằng thuốc nhuộm phân biệt khác Kết quả là tế bào chất và bào tử sẽ có màu sắc khác nhau, giúp dễ dàng phân biệt chúng.
- Làm vết bôi trên phiến kính
Nhỏ dung dịch A lên vết bôi và hơ nhẹ bên dưới phiến kính để làm bay hơi mà không để sôi Thêm thuốc nhuộm từ từ để tránh cô cạn và giữ trong 5 phút Sau khi nguội, đổ thuốc nhuộm đi.
- Dùng dung dịch B rửa lại cho đến khi hết màu đỏ, rửa nước.
- Nhuộm lại bằng dung dịch trong 2- 3 phút, rửa nước, thấm khô.
- Soi kính: dùng vật kính dầu x100 Bào tử bắt màu đỏ, tế bào bắt màu xanh
Figure 2: Kết quả Nhuộm bào tử
IV Nhận xét và giải thích
Sử dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà còn bảo vệ sự phát triển của nấm mốc, đảm bảo môi trường luôn khô ráo và an toàn.
Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau.
Dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc điểm hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc, chúng ta có thể xác định và phân loại nấm mốc một cách chính xác.
Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì.
Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát.
3 Nhận xét và giải thích
Kết quả nghiên cứu cho thấy nấm quan sát được có dạng sợi, và hình dạng này tương đồng với Penicillium thuộc lớp nấm bất toàn.
Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn.
Bào tử vô tính là bào tử trần.
KỸ THUẬT TUYỆT TRÙNG BẰNG AUTOCLAVE TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ ( BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA) I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Đĩa petri, giấy báo, bình định mức 1000ml, đèn cồn, pipette
II Pha chế môi trường giá đậu đường
Cân 100g giá đậu ( đã rữa sạch) thêm 1000ml nước Đun sôi 30 phút.
Lấy phần dịch trong, thêm nước cho đến khi đủ 1000ml.
Bổ sung thêm glucose (5% w/v), pepton (0.1% w/v), 2.2% (w/v) agar.
III Kỹ thuật tuyệt trùng bằng AUTOCLAVE
- Đặt mẫu cần tuyệt trùng vào giỏ rồi đặt vào trong nồi hấp và đống chặt van.
- Chọn lựa các chức năng: nhiệt độ tuyệt trùng, thời gian tuyệt trùng.
- Nhấn start để bắt đầu quá trình tuyệt trùng.
Nồi bắt đầu gia nhiệt cho đến khi đạt nhiệt độ tuyệt trùng 121°C trong 15 phút Sau khi hoàn thành quá trình tuyệt trùng, thời gian sấy sẽ bắt đầu.
-Khi kết thúc quá trình sấy, sẽ có âm báo, đèn complete sáng.
- Nhấn Emerency để xả áp suất, mở nắp khi đồng hồ báo Zero.
IV Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí a Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích
- Đem xà lách bỏ vào túi nilong, thêm nước, tiến hành đem đi đập dập, sau đó lấy phần dịch trong.
Mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách sử dụng pipet vô trùng để chuyển 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng, sau đó trộn đều Dung dịch này đạt độ pha loãng 10^-1 Tiếp tục thực hiện các bước tương tự để pha loãng đến 10^-2 và 10^-3.
Vi khuẩn hiếu khí là những loại vi khuẩn phát triển và hình thành khuẩn lạc khi có mặt của oxy phân tử Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thực phẩm là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ vệ sinh của thực phẩm.
Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí là yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu vi sinh vật, xác định nguy cơ hư hỏng và thời hạn bảo quản sản phẩm, cũng như mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản sản phẩm.
Dùng bút lông dầu ghi chú lên đĩa petri (tên mẫu, Giảng viên hướng dẫn, tên nhóm, độ pha loãng)
Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa.
Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10 – 15 ml môi trường M1 đã được đun chảy và ổn định ở 45 - 50°C.
Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3 – 5 lần ngay sau khi đổ môi trường.
Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn.
Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C trong 24 - 48 giờ (24 giờ lấy kết quả sơ bộ, 48 giờ lấy kết quả chính thức) ở trên, phần nắp nằm bên dưới)
SỐ KHUẨN LẠC TRÊN ĐĨA Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000
Số khuẩn lạc( CFU) trên đĩa 27,23,11 20,19,23 17,18,16
Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:
Theo độ pha loãng từ 10^-1 đến 10^-3, mật độ vi khuẩn giảm dần, kéo theo sự giảm sút của số lượng khuẩn lạc thu được Tuy nhiên, nếu người thực hiện thao tác không đúng cách, có thể dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài.
Khi tiến hành trải đĩa chưa trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác.
Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp.
Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn.
- NẤM MỐC BẰNG THIẾT BỊ LẤY MẪU TRONG KHÔNG KHÍ).
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
2 Môi trường và mẫu thưc hiện:
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: xà lách
Tổng số nấm men và nấm sợi là chỉ tiêu vi sinh quan trọng trong thực phẩm, giúp đánh giá tình trạng vệ sinh sản phẩm và dự đoán thời gian bảo quản (Lê Văn Việt Mẫn, 2006)
III Nguyên tắc và cách tiến hành Nguyên t ắc:
Trong kỹ thuật này, một thể tích nhỏ huyền phù vi sinh vật được pha loãng và chuyển vào trung tâm bề mặt đĩa thạch, sau đó được trải đều bằng que cấy gạt đã được vô trùng Que cấy gạt được vô trùng bằng cách nhúng vào 95% ethanol và sau đó đốt cháy Sau một thời gian, vi khuẩn sẽ phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt trên bề mặt môi trường.
1) Ghi nhãn ở đáy đĩa petri.
2) Dùng pippet chuyển 0.1ml huyền phù vi sinh vật vào giữa đĩa petri chưa môi trường PDA.
3) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chứa 95% ethanol, gõ nhẹ que cấy vào thành cốc.
4) Đốt que cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội que cấy bên dưới nắp đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy.
5) Trãi đều huyền phù vi sinh vật khắp bề mặt môi trường không chạm que cấy vào thành đãi petri và không đặt nắp hộp petri xuống mặt bàn.
6) Nhúng que cấy gạt vào cốc thủy tinh chưa 95% ethanol và đốt que cấy.
7) Lặp lại quy trình này với các đĩa petri khác.
8) Lật sấp đĩa petri vad ủ ở 30 độ C trong 24-48 giờ.
9) Quan sát hình thái của khuẩn lạc và ghi nhận lại.
(File video đính kèm: MÔI TRƯỜNG M5)
(File video đính kèm: NẤM MEN, NẤM MỐC.mp4).
IV Kết quả thí nghiệm
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -1
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -2
Hình: Mật độ vi sinh vật pha loãng ở nồng độ 10 -3
Bảng 1: Số lạc khuẫn trên đĩa Độ pha loãng 1:10 1:100 1:1000
Số khuẩn lạc(CFU) 587, 475, 551 137, 199, 380 63, 71, 43 trên đĩa
Giá trị APC (aerobic plate count) được tính như sau:
V Nhận xét và giải thích kết quả
Dùng phương pháp trải đĩa để thực hiện đếm tổng số nấm men nấm mốc, phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp.
Việc đếm lạc khuẩn thuận tiện và chính xác hơn khi có máy hổ trợ đếm lạc khuẩn.
Việc chuẩn bị môi trường và pha loãng mẫu tốn nhiều thời gian.
Pha loãng mẫu cần độ chính xác cao.
Người tiến hành thao tác chậm không chuẩn xác dẫn đến nhiễm khuẩn từ bên ngoài vào.
Khi tiến hành trải đĩa phải trải đều đĩa nếu không nấm sẽ mọc san sát nhau rất khó quan sát và đếm chính xác
3 Nhận xét và giải thích
Theo độ pha loãng giảm dần từ 10 -1 đến 10 -3 mật độ vi khuẩn giảm dần nên kết quả thu được khuẩn lạc cũng giảm dần.
PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG LSB, BGBL.
I.Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện -Mẫu nước hồ cá
II Pha chế môi trường a Chuẩn bị môi trường LSB
Dùng 35.6g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng 121oC trong 15 phút. b Chuẩn bị môi trường BGBL
Dùng 40g hỗn hợp pha sẵn để chuẩn bị thành 1000ml môi trường Tiệt trùng
III ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN a.Nguyên tắc
Coliforms là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 37°C trong môi trường lỏng Lauryl Sulfate và Brilliant Green Lactose Bile Salt Chúng hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, cũng như trong ruột người và động vật Coliforms được coi là chỉ thị vi sinh vật, với số lượng của chúng trong thực phẩm, nước hoặc môi trường khác được sử dụng để chỉ ra khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác.
Phương pháp MPN (Most Probable Number) hay còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn, được sử dụng để đánh giá số lượng vi sinh vật trong một mẫu bằng cách xác định số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích Quy trình thực hiện phương pháp này bao gồm pha loãng mẫu và kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật trong các môi trường nuôi cấy khác nhau.
Để định lượng vi sinh vật, cho một thể tích chính xác dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường thích hợp, thực hiện pha loãng ở ba nồng độ bậc 10 liên tiếp (10^1, 10^2, 10^3) Ủ ống nghiệm ở nhiệt độ và thời gian phù hợp, sau đó quan sát các biểu hiện tăng trưởng của vi sinh vật qua hiện tượng sinh hơi, đổi màu hoặc đục Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương tính tại từng độ pha loãng và sử dụng các số liệu này để phân tích kết quả dựa vào bảng tham khảo.
Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dang số
MPN/ml, MPN/1 g mẫu (số vi sinh vật/ml hay số vi sinh vậg mẫu.
Để tiến hành thí nghiệm, cấy lần lượt 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10^-1 vào 3 ống nghiệm chứa 10 ml môi trường LSB và ống Durham úp ngược Lặp lại quy trình với dịch mẫu đã pha loãng 10^-2 và 10^-3 Ủ các ống nghiệm ở 37°C trong 48 giờ Ống dương tính được xác định bởi sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham Ghi nhận số lượng ống dương tính Để khẳng định kết quả, sử dụng que cấy vòng chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính sang các ống chứa môi trường BGBL và ủ ở 37°C trong 48 giờ, sau đó ghi nhận số ống dương tính tương ứng với từng độ pha loãng.
Sau khi tiệt trùng môi trường, cần loại bỏ các ống nghiệm có chứa bọt khí trong ống Durham Các ống dương tính với Coliforms sẽ xuất hiện ở cả môi trường LSB và BGBL.
- 8 ống theo 3 độ pha loãng của môi trường LBS dương tính
- Sau khi thử nghiệm khẳng định lại với môi trường BGBL thì 8 ống đều dương tính.
D10^-1 D10^-2 Ống dương tính với môi trường là LBS. Ống dương tính với môi trường LSB
D10^-3 Ống dương tính với độ pha loãng 10^-1,10^-2, 10^-3 trong môi trường BGBL. d Nhận xét
Số ống dương tính trong mỗi mẫu pha loãng Độ pha loãng của mẫu Kết quả được MPN/ml10^-1 10^-2 10^-3 chọn
Các ống nghiệm LSB có kết quả dương tính (bọt khí xuất hiện trong ống Durham) không đảm bảo chứa vi khuẩn Coliform Để xác định sự hiện diện của Coliform, cần thực hiện cấy chuyền và kiểm tra sự phát triển vi khuẩn trên môi trường BGBL, ủ trong tủ ấm ở 37 độ C trong 48 giờ Nếu sau thời gian ủ, ống nghiệm BGBL xuất hiện khí và chuyển sang màu vàng, kết quả là dương tính, xác nhận sự có mặt của Coliform trong môi trường.
Phương pháp MPN giúp định lượng vi sinh vật trong các mẫu có nồng độ thấp, cho phép phát hiện sự sinh trưởng của vi sinh vật ngay cả khi mẫu cấy ban đầu chỉ chứa một tế bào Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp là yếu tố quan trọng để đạt được kết quả chính xác trong quá trình này.
ỐNG NGHIỆM THẠCH NGHIÊNG + CẤY CHUYỀN (MẪU NẤM MỐC) ỐNG NGHIỆM THẠCH ĐỨNG + CẤY ĐÂM SÂU(MẪU NẤM MỐC)
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
Que cấy vòng, que cấy thẳng
2 Môi trường và mẫu thực hiện
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: nấm mốc
Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong mẫu cần nghiên cứu.
Nuôi cấy giống vi sinh vật thuần khiết và nhân giống các giống vi sinh vật từ phương pháp cấy ria.
III Nguyên tắc và cách tiến hành 1 Nguyên tắc
Môi trường được tiệt trùng trong autoclve Ống nghiệm chưa môi trường thạch nuôi cấy vi sinh vật là nấm mốc.
2.1 Chuẩn bị ống nghiệm thạch nghiêng và ống nghiệm môi trường thạch sâu
Để tạo ống nghiệm thạch nghiêng, cần tiệt trùng môi trường trong autoclave Sau khi môi trường nóng chảy được lấy ra, hãy đặt ống nghiệm trên mặt phẳng ngang với đầu ống cao hơn đáy, đảm bảo môi trường bên trong chiếm 2/3 chiều cao ống nghiệm Cuối cùng, để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn và bảo quản ống nghiệm ở vị trí thẳng đứng.
ống thạch nghiêng sâu được chuẩn bị tương tự ống nghiệm thạch nghiêng nhưng môi trường được đông cứng và để nguội ở trạng thái thẳng đứng.
2.2 Cấy chuyền và cấy đâm sâu
Cấy chuyền ở ống nghiệm thạch nghiêng
Sử dụng que cấy đã được tiệt trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch nghiêng PDA bằng cách cấy ria, đồng thời vuốt nhẹ dây cấy để tạo ra đường zic-zac trên bề mặt môi trường thạch nghiêng.
Để đảm bảo vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không chạm vào thành và miệng ống nghiệm Sau đó, hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa đèn cồn.
3) Đậy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiêm lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ phù hợp trong 24-48 giờ Sau đó kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật.
Cấy đâm sau ở ống thạch đứng
1) Dùng que cấy thẳng đã vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn, chuyển giống vi sinh vật (nấm mốc) từ đĩa petri sang ống nghiệm thạch đứng PDA.
2) Cấy nấm mốc vào ống nghiệm bằng cách đâm thẳng đứng vào chính giữa môi trường (2/3 chiều sâu của môi trường)
Để đảm bảo quy trình vô trùng, hãy lấy que cấy ra khỏi ống nghiệm mà không để que cấy chạm vào thành và miệng ống nghiệm Tiếp theo, hơ ống nghiệm dưới ngọn lửa của đèn cồn để thực hiện việc vô trùng.
Đậy kín miệng ống nghiệm và đặt lên giá đỡ, ủ ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng 24-48 giờ Sau thời gian này, kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật bằng cách tạo một đường đục theo vết cấy đã đâm sâu.
(File đính kèm: THẠCH NGHIÊNG, THẠCH ĐỨNG.)
Hình: Môi trường thạch nghiêng nấm mốc
Hình: Môi trường thạch đứng nấm mốc
IV Nhận xét và giải thích
Việc phân lập giống vi sinh vật thuần khiết và bảo quản chúng trong thời gian dài là rất quan trọng Kỹ thuật bảo quản hiệu quả không chỉ giúp duy trì tính thuần khiết của vi sinh vật mà còn giảm thiểu số lần cấy chuyền, từ đó tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong nghiên cứu và sản xuất.
Cấy mẫu cần được thực hiện một cách chính xác và nhanh chóng, vì thời gian cấy kéo dài sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm vi sinh vật Đối với ống thạch đứng, que cấy vòng cần được cắm sâu vào 2/3 chiều sâu của môi trường để đảm bảo hiệu quả.
3 Nhận xét và giải thích kết quả
Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện ở điều kiện vô trùng để tránh các vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn từ môi trường ngoài.
Để đảm bảo sự phát triển của vi sinh vật, môi trường và các dụng cụ nuôi cấy cần được tiệt trùng hoàn toàn Trong ống thạch đứng, vi khuẩn kị khí thường phát triển ở đáy cột môi trường, trong khi đó, ở ống thạch nghiêng, các vi sinh vật hiếu khí tạo ra vệt nổi màu trắng đục hoặc trong trên bề mặt thạch.
NHUỘM ĐƠN TIÊU BẢN GIỌT ÉP
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
- Phiến kính hình vuông, phiến kính hình chữ nhật
- Kính hiển vi, dầu soi
II Tiêu bản giọt ép a.Nguyên tắc
Vi khuẩn không di động, nhưng trong môi trường lỏng, chúng thường thể hiện chuyển động hỗn loạn được gọi là chuyển động Brown Một số vi khuẩn có khả năng di chuyển thực sự nhờ vào các cơ chế tự thân khác nhau.
Tiêu bản giọt treo (hanging drop slide) là phương pháp hữu ích để quan sát các kiểu di động và không di động của vi khuẩn Phương pháp này cho phép nghiên cứu hình dạng vi khuẩn trong trạng thái sống, cũng như sự sắp xếp của các tế bào vi khuẩn khi chúng kết hợp với nhau.
-Dùng que cấy vòng chuyển một ít dung dịch mẫu vi khuẩn lên phiến kính hình chữ nhật.
- Dùng phiến kính hình vuông nhẹ nhàng đặt đè lên giọt nước chứa vi khuẩn.
Tránh không để hình thành bọt khí.
-Đặt lên kính hiển vi để quan sát với vật kính dầu. c Kết quả
Tiêu bản giọt ép nhìn qua kính hiển vi quang học. d Nhận Xét
Nấm mốc có dạng hình que, hình cầu.
Có sự chuyển động Brown.
Bằng phương pháp làm tiêu bản giọt ép, chúng ta có thể quan sát hình dạng, kích thước, sự sắp xếp và chuyển động của vi khuẩn dưới kính hiển vi.
-Có thể quan sát được trạng thái sống của tế bào vi khuẩn đặc biệt là sự chuyển động của chúng.Thao tác đơn giản, tiến hành nhanh.
Việc xác định hình thái chính xác của vi khuẩn gặp nhiều khó khăn do bọt khí có thể hình thành khi hai phiến kính chồng lên nhau, gây cản trở trong quá trình quan sát Hơn nữa, việc phân biệt giữa chuyển động Brown và chuyển động tự thân cũng dễ dẫn đến nhầm lẫn.
III Nhuộm đơn a.Nguyên tắc
Kích thước nhỏ bé của vi khuẩn và các chất trong tế bào khiến chúng gần như trong suốt, ngay cả khi được phóng đại và giảm độ chiếu sáng Để quan sát chúng dễ dàng hơn, cần phải cố định vi khuẩn để ngăn chúng di động Một phương pháp đơn giản là tạo vết bôi vi khuẩn lên phiến kính thủy tinh, sau đó cố định và nhuộm chúng bằng phẩm nhuộm.
Phẩm nhuộm vi khuẩn tốt nhất là loại aniline, một phẩm nhuộm hữu cơ từ nhựa than đá, giúp hiển thị rõ nét cấu trúc vi khuẩn khi sử dụng trên vết bôi đã cố định Các phẩm nhuộm này có dạng acid, basic hoặc trung tính, trong đó phẩm nhuộm acid và trung tính thường được áp dụng trong nghiên cứu vi khuẩn Ion âm trong phẩm nhuộm acid kết hợp với cation trong tế bào tạo thành muối, trong khi phẩm nhuộm cơ bản cũng tương tự nhưng kết hợp với acid Tế bào vi khuẩn chứa nhiều ribonucleic acid, do đó phẩm nhuộm trung tính rất hiệu quả trong việc bắt màu, thường kết hợp cả hai loại phẩm nhuộm trên Điều này làm cho phẩm nhuộm trung tính đặc biệt hữu ích trong việc nhuộm các tế bào phức tạp, giúp làm nổi bật cấu trúc bên trong vi khuẩn Tế bào và cấu trúc nhuộm bằng phẩm cơ bản được gọi là basophilic, trong khi những tế bào nhuộm bằng phẩm acid được gọi là acidophilic.
-Lắc kỹ dung dịch vi khuẩn Với thao tác vô trùng chuyển 1 hoặc hai vòng cấy vi khuẩn vào giữa phiến kính Trải đều trên diện tích khoảng ẵ inch.
- Hơ phiến kính trên ngọn lửa để cố định và giết chết vi khuẩn.
-Nhuộm với phẩm nhuộm crystal violet trong 20 - 30 giây)
-Rửa trôi thuốc nhuộm bằng nước trong vài giây.
-Thấm khô bằng giấy thấm Không được xát lên vết
- Quan sát bằng kính hiển vi với vật kính dầu.
Nhuộm Gram với mẫu là nấm men d Nhận Xét
Vi khuẩn được quan sát chủ yếu có hình dạng chuỗi và một phần nhỏ là hình que Kết quả này đạt được nhờ kỹ thuật nhuộm đơn, tạo ra sự tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn và nền, giúp việc quan sát trở nên dễ dàng hơn.
Có thể cố định vi khuẩn trên phiến kính thủy tinh, giúp gắn chặt vi khuẩn mà không làm biến dạng tế bào Phương pháp này cho phép tiêu diệt vi khuẩn hiệu quả mà vẫn giữ nguyên hình dáng của chúng.
Kỹ thuật nhuộm với thuốc nhuộm cơ bản crystal violet tạo ra sự tương phản rõ rệt giữa vi khuẩn và nền, giúp dễ dàng quan sát Thời gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh chóng.
Để đảm bảo quy trình nhuộm đơn đạt độ chính xác cao, cần chú ý đến thời gian và cách chuẩn bị vết bôi Việc sử dụng một lượng vi khuẩn vừa phải là rất quan trọng; nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều sẽ dẫn đến sự chồng chéo, trong khi nếu quá ít sẽ gây khó khăn trong việc quan sát kết quả.
KỸ THUẬT NHUỘM GRAM
II Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
Phiến kính hình chữ nhật, dầu soi kính
2 Mẫu cần thực hiện: Nước dưa cải chua
Phân chia vi khuẩn thành hai nhóm khác nhau: vi khuẩn Gram dương (+) và vi khuẩn Gram âm (-).
IV Nguyên tắc và cách tiến hành
Nguyên tắc đầu tiên trong quy trình nhuộm vi khuẩn là sử dụng phẩm nhuộm cơ bản crystal violet Tiếp theo, tiêu bản được xử lý với dung dịch iodine để cản màu, sau đó tẩy màu bằng ethanol Cuối cùng, tiêu bản được nhuộm bổ sung với phẩm nhuộm safranin Kết quả cho thấy vi khuẩn Gram dương có màu tím, trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng.
1) Chuẩn bị vết bôi và cố định vi sinh vật
2) Dùng dung dịch crytal violet phủ lên vết bôi Để yên trong 1 phút.
3) Để nghiêng phiến kính 45 độ, rửa dưới vòi nước cho trôi hết phần thuốc nhuộm dư (giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu)
4) Phủ lên vết bôi dung dịch iodine Để yên 1 phút.
Để nghiêng phiến kính 45 độ, bạn cần tẩy màu bằng dung dịch 95% ethenol cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra không còn màu, thường mất khoảng 10-20 giây Đây là bước quan trọng nhất trong quy trình.
6) Ngay lập tức rửa phiến kính dưới vòi nước.
7) Phủ lên vết bôi dung dịch safranin O Để yên 1 phút
9) Thấm nhẹ bằng giấy thấm Hơ khô phiến kính trước khi quan sát dưới kính hiển vi.
10) Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát Chụp ảnh tiêu bản.
(File video đính kèm: NHUỘM GRAM.)
Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram
Hình: Kết quả thu được khi nhuộm gram
IV Nhận xét và giải thích
1 Ưu điểm của kỹ thuật nhuộm Gram
Cho kết quả nhanh hơn phương pháp cấy.
Phân loại được vi khuẩn Gram âm và Gram dương.
2 Nhược điểm của kỹ thuật nhuộm Gram
Nhuộm đơn nhiều lần với các loại thuốc nhuộm khác nhau cần đảm bảo độ chính xác về thời gian để tránh làm biến đổi vi khuẩn Gram dương thành vi khuẩn Gram âm.
3 Nhận xét và giải thích kết quả
Kết quả thu được vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng.
Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn so với vi khuẩn Gram dương, với vách tế bào chứa nhiều lipid và dễ bị hòa tan trong các chất tẩy màu như cồn và acetone Điều này dẫn đến việc thuốc nhuộm ban đầu, crystal violet, dễ bị rửa trôi, khiến vi khuẩn Gram âm có thể hấp thụ màu hồng từ thuốc nhuộm bổ sung safranin Ngược lại, ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm co lại các lỗ trong peptidoglycan, giữ lại phức chất tím tinh thể - iốt trong tế bào.
TIÊU BẢN PHÒNG ẨM
I Chuẩn bị dụng cụ và mẫu cần thực hiện
1 Dụng cụ a) Nước cất b) Đĩa petri c) 95% ethanol d) Đèn cồn e) Que cấy vòng f) Pipette các loại g) Phiến kính hình chữ nhật, phiến kính hình vuông. h) dung dịch methylen blue
2 Môi trường và mẫu thưc hiện:
Môi trường M5 (Potato dextrose agar)
200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ
Mẫu thực hiện: nấm mốc
Có thể quan sát cấu trúc hình thái đặc trưng của nấm mốc mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của chúng Phương pháp này cho phép dễ dàng quan sát các cấu trúc liên quan đến sự sinh sản Việc định danh nấm mốc thường dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc tính hình thái học và sự phát triển của khuẩn lạc (Sơn, 2018)
III Nguyên tắc và cách tiến hành
Môi trường có nồng độ đường cao và pH thấp (5.6) không thuận lợi cho sự phát triển của hầu hết vi khuẩn, từ đó giúp hạn chế sự tạp nhiễm Tuy nhiên, nấm mốc lại phát triển tốt ở pH này Để quan sát khuẩn lạc nấm mốc, có thể lấy một ít sinh khối và đặt lên phiến kính với một giọt nước hoặc thuốc nhuộm Phương pháp tiêu bản phòng ẩm (slide culture) cũng là một lựa chọn hiệu quả, cho phép quan sát cấu trúc hình thái đặc trưng mà không làm ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm mốc.
- Chuẩn bị các phiến kính hình chữ nhật (glass slide) và phiến kính hình vuông (coverslips) Ngâm phiến kính trong ethanol 80% trong tối thiểu 15 phút.
- Hơ bề mặt của các phiến kính này trên ngọn lửa để vô trùng (dùng kẹp để cầm).
- Đun chảy ống nghiệm chứa môi trường Sabouraund dextrose agar hay
Potato dextrose agar, sau đó làm nguội đến 48 – 50oC Đổ môi trường vào trong đĩa petri.
- Để đĩa nguội sau đó dùng dao cắt một ô vuông khoảng ô kính hình vuông
- Cho miếng thạch đã cắt vào giữa phiến kính hình chữ nhật và đặt phiến kính hình vuông lên.
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên hãy đặt một ít giấy thấm nước (vô trùng) vào đĩa petri Sau đó, cho một vài que tăm lên trên giấy thấm Tiếp theo, đặt các phiến kính đã chuẩn bị lên trên các que tăm Cuối cùng, ủ hỗn hợp này ở nhiệt độ phòng trong khoảng 2 đến 4 ngày.
Dưới kính hiển vi, việc sử dụng dung dịch methylen blue (0.3% trong ethanol) giúp quan sát cấu trúc của nấm mốc một cách rõ ràng hơn Cồn trong dung dịch giúp làm mềm vách tế bào nấm mốc, tạo điều kiện cho thuốc nhuộm dễ dàng thẩm thấu vào bên trong tế bào.
Figure: Kết quả tiêu bản phòng ẩm
IV Nhận xét và giải thích
Sử dụng tiểu bản phòng ẩm không chỉ giúp tiết kiệm thời gian thực hiện mà còn bảo vệ sự phát triển của nấm mốc, đảm bảo môi trường luôn khô ráo và an toàn.
Quan sát một cách dể dàng các cấu trúc liên quan của nấm mốc bằng các vật kính khác nhau.
Dựa vào các cấu trúc sinh sản, đặc điểm hình thái học và quá trình phát triển của khuẩn lạc, chúng ta có thể xác định và phân loại nấm mốc một cách hiệu quả.
Trong quá trình cấy mẫu, để lẫn vi sinh vật khác vào làm một số mẫu nấm khó quan sát thậm chí không nhìn thấy gì.
Thời gian phải phù hợp nếu để quá dài không xem kết quả sẽ dẫn đến việc mọc nấm trở nên dày đặt khó quan sát.
3 Nhận xét và giải thích
Kết quả cho thấy nấm quan sát được có dạng sợi, và hình dạng này tương đồng với Penicillium, một loại nấm thuộc lớp nấm bất toàn.
Deuteromycetes, không có hình thức sinh sản hữu tính Hệ sợi có vách ngăn.
Bào tử vô tính là bào tử trần.
Thí nghiệm Vi sinh Thực Phẩm không chỉ là môn học thực hành về vi sinh vật mà còn mang lại bài học kinh nghiệm quý giá Môn học này giúp sinh viên nắm vững kiến thức về sử dụng thiết bị phòng thí nghiệm, an toàn trong phòng thí nghiệm và kỹ năng quan sát vi khuẩn Qua các bài học, sinh viên sẽ tiến bộ rõ rệt, củng cố kiến thức và cải thiện kỹ năng thao tác của mình.
